CN101899458A

CN101899458A - 一株高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母及其构建

Info

Publication number: CN101899458A
Application number: CN2009102648501A
Authority: CN
Inventors: 李崎; 李永仙; 郑飞云; 刘春凤; 顾国贤; 秦久福
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: CN101899458B

Abstract

本发明公开了基因工程领域中的一种巴斯德毕赤酵母重组菌及其应用。本研究室通过体外分子进化技术，对淀粉液化芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因进行了热稳定性提高定向进化，获得多株热稳定性提高突变体。本发明首次在巴斯德毕赤酵母系统中表达了其中一株热稳定提高最明显β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，构建到AOX I甲醇诱导型启动子下游，得到重组质粒pPICZαA-his₆-bgl，将其经Pme I线性化后转化毕赤酵母GS115，bgl基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上，并处于酵母α因子的下游，实现了异源分泌表达。通过重组菌株培养条件的优化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表达条件为：pH7.0，OD₆₀₀为2.5，甲醇的日诱导添加量为1％，甲醇诱导后菌体的培养时间为2.5-3天。在此条件下β-葡聚糖酶分泌到培养基中的蛋白表达量为190mg/L，比酶活达到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的大小为27KDa左右，与理论分子量大小吻合。

Description

一株高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母及其构建

技术领域

基因工程领域。

背景技术

在啤酒工业中，啤酒厂在糖化过程中使用β-葡聚糖酶已经比较普遍，国外许多公司如NOVO、诺维信、DMS等早已有商品化的酶制剂出售。在糖化过程中，大麦胚乳细胞壁中的β-葡聚糖虽然在制麦阶段大部分被降解，但因植物β-葡聚糖酶耐温性差，在糖化时其剩余活力会被完全破坏，残留的β-葡聚糖仍有可能会导致麦汁粘度过大，致使过滤困难，延长糖化醪过滤时间，降低浸出物含量。在发酵过程中，过量的β-葡聚糖会导致酵母早期沉降，降低发酵度。在成品啤酒中，β-葡聚糖会与蛋白质结合，导致雾状混浊和凝胶沉淀，降低啤酒的非生物稳定性。啤酒生产中添加β-葡聚糖酶可将β-葡聚糖降解为低聚糖和葡萄糖，降低麦汁粘度，从而大大提高过滤速度，增加生产效率。大麦一般不用做人类食物的直接来源，价格低廉，但若直接作为动物饲料使用时其中含有的β-葡聚糖会造成单胃哺乳动物(如猪)和禽类消化道液体粘稠，影响营养成分的吸收，故β-葡聚糖被称为抗营养因子。在大麦为主要原料的饲料中添加β-1，3-1，4-葡聚糖酶，降解β-葡聚糖，降低消化道内液体的粘度，改善禽畜肠胃道环境，提高营养的吸收效率，消除抗营养因子的作用。这对帮助饲料工业开辟一条具有高经济价值的道路具有实际意义。Cantwell于1983年首次克隆和表达了来自β-1，3-1，4-葡聚糖酶，此后不断有芽孢杆菌属和非芽孢杆菌属的该基因得到克隆和表达。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点(MCR)3′端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5′端引入了alpha factor

(α-factor)用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇(甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜)。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产耐高温β-葡聚糖酶毕赤酵母及其构建。本发明的技术方案为：

1.淀粉液化芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶热稳定性提高突变体基因的开放阅读框序列为序列1。

2.一株高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母，其含有基因序列1，分类命名为：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3520

3.以重组质粒pET-28a-bgl为模板，PPICZαA-F(AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAACGAGTGTTGCTAAT)和PPICZαA-R(GCTCTAGACCTTTTTTTGTATAGCGCAC)为PCR引物扩增，扩增的DNA片段与实际大小一致，约720bp。通过PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，得到耐温性β-葡聚糖酶基因bgl。

4.基因bgl。及质粒pPICZαA经NotI和Xba I双酶切回收后，再经T₄DNA连接酶连接，转化Trans 5α，在Zeisin LLB平板上筛选阳性转化子。结果如表1，表2，表3所示。

5.将阳性转化子进行质粒抽提，用Not I和Xba I双酶切进行鉴定和PCR检测，发现重组质粒经酶切后释放一条720bp左右的片段，该片段与PCR产物大小一致，初步表明重组质粒pPICZαA-bgl构建成功。经测序证明，bgl基因序列嵌入到pPICZαA的5’AOX 1和AOX 1TT之间，并保持了AOX 1控制下的正确阅读框。

表1PCR扩增产物NotI和Xba I双酶切体系(50μL)

表2pPICZαA Not I和Xba I双酶切体系(50μL)

表3表达载体pPICZαA与目的基因的连接体系(10μL)

6.将含有pPICZαA-bgl的Trans5α重组菌大量培养，经质粒提取后，采用Pme I线性化并纯化后用于毕赤酵母转导。

表4重组质粒的线性化酶切体系(50μL)

7.重组表达载体pPICZαA-bgl经PmeI完全酶切线性化后，电转化Pichia pastorisGS115并涂布Zeocin YPDS平板，30℃倒置培养2～4天直至菌落出现。挑选阳性转化子，接种含有Zeocin YPD液体培养基。对转化子进行Mut表型鉴定，得到Mut+菌株，进一步经诱导培养和酶活测定，筛选得到高产毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl。

本发明的有益效果为：将Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl按Mut+诱导方式诱导产酶，通过重组菌株培养条件的优化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表达条件为：pH 7.0，OD₆₀₀为2.5，甲醇的日诱导添加量为1％，甲醇诱导后菌体的培养时间为2.5-3天。在此条件下β-葡聚糖酶分泌到培养基中的蛋白表达量为190mg/L，比酶活达到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的大小为27KDa左右，与理论分子量大小吻合。

