ES2639575T3 - Utilización de glucoamilasa y fitasa de Buttiauxella durante la sacarificación - Google Patents

Abstract

Un método de producción de un alcohol que comprende: a) poner en contacto una suspensión que comprende un sustrato de almidón con al menos una α- amilasa que produce oligosacáridos; b) poner en contacto los oligosacáridos con al menos una glucoamilasa y al menos una fitasa, donde la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5, para producir azúcares fermentescibles; c) fermentar los azúcares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentación para producir alcohol; y opcionalmente d) recuperar el alcohol y/o los residuos desecados y solubles de destilería (DDGS).

Description

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DESCRIPCION

Utilizacion de glucoamilasa y fitasa de Buttiauxella durante la sacarificacion CAMPO TECNICO

[0001] Los metodos descritos se refieren a la utilizacion de glucoamilasa y de una fitasa de especie de Buttiauxella en procesos de conversion de almidon, por ejemplo, para la produccion de DDGS para pienso para animales o en procesos de fermentacion para la produccion de compuestos organicos, tal como etanol.

ANTECEDENTES

[0002] Los metodos de fermentacion industriales utilizan, principalmente, glucosa como materia prima para la produccion de una variedad de productos finales, incluidas las enzimas, las protemas, los aminoacidos, los acidos organicos, los polialcoholes, los medicamentos y otros productos bioqmmicos. En una gran cantidad de aplicaciones, la glucosa se produce a partir de la conversion enzimatica de sustratos que comprenden almidon y celulosa (p. ej., granos molidos de cereal entero). El procesamiento de almidon para producir glucosa por lo general conlleva dos etapas, a saber la licuefaccion del almidon granular y la sacarificacion del almidon licuado para producir glucosa. Otras etapas pueden incluir la purificacion y la isomerizacion, por ejemplo, cuando el producto final deseado es una dextrosa o una fructosa purificada, o la fermentacion y la destilacion, por ejemplo, cuando el producto final deseado es un alcohol (p. ej., etanol).

[0003] La licuefaccion convierte una suspension de granulos de polfmero de almidon en una solucion de dextrinas de longitud de cadena mas corta de viscosidad inferior. La etapa de sacarificacion tambien convierte dichas dextrinas de cadena mas corta en glucosa. Habitualmente, el almidon se licua mediante la exposicion a una temperatura elevada y byconversion enzimatica. Un proceso de licuefaccion enzimatico habitual conlleva la adicion de una alfa (a)-amilasa bacteriana termoestable (p. ej., SPEZYME® FRED o SPEZYME® XTRA (Danisco US, Inc, Genencor Division) o TERMAMYL® SC o TeRmAMYL™ 120L (Novozymes)) a una suspension que comprende un sustrato que incluye almidon granular. El pH se ajusta a entre 5,5 y 6,5 y se eleva la temperatura a mas de 90 °C. En primer lugar, se gelatiniza el almidon y, a continuacion, se expone a las enzimas sacarificantes. Normalmente, la sacarificacion tiene lugar en presencia de enzimas glucoamilasa, tal como glucoamilasa de Aspergillus niger (p. ej., OPTIDEX® L-400 (Danisco US, Inc. Genencor Division)) a un pH mas acido que el que se utiliza en la etapa de licuefaccion. El pH de una etapa de sacarificacion normal se encuentra entre pH 4,0 y 5,0. A continuacion, los azucares resultantes se fermentan para producir los productos finales deseados (es decir, etanol). En el proceso de produccion de etanol, se producen productos derivados y productos residuales, tales como residuos desecados y solubles de destilena (DDGS, por sus siglas en ingles), que se utilizan para pienso. Asimismo, el lfquido resultante del proceso (es decir, la vinaza fina) se recicla mezclandolo con suspension.

[0004] Existe una cantidad de variaciones para la licuefaccion y la sacarificacion de un sustrato de almidon. Por ejemplo, el documento de patente WO 2008/097620 (agosto de 2008) describe metodos para la hidrolisis del almidon con el empleo de una alfa-amilasa y una fitasa. En el documento de patente WO 2008/097619 (agosto de 2008) se describen fitasas espedficas y su utilizacion en la hidrolisis del almidon. Sin embargo, todavfa se necesitan avances en la licuefaccion, sacarificacion y fermentacion del almidon. Shi et al, Aquaculture, 275 (enero de 2008), 70-75, describe fitasas de Buttiauxella, separadas del intestino de la carpa china.

BREVE SUMARIO

[0005] Se describen metodos que conllevan la utilizacion de una glucoamilasa en combinacion con una fitasa en un proceso de conversion de almidon. Dicho proceso puede utilizarse para la produccion de compuestos organicos, tales como etanol, para la produccion de DDGS para pienso para animales, o para ambas. En algunos modos de realizacion, los metodos comprenden la adicion de una mezcla de enzimas que comprende una glucoamilasa y una fitasa a procesos de conversion de almidon durante la fase previa a la sacarificacion, la sacarificacion y/o la sacarificacion/fermentacion combinadas. Dichos metodos ofrecen diversas ventajas en comparacion con la utilizacion de una glucoamilasa solamente.

