CN101688192A - 用植酸酶和α-淀粉酶进行淀粉水解 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种液化淀粉的方法，包括将淀粉底物浆液和由植酸酶和α－淀粉酶组成的酶组合物相接触。本发明也涉及包含来自布丘氏菌的植酸酶及其变体和α－淀粉酶的酶混合物。

Description

用植酸酶和α-淀粉酶进行淀粉水解
本申请要求申请日为2007年2月7日的美国专利临时申请60/900,237、申请日为2007年3月6日的美国专利临时申请60/905,222和申请日为2007年3月6日的美国专利申请11/714,487的优先权，其内容做为整体引入本发明作为参考。
发明领域
本发明涉及包括至少一种植酸酶和至少一种α-淀粉酶的酶组合物，液化淀粉的方法，生产诸如葡萄糖和醇(如乙醇)的终产物的方法。
背景技术
工业发酵主要使用葡萄糖作为生产众多终产物的原料，所述终产物例如酶、蛋白质、氨基酸、有机酸、糖醇、药物和其它生化制品。在许多申请中，葡萄糖由酶转化底物而生产，底物包括淀粉和纤维素(如整粒磨碎的谷物颗粒)。包含直链淀粉和支链淀粉两种多糖成分的淀粉以颗粒的形式贮存于植物细胞中。这些颗粒的部分晶体结构导致在冷水中的不溶性，因此，淀粉颗粒在水中的溶解通常需要热能来破坏颗粒的晶体结构。人们曾经使用了许多工艺促进淀粉增溶，包括直接和间接对包含粒状淀粉的底物进行加热。(参见，例如，STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY，Eds R.L.Whistler et al.，2ndEd.，1984 Academic Press Inc.，Orlando FLand STARCH CONVERSION TECHNOLOGY，Eds G.M.A.Van Beynumet al.，Food Science and Technology Series 1985 Marcel Dekker Inc.NY)。
由淀粉制得葡萄糖的工艺通常由两步组成，包括淀粉液化和液化淀粉的糖化。进一步的步骤包括：(a)当期望的终产物是纯化的葡萄糖或果糖时进行的纯化和异构化，或(b)当期望的终产物是例如一种醇(如乙醇)时进行的发酵和蒸馏。
淀粉液化处理的一个目标是将淀粉聚合物颗粒浆液转化为具有更短链长度和低粘度的糊精的溶液。这对于方便操作在淀粉转化方法中使用的工业设备是很重要的一步。通常，淀粉利用高温和酶生物转化进行液化。例如，一种常见的酶液化方法涉及将一种热稳定细菌α-淀粉酶{例如
Figure G2008800043527D00021
PRIME和
Figure G2008800043527D00022
FRED，
Figure G2008800043527D00023
XTRA(Genencor International Inc.)或TERMAMYL SC，TERMAMYL SUPRA或TERMANYL 120L(Novozymes))加入包含包括颗粒淀粉的底物的浆液中，将pH值调整到5.5到6.5间，温度高于90℃。淀粉被胶化，随后用糖化酶处理。典型的，糖化在葡糖淀粉酶，例如来自黑曲霉(Aspergillusniger)的葡糖淀粉酶(例如，OPTIDEX L-400(Genencor International Inc.))的存在下在比液化步骤更偏酸性的pH值下进行。典型糖化步骤的pH值大约是pH 4.0到5.0。
淀粉底物的液化和糖化步骤存在许多变化，尽管现有技术已经有所进步，对更有效的淀粉液化方式仍然存在需求。
发明简述
一方面，本发明涉及包含至少一种植酸酶和至少一种α-淀粉酶的酶组合物。在一些实施方式中，植酸酶来自布丘氏菌属(Buttiauxella)细菌、其变体及其修饰形式。在一些实施方式中，植酸酶包括一种野生型序列，其与SEQ ID NO：1所示序列具有至少75％同一性，或SEQ ID NO：1的变体(如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)。在一些实施方式中，α-淀粉酶来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)，如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。在进一步的实施方式中，α-淀粉酶是一种来自芽孢杆菌的亲本α-淀粉酶的变体。在一些实施方式中，植酸酶和α-淀粉酶以一种混合制剂或一种混合物形式提供。在一些实施方式中，本发明涵盖的酶组合物除包含植酸酶外，还包含至少两种α-淀粉酶(例如，来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶和来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶)。
在另一方面，本发明涉及包含一种酶组合物的淀粉水解组合物，该酶组合物包含上述植酸酶和α-淀粉酶。
在另一方面，本发明涉及在包含通过干或湿磨碎方法获得的淀粉底物的浆液中液化淀粉的方法，该方法包括调节包含底物的浆液的pH值到约pH 4.0到低于约pH6.2；以任一顺序将植酸酶和α-淀粉酶的组合加入浆液，其中植酸酶来自布丘氏菌，包括野生型或其变体；在大约40到110℃的温度下与浆液反应5分钟到8小时，以获得液化淀粉。
在另一方面，本发明涉及一种从包含颗粒淀粉的底物液化淀粉的方法，包括a)将包含颗粒淀粉底物的浆液与植酸酶和α-淀粉酶一起于底物的初始淀粉胶化温度以下0到30℃的温度下温育2分钟到4小时，pH值在约4.0到约6.2范围内；b)升高温度到初始胶化温度以上的0到约45℃5分钟到6小时，控制pH值在约4.0到约6.2之间，从而得到液化淀粉。该方法可进一步包括糖化该液化淀粉以获得糊精；回收糊精。在一些实施方式中，该方法进一步包括在适当的发酵条件下发酵糊精以获得终产物，例如醇(如乙醇)，有机酸(如琥珀酸、乳酸)，糖醇(如甘油)，抗坏血酸中间体(如葡糖酸、DKG，、KLG)，氨基酸(如赖氨酸)，和蛋白质(如抗体及其片段)。在一个实施方式中，本方法包括以任何顺序向初次和/或二次液化步骤的浆液中同时或分别加入BP-17和至少一种α-淀粉酶的组合。
在另一方面，本发明涉及一种降低淀粉液化方法中需要的α-淀粉酶剂量的方法，包括将包含诸如磨碎谷物的淀粉底物的浆液和本发明涵盖的α-淀粉酶与植酸酶相接触。
在另一方面，本发明涉及通过使粉碎的谷物的浆液与本发明涵盖的植酸酶接触并任选地使粉碎的谷物的浆液与α-淀粉酶和植酸酶同时或先后相接触，从而降低包含颗粒淀粉的全粉碎谷物中植酸含量的方法。
在另一方面，本发明涉及一种生产乙醇方法，包括在存在植酸酶和α-淀粉酶的条件下发酵植物材料并蒸馏所述发酵材料以生产乙醇。在一些实施方式中，植物材料是磨碎的或粉碎的谷物。在一些实施方式中，本方法不涉及加入酸或碱。在一些实施方式中，浆液被植酸酶处理足够长时间以增加α-淀粉酶的热稳定性。在一些实施方式中，浆液被植酸酶处理足够长时间以使淀粉在较低的pH值下被水解。在进一步的实施方式中，浆液被植酸酶处理足够长时间以降低α-淀粉酶的植酸抑制。
附图简述
图1示例性的显示了本发明的一种实施方式，包括一个可选的预处理步骤(初次液化)。
图2显示了85℃，pH 5.8的条件下与植酸和α-淀粉酶接触时，36％ds全粉碎玉米粉浆液的粘度降低，参考实施例8。
图3显示了pH 5.8的条件下与SPEZYME XTRA和BP-17的组合接触时，30％ds玉米粉浆液的粘度降低，详见实施例9。
图4显示了用于异源表达野生型和BP-17变体布丘氏菌植酸酶的pTREX4/植酸酶融合构建体。
图5显示了用于异源表达野生型和BP-17变体布丘氏菌植酸酶的pTREX4/植酸酶直接构建体。
发明详述
定义
除非另外定义，本发明所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员的通常理解的具有相同含义。Singleton，et al.，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wileyand Sons，New York(1994)，和Hale & Markham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)为技术人员提供了此处所用许多术语的通常含义。尽管如此，为提供更加清晰和容易参考，一些术语在下文中加以定义。
此处所用术语“植酸酶”是指一种能催化包括植酸在内的磷酸酯的水解并释放无机磷酸盐和肌醇的酶。在一些实施方式中，除植酸外，植酸酶也可以水解磷酸化作用中间程度的至少一种肌醇-磷酸。
此处所用术语“野生型”是指一种在宿主细胞中自然产生的(天然的)酶。在一些实施方式中，术语“亲本”或“亲本序列”可与术语野生型互换使用。
术语“野生型布丘氏菌植酸酶(WT-BP)”是指一种具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶。
术语“布丘氏菌植酸酶-11(BP-11)”是指一种具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变体植酸酶。
术语“布丘氏菌植酸酶-17(BP-17)”是指一种具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的变体植酸酶。
“α-淀粉酶”是α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)并且切割或水解淀粉(例如支链淀粉或支链淀粉聚合物)内部α-1，4-糖苷键的酶。
术语“功能等同物”是指一种酶具有与布丘氏菌属植酸酶(WT-BP)相同的酶学功能特征并来自野生型植酸酶。
术语“变体”当用于描述一种酶(如一种α-淀粉酶，一种植酸酶等等)时，意指一种衍生自天然产生的酶(野生型)但与天然产生的酶相比具有一个或多个氨基酸的取代、插入或缺失的酶。该术语包括酶的杂合形式，其中例如该酶可具有衍生自一种芽孢杆菌(例如地衣芽孢杆菌)的C-末端和衍生自不同的芽孢杆菌(例如，嗜热脂肪芽孢杆菌)的N-末端。与野生型相比，变体可具有一种或更多改变的性质，例如但不限于增加的热稳定性，增加的蛋白水解稳定性，增加的比活性，更宽的底物特异性，在一定pH值范围内更宽的活性，或上述性质的组合。
术语“接触”是指将至少一种酶放置得足够接近其各自底物，以使该酶能够将底物转化成至少一种终产物。所属领域技术人员将意识到混合包含至少一种酶的至少一种溶液与其相应的酶底物导致“接触”。
“液化作用”或“液化”意指将淀粉转化成链长更短且粘度更低的糊精的方法。
“糊精”是葡萄糖的短链聚合物(如，2到10个单位)。
此处所用术语“淀粉”是指任何由植物的复杂多糖碳水化合物组成的物质，包括具有通式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任意数值。
术语“颗粒淀粉”意指粗淀粉，即未经胶化温度处理的淀粉。
术语“糖化酶”和“葡糖淀粉酶”(E.C.3.2.1.3)”在此可以互换使用，指的是任何能催化D-葡萄糖从淀粉和相关寡糖和多糖的非还原端释放的酶。
术语“寡糖”是指具有由糖苷键连接的2到10个单糖单元的任何化合物。这些简单糖的短链多聚体包括糊精。
术语“DE”或“葡糖当量”是一种测量总还原糖浓度的工业标准，基于干重以D-葡萄糖计算。未水解颗粒淀粉的DE基本为0而D-葡萄糖的DE为100。
术语“葡萄糖浆”是指包含葡萄糖固体的含水组合物。葡萄糖浆的DE值至少为20。在一些实施方式中，葡萄糖浆含水不超过21％并且含以葡萄糖计算的还原性糖不低于25％。在一个实施方式中，葡萄糖浆包含至少90％的D-葡萄糖，在另一个实施方式中，葡萄糖浆包含至少95％的D-葡萄糖。一些实施方式中，术语葡萄糖和葡萄糖浆可互换使用。
术语“总糖含量”是指淀粉组合物中存在的总糖含量。
术语“干固体(ds)”是指以干重计算的浆液中总固体的百分比。
如此处所用，关于本文鉴定的氨基酸或核苷酸序列的“序列同一性百分比(％)”定义为：经过序列比对和空位引入后，候选序列中与一条序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的氨基酸残基或核苷酸百分比，其中，如果需要，为达到最大百分比的序列同一性，且不考虑保守取代作为序列同一性的一部分，可引入空位。进行序列比对和决定序列同一性的方法为本领域技术人员所熟知，不需要进行过度的实验，同一性值的计算结果可以明确得到。参见，例如，Ausubel，et al，eds.(1995)Current Protocols inMolecular Biology，Chapter 19(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；ALIGN程序(Dayhoff(1978)in Atlas of Protein Sequence andStructure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C)。许多算法可用于比对序列和决定序列同一性，包括，例如Needleman等人的同源性比对算法，(1970)J.MoI.Biol.48：443；Smith等人的局部同源性算法，(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Pearson等人的相似性方法研究.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444；Smith-Waterman算法(Meth.MoI.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(见Altschul，et al，(1990)J.MoI.Biol.215：403-410)。也有利用这些算法的计算机程序，包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或WU-BLAST-2(Altschul，et al，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或GAP，BESTFIT，BLAST Altschul，et al，supra，FASTA，和TFASTA，其可获得于the Genetics Computing Group(GCG)软件包，第8版，Madison，Wis.，USA；和PC/Gene program中的CLUSTAL，来自Intelligenetics，Mountain View，Calif。所属领域技术人员能决定测量比对的合适参数，包括为实现被比较序列长度上的最大比对而需要采用的算法。优选的，用程序设定的默认参数决定序列的同一性。特别的，序列同一性可由Smith-Waterman同源性搜索算法(Meth.MoI.Biol.70：173-187(1997))决定，如在MSPRCH程序(Oxford Molecular)中所实现，使用仿射空位搜索并采用以下搜索参数：空位开放罚分12，空位延伸罚分1。优选的，成对氨基酸比较可使用Genetics Computer Group，Inc.，Madison，Wis.的GCG序列分析软件包中的GAP程序进行，使用blosum62氨基酸置换矩阵，空位权重为12，长度权重为2。对于两个氨基酸序列的优化比对，变体氨基酸序列的连续片段可具有与参考氨基酸序列相比额外氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。用于与参考氨基酸序列比较的连续片段将包括至少20个连续的氨基酸残基，也可以是30、40、50或更多氨基酸残基。由于衍生的氨基酸序列包含空位而对增加的序列同一性的校正可通过赋予空位罚分进行。