生物材料样品保藏

一株高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母，该菌株为巴斯德毕赤酵母，命名为Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3520，2009年12月17日。

附图说明

图1重组载体pPICZαA-bgl的结构图。

图2重组载体pPICZαA-bgl Not I和Xba I双酶切验证电泳图。

图3重组菌SDS-PAGE图。

具体实施方式

实例1

将发明得到的重组巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl按Mut+诱导方式诱导产酶，通过重组菌株培养条件的优化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表达条件为：pH 7.0，OD₆₀₀为2.5，甲醇的日诱导添加量为1％，甲醇诱导后菌体的培养时间为2.5-3天。在此条件下β-葡聚糖酶分泌到培养基中的蛋白表达量为190mg/L，比酶活达到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的大小为27KDa左右，与理论分子量大小吻合。

序列

1.耐温性淀粉液化芽孢杆菌β-葡聚糖酶突变基因(bgl)开放阅读框(ORF)序列：

ORIGIN

1ATGAAACGAG TGTTGCTAAT TCTTGTCACC GGATTGTTTA TGAGTTTGTG TGGGATCACT

61TCTAGTGTTT CGGCTCAAAC AGGCGGATCG TTTTTTGAAC CTTTTAACAG CTATAACTCC

121GGGTTATGGC AAAAAGCTGA TGGTTACTCA AATGGAGATA TGTTTAACTG CACTTGGCGT

181GCGAATAACG TCTCTATGAC GTCATCAGGT GAAATGCGTT TGGCGCTGAC AAGTCCGTCT

241TATAACAAGT TTGACTGCGG GGAAAACCGC TCGGTTCAAA CATATGGCTA TGGACTTTAT

301GAAGTCAGAA TGAAACCGGC TAAAAACACA GGGATTGTTT CATCGTTCTT CACTTATACA

361GGTCCAACGG AGGGGACTCC TTGGGATGAG ATTGATATCG AATTTTTGGG AAAAGACACA

421ACAAAGGTTC AATTTAACTA TTATACAAAT GGCGCAGGAA ACCATGAGAA GTTGGCGGAT

481CTCGGATTTG ATGCAGCCAA TGCCTATCAT ACGTATGCGT TCGATTGGCA GCCAAACTCT

541ATTAAATGGT ATGTCGATGG GCAATTAAAA CATACTGCGA CAACCCAAAT ACCGGCAGCG

601CCGGGGAAAA TCATGATGAA TTTGTGGAAT GGTACGGGTG TCGATGATTG GCTCGGTTCC

661TACAATGGCG TAAATCCGCT ATACGCTCAT TACGACTGGG TGCGCTATAC AAAAAAA

2.耐温性淀粉液化芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因(bgl)编码蛋白质的氨基酸序列

1MKRVLLILVT GLFMSLCGIT SSVSAQTGGS FFEPFNSYNS

41GLWQKADGYS NGDMFNCTWR ANNVSMTSSG EMRLALTSPS

81YNKFDCGENR SVQTYGYGLY EVRMKPAKNT GIVSSFFTYT

121GPTEGTPWDE IDIEFLGKDT TKVQFNYYTN GAGNHEKLAD

161LGFDAANAYH TYAFDWQPNS IKWYVDGQLK HTATTQIPAA

201PGKIMMNLWN GTGVDDWLGS YNGVNPLYAH YDWVRYTKK^＊

Claims

2.一株高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母，其含有基因序列1，分类命名为：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3520。

3.高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorisGS115-pPICZαA-bgl)的构建法，其特征如下：

A.以重组质粒pET-28a-bgl为模板，PPICZαA-F(AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAACGAGTGTTGCTAAT)和PPICZαA-R(GCTCTAGACCTTTTTTTGTATAGCGCAC)为PCR引物扩增，扩增的DNA片段与实际大小一致，约720bp。通过PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，得到耐温性β-葡聚糖酶基因bgl。

B.基因bgl。及质粒pPICZαA经Not I和Xba I双酶切回收后，再经T4DNA连接酶连接，转化Trans5α，在Zeisin LLB平板上筛选阳性转化子。

C.将阳性转化子进行质粒抽提，用Not I和Xba I双酶切进行鉴定和PCR检测，发现重组质粒经酶切后释放一条720bp左右的片段，该片段与PCR产物大小一致，初步表明重组质粒pPICZαA-bgl构建成功。经测序证明，bgl基因序列嵌入到pPICZαA的5’AOX 1和AOX 1TT之间，并保持了AOX 1控制下的正确阅读框。

D.将含有pPICZαA-bgl的Trans5α重组菌大量培养，经质粒提取后，采用PmeI线性化并纯化后用于毕赤酵母转导。

E.重组表达载体pPICZαA-bgl经Pme I完全酶切线性化后，电转化Pichia pastorisGS115并涂布Zeocin YPDS平板，30℃倒置培养2～4天直至菌落出现。挑选阳性转化子，接种含有Zeocin YPD液体培养基。对转化子进行Mut表型鉴定，得到Mut+菌株，进一步经诱导培养和酶活测定，筛选得到高产毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS 115-pPICZαA-bgl。

F.将Pichiapastoris GS115-pPICZαA-bgl按Mut+诱导方式诱导产酶，通过重组菌株培养条件的优化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表达条件为：pH7.0，OD₆₀₀为2.5，甲醇的日诱导添加量为1％，甲醇诱导后菌体的培养时间为2.5-3天。在此条件下β-葡聚糖酶分泌到培养基中的蛋白表达量为190mg/L，比酶活达到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的大小为31KDa左右，与理论分子量大小吻合。