[0006] La invencion da a conocer un metodo de produccion de un alcohol, que comprende:

(a) poner en contacto una suspension que comprende un sustrato de almidon con al menos una a-amilasa que produce oligosacaridos;

(b) poner en contacto los oligosacaridos con al menos una glucoamilasa y al menos una fitasa, donde la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5, para producir azucares fermentescibles;

(c) fermentar los azucares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentacion para producir alcohol; y opcionalmente

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(d) recuperar el alcohol y/o los DDGS. En algunos modos de realizacion, la temperature puede elevarse por encima de la temperature de gelatinizacion del sustrato de almidon despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b).

[0007] En algunos modos de realizacion, el sustrato de almidon es un grano molido y el grano molido se escoge entre mafz, cebada, trigo, arroz, sorgo, centeno, mijo y/o tritical. En algunos modos de realizacion, la fitasa tiene una alanina en el aminoacido 92 y/o al menos uno de los siguientes aminoacidos: una treonina en la posicion 89, una isoleucina en la posicion 134, una serina en la posicon 164, una lisina en la posicion 176, una prolina en la posicion 178, un acido glutamico en la posicion 207, una serina en la posicion 209, una leucina en la posicion 248, una tirosina en la posicion 256, un acido glutamico en la posicion 261 y una lisina en la posicion 269. En algunos modos de realizacion, la fitasa tiene al menos uno de los siguientes cambios aminoaddicos: A89T, D92A, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E y N269K. En algunos modos de realizacion, la fitasa es Buttiauxella spp. de tipo salvaje, fitasa (BP-WT, por sus siglas en ingles) o una variante seleccionada entre BP-11 y BP-17. En algunos modos de realizacion, la fitasa tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 8.

[0008] En algunos modos de realizacion, el metodo tambien incluye poner en contacto los oligosacaridos con al menos una enzima diferente/adicional seleccionada entre una a-amilasa, una segunda glucoamilasa, una segunda fitasa, una celulasa, una pululanasa, una proteasa y/o una lacasa. El alcohol puede ser etanol.

[0009] La invencion tambien da a conocer un metodo para la reduccion del acido fftico durante la fermentacion de etanol, que comprende:

(a) poner en contacto una suspension que incluye un sustrato de almidon con al menos una a-amilasa para producir un producto de licuefaccion;

(b) poner en contacto el producto de licuefaccion con al menos una glucoamilasa y al menos una fitasa, donde la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a SEQ ID NO: 5 y donde la fitasa tiene una alanina en la posicion 92, en condiciones tales que se producen azucares fermentescibles;

(c) fermentar los azucares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentacion en condiciones tales que se produce etanol y/o DDGS; y opcionalmente

(d) recuperar el etanol y/o los DDGS. En algunos modos de realizacion, el metodo incluye elevar la temperature por encima de la temperatura de licuefaccion para el sustrato de almidon. En algunos modos de realizacion, la puesta en contacto del producto de licuefaccion con al menos una glucoamilasa y al menos una fitasa y la fermentacion de los azucares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentacion se producen simultaneamente.

[0010] En algunos modos de realizacion, la glucoamilasa procede de un hongo filamentoso que se escoge entre Trichoderma, Penicillium, Taleromyces, Aspergillus y/o Humicola. En algunos modos de realizacion, la Trichoderma es Trichoderma reesei. En algunos modos de realizacion, la fitasa es BP-17. En algunos modos de realizacion, los DDGS poseen fitasa activa residual. Los DDGS pueden mezclarse con un pienso. En algunos modos de realizacion, cuando se mezclan los DDGS con granos o pienso para producir un pienso para animales, la fitasa activa reduce el acido fftico en el pienso. En algunos modos de realizacion, el sustrato de almidon es un grano molido, tal como mafz, cebada, mijo, trigo, arroz, sorgo, centeno y/o tritical.

[0011] La invencion tambien da a conocer un metodo de reduccion de acido fftico en DDGS, que comprende:

(a) poner en contacto una suspension que comprende un sustrato de almidon con al menos una a-amilasa para producir un producto de licuefaccion;

(b) poner en contacto el producto de licuefaccion con al menos una glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA) y al menos una fitasa, donde la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a SEQ ID NO: 5 en condiciones tales que se producen azucares fermentescibles;

(c) y fermentar los azucares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentacion para producir etanol y/o DDGS. En algunos modos de realizacion, la puesta en contacto del sustrato de almidon con al menos una glucoamilasa y al menos una fitasa y la fermentacion de los azucares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentacion se producen simultaneamente.

En algunos modos de realizacion, la fitasa tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a la fitasa de SEQ ID NO: 5 y tiene una alanina en el aminoacido 92. En algunos modos de realizacion, la fitasa es Buttiauxella spp. de tipo salvaje, fitasa (BP-WT, por sus siglas en ingles) o una variante seleccionada entre BP- 11 y BP-17.