术语“％同源性”在此可与术语“％同一性”互换使用。典型的可用于确定两条序列同一性的计算机程序包括，但不限于，BLAST程序套装，如BLASTN，BLASTX，和TBLASTX，BLASTP和TBLASTN，公众可在互联网上获得(参见，例如，National Center for Biotechnology Information网站的BLAST页面)。也可参见Altschul，et al，1990和Altschul，et al，1997。
当评价一条给定核苷酸序列和GenBank DNA序列和其它公共数据库中的核苷酸序列的相关性时，典型的使用BLASTN进行序列检索。优选使用BLASTX针对在GenBank蛋白序列和其它公共数据库中的氨基酸序列检索所有可读框都均已被翻译的核苷酸序列。使用默认参数运行BLASTN和BLASTX，开放空位罚分11.0，延伸空位罚分1.0，利用BLOSUM-62矩阵。(参见，例如，Altschul，et al.，1997.)。
对选定序列进行的决定两条或更多序列间“％同一性”的一种优选比对是利用如Mac Vector 6.5版中的CLUSTAL-W程序进行的，以默认参数运行，包括开放空位罚分10.0，延伸空位罚分0.1，BLOSUM 30相似性矩阵。
此处所用术语“粉碎的”是指尺寸减小(例如通过研磨、压碎、分级分离或其它尺寸减小方法)的植物材料。粉碎包括干或湿粉碎。“干粉碎”是指完整干谷物的粉碎。“湿粉碎”是指谷物先在水中浸湿(浸泡)以软化谷物的方法。
术语“胶化”意指淀粉分子的增溶作用(通常通过蒸煮)，以形成粘稠的悬液。
术语“胶化温度”是指含底物淀粉开始胶化的最低温度。胶化的精确温度取决于具体淀粉，并随植物种类、环境以及生长条件等因素而变化。
术语“在胶化温度以下”是指低于胶化温度的温度。
术语“浆液”是指包含不溶固体的含水混合物(如颗粒淀粉)。
术语“发酵”是指通过微生物对有机物进行酶解和厌氧降解，以生产更简单的有机化合物。当发酵发生在厌氧条件下，该术语并非有意仅限于严格厌氧条件，因为发酵也发生在有氧条件下。
短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指在生产终产物中的一种方法，其中发酵生物，如产生乙醇的微生物，和至少一种酶，如糖化酶，在相同方法步骤中在同一容器中混合。
术语“细釜馏物”是指和固体分开(如经筛分或离心)的釜馏物的液体部分，其含有悬浮的细小颗粒和溶解的物质。术语“回流物”和/或“补给水”通常用于指回收的细釜馏物。
术语“终产物”是指任何由可发酵底物经酶促转化得到的碳源衍生产物。在一些优选的实施方式中，终产物是醇(如乙醇)。
术语“衍生自”涵盖了术语“来源于”，“获得自”或“可获得自”，和“分离自”，在一些使用实施方式中，意思是一种由核苷酸序列编码的多肽产生于细胞，该细胞中天然存在该核苷酸或插入了该核苷酸。
此处所用术语“发酵生物”是指适用于发酵以直接或间接生产终产物的任何微生物或细胞。
此处所用术语“乙醇生产者”或“乙醇产生微生物”是指发酵生物，其能由单-或寡糖产生乙醇。
术语“回收的”，“分出的”，和“分离的”用于此处是指一种蛋白质、细胞、核酸或氨基酸，其从至少一种与之天然伴随的成分中移除。
术语“蛋白质”和“多肽”在此可以互换使用。在本发明的公开内容和权利要求中，使用常规的1字母和3字母代码表示氨基酸残基。氨基酸的3字母代码的定义与IUPAC-IUB Joint Commission on BiochemicalNomenclature(JCBN)的定义一致。也可以理解的是，由于遗传密码的简并性，一种多肽可由多于一种核苷酸序列所编码，
术语“可操作的连接”是指元件按照允许它们行使相关功能的排布顺序而连接。例如，启动子可操作的连接于编码序列，如果其控制该序列的转录的话。
术语“选择标记”是指能在宿主中表达以便于选择那些包含导入核酸或载体的宿主的基因。选择性标记的例子包括但不限于抗微生物(如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予代谢优势的基因，如在宿主细胞中的营养优势。
术语“异源的”当用来描述多核苷酸或蛋白质时，是指一种并非在宿主细胞中自然产生的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方式中，该蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。该术语有意的涵盖了由天然产生的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。
术语“内源的”当用来描述多核苷酸或蛋白质时，是指一种在宿主细胞中天然产生的多核苷酸或蛋白质。
此处所用术语“转化的”，“稳定转化的”和“转基因的”当用于描述细胞时，意思是该细胞具有非天然(如异源的)的核酸序列，其整合入其基因组或作为一种附加质粒经过多次传代后仍能保留下来。
此处所用术语“表达”是指根据基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
术语“导入”在向细胞中插入核酸序列的上下文中，意指“转染”、或“转化”或“转导”，并包括将核酸序列整合入真核或原核细胞中，其中该核酸序列可整合到该细胞基因组(如，染色体，质粒，质体或线粒体DNA)，转化成自主复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。
必须注意的是此处以及权利要求中所用的单数形式“一个”和“这个”包括复数，除非上下文另有明确要求。因此，例如，“细胞”包括一个或更多细胞或其为本领域技术人员所熟知的等同物，等等。
若提到了数值范围，可以理解的是除非上下文另有明确要求，在该范围的上下限之间的每个居中值，直到下限单位的十分之一也明确的公开。在一个记载的范围内任何已记载的数值或居中值之间的较小范围和其它任何在记载范围内已公开的或居间的数值都被涵盖到本发明中。这些较小范围的上下限可被独立的包括或排除在该范围中，每个范围(在该较小范围中只包括上限或下限之一或同时包括上下限)同样被涵盖到本发明中，在公开的范围内受到任何明确的排除。若记载的范围包括一个或两个端值，排除端值之一或两者的范围也包含在本发明中。
其它术语定义将会出现在说明书中。在对示例性实施方案作具体描述之前，可以理解的是，本发明不限于所描述的特定实施方式，因为这些当然可以改变。
提供此处所讨论的出版物仅用于在本申请的申请日之前它们的公开。此处没有内容被理解为承认本发明由于在先发明而不能早于这些出版物。
实施例
本发明人发现向使用了α-淀粉酶的淀粉水解过程中添加植酸酶，尤其是一种野生型布丘氏菌植酸酶(如P1-29，SEQ ID NO：1)及其变体(如BP-11，SEQ ID NO：2和BP-17，SEQ ID NO：3)，相比使用α-淀粉酶而不用植酸酶，可提供一些优势。此外，发明人发现使用野生型布丘氏菌植酸酶(如P1-29)及其变体提供了提高淀粉水解效率的方式。
目前的乙醇生产工艺需要在淀粉液化前后调节pH值，以为液化酶和酵母发酵提供合适的条件。pH调节也导致许多缺点。例如，调节pH导致高盐度进而抑制发酵生物。如果使用硫酸，其也会导致硫处理问题。此外，pH调节需要在工艺中增加步骤，降低了效率。通过使用植酸酶稳定液化酶(如α-淀粉酶)，发现液化可在比通常更低的pH值下发生。实际上，使用植酸酶处理可导致液化发生在全粉碎谷物浆液的pH下，而不需pH调节，即便全粉碎浆液含有高水平的细釜馏物。这样就不必在全粉碎谷物转化为乙醇时使用碱或酸调节pH。这样进一步使得在单个液化步骤中而不调节pH，或在两个液化步骤中使用低剂量的该酶将淀粉转化为葡萄糖。作为附加的优点，这样使得该方法继续进入同时糖化发和酵而不用任何进一步的pH调节。此外，即使该方法进行中允许调节pH，也会使α-淀粉酶的热稳定性增加。
植酸酶
在一些实施方式中，本发明中有用的至少一种植酸酶来自布丘氏菌属细菌。布丘氏菌属包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。布丘氏菌属的菌株可从DSMZ，德国国家生物材料资源中心(Inhoffenstrabe7B，38124 Braunschweig，Germany)得到。以登陆号NCIMB 41248进行保藏的布丘氏菌属菌株P1-29就是可产生植酸酶并用于本发明的特别有用的菌株的一个例子。可根据WO 06/043178中的描述，例如通过杂交技术从布丘氏菌属鉴定植酸酶。
在一个优选的实施方式中，可用于本发明的植酸酶是与SEQ ID NO：1(见表1)所示氨基酸序列具有至少75％，至少80％，至少85％，至少88％，至少90％，至少93％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％和至少99％的序列同一性的植酸酶和其变体。在一些优选的实施方式中，植酸酶来自布丘氏菌属。更优选的，用于本发明的植酸酶是与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少95％到99％的序列同一性的植酸酶或其变体。在一些实施方式中，该植酸酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
表1：BP-WT的多肽序列(SEQ ID NO：1)
NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT
PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE
AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA
QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS
IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL
KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI
LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV
SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR
VVSQSVEPGC QLQ(SEQ ID NO：1)
在一些实施方式中，植酸酶是与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的片段，该片段包含至少350个氨基酸、至少375个氨基酸或至少400个氨基酸。在一些实施方式中，该片段具有植酸酶活性。在一些实施方式中，该片段的植酸酶活性是SEQ ID NO：1的亲本或野生型植酸酶的至少40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％，或100％。
在一些其它实施方式中，植酸酶是具有如SEQ ID NO：1的氨基酸序列的植酸酶的变体。一些优选的变体是在PCT专利公布WO 2006/043178中公开的变体。
其它优选的SEQ ID NO：1变体包括在本公开的SEQ ID NO：1的下述至少一个位置含有突变的多肽：26，37，89，92，134，160，164，171，176，178，188，190，192，207，209，211，235，248，256，261，270，306或318。在一些实施方式中，变体将包括在对应于SEQ ID NO：1的下述位置含有突变的植酸酶多肽：89，134，164，176，178，207，209，248，256，261和270。在其它实施方式中，变体将包括在对应于SEQ ID NO：1的位置含有至少再一个突变。在一些实施方式中，变体具有SEQ ID NO：1的亲本或野生型植酸酶活性的至少40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％，或100％。
在其它实施方式中，植酸酶在相应于K26E，T134V/I，F164S，T176K，K207T/E，D211C，或Q256Y的位置包括至少一个突变。在其它实施方式中，该变体包括含有突变的组合的多肽。例如，参考WO 2006/043178的表1，其中编号参考该PCT申请公开文本的SEQ ID NO：3。在一些实施方式中，该变体具有SEQ ID NO：1的亲本或野生型植酸酶的植酸酶活性的至少40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％，或100％。
在本发明的一些实施方式中，植酸酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸或由其组成，或与之具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的植酸酶。包含本文SEQ ID NO：2的氨基酸或由其组成的植酸酶也作为野生型布丘氏菌的一种变体公开于WO 2006/043178中。该变体在本文中被称作BP-11。SEQ ID NO：1(BP-WT)和BP-11变体(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列之间有11个氨基酸残基不同，这些残基在表2的SEQ ID NO：2氨基酸序列中以粗体加下划线表示。在一些实施方式中，植酸酶包括BP-11植酸酶，其中可有1、2、3或更多的氨基酸改变。
表2：BP-WT和BP-11氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的差异
NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT
PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVW
Figure G2008800043527D00131
D VDQRTLKTGE
AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAG
Figure G2008800043527D00132
CSMDKT QVQQAVEKEA
QTPIDNLNQH YIPLALMNT TLNFS
Figure G2008800043527D00134
S
Figure G2008800043527D00135
WC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS
IKDNGN
Figure G2008800043527D00136
V
Figure G2008800043527D00137
L DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWA
Figure G2008800043527D00138
LL
KLHNV
Figure G2008800043527D00139
FDLMRTPYIARHGTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI
LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV
SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR
VVSQSVEPGC QLQ(SEQ ID NO：2)
在本发明的一些实施方式中，变体将包含相应于SEQ ID NO：1的A89，D92，T134，F174，T186，A188，K207，A209，S248，Q256，A261，和N269的残基位置的氨基酸残基取代或由其组成。在一些实施方式中，植酸酶包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或由其组成，或与之具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％和至少99％的氨基酸序列同一性的植酸酶。SEQID NO：3的变体在本文称作BP-17。SEQ ID NO：1和BP-17变体(SEQ IDNO：3)的氨基酸序列之间有12个氨基酸残基不同，分别是有关下述取代：A89T，D92A，T134I，F174S，T186K，A188P，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，和N269K。此外BP-17不同于BP-11之处在于相应于92位的一个氨基酸取代。因此，在一些实施方式中，变体与SEQ ID NO：1具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性，并至少在92位含有一个丙氨酸。在其它实施方式中，变体与SEQ ID NO：3具有至少95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性并至少在92位含有一个丙氨酸。在其它实施方式中，变体与SEQ ID NO：1具有至少95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性，并至少在92位含有一个丙氨酸，并具有至少另外一个氨基酸取代，该取代选自下组：A89T，T134I，F174S，T186K，A188P，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，和N269K。BP-WT和BP-17残基之间的差别在下表3中以粗体加下划线表示。
表3：BP-WT和BP-17氨基酸序列的差异(SEQ ID NO：3)
NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT
PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVW
Figure G2008800043527D00141
D V
Figure G2008800043527D00142
QRTLKTGE
AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAG
Figure G2008800043527D00143
CSMDKT QVQQAVEKEA
QTPIDNLNQH YIPLALMNT TLNFSS
Figure G2008800043527D00146
WC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS
IKDNGN
Figure G2008800043527D00147
V
Figure G2008800043527D00148
L DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWA
Figure G2008800043527D00149
LL
KLHNV
Figure G2008800043527D001410
FDLM
Figure G2008800043527D001411
RTPYIARH
Figure G2008800043527D001412
GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI
LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV
SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR
VVSQSVEPGC QLQ(SEQ ID NO：3)
在一些实施方式中，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少95％序列同一性的植酸酶含有保守的氨基酸取代。保守氨基酸取代包括例如，Gly或Cys取代Ala；Lys、Met或Ile取代Arg；Asp或Glu取代Asn；Asn或Gln取代Asp；Met或Thr取代Cys；Asn、GIu、或Asp取代Gln；Ala或Pro取代Gly；Val、Leu或Met取代Ile；VaI或Met取代Leu；Arg、Met或Ile取代Lys；Cys、Ile、Leu或VaI取代Met；Tyr、His、Trp取代Phe；Thr、Met或Cys取代Ser；Ser、Met或Val取代Thr；Phe或His取代Tyr；Leu、Ile或Met取代Val。在一些实施方式中，保守氨基酸取代具有SEQ ID NO：1的亲本或野生型植酸酶活性的至少40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％，或100％。在一些实施方式中，保守氨基酸取代具有植酸酶活性。
在一些实施方式中，植酸酶是具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3至少95％序列同一性的氨基酸序列的片段，其中该片段包含至少350个氨基酸、至少375个氨基酸或至少400个氨基酸。在一些实施方式中，该片段具有植酸酶活性。在一些实施方式中，该片段的植酸酶活性是SEQ IDNO：1的亲本或野生型植酸酶的至少40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或100％。
α-淀粉酶
在一些实施方式中，α-淀粉酶是酸稳定的α-淀粉酶，当加入有效量时在pH3.0到7.0并优选pH3.5到6.5的范围内有活性。本发明使用的α-淀粉酶可以是真菌α-淀粉酶或细菌α-淀粉酶。进一步，α-淀粉酶可以是野生型α-淀粉酶及其变体或片段，或杂合α-淀粉酶，例如其催化结构域来自一种微生物来源，淀粉结合结构域来自另一种微生物来源。
真菌α-淀粉酶的实例包括获得自丝状真菌菌株的，包括但不限于获得自曲霉属(例如，黑曲霉(A.niger)、A.kawachi和米曲霉(A.oryzae))；木霉属(Trichoderma sp.)，根霉属(Rhizopus sp.)，毛霉属(Mucor sp.)，和青霉属(Penicillium sp.)菌株的那些。
更优选的，酸稳定α-淀粉酶来自细菌株系。细菌株系包括但不限于芽孢杆菌属，链霉菌属和乳杆菌属。一些细菌株系包括芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜热脂肪杆菌(B.stearothermophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)和凝固芽孢杆菌(B.coagulans)。尤其是地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪杆菌和解淀粉芽孢杆菌。
用于本发明的组合物及方法的优选的一种细菌α-淀粉酶包括描述于下述专利中的α-淀粉酶之一：USP 5,093,257；USP 5,763,385；USP5,824,532；USP 5,958,739；USP 6,008,026；USP 6,093,563；USP 6,187,576；USP 6,297,038；USP 6,361,809；USP 6,867,031；US 2006/0014265；WO96/23874，WO 96/39528；WO 97/141213，WO 99/19467；和WO 05/001064。
期望在本发明涵盖的组合物和方法中使用的可商购的α-淀粉酶包括：
Figure G2008800043527D00161
AA；
Figure G2008800043527D00162
FRED；XTRA；GZYME 997；和CLARASE L(Genencor International Inc.)；TERMAMYL 120-L，LC和SC和SUPRA(Novozymes Biotech)；LIQUOZYME X和SAN SUPER(Novozymes A/S)和ULTRA THIN(Diversa/Valley Research)。在一些实施方式中，，SPEZYME XTRA和/或SPEZYME FRED，如WO 05/111203中所描述，与一种布丘氏菌植酸酶或变体组合使用。
在一些实施方式中，该α-淀粉酶是Termamyl-样α-淀粉酶。Termamyl-样α-淀粉酶意指在氨基酸水平上表现出与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基本同源的α-淀粉酶，例如与WO 06/066594中指定为SEQ ID NO：4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶具有至少75％序列同一性，包括80％，85％，90％，95％，99％和100％序列同一性。
本发明涵盖的酶组合物可包括混合或配制的酶组合物。酶组分可用于混合制剂，其包括至少两种混合在一起的酶组分(混合物)或酶组分可以在方法的一个或更多步骤中单独添加。这涉及将两种单独的酶组分按时间顺序的方式加入，以便保持植酸酶和淀粉酶的比例，例如，同时加入各组分。按配制的酶组合物意思是以配方的方式单独提供酶，例如以特定比例。在一些实施方式中，该组合物将包括一种与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的植酸酶，和/或一种与SEQ ID NO：2具有至少95％序列同一性的植酸酶；和/或一种与SEQ ID NO：3具有至少95％序列同一性的植酸酶和一种α-淀粉酶。
在一些实施方式中，α-淀粉酶包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，如SPEZYME AA、LIQUOZYME或SPEZYME XTRA。在一些实施方式中，α-淀粉酶包括来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶。在一些实施方式中，α-淀粉酶是一种杂合酶，例如杂合酶可以包含来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌种和地衣芽孢杆菌菌种的片段。
在一些实施方式中，酶组合物或混合物将包括：a)BP-WT、SPEZYMEXTRA和任选地SPEZYME FRED；b)BP-WT的变体、SPEZYME XTRA和任选地SPEZYME FRED；c)BP-17、SPEZYME XTRA和任选地SPEZYME FRED。在一些实施方式中，该组合物包括α-淀粉酶和布丘氏菌植酸酶。在一些实施方式中，该组合物包含SPEZYMETM XTRA和BP-WT。一些实施方式中，该组合物包含SPEZYMETM XTRA和BP-17。在一些实施方式中，该组合物包含SPEZYMETM XTRA和一种与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3具有至少75％序列同一性的植酸酶，包括80％，85％，90％，95％，和99％的序列同一性。在一些实施方式中，该组合物包含SPEZYMETM FRED和BP-WT。在一些实施方式中，该组合物包含SPEZYMETM FRED和BP-17。在一些实施方式中，该组合物包含SPEZYMETM FRED和一种与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3具有至少75％序列同一性的植酸酶，包括80％，85％，90％，95％，或99％的序列同一性。
在混合的制剂中或单独包含植酸酶和α-淀粉酶的酶组合物包括淀粉水解组合物，例如，产自Danisco US，Inc.，Genencor Division的MAXALIQTM One。在一些实施方式中，该植酸酶可与诸如LIQUOZYME、TERMAMYL LC或SUPRA的α-淀粉酶组合。用于淀粉液化的α-淀粉酶的混合物是已知的，可参考USP 4,933,279，其公开了一种混合酶产品，包含一种来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶和一种来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶的混合物。
在一些实施方式中，使用植酸酶和α-淀粉酶，无论其以混合或单独添加的方式提供，使得淀粉液化方法在比只使用α-淀粉酶而不用所述植酸酶的情况所需要的pH值更低的pH下进行。例如，淀粉液化方法可在比只用α-淀粉酶而不用本发明包括的植酸酶的情况低约0.5到1.5个单位(如，低约0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0、1.2或1.5个单位)的pH下进行。
在一些实施方式中，当使用植酸酶组合物和α-淀粉酶组合物时，例如在淀粉水解过程中，植酸酶(FTU/g ds)和α-淀粉酶(AA U/g ds)的比率是约15∶1到约1∶15，备选地约10∶1到约1∶10，备选地约5∶1到约1∶5，备选地约3∶1到约1∶2，包括约1∶1，约1.1∶1，约1.2∶1，约1.3∶1，约1.4∶1，约1.5∶1，约1.6∶1，约1.7∶1，约1.8∶1，约1.9∶1，和约2∶1。
在混合的制剂中或者单独包含植酸酶和α-淀粉酶的一些有用的酶组合物包含淀粉水解组合物，其将在“方法”标题下进一步详细讨论。
次要的酶
虽然本发明的一些实施方式包含一种组合物或者说α-淀粉酶和植酸酶的混合物，该组合物可任选地包含其它酶。备选地，其它酶可与组合物于本发明方法的不同时间点分别同时加入，或在该过程的不同时间加入。例如，液化过程中的其它有用组分包括但不限于：纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、半乳糖苷酶、酯酶、环糊精转糖基转移酶(CGTases)、β-淀粉酶和上述的组合。
葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3.)可来自细菌、植物和/或真菌来源的异源或内源蛋白表达。一些本发明有用的葡糖淀粉酶可由多种丝状真菌或酵母菌株生产。特别的，由曲霉属和木霉属菌株分泌的葡糖淀粉酶是商业上重要的。合适的葡糖淀粉酶包括天然产生的野生型葡糖淀粉酶、其变体和通过基因工程突变的葡糖淀粉酶(如杂合葡糖淀粉酶)。下列葡糖淀粉酶是可用于本发明涵盖的方法的葡糖淀粉酶的非限制性实例。黑曲霉(Aspergillusniger)G1和G2葡糖淀粉酶(参见例如，Boel et al.，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381，WO 00/04136和USP 6,352,851)；泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(参见例如WO 84/02921)；米曲霉(Aspergillus oryzae)葡糖淀粉酶(参见例如Hata et al.，(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949)和Aspergillus shirousami(参见例如Chen et al.，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Chen et al.(1995)Prot.Eng.8：575-582；和Chen etal.，(1994)Biochem J.302：275-281)。
葡糖淀粉酶也可以获自踝节菌属(Talaromyces)菌株，例如来自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和T.thermophilus(参见例如WO99/28488；USP No.RE：32,153；USP No.4,587,215)；木霉属菌株，例如里氏木霉(T.reesei)和特别是与美国专利公开号2006-0094080所公开的SEQ ID NO：4具有至少约80％，85％，90％或95％序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉属菌株，如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉属菌株和腐质霉属(Humicola)菌株，如灰腐质霉(H.grisea)(参见例如Boel et al.，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen et al.，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor et al.，(1978)CarbohydrateRes.61：301-308；USP.4,514,496；USP 4,092,434；USP 4,618,579；Jensen etal.，(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223和WO 2005/052148的SEQ IDNO：3)。在一些实施方式中，葡糖淀粉酶与WO 05/052148的SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少约85％，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％和99％的序列同一性。其它本发明有用的葡糖淀粉酶包括来自罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)的葡糖淀粉酶及其变体(参见例如WO 04/11 1218)。也可参见此处关于其它葡糖淀粉酶的糖化作用的讨论。
具有葡糖淀粉酶活性的商用的酶可通过，例如，黑曲霉(参见例如商品名DISTILLASE，OPTIDEX L-400和G ZYME G990 4X，产自DaniscoUS，Inc，Genencor Division.)或根霉属物种(参见例如商品名CU.CONC，产自Shin Nihon Chemicals，日本)产生。也包括商购的消化酶，商品名GLUCZYME，产自Amano Pharmaceuticals，日本(参见例如Takahashi etal.，(1985)J.Biochem.98：663-671)。其它酶包括来自一种根霉属的三种形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，命名为″Gluc1″(MW 74,000)，″Gluc2″(MW58,600)和″Gluc3″(MW 61,400)。也发现酶制剂GC480(Danisco US，Inc，Genencor Division)可用于本发明。上述葡糖淀粉酶和商用酶并不是意图限制本发明而仅是作为实例提供。
在一些实施方式中，附加的酶是第二种α-淀粉酶，例如细菌或真菌α-淀粉酶，在其它实施方式中，α-淀粉酶是一种真菌或细菌α-淀粉酶的衍生物、突变体或变体。可以使用任何α-淀粉酶，包括本领域所熟知的和此处所讨论的。与至少一种本发明的α-淀粉酶和植酸酶组合使用的α-淀粉酶的非限制性的实例来自芽孢杆菌属、曲霉属、木霉属、根霉属、镰孢属、青霉属、脉孢霉属(Neurospora)和腐质霉属(Humicola)菌株。
一些其它α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，所述芽孢杆菌包括地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、嗜热脂肪杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，及其杂种、突变体和变体(参见例如USP 5,763,385；USP 5,824,532；USP 5,958,739；USP6,008,026和USP 6,361,809)。一些这样的淀粉酶是可商购的，例如可购自Novo NordiskA/S的TERMAMYL和SUPRA，可购自Diversa的ULTRATHIN，可购自Novo Nordisk A/S的LIQUEZYME SC和可购自Danisco US，Inc，Genencor Division的SPEZYME FRED、SPEZYMEXTRA和GZYME G997。
在另一个实施方式中，本发明包括加入第二种植酸酶。本部分关于植酸酶讨论的任何植酸酶都可以使用。
纤维素酶也可掺入α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。纤维素酶是水解纤维素(β-1，4-D-糖苷键)和/或其衍生物(例如磷酸溶胀纤维素)的酶组合物。纤维素酶包括外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)(EC3.2.191，EC3.2.1.4和EC3.2.1.21)。纤维素酶的实例包括来自青霉属，木霉属，腐质霉属，镰孢属，热单孢菌属(Thermomonospora)，纤维单胞菌属(Cellulomonas)，梭菌属(Clostridium)和曲霉属的纤维素酶.。应用于饲料的可商购的纤维素酶是β-葡聚糖酶，如ROVABIO(Adisseo)，NATUGRAIN(BASF)，MULTIFECT BGL(Danisco US，Inc，GenencorDivision)和ECONASE(AB Enzymes)。
木聚糖酶也可包括在内。水解木聚糖主链的木聚糖酶(如内切-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)可来自细菌，如芽孢杆菌属，链霉菌属(Streptomyces)，梭菌属，热酸菌属(Acidothermus)，小四孢菌属(Microtetrapsora)或热单胞菌属(Thermonospora)。此外木聚糖酶可来自真菌，如曲霉属、木霉属、脉孢霉属、腐质霉属、青霉属或镰孢属(参见例如EP473545；USP 5,612,055；WO 92/06209；和WO 97/20920)。商业制剂包括MULTIFECT和FEEDTREAT Y5(Danisco US，Inc，Genencor Division)，RONOZYME WX(Novozymes A/S)和NATUGRAIN WHEAT(BASF)。
蛋白酶也可包括在内。蛋白酶可来自芽孢杆菌，例如解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。这些蛋白酶源包括枯草杆菌蛋白酶，例如获自解淀粉芽孢杆菌和其突变体(USP 4,760,025)的枯草杆菌蛋白酶。适合的商业蛋白酶包括MULTIFECT P 3000(Danisco US，Inc，Genencor Division)和SUMIZYME FP(Shin Nihon)。蛋白酶也可以来自真菌，例如木霉属(例如，NSP-24)，曲霉属，腐质霉属和青霉属。
在一些实施方式中，可以包括选自α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、和木聚糖酶的两种或更多酶的组合。
酸性真菌蛋白酶(AFP)也可以包括在本发明的酶组合物和酶混合物中。真菌蛋白酶包括例如，获自曲霉属，木霉属，毛霉属和根霉属的蛋白酶，例如获自黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米黑毛霉(M.miehei)(本发明有用的一种AFP参见例如美国申请号11/312,290，2005年12月20日提交)。
使用方法
本发明的方法涉及在淀粉转化工艺的液化中使用本发明的植酸酶和α-淀粉酶，导致可以在较低的pH值下进行的工艺。在一些实施方式中，该方法不再需要加入酸或碱来调节pH值。在一些实施方式中，该方法包括初次液化步骤和二次液化步骤。在一些实施方式中，该方法也包括不使用α-淀粉酶的预处理步骤。这样，预处理步骤可以使用或不使用α-淀粉酶，但当包括α-淀粉酶时，该步骤也可称为初次液化步骤。在一些实施方式中，该方法致使生产可发酵的糖。在一些实施方式中，该方法得到乙醇。
本发明有用的底物包括谷物和/或包含颗粒淀粉的植物材料。植物材料可获自的植物，包括但不限于小麦、玉米、黑麦、高粱(蜀黍)、稻、粟、大麦、黑小麦、木薯(树薯)、马铃薯、红薯、甜菜、甘蔗和诸如大豆和豌豆的豆类。本发明可用的植物材料包括玉米、大麦、小麦、稻、高粱和上述的组合。植物材料可包括杂交变种和遗传修饰变种(如包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物的任何部分都可用于提供底物，包括但不限于植物部分，例如叶、茎、外皮、外壳、块茎、玉米穗轴、谷粒等等。在一些实施方式中，可以使用基本上整个植株，例如，可使用完整玉米秸秆。在一些实施方式中，完整谷粒可用作颗粒淀粉的来源。完整谷粒包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱、及上述的组合。在其它实施方式中，颗粒淀粉可获自分级分离的谷类颗粒，包括纤维、胚乳和/或胚芽成分。对诸如玉米和小麦的植物材料的分级分离方法为本领域所公知。在一些实施方式中，不同来源的植物材料可混合在一起以得到本发明方法中用到的底物(如玉米和蜀黍或玉米和大麦)。
在一些实施方式中，植物材料通过粉碎等方式制备。本发明的方法优选使用两种普遍的粉碎工艺，包括湿粉碎和干粉碎。例如在干粉碎中，粉碎完整谷物并用于该方法。在湿粉碎中谷物被分离(例如分离胚芽与粗粉)。特别的，粉碎完整谷物的方法是熟知的，包括使用锤磨机和滚筒式磨。粉碎的方法为本领域所熟知，参考THE ALCOHOL TEXTBOOK：AREFERENCE FOR THE BEVERAGE，FUEL AND INDUSTRIALALCOHOL INDUSTRIES 3rd ED.K.A.Jacques et al.，Eds，(1999)Nottingham University Press.参见，第2、4章。
在一些实施方式中，植物材料无论通过粉碎还是其它方式降低粒度，都将与溶液组合，形成包含淀粉底物的浆液。在一些实施方式中，该浆液可以包括来自淀粉处理的测流，例如回流物。在一些实施方式中，该浆液将包含15-55％ds(如20-50％，25-45％，25-40％，和20-35％ds)。
在一些实施方式中，可将本发明的植酸酶和α-淀粉酶的组合加入粉碎的淀粉底物(如粉碎谷物)浆液中。在一些实施方式中，浆液的pH值范围保持在约4.0到低于约6.5，也可是约4.0到低于约6.2，也可是约4.5到低于约6.0，优选约5.0到约6.0(如约5.4到约5.8)的pH范围，浆液中的粉碎颗粒淀粉可与酶组合物接触2分钟到8小时时间(如5分钟到6小时，5分钟到4小时和30分钟到4小时)，以获得液化淀粉。在一些实施方式中，温度范围在40到115℃。在一些实施方式中，温度范围在40到110℃；也可是50到110℃；也可是60到110℃；也可是60到100℃；也可是70到95℃。
在一些实施方式中，植酸酶以足够允许该方法在较低pH值下发生的量加入浆液中，pH值甚至低到浆液不用加入酸或碱的pH。在一些实施方式中，植酸酶将植酸水平降低到足够增加α-淀粉酶的热稳定性的程度。在一些实施方式中，IP6植酸含量降低。IP6被定义为含有6个磷酸基团的肌醇。IP6通常具有不同量的衍生物，每种具有1到5个磷酸基(IP5-IP1)。
在一些实施方式中，植酸酶以足以增加α-淀粉酶的热稳定性的量和时间加入。在一些实施方式中，植酸酶以足以允许在α-淀粉酶存在下于较低的pH值水解淀粉的量加入。在一些实施方式中，植酸酶以足以在较低的pH值下增加α-淀粉酶的热稳定性的量加入。可以理解的是，即使该方法包括了pH调节，植酸酶也使得α-淀粉酶的热稳定性增加，尤其是在与没有植酸酶时其依旧稳定的pH相比更低的pH值下。
所属领域技术人员将可以容易的决定用于本发明方法的布丘氏菌植酸酶和α-淀粉酶有效剂量。淀粉液化的最佳使用水平取决于诸如植物材料的种类、粘度、处理时间、pH、温度和ds等处理参数。作为总的指导，在一些实施方式中，液化方法中使用的植酸酶量(剂量)的范围在约0.001到约50FTU/gds，在一些实施方式中是约0.01到约5.0FTU/gds；备选地约0.05到约10FTU/gds，也可是约0.10到约5.0FTU/gds。
在一些实施方式中，α-淀粉酶的量是为本领域技术人员所熟知的有效量的α-淀粉酶。在一些实施方式中，该范围是约0.05到约50AAU/gds，也可是约0.1到约20AAU/gds，也可是约1.0到约10AAU/gds。在一些实施方式中，α-淀粉酶的范围是约0.5到约100LU/gds，约1.0到约50LU/gds，和约5.0到约25LU/gds LU。在进一步的实施方式中，α-淀粉酶剂量范围是约0.01到约10.0kg公吨(MT)ds；约0.05到约5.0kg/MT ds；和约0.1到约4.0kg/MT ds。
在本发明的范围内也考虑到对包含诸如颗粒淀粉底物(如粉碎谷物)的底物的浆液采用预处理(温育)步骤。
温育步骤包括使包含淀粉底物(如粉碎谷物)的浆液与根据本发明的植酸酶及任选地一种α-淀粉酶在颗粒淀粉的淀粉胶化温度以下0到30℃的温度下相接触。该温度可以是淀粉胶化温度以下0到25℃，0到20℃，0到15℃和0到10℃。该具体值根据浆液包含的颗粒淀粉的类型而不同。例如，玉米的淀粉胶化温度通常高于黑麦或小麦的淀粉胶化温度。在一些实施方式中，温度在45到80℃之间，50到75℃之间，也可是50到72℃之间，并在一些实施方式中，温度低于68℃；低于65℃，低于62℃，低于60℃，也可以是低于55℃。在其它实施方式中，温度将在40℃以上，45℃以上，50℃以上，和55℃以上。在一些实施方式中，温育温度在约58到约72℃之间和约60到约68℃之间。温育可在pH约4.0到约6.5，pH约4.0到约6.0，和pH约5.0到约6.0范围内进行约2分钟到约5小时(如约5分钟到约3小时；约15分钟到约2.5小时和约30分钟到约2小时)。在一些实施方式中，温育步骤包括加入植酸酶而不加α-淀粉酶。在其它实施方式中，植酸酶和α-淀粉酶在温育步骤中作为混合物加入或顺序加入。
在随后的步骤中，温育的底物通过使其升温而被液化，例如在淀粉胶化温度以上0到55℃，(如65℃到120℃，70℃到110℃，70℃to 90℃)进行2分钟到8小时时间(如2分钟到6小时，5分钟到4小时和优选的1小时到2小时)，pH在约4.0到约6.5。
在一些实施方式中，热稳定α-淀粉酶在此步骤加入，但在其它实施方式中，不加入α-淀粉酶。在一些实施方式中，温育和升温步骤在基本相同的pH范围下进行(如pH约4.5到约6.0或pH约5.0到约6.0)。
在一些实施方式中，包括将包含颗粒淀粉的底物与根据本发明的植酸酶在低于胶化温度的温度下相接触的温育步骤将增强升温步骤中α-淀粉酶的稳定性。在一些实施方式中，α-淀粉酶稳定性的增强在pH约5.8到约5.2范围内。
该方法进一步包括用糖化酶(如OPTIDEX L-400，OPTIMAX 4060VHP，FERMENZYME L-400，DISTILLASE，GZYME 480(Danisco US，Inc.Genencor Division)对液化底物进行糖化以获得糊精；并可包括糊精。这些方法为本领域所熟知，包括加入诸如葡糖淀粉酶的糖化酶和可选的其它次要酶。
糖化过程可持续12到120小时。但是，通常进行30分钟到2小时的预-糖化并随后在发酵中完成糖化。有时这被称为同时糖化和发酵(SSF)。糖化通常在30到65℃的温度和典型的pH 4.0到5.0下进行。
作为糖化酶使用的葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3.)可以是本领域技术人员熟知的以及此处所讨论的任何葡糖淀粉酶，例如在″次要酶″部分中提到的。
在一些实施方式中，本发明包括降低包含淀粉的浆液的粘度的方法，包括将包含颗粒淀粉(如磨碎谷物)的底物浆液与本发明涵盖的植酸酶一起温育15分钟到4小时，pH在约5.0到约6.0，温度在55到68℃。在一些实施方式中，温育步骤后，浆液温度升高到70到90℃间。升温后得到的液化物的粘度与未和本发明的植酸酶共同温育的相应液化物相比降低。在一些实施方式中，由于这种粘度降低，将降低淀粉水解方法中使用的α-淀粉酶的量。例如当α-淀粉酶与本发明的植酸酶组合时，在相同条件下在相同pH(例如约pH 5.5到约6.0)下获得相同水平粘度需要的α-淀粉酶的剂量可减少约20％，30％，40％，50％，或60％。
在一些实施方式中，该方法包括使用布丘氏菌植酸酶或其变体和α-淀粉酶组合物或混合物，产生一种高葡萄糖产品。在一些实施方式中，液化和糖化产生的葡萄糖产量(葡萄糖占总的水解并溶解的干固体的百分比)是至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％和至少95％。
在一些实施方式中，产生的葡萄糖可进一步用于产生果糖或高纯度葡萄糖。在本发明的一些实施方式中，葡萄糖可通过本领域熟知的方法从处理的醪液中分离，例如通过离心、膜分离和常规的过滤方法。葡萄糖可用本领域熟知的方法通过酶转化为果糖糖浆。
在一些实施方式中，该方法进一步包括使用糊精(如葡萄糖)在合适的发酵条件下作为微生物发酵的发酵原料以获得终产物，例如醇(如乙醇)、有机酸(如琥珀酸、乳酸)、糖醇(如甘油)、抗坏血酸中间体(如葡糖酸、DKG、KLG)、氨基酸(如赖氨酸)和蛋白质(如抗体及其片段)。
发酵使用的生物取决于期望的终产物。典型的，如果期望的终产物是乙醇，用酵母作为发酵生物。在一些实施方式中，产乙醇微生物是酵母，特别是酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株(USP4,316,956)。许多种酿酒酵母都可以商购，包括但不限于FALI(Fleischmann′s Yeast)，SUPERSTART(Alltech)，FERMIOL(DSMSpecialties)，RED STAR(Lesaffre)和安琪乙醇酵母(Angel Yeast Company，China)。本方法使用的起始酵母的量足以在一个合适的时间量内有效产生商业重要量的乙醇(例如由具有25到40％DS的底物在72小时内产生至少10％的乙醇)。酵母细胞的提供量通常是104到1012，优选107到1010个活酵母菌数/ml发酵液。发酵可包括，除发酵微生物(如酵母)外，营养、酸和/或其它酶、包括但不限于植酸酶。
发酵中酵母的使用是熟知的，参考THE ALCOHOL TEXTBOOK，K.JACQUES ET AL.，EDS.1999，NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS，UK。在一些实施方式中，按本发明的方法生产的乙醇的量是至少8％，至少10％，至少12％，至少14％，至少15％，至少16％，至少17％，至少18％，至少20％和至少22％(v/v)。
任选的，发酵后，醇(如乙醇)可通过诸如蒸馏的方式提取。乙醇可用于燃料、可携带的或工业乙醇。
在一些实施方式中，本发明包括的植酸酶组合物在淀粉水解中的使用可降低发酵液的植酸含量、细釜馏物的植酸含量和/或发酵副产物的植酸含量，副产物例如酒糟干颗粒(DDG)；可溶性酒糟干颗粒(DDGS)；酒糟湿颗粒(DWG)和可溶性酒糟湿颗粒(DWGS)。在一些实施方式中，与不使用植酸酶的基本相同的方法相比，本发明的方法(包括但不限于例如温育30到60分钟)可以降低所得发酵滤液的植酸含量至少60％，65％，70％，75％，80％，85％和90％和更多。在一些实施方式中，和与所要求保护方法基本相同但不用本发明的植酸酶的相应方法得到的DDGS中的植酸含量相比，本发明的DDGS中发现的植酸量可被降低至少50％，至少70％，至少80％和至少90％。例如，虽然DDGS的商业样品中植酸百分含量可以不同，植酸百分含量的通常范围可以是约1％到约3％或更高。在一些实施方式中，由本方法得到的DDGS的植酸百分含量是低于1.0％，低于0.8％，低于0.5％和低于0.3％。在一些实施方式中，和与所要求方法基本相同但不用本发明的植酸酶的相应方法得到细釜馏物中的植酸含量相比，在本发明的细釜馏物中发现的植酸量可降低至少50％，至少70％，至少80％和至少90％。
在工业乙醇方法中，乙醇可由滤液蒸馏得到，导致形成细釜馏物部分，细釜馏物部分可以被并且经常被回收到发酵流(回流物)中。和与所要求方法基本相同但不用本发明的植酸酶的相应方法得到细釜馏物中的植酸含量相比，本发明可产生含有更少植酸的细釜馏物。例如，在具有约8％ds的细釜馏物中的植酸含量(ppm)在2500到3000ppm范围内。在本发明的一些实施方式中，当底物根据此处包括的方法处理时，细釜馏物中的植酸含量低于2000ppm，低于1000ppm，低于500ppm，低于100ppm和低于50ppm。
实验
本发明在下列实施例中进一步详述，这些实施例并非意图以任何方式限制本发明所要求保护的范围。附图意味着被当作本发明说明书的整体部分。所有引用的参考文献都作为全部描述内容的参考引入本发明。提供下述实施例用以举例说明，并非对本发明的限制。
在随后的公开和实验部分，应用下述缩写：wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔的)；mM(毫摩的)；μM(微摩的)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；ds(干固体)；DO(溶解氧)；W/V(质量体积比)；W/W(质量比)；V/V(体积比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，Palo Alto，CA)；IKA(IKA Works Inc.2635 NorthChase Parkway SE，Wilmington，NC)；Genencor(Danisco US Inc，Genencor Division，Palo Alto，CA)；MT(公吨)；Ncm(牛顿厘米)；ETOH(乙醇)；eq(当量)；N(正常的)；ds或DS(干固体含量)；/g ds(每克干固体)；SAPU(分光光度计蛋白酶单位)。
方法
粘度测量：玻璃锅粘度计LR-2.ST系统IKA用于测定粘度。简单的说，该粘度计由2000ml双壁玻璃容器和一个通过Eurostar Labortechnik电力控制粘度计(Viscoklick粘度计的粘度范围是0-600Ncm)搅拌的锚定混合器组成。大体上，如此处所例举的，含淀粉底物和适量的酶的浆液被倒入粘度计容器。在加热到85℃的过程中记录温度和粘度并继续温育额外的60到120分钟。不时记录以Ncm为单位测量的粘度。
通过高效液相色谱(HPLC)分析碳水化合物和醇：寡糖反应产物的成分通过HPLC测量(Beckman System Gold 32 Karat Fullerton，配有一个HPLC柱的CA(Rezex 8 u8％H，Monosaccharides)，温度保持在50℃，配备一个折射率(RI)检测器(ERC-7515 A RI Detector，Anspec CompanyInc.)。糖类根据分子量进行分离。将单糖命名为DP1，例如葡萄糖；将二糖命名为DP2，例如麦芽糖；将三糖命名为DP3，例如麦芽三糖，命名“DP4+”是聚合度(DP)为4或更大的寡糖。
植酸酶活性(FTU)通过无机磷酸的释放来测定。无机磷酸盐与酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色络合物，该黄色络合物可在415nm波长下用分光光度计测量，并且通过磷酸盐标准曲线定量释放的无机磷酸盐。一单位植酸酶(FTU)是在按照欧洲标准(CEN/TC 327，2005-TC327WI 003270XX)给出的反应条件下，每分钟由植酸释放1微摩尔无机磷酸盐所用的酶量。
植酸含量：通过调节5％的浆液(对于干样品)的pH值到pH 10.0后从样品中提取植酸，随后使用离子交换柱通过HPLC测定。使用NaOH梯度系统从柱上洗脱植酸。通过与标准品比较来计算液体中的植酸含量。
α-淀粉酶活性(AAU)可通过淀粉水解速率测定，反映为分光光度计测量的碘染色能力的下降速率。细菌α-淀粉酶的1AUU活性是在标准条件下每分钟水解10mg淀粉需要的酶量。
α-淀粉酶活性也可以以可溶性淀粉单元(SSU)的形式确定，其基于等份的酶样品在pH4.5、50℃下水解可溶性马铃薯淀粉底物(4％DS)的程度。还原糖含量使用DNS方法测定，如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428所描述。
SPEZYME FRED的α-淀粉酶活性(以Liquifon Units(LU)表示)根据USP 5,958,739中公开的方法测定。简单的说，该测定方法使用对-硝基苯基麦芽糖庚糖苷(p-nitrophenyl maltoheptoside)作为底物，其非还原性末端糖被化学封端。对硝基苯基的释放速率和α-淀粉酶活性成比例并且在410nm下监测释放。针对标准对照计算活性。
葡糖淀粉酶活力单位(GAU)通过用PNPG测定法测量葡糖淀粉酶活性而测定。
实施例
实施例1：SPEZYME XTRA和BP-WT
制备了全玉米粉(36％ds，800g玉米粉)的含水浆液(1.0kgs)。该浆液的pH使用稀H2SO4调节至pH5.8。将该浆液转移到烧瓶中并以2.8AAU/gds的量加入SPEZYME XTRA(Genencor)(以7.2FTU g ds的量加入BP-WT(SEQ ID NO：1)或不加入BP-WT)，或者以5.6AAU/gds的量加入SPEZYME XTRA而不加入植酸酶，所有情况下浆液均在65℃下温育30分钟。
将预热的全玉米粉浆液转移至粘度计(IKA)的保温容器中。持续加热浆液直到85℃随后浆液保持在该温度。随温度的升高测量浆液的粘度(表4)。
表4
Figure G2008800043527D00301
Figure G2008800043527D00311
表4的粘度数据说明在85℃将全玉米粉与标准剂量的SPEZYMEXTRA(5.6AAU/gds)一起温育产生液化物，其粘度稳定在23.8Ncm。相比之下，用一半剂量的SPEZYME XTRA(2.8AAU/g ds)和7.2FTU的BP-WT对全玉米粉进行预处理在85℃可使得液化物的粘度更低。
实施例2：SPEZYME ETHYL和BP-WT
研究了SPEZYME ETHYL在全玉米粉和布丘氏菌植酸酶(BP-WT)一起温育中的作用。实验条件与实施例1的描述相同，pH5.8。此外，在提高温度到85℃之前，全玉米粉的温育在更低的pH下进行(pH 4.5，65℃)。初始时间为0，第一个10分钟每30秒取样，随后每4分钟取样直到62分钟。一些结果总结于表5A，(pH 5.8，65℃温育30分钟)和表5B(pH 4.5，65℃温育30分钟)。
表5A-85℃下全玉米粉(35％ds)和SPEZYME ETHYL温育过程中植酸酶对粘度降低的影响
Figure G2008800043527D00312
Figure G2008800043527D00321
表5B-85℃下全玉米粉(35％ds)和SPEZYME ETHYL温育过程中植酸酶对粘度降低的影响
Figure G2008800043527D00332
Figure G2008800043527D00341
实施例3：SPEZYME FRED和BP-WT
研究了SPEZYME FRED在全玉米粉和布丘氏菌植酸酶(BP-WT)共温育中的作用。在提高温度到85℃之前，实验条件与实施例1的描述相同(pH5.8，65℃温育30分钟)。初始时间为0，第一个10分钟每30秒取样，随后每4分钟取样直到62分钟。结果总结于表6。
表6-85℃下全玉米粉(35％ds)和SPEZYME FRED共温育过程中植酸酶对粘度降低的影响
Figure G2008800043527D00342
Figure G2008800043527D00351
表6显示的结果表明，在pH 5.8，65℃下与植酸酶和SPEZYME FRED共温育30分钟产生的液化物粘度降低。
实施例4：BP-WT存在下的粘度影响
包含36％全玉米粉的浆液的pH值用稀HCL调节到pH 5.8，pH 5.4，pH 5.2或pH 5.0。向浆液中添加SPEZYME XTRA(2.0AAU/g ds)和BP-WT(3.6FTU/g ds)并在65℃下保持30分钟。不与植酸酶一起使用的SPEZYME XTRA(4.0AAU/g ds，pH 5.8)用作对照。在升温至85℃的过程中测量浆液粘度(表7)。
表7
SPEZYMEXTRA(4AAU/gds)pH5.8(Ncms)   SPEZYMEXTRA(2AAU/gds)+BP-WTpH5.8(Ncms)   SPEZYMEXTRA(2AAU/gds)+BP-WTpH5.4(Ncms)   SPEZYMEXTRA(2AAU/gds)+BP-WTpH5.2(Ncms)
  时间(分钟)
  0   7.4   8.4   6.3   7.4
  0.5   9.2   8.5   6.5   9.2
  1.0   12.9   10.0   8.8   12.9
  1.5   26.6   15.4   15.0   26.6
  2.0   40.0   32.5   22.2   40.0
  2.5   48.2   42.4   34.3   48.2
  3.0   50.9   47.9   43.7   50.9
  3.5   54.6   51.1   48.7   54.6
  4.0   58.3   54.1   52.5   58.3
  4.5   60.9   57.1   55.6   60.9
  5.0   61.2   58.4   58.5   61.2
  5.5   58.2   56.5   59.2   58.2
  6.0   54.7   53.3   56.2   54.7
  6.5   51.4   50.1   53.8   51.4
  7.0   48.4   46.7   49.9   48.4
  7.5   45.4   43.3   46.2   45.4
  8.0   41.9   39.9   43.1   41.9
  8.5   38.5   36.5   39.9   38.5
  9.0   36.8   33.9   36.0   36.8
  9.5   34.3   31.5   34.3   34.3
  10   32.6   29.7   31.8   32.6
  14   24.8   21.6   23.6   24.8
  18   22.6   17.9   20.5   22.6
  22   21.2   16.7   18.4   21.2
  26   20.8   14.0   17.6   20.8
  30   20.0   12.7   16.5   20.0
  34   19.5   12.1   15.9   19.5
  38   19.2   11.6   15.7   19.2
  42   19.1   11.0   15.4   19.1
  46   19.2   10.9   15.3   19.2
  50   19.1   10.9   15.3   19.1
  54   18.8   10.7   15.2   18.8
  58   18.6   10.6   15.0   18.6
  62   17.7   10.5   14.9   17.7
表7表明在pH 5.8，5.4和5.2下，使用BP-WT和SPEZYME XTRA(2.0AAU/gds)对浆液粘度的降低与在pH 5.8下使用对照SPEZYME XTRA(4.0AAU/gds)时粘度的降低相当。但是，组合中使用中α-淀粉酶的用量是对照中剂量的一半。pH5.0下的数据未显示。SPEZYME XTRA和BP-WT的组合在测试条件下与对照相比并未降低浆液的粘度。
实施例5：对细釜馏物和DDGS的效果
将全玉米粉浆(36％ds)于65℃下在存在2.0AAU的SPEZYMEXTRA和3.6FTU的布丘氏菌植酸酶-WT的情况下温育30分钟，60分钟或120分钟。条件如在上述实施例1中描述。经过特定的时间后，温度升高到85℃并保持在该温度下60分钟。液化淀粉底物的pH值降低到pH4.2并在酵母发酵条件下进一步评估。液化淀粉的％ds调节到31％ds。加入0.4GAU/gds的FERMENZYMETM L-400并在32℃使用酵母发酵。测定细釜馏物和DDGS的醇终浓度、残留淀粉含量和植酸含量(表8)。
表8
Figure G2008800043527D00381
在表8中观察到，仅30分钟的温育时间即可显著降低产生的发酵滤液的植酸含量。标准对照(不含植酸酶)的滤液测定值为480ppm，相比之下，温育样品的滤液在30分钟时为56ppm且在120分钟为40ppm。
实施例6：由液化淀粉-BP-WT生产葡萄糖
36％ds的全玉米粉浆液在存在SPEZYME XTRA(2.0AAU)和3.6FTU的布丘氏菌植酸酶-WT并与实施例1的描述相同的条件下，于65℃下温育30分钟。30分钟后，温度升高到85℃并继续保持该温度60分钟。液化物的温度降低到60℃且pH调节到pH 4.2。使用H2O将液化淀粉调节为32％和36％ds并使用剂量为0.4Kgs/MTds玉米的OPTIMAXTM 4060VHP在60℃下进行糖化。在60℃温育期间内在不同时间间隔取样，利用HPLC分析葡萄糖产量(表9)。
表9-由液化淀粉生产葡萄糖
  32％ds
  小时   ％葡萄糖   ％DP2   ％DP3   ％DP4
  16   90.5   3.7   1.9   3.9
  24   93.6   3.0   1.8   1.6
  40   94.7   2.9   1.7   0.7
  36％ds
  小时
  16   89.3   3.9   2.0   4.8
  24   94.4   2.8   1.4   1.4
  40   94.5   3.0   1.7   0.7
产生的高葡萄糖产品可用作发酵方法中的原料来生产终产物，包括但不限于醇、有机酸、氨基酸、抗坏血酸中间体、糖醇等等。
实施例7：植酸酶温育对粘度的影响
研究了在不同条件下，在pH5.8，温度65℃下，将包含全玉米粉(36％ds)的浆液和BP-WT(3.6FTU/g ds)温育时，升温到85℃时植酸酶温育对粘度降低的影响。
条件1为对照，其中不加入植酸酶，加入SPEZYME XTRA (4AAU/gds)并温育30分钟；条件2，温育开始时加入BP-WT，温育浆液60分钟。在大约60分钟时，将SPEZYME XTRA(2AAU/gds)加入浆液；条件3，BP-WT和SPEZYME XTR A(2AAU/gds)两者都在60分钟温育开始时加入；条件4，SPEZYME XTRA(2AAU/gds)在温育开始时加入，并温育30分钟。在所有情况下，温育阶段过后温度升高到85℃。随时间测量粘度。
表10-植酸酶温育对DE和淀粉增溶作用(BRIX)的比较
  温育BP-WT+SPEZYMEXTRA   温育仅BP-WT
  时间(分钟)   DE    BRIX   DE    BRIX
  30   9.97    30.7   9.20
  60   10.11   31.3   9.12
  90   10.57   31.4   8.73
  120   10.60   31.6   8.93    31.4
表11
  时间(分钟)   条件1(℃)(Ncms)   条件2(℃)(Ncms)   条件3(℃)(Ncms)   条件4(℃)(Ncms)
  0   65.0   6.0   65.6   7.2   67.0   5.2   65.2   8.6
  0.5   65.5   6.8   66.7   6.9   68.1   2.1   66.6   9.3
  1.0   65.9   10.2   67.6   8.1   69.2   2.6   68.0   12.7
  2.0   68.8   24.9   69.3   28.0   71.1   30.4   70.0   41.0
  3.0   70.5   40.0   70.2   56.2   72.1   58.5   70.9   54.5
  4.0   72.0   45.9   71.7   65.2   73.2   64.9   72.3   63.4
  5.0   73.6   47.6   72.7   73.7   74.2   61.1   72.9   68.1
  6.0   75.3   45.1   74.3   67.5   76.5   54.3   74.3   64.0
  7.0   76.9   39.9   76.1   57.0   78.9   46.0   76.4   58.5
  8.0   78.4   34.2   77.6   49.8   80.0   38.4   79.2   53.0
  9.0   80.2   29.8   80.2   40.8   81.1   33.2   80.4   47.9
  10.0   81.5   27.5   81.1   36.1   82.4   29.6   81.5   44.1
  14.0   84.3   23.9   84.7   25.4   84.2   21.8   84.1   38.5
  22.0   84.1   23.8   84.6   19.7   84.0   17.7   84.0   37.5
  26.0   84.3   23.6   84.5   18.4   84.6   16.5   84.4   37.4
  30.0   84.6   23.9   84.6   17.5   85.3   15.7   84.9   36.5
  34.0   85.0   23.9   84.8   17.0   85.2   15.2   85.3   36.3
  42.0   85.0   23.5   85.0   16.7   84.9   14.8   85.6   35.8
  46.0   85.1   23.5   85.5   16.0   85.1   14.4   85.7   35.6
  50.0   85.3   23.3   85.7   15.9   85.4   14.2   85.8   35.5
  54.0   85.4   23.4   85.6   15.9   85.4   14.2   85.8   35.2
  62.0   85.2   23.5   85.4   15.6   85.3   14.1   85.3   36.2
如表格10和11所示，在约72-74℃的胶化温度下，粘度峰值被更高剂量的SPEZYME XTRA(4AAU/gds相对于2AAU/gds)所降低。但是，使用BP-WT同时加入或不加入SPEZYME XTRA的温育导致85℃下粘度的显著降低，即使在85℃的升温到步骤中也将SPEZYME XTRA的剂量降低50％。
实施例8：α-淀粉酶混合物
在pH5.8，温度65℃下温育36％ds的全玉米粉浆液30分钟。浆液用下列处理之一进行接触，加热并保持在85℃。预处理、升温和保温步骤中每10～30秒测量一次粘度。
处理1-SPEZYME FRED(10LU)+SPEZYME XTRA(2AAU)；
处理2-SPEZYME FRED(5LU)+SPEZYME XTRA(IAAU)+BP-WT(7.6FTU/gds)；
处理3-SPEZYME FRED(2.5LU)+SPEZYME XTRA(2AAU)+BP-WT(7.6FTU/gds)；
处理4-SPEZYME XTRA(2AAU)+BP-Wt(3.6FTU)；
处理5-SPEZYME XTRA(4AAU)。
结果显示于图2。植酸酶的加入延长了α-淀粉酶的稳定性，图2中随时间(X-轴)变化粘度(Ncm)(Y-轴)的持续下降证明了这一点。在粘度峰值(约72到75℃)，SPEZYME XTRA有效降低了粘度，但在更高的温度，SPEZYME FRED、SPEZYME XTRA和BP-WT的组合更好得降低粘度。
实施例9：SPEZYME XTRA和BP-17对粘度的影响
将30％ds的玉米粉浆(pH 5.8)在65℃不加酶预温育10分钟，随后在含有SPEZYME XTRA(2.0AAU/g和4.0AAU/g)不含植酸酶或含有SPEZYME XTRA(2.0AAU/g)+BP-17(7.3FTU/g)的条件下，于65℃温育30分钟。经过30分钟的酶预处理后，温度升高到85℃并使浆液在85℃下继续保持30分钟。如图3所示，当随时间(分钟)变化测量粘度(M(uNM))时，BP-17的加入降低了用来降低浆液粘度需要的α-淀粉酶的量。
实施例10：植酸酶对乙醇产量和DDGS的影响
分析了常规液化方法中植酸酶对乙醇产量和DDGS的影响。经或未经植酸酶处理的液化物被用于在常规酵母发酵中为植酸比较DDGS组成，也比较乙醇产量。使用全玉米粉浆，含有30％(V/V)细釜馏物的32％ds玉米，pH使用稀氢氧化钠调节到pH5.8，以4AAU/gds玉米的量加入SPEZYME XTRA，在70℃下温育30分钟。处理过的浆液随后通过225°F下的中试喷气炉并保持3分钟。胶化的淀粉随后闪喷到大气压中并保持在85℃。再加入剂量为1.5AAU/gds玉米的SPEZYME XTRA以完成液化并再保持90分钟。制备了用植酸酶处理的液化物，在浆液处理过程中以4FTU/gds玉米加入BP-17植酸酶。
随后用稀硫酸将液化物的pH调整到4.2并用于酵母发酵。每个实验中，容器的皮重在配制培养基前测得。将800克的32％DS玉米的液化物放入1L烧瓶中。将10克酵母和1克葡萄糖加入40克水中并温和搅拌1小时，制得红星乙醇红酵母接种物。5mls的酵母接种物被加入平衡的发酵瓶中。加入0.4GAU/gds玉米的G ZymeTM 480乙醇(Genencor-Danisco)以开始同时糖化和发酵。记录初始发酵瓶的毛重并把发酵瓶置于32℃水浴中。进行发酵并在不同的时间间隔测量发酵中的重量损失。由于二氧化碳的失去造成的重量减轻用于计算乙醇产量。发酵结束时得到最终的毛重。发酵液定量转移到5L圆底容器中。进行真空蒸馏，直到含有200mls水的容器中收集到约800mls的蒸馏物。将乙醇稀释到2L并用HPLC分析。干燥前获得釜脚的重量和DS。对DDGS和细釜馏物进行残留淀粉和植酸分析。根据重量损失、蒸馏和残留淀粉分析进行化学当量计算，如下：
以CO2重量损失计算乙醇：
乙醇产量(mmol)＝CO2损失(g)/88
乙醇产量(g)＝(CO2损失(g)/88)＊92＝＞CO2损失(g)＊1.045
乙醇产量(ml)＝((CO2损失(g)/88)＊92)/0.789＝＞CO2损失(g)x1.325
表12：常规液化方法的DDGS和使用SPEZYME XTRA和SPEZYME XTRA-BP-17植酸酶的常规方法的DDGS的比较
液化条件   乙醇产量重量损失   植酸DDGS(％ds)   植酸细釜馏物
  常规方法-SPEZYMEXTRA   2.71加仑/蒲式耳 1.21 480ppm
  常规方法-SPEZYMEXTRA和BP-17植酸酶(PALS方法) 2.69加仑/蒲式耳 0.1-0.2 48ppm
表12的数据显示了DDGS和细釜馏物中植酸含量的主要区别。使用BP-17使DDGS和细釜馏物中的植酸下降大于90％。
实施例11-15中，野生型或变体布丘氏菌植酸酶被直接或作为融合蛋白在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达。在所有情况中都观察到大于10g/L的极强表达水平。
实施例11-野生型布丘氏菌植酸酶作为不含Kex2位点的融合蛋白的 构建和在里氏木霉中的表达
编码野生型布丘氏菌属植酸酶可读框的DNA由GENEART AG(BioPark Josef-Engert-Str.11，D-93053 Regensburg，Germany)合成。为克隆目的引入限制性位点Spel和Ascl(参见表13，SEQ ID NO：4)。植酸酶可读框(SEQ ID NO：4)被插入载体pTrex4的Spel和Ascl位点(参见图4)。使用Bio-Rad(Hercules，CA)的Biolistic PDS-1000/He Particle DeliverySystem将得到的构建体用生物射弹法转化入衍生自里氏木霉的菌株。使用的转化方案如Foreman(WO 2005/001036)所描述。获得稳定转化体后，将这些转化体培养于摇瓶培养基中，以按照Foreman(WO2005/001036)所列出的方法进行布丘氏菌植酸酶蛋白的表达分析。WO2005/001036中的转化和表达分析方案整体作为参考引入此处)。在MM乙酰胺平板上生长数天后，将显示出稳定形态的转化体接种到含有30ml Proflo培养基的250ml摇瓶中。Proflo培养基含有：30g/Lα-乳糖；6.5g/L(NH4)2SO4；2g/LKH2PO4；0.3g/L MgSO4·7H2O；0.2g/L CaCL2；1ml/L 1000X微量元素盐溶液；2ml/L 10％吐温80；22.5g/L Proflo棉子粉(Traders Protein，Memphis，TN)；和0.72g/L CaCO3。在28℃，225rpm下培养2天后，将10％的Proflo培养物转移到含有30ml乳糖确定成分培养基的250ml摇瓶中。乳糖确定成分培养基的成分如下：5g/L(NH4)2SO4；33g/L PIPPS缓冲液；9g/L酪蛋白氨基酸；4.5g/L KH2PO4；1g/L MgSO4·7H2O；5ml/L Mazu DF60-P消泡剂(mazur Chemicals，Gurnee，IL)；1ml/L 1000X微量元素盐溶液；pH 5.5。灭菌后将40ml/L 40％(w/v)的乳糖溶液加入培养基中。乳糖确定成分培养基摇瓶在28℃，225rpm下培养2-3天。将培养上清夜的样品与合适体积的4X NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen Carlsbad，CA)和还原剂混合，使用4-12％NuPAGE预制凝胶以及MOPS电泳缓冲液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。为检测蛋白，用纯蓝染料(Simply Blue Stain)(InvitrogenCarlsbad，CA)对凝胶染色。在染色凝胶上观察到一个具有大约96kDa分子量的蛋白条带。融合蛋白期望的分子量是大约96kDa。发现该蛋白的表达量高于10g/L。
表13：5’末端含有Spel位点、3’末端含有Ascl位点的野生型布丘氏 菌植酸酶的DNA序列
ACTAGTAACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGAGAAGGTCGTCATCCTCAG
CCGCCACGGAGTCCGCGCCCCCACCAAGATGACCCAGACCATGCGCGACGTCACCC
CCAACACCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTACATCACCCCCCGCGGCGAG
CACCTCATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAAGTTCCAGCAGCAGGGCAT
CCTCAGCCAGGGCTCGTGTCCCACCCCCAACAGCATCTATGTCTGGGCCGACGTCGA
CCAGCGCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCCGGCCTCGCCCCCCAGTGCG
GCCTCACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGCCGACCCCCTCTTCCACCCC
GTCAAGGCCGGCACCTGCAGCATGGACAAGACCCAGGTCCAGCAGGCCGTCGAGA
AGGAGGCCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCACTACATCCCCTTCCTCGCC
CTCATGAACACCACCCTCAACTTCAGCACCAGCGCCTGGTGCCAGAAGCACAGCGC
CGACAAGAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAAGCTCAGCATCAAGGACA
ACGGCAACAAGGTCGCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCAGCTCCACCCTCGCCGAG
ATCTTCCTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCTGCCTGGGGCAACATCCAC
AGCGAGCAGGAGTGGGCCAGCCTCCTCAAGCTCCACAACGTCCAGTTCGACCTCAT
GGCCCGCACCCCCTACATCGCCCGCCACAACGGCACCCCCCTCCTCCAGGCCATCA
GCAACGCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCCCGACATCAGCCCCGAC
AACAAGATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCGCCAACATCGCCGGCAT
GCTCAACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAACACCCCCCCCGGCGGCG
CTCTCGTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGCAAGCAATATGTCTCTGTCAGCA
TGGTCTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCCCCCTCAGCCTCAACCAG
CCCGCCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAACGACCAGACCGCCGAGGG
CTACTGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCAGAGCGTCGAGCCCGGCTG
CCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC(SEQ ID NO：4)
实施例12-野生型布丘氏菌植酸酶作为含有Kex2位点的融合蛋白的 构建和在里氏木霉中的表达
通过聚合酶链反应(PCR)，使用GENEART合成的DNA作为模板(参见表13，SEQ ID NO：4)，扩增野生型布丘氏菌植酸酶的可读框。使用的PCR仪是Peltier热循环仪PTC-200(MJ Research)。PCR中使用的DNA聚合酶是HERculase(Stratagene)。用于扩增植酸酶可读框的引物是引物SK667(正向)5′CACTACTAGTGTCGCTGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAG-3′(SEQ ID NO：6)，和引物SK664 5′GAGTTCGGCGCGCCTTACTGGA-3′(SEQ ID NO：7)。正向引物包含氨基酸序列VAVEKR(SEQ ID NO：8)，用于Kex2蛋白酶的高效切割，也含有用于克隆目的的Spel位点。扩增野生型布丘氏菌植酸酶可读框的PCR条件如下：步骤1：94℃1分钟。步骤2：94℃30sec。步骤3：58℃30sec。步骤4：72℃1分钟。步骤2、3和4再重复24个循环。步骤5：72℃5分钟。步骤6：4℃下保藏。使用Qiaquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，并用限制性酶Spel和Ascl(Roche)进行消化。使用QiaquickPCR纯化试剂盒纯化消化的DNA，并连接到pTrex4载体的Spel和Ascl位点中(见图4)。将连接反应产物转化到TOP 10化学感受态大肠杆菌(E.coli)细胞(Invitrogen)中。使用Bio-Rad(Hercules，CA)的BiolisticPDS-1000/He Particle Delivery System，将产生的构建体转化到衍生自里氏木霉的菌株中。使用的转化方案由Foreman所描述(WO 2005/001036)。当获得稳定转化体后，使这些转化体生长，如实施例11所描述的鉴定蛋白表达。在染色凝胶上观察到一个具有大约96kDa分子量的蛋白条带。融合蛋白期望的分子量是大约96kDa。该蛋白的表达量高于10g/L。
实施例13-野生型布丘氏菌植酸酶作为直接构建体的构建和在里氏木 霉中的表达
通过聚合酶链反应(PCR)，使用GENEART合成的DNA作为模板(参见表13，SEQ ID NO：4)，扩增野生型布丘氏菌植酸酶的可读框。使用的PCR仪是Peltier热循环仪PTC-200(MJ Research)。PCR中使用的DNA聚合酶是HERculase(Stratagene)。用于扩增植酸酶可读框的引物是引物SK680(正向)5′CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCC GCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-3′(SEQID NO：9)，和引物SK65′CCTTACTGGAGCTGGCAG-3′(SEQ IDNO：10)。正向引物在5’末端包含额外的4个核苷酸(序列-CACC)，其是克隆入pENTRY/D-TOPO载体(Invitrogen)所需要的。扩增野生型布丘氏菌植酸酶可读框的PCR条件如下：步骤1：94℃维持1分钟。步骤2：94℃维持30sec。步骤3：58℃维持30sec。步骤4：72℃维持1分钟。步骤2、3和4再重复24个循环。步骤5：72℃维持5分钟。步骤6：4℃下保藏。使用Qiaquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。将PCR产物首先克隆入pENTRY/D TOPO载体(Invitrogen)，随后转化入TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)。使用LR克隆酶II(Invitrogen)根据制造商的说明书，将含有正确植酸酶可读框序列的pENTR/D-TOPO载体与pTrex3g载体重组(见图5)。转化产生的构建体，按照实施例11描述鉴定蛋白质。在染色凝胶上观察到一个具有大约46kDa分子量的蛋白条带。融合蛋白期望的分子量是大约46kDa。该蛋白的表达量高于10g/L。
实施例14：BP-17变体布丘氏菌植酸酶作为含有Kex2位点的融合蛋 白的构建和在里氏木霉中的表达
编码BP-17变体布丘氏菌植酸酶可读框的DNA由GENEARTAG(BioPark Josef-Engert-Str.11，D-93053 Regensburg，Germany)合成(见表14，SEQ ID NO：5)。其含有氨基酸序列VAVEKR(SEQ ID NO：8)，以便于Kex2蛋白酶切割融合蛋白，也含有用于克隆目的的限制性位点SpeI和AscI。将植酸酶可读框插入载体pTrex4的Spel和Ascl位点(见图4)。转化产生的构建体，按照实施例11的描述鉴定蛋白。在染色凝胶上观察到一个具有大约96kDa分子量的蛋白条带。融合蛋白期望的分子量是大约96kDa。发现该蛋白的表达量高于10g/L。
表14：5’末端含有Spel位点、3’末端含有Ascl位点的布丘氏菌植酸 酶的BP-17变体的DNA序列
ACTAGTGTCGCCGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGA
GAAGGTCGTCATCCTCAGCCGCCACGGCGTCCGCGCCCCTACCAAGATGACCCAGA
CCATGCGCGACGTCACCCCCAACACCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTAC
ATCACCCCTCGCGGCGAGCACCTCATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAA
GTTCCAGCAGCAGGGCATCCTCAGCCAGGGCTCGTGCCCCACCCCCAACAGCATCT
ACGTCTGGACCGACGTCGCCCAGCGCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCC
GGCCTCGCCCCCCAGTGCGGCCTCACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGC
CGACCCCCTCTTCCACCCCGTCAAGGCCGGCATCTGCAGCATGGACAAGACCCAGG
TCCAGCAGGCCGTCGAGAAGGAGGCCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCAC
TACATCCCCAGCCTCGCCCTCATGAACACCACCCTCAACTTCAGCAAGAGCCCCTGG
TGCCAGAAGCACAGCGCCGACAAGAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAA
GCTCAGCATCAAGGACAACGGCAACGAGGTCTCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCA
GCTCCACCCTCGCCGAGATCTTCCTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCCG
CCTGGGGCAACATCCACAGCGAGCAGGAGTGGGCCCTCCTCCTCAAGCTCCACAAC
GTCTACTTCGACCTCATGGAGCGCACCCCCTACATCGCCCGCCACAAGGGCACCCCC
CTCCTCCAGGCCATCAGCAACGCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCC
CGACATCAGCCCCGACAACAAGATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCG
CCAACATCGCCGGCATGCTCAACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAAC
ACCCCCCCTGGCGGCGCTCTCGTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGCAAGCA
GTACGTCAGCGTCAGCATGGTCTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCC
CCCTCAGCCTCAACCAGCCTGCCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAAC
GACCAGACCGCCGAGGGCTACTGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCA
GAGCGTCGAGCCCGGCTGCCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC(SEQ ID NO：5).
实施例15-BP-17变体布丘氏菌植酸酶的构建和作为直接构建体在里 氏木霉中的表达
通过聚合酶链反应(PCR)，使用GENEART合成的DNA作为模板(参见表14，SEQ ID NO：5)，扩增BP-17变体布丘氏菌植酸酶的可读框。使用的PCR仪是Peltier热循环仪PTC-200(MJ Research)。PCR中使用的DNA聚合酶是HERculase(Stratagene)。用于扩增植酸酶可读框的引物是引物SK680(正向)5′CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-3’(SEQID NO：9)，和引物SK6 5’CCTTACTGGAGCTGGCAG-3′(SEQ IDNO：10)。正向引物在5’末端包含额外的4个核苷酸(序列-CACC)，其是克隆入pENTRY/D-TOPO载体(Invitrogen)所需要的。扩增野生型布丘氏菌植酸酶可读框的PCR条件如下：步骤1：94℃维持1分钟。步骤2：94℃维持30sec。步骤3：58℃维持30sec。步骤4：72℃维持1分钟。步骤2、3和4再重复24个循环。步骤5：72℃维持5分钟。步骤6：4℃下保藏。使用Qiaquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。将纯化的PCR产物首先克隆入pENTRY/D TOPO载体(Invitrogen)，随后转化入TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)。使用LR克隆酶II(Invitrogen)根据制造商的说明书，将含有正确植酸酶可读框序列的pENTR/D-TOPO载体与pTrex3g载体重组(见图5)。转化产生的构建体，按照实施例11的描述鉴定蛋白表达。通过纯蓝染色分析观察到一个具有大约46kDa分子量的蛋白条带。在染色凝胶上观察到一个具有大约46kDa分子量的蛋白条带。融合蛋白期望的分子量是大约46kDa。发现该蛋白的表达量高于10g/L。
实施例16-20提供更多数据显示了α-淀粉酶和布丘氏菌植酸酶的组合降低了对α-淀粉酶的抑制并使乙醇发酵在更低的pH值下、甚至在不加入碱或酸的情况下进行。
实施例16：消除植酸抑制对α-淀粉酶热稳定性的影响
将全玉米粉含水浆液(包含50％细釜馏物的32-40％ds玉米)于pH5.8，70℃下温育。一种热稳定性植酸酶(BP-17)和两种来自Danisco USInc，Genencor Division的液化热稳定性α-淀粉酶SPEZYMETM XTRA和SPEZYMETM ETHYL在本研究中用于比较。
将全玉米粉(Badger State Ethanol，Monroe，WI)与含水的50％(WV)细釜馏物混合达到32％ds终浓度。玉米固体在夹层锅中制备。浆液随后混合好并使用碳酸钠或氢氧化钠调整pH值到pH5.8，这是商业乙醇方法的典型液化pH值。该浆液在夹层锅中混合并将温度提高到65-70℃的预处理温度。在到达70℃前，加入液化酶SPEZYMETM XTRA(10AAU每克ds玉米)或来自嗜热脂肪芽孢杆菌的遗传修饰的α-淀粉酶(SPEZYMETMETHYL，产自Danisco US Inc，Genencor Division)，启动计时器以开始初次液化步骤(1°液化，见图1)。在存在这些酶并加入或不加入BP-17植酸酶(12FTU每克ds玉米)的条件下温育浆液40分钟。预处理的浆液随后通过已用蒸汽或水预热到所期望温度的喷射式蒸煮锅(180-225°F)。浆液通过喷射器以约4升/分钟的最大速度(设定1.5)送出。使用保持线圈的前三圈产生恰好3分钟的保持时间。所有水被转移且期望温度保持稳定后，收集等分的溶解的玉米糊并置于第二个浴(顶部搅拌)中保持85℃，以开始二次液化步骤(2°液化)。在0，30，60和90分钟取样检测粘度(用Brookfield的方法)、白利糖度和DE(用Schoorls的方法)。结果总结于表15。
表15显示了对于通过喷射蒸煮条件(225°F)后的全玉米粉来说，初次液化条件对不同α-淀粉酶热稳定性的影响的比较。初次液化条件是：32％全玉米粉(水中的)浆液，pH调节到pH5.8，于存在不同酶的条件下，70℃温育40分钟。喷射蒸煮条件是225°F维持3分钟。
表15：
  酶处理  1°液化中的植酸酶(BP-17)   时间@85℃DE粘度，CPS
  SPEZYMETMXTRA10AAU/g ds.玉米，32％ds玉米浆，含50％细釜馏物，pH5.8  无   0       9.56  684030分钟  9.41  990060分钟  9.95  988090分钟  9.78  9800
  SPEZYMETMETHYL 10AAU/gds.玉米，32％ds玉米浆，含50％细釜馏物，pH5.8   无   0       7.55  506030分钟  7.88  434060分钟  8.15  424090分钟  8.44  3750
  SPEZYMETMXTRA 10AAU/gds.玉米+12FTU，BP-17植酸酶/g ds玉米，pH5.8   有   0       11.04  106030分钟  15.73  70060分钟  16.84  75090分钟  17.9   750
在初次液化过程中加入BP-17植酸酶使全玉米粉的植酸酶含量从0.60％ds玉米降低到0.09％ds玉米(降低＞85％)。表15中的数据显示，根据DE产生或粘度下降数据，SPEZYMETM XTRA和SPEZYMETMETHYL在225°F的喷射温度下被完全失活。但是，喷射前通过植酸酶消除植酸抑制使得α-淀粉酶的热稳定性有显著增加，如二次液化步骤中85℃下DE发展和粘度下降的数据所示。结果显示了植酸抑制α-淀粉酶并且抑制的消除增加了液化热稳定性α-淀粉酶的热稳定性和/或pH稳定性。
实施例17：消除植酸抑制对α-淀粉酶pH稳定性的影响
使用50∶50比例的水和细釜馏物将全玉米粉调成32％(ds玉米)的浆液。测量该浆液的pH为pH5.15。在套层釜中使用水和蒸汽将浆液加热到70℃(158°F)。加入液化酶(SPEZYME XTRA和BP-17)，通过70℃保温40分钟预处理浆液。40分钟预处理后，使用大中试喷射器(配备一个M 103水加热器)，将浆液通过保持在225°F的喷射式蒸煮锅并保持3分钟时间。从喷射器收集液化物并置于85℃水浴。不断搅拌液化物并在85℃下保持90分钟。在0，30，60和90分钟收集样品。检测所有样品的白利糖度、DE(使用Schoorls方法)和粘度(Brookfield粘度计，使用spindle 2，速度为20rpms)。也使用SPEZYMETM ETHYL和BP-17植酸酶进行了液化研究。
表16显示了在不调节pH时的全玉米粉液化过程中的DE产生过程和粘度下降。数据显示，如果消除了植酸对α-淀粉酶的抑制作用，SPEZYMETM XTRA或SPEZYMETM ETHYL可被成功的用于pH5.2下全玉米粉的液化方法。
表16：
酶处理   1°液化中的植酸酶(BP-17)(40m 70℃)   ％植酸去除 时间@85℃DE粘度，CPS
  SPEZYMETMXTRA10AAU/g ds.玉米，32％ds玉米   12.8FTU/g ds玉米   0       10.38  362030分钟  12.69  163060分钟  14.69  174090分钟  15.62  2140
  浆，含50％细釜馏物，pH5.15
  SPEZYMETMETHYL 10AAU/gds.玉米，32％ds玉米浆，含50％细釜馏物，pH5.15   12.8FTU/g ds玉米   0       8.38   220030分钟  9.78   128060分钟  11.70  125090分钟  12.54  1290
表15和表16的结果显示，在225°F高温喷射全玉米粉前，SPEZYMETM XTRA和SPEZYMETM ETHYL对植酸抑制的降低可显著增加低pH下活性的稳定性，其如被85℃下DE进展的稳定增加并伴随液化物粘度的下降所证明。
实施例18：单次剂量与分次剂量α-淀粉酶的比较
本实施例阐明了全玉米粉液化方法中，加入单次剂量和分次剂量α-淀粉酶的比较。使用水和细釜馏物(总量的2.8％)将全玉米粉调到40％(ds玉米)。随后使用6N硫酸将浆液pH调节到5.2。在套层釜中使用水和蒸汽将浆液加热到155°F。分别以10AAU/g ds玉米和12.8FTU/g ds玉米的量加入SPEZYME XTRA和BP-17植酸酶。通过155°F下保温40分钟对浆液进行预处理。40分钟预处理后，使用大中试喷射器(配备一个M 103水加热器)将浆液穿过保持在225°F的喷射式蒸煮锅，保持1分钟。从喷射器收集液化物并置于85℃水浴以进行二次液化。进行三个独立的二次液化，1)不另加SPEZYME XTRA，2)另加1AAU/g ds玉米剂量的α-淀粉酶。和3)另加2AAU/g ds玉米的α-淀粉酶剂量。不停搅拌液化物并于85℃保持90分钟。在0，35和60分钟收集样品。检测所有样品的白利糖度、DE(使用Schoorls方法)和粘度(Brookfield粘度计，使用spindle 2，20rpms)表17。
表17是单次剂量(初次液化)和分次剂量(二次液化)SPEZYMETMXTRA的比较
表17：
Figure G2008800043527D00511
Figure G2008800043527D00521
表17的数据显示，由于在初次液化步骤中SPEZYMETM XTRA的稳定化，经过225°F的喷射蒸煮温度后，相当量的SPEZYMETM XTRA活性得以保留。观察到在二次液化步骤中不加入二次剂量的SPEZYMETMXTRA，DE增加并且粘度降低。但是，在二次液化步骤中加入二次剂量的SPEZYMETM XTRA进一步增强了DE进展和粘度降低。
实施例19：对DDGS和乙醇产生的影响
液化物被用作酒精生产中乙醇发酵的发酵原料。使用了来自常规液化方法的液化物#1(32％ds玉米，含有50％细釜馏物)，该方法的初次液化步骤中在pH 5.8下使用SPEZYMETM XTRA而不使用植酸酶。也使用了来自实施例17中的液化物，液化物#2，在初次液化步骤中使用SPEZYMETM XTRA与植酸酶处理且发酵前不调节pH。如常规乙醇方法一样，使用稀硫酸将对照液化物-1的pH调节到4.2，而实施例17中的液化物(液化物#2)不进行进一步的pH调节。来自实施例17的液化物用作本发明方法的不调节pH的测试。在每个实验中制备培养基前测得容器的皮重。用2L瓶取32％DS玉米的液化物(2L)。通过向40克水中加入10克酵母和1克葡萄糖并轻轻搅拌4小时，制备红星乙醇红酵母(RED STAR(Lesaffre)接种物。将每种接种物5mls加入平衡的发酵瓶中，随后加入0.4GAU/g ds玉米的G ZymeTM 480乙醇(Danisco US Inc，GenencorDivision)，以开始同时糖化和发酵。记录初始毛重并将培养瓶置于32℃恒温水浴中。在不同的时间间隔取样并用HPLC分析碳水化合物和乙醇含量。也使用每种液化物1千克进行发酵并在不同时间间隔测量发酵中的重量损失。可依据由二氧化碳损失引起的重量减轻测量乙醇(表18)。在发酵结束时，测得最终的毛重。发酵液定量转移到5L圆底容器中。进行真空蒸馏直到在含有200mls水的容器中收集到约800mls的乙醇。将乙醇稀释到2L并用HPLC分析。在干燥前获得釜脚的重量和DS。对DDGS进行残留淀粉分析。依据重量减轻、蒸馏和残留淀粉分析进行化学当量计算。
以CO2重量减少计算乙醇：
乙醇产量(mmol)＝CO2减少(g)/88
乙醇产量(g)＝(CO2减少(g)/88)＊92＝＞CO2减少(g)＊1.045
乙醇产量(ml)＝((CO2减少(g)/88)＊92)/0.789＝＞CO2减少(g)x1.325
表18：来自常规液化方法的DDGS和来自无pH调节方法的DDGS的比较
  液化条件   乙醇产量重量减轻   DDGS，％ds淀粉  植酸  ％IP6  自由磷酸  硫酸(mg/g ds)
  常规方法-pH5.8(液化物#1)   2.70加仑/蒲式耳   7.25  0.6   100    1.20      1.92
  不调节pH，pH5.2(液化物#2)   2.69加仑/蒲式耳   9.28  0.2   0      1.33      0.23
表格18的数据显示了在两种方法间游离硫酸盐和植酸含量的主要区别。在初次液化中消除植酸对热稳定性α-淀粉酶的抑制使得DDGS中植酸含量降低，游离可用磷酸增加且硫酸减少。因此，该不调节pH的方法使淀粉液化方法中的液化热稳定性α-淀粉酶获得了在低pH下的pH稳定性。

Claims (27)

1、包含植酸酶和α-淀粉酶的混合物的酶组合物，其中植酸酶具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
2、权利要求1的组合物，其中所述植酸酶与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3有至少90％的序列同一性。
3、权利要求1的组合物，其中所述植酸酶与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3有至少95％的序列同一性。
4、权利要求1的组合物，其中所述植酸酶是SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3。
5、权利要求1的组合物，其中所述α-淀粉酶获自芽孢杆菌。
6、权利要求5的组合物，其中所述芽孢杆菌是嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
7、权利要求5的组合物，其中所述α-淀粉酶是获自芽孢杆菌的α-淀粉酶的变体。
8、权利要求6的组合物，其中所述芽孢杆菌是嗜热脂肪芽孢杆菌。
9、权利要求1的组合物，其中该组合物是淀粉水解组合物。
10、权利要求1的组合物，其中所述植酸酶是BP-17且所述α-淀粉酶是XTRA。
11、一种液化淀粉的方法，所述方法包括：
将粉碎谷物的浆液与植酸酶和α-淀粉酶在约pH4.0到约pH6.2之间的pH下相接触，其中所述植酸酶是布丘氏菌属植酸酶或其具有植酸酶活性的变体；和
将浆液在约40到约110℃的温度下反应约5分钟到约8小时以获得液化的淀粉。
12、权利要求11的方法，其中所述粉碎的谷物选自玉米、大麦、小麦、稻、高粱、黑麦、粟和黑小麦。
13、一种液化淀粉的方法，所述方法包括：
a.将含有颗粒淀粉底物的浆液与BP-17植酸酶和α-淀粉酶在低于该颗粒淀粉底物的初始淀粉胶化温度0到约30℃的温度下，在约4.0到约6.2的pH范围内，温育约2分钟到约4小时；
b.将温度升高到初始淀粉胶化温度以上0到约45℃并在约pH4.0到约pH6.2的pH下保持约5分钟到约6小时，并获得液化的淀粉。
14、权利要求13的方法，其进一步包括糖化该液化的淀粉以获得糊精；和回收该糊精。
15、权利要求14的方法，其进一步包括在合适的发酵条件下发酵该糊精以获得终产物。
16、权利要求14的方法，其中所述终产物选自醇、有机酸、糖醇、抗坏血酸中间体、氨基酸和蛋白质。
17、权利要求16的方法，其中所述醇是乙醇。
18、一种降低淀粉液化方法中所需的α-淀粉酶的剂量的方法，包括：
将包含粉碎的谷物的浆液与α-淀粉酶相接触；和
将该浆液与来自布丘氏菌的植酸酶、其具有植酸酶活性的变体和修饰形式相接触。
19、一种降低全磨碎谷物中植酸含量的方法，包括：
将磨碎谷物的浆液与来自布丘氏菌的植酸酶、其具有植酸酶活性的变体和修饰形式相接触。
20、权利要求19的方法，其进一步包括将所述浆液与α-淀粉酶相接触。
21、权利要求20的方法，其中所述α-淀粉酶和植酸酶同时加入。
22、一种生产乙醇的方法，包括：
将包含底物的磨碎谷物浆液与植酸酶和α-淀粉酶在约pH4.0到约pH6.2之间的pH值下相接触，其中所述植酸酶获自布丘氏菌或其变体；和
将该浆液在约40到约110℃的温度下反应约5分钟到约8小时以获得液化的淀粉；
将液化的淀粉与葡糖淀粉酶相接触，使液化的淀粉糖化并产生糊精；和
发酵糊精以生产乙醇。
23、权利要求22的方法，其中所述植物材料是磨碎或粉碎的谷物。
24、权利要求22的方法，其中该方法不包括酸或碱的添加。
25、权利要求22的方法，其中用所述植酸酶处理所述浆液足够长时间以增加α-淀粉酶的热稳定性。
26、权利要求1的方法，其中用所述植酸酶处理所述浆液足够长时间以使淀粉在较低pH下水解。
27、权利要求1的方法，其中用所述植酸酶处理所述浆液足够长时间以减少植酸对α-淀粉酶的抑制。
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