[0012] Los metodos de la invencion pueden utilizar una unica composicion que comprende una mezcla de una glucoamilasa en combinacion con una fitasa. Dicha mezcla puede anadirse durante las etapas de fase previa a la sacarificacion, sacarificacion y/o sacarificacion/fermentacion combinadas de un proceso de conversion de almidon.

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[0013] A continuacion, se describen con mayor detalle estos y otros aspectos de las presentes composiciones y metodos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0014] En la figura 1, se muestra el contenido de fosforo libre en los DDGS obtenido mediante la utilizacion de una composicion enzimatica que incluye fitasa BP-17 con distintas concentraciones en una fermentacion de levadura de mafz.

BREVE DESCRIPCION DE LOS SECUENCIAS

[0015]

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoacidos de glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA).

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoacidos del dominio catalftico de TrGA correspondiente a los residuos 1-453.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoacidos de la region de enlace de TrGA correspondiente a los residuos 453-491.

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoacidos del dominio de union a almidon de TrGA correspondiente a los residuos 492-599.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoacidos de la secuencia proteica madura de fitasa de Buttiauxella.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoacidos de la secuencia proteica madura de la variante de fitasa de Buttiauxella D92A.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoacidos de la secuencia proteica madura de la variante de fitasa de Buttiauxella BP-11.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoacidos de la secuencia proteica madura de la variante de fitasa de Buttiauxella BP-17.

DESCRIPCION DETALLADA

I. Introduccion

[0016] En el presente documento, se describen composiciones y metodos que se refieren a una mezcla enzimatica que incluye una glucoamilasa en combinacion con al menos una fitasa para su utilizacion en procesos de conversion de almidon, por ejemplo, para la produccion de DDGS para pienso para animales o en procesos de fermentacion para la produccion de compuestos organicos, tales como etanol. Las composiciones y los metodos pueden utilizarse para la reduccion de acido fftico durane la sacarificacion, la fermentacion y/o la fermentacion y la sacarificacion simultaneas (SSF, por sus siglas en ingles), lo que da lugar a una reduccion de acido fftico en los productos o productos derivados de la fermentacion (p. ej., los DDGS y la vinaza fina).

[0017] La fitasa utilizada en los metodos de la invencion tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 5, incluidos al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99% y hasta un 100 %, inclusive. En algunos modos de realizacion, la fitasa incluye ademas una alanina en la posicion 92. En algunos modos de realizacion, la fitasa incluye una alanina en la posicion 92 y, adicionalmente, tiene al menos una de las siguientes caractensticas de secuencia de aminoacidos: una treonina en la posicion 89, una isoleucina en la posicion 134, una serina en la posicon 164, una lisina en la posicion 176, una prolina en la posicion 178, un acido glutamico en la posicion 207, una serina en la posicion 209, una leucina en la posicion 248, una tirosina en la posicion 256, un acido glutamico en la posicion 261 y una lisina en la posicion 269. En algunos modos de realizacion, la fitasa tiene al menos una de las siguientes sustituciones aminoaddicas: A89T, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E y N269K con o sin la sustitucion adicional D92A.

[0018] En algunos modos de realizacion, la glucoamilasa se obtiene a partir de un hongo filamentoso. En modos de realizacion espedficos, la glucoamilasa tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia con respecto a la glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA; SEQ ID NO: 1), incluidos al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99% y hasta un 100 %.

[0019] A continuacion, se describen con mayor detalle estas y otras caractensticas de los presentes metodos.

II. Definiciones

[0020] A menos que se indique lo contrario, los presentes metodos conllevan tecnicas convencionales utilizadas habitualmente en biologfa molecular, ingeniena de protemas, tecnicas de ADN recombinante, microbiologfa, biologfa celular, cultivo de celulas, biologfa transgenica, inmunologfa y purificacion de protemas. Los expertos en la materia conocen dichas tecnicas, que se describen en numerosos textos y obras de referencia. Si bien se ejemplifican metodos y materiales espedficos, pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes.

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A menos que se definan de otra forma, debena otorgarse a todos los terminos tecnicos y cientificos su significado habitual. Por motivos de claridad, se definen los siguientes terminos a continuacion:

Las "alfa amilasas" son a-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas (E.C. 3.2.1.1) que son capaces de escindir o hidrolizar enlaces a-1,4 -glicosfdicos internos en el almidon (p. ej., poKmeros de amilopectina o de amilosa).

[0021] Los terminos "enzima hidrolizante del almidon granular (GSH)" y "enzimas con actividad hidrolizante del almidon granular (GSH)" se refieren a enzimas capaces de hidrolizar almidon en forma granular.

[0022] El termino "equivalente funcional" se refiere a una molecula, por ejemplo, una enzima, que tiene las mismas caractensticas funcionales (tales como actividad enzimatica) de otra molecula. El termino "variante", cuando se utiliza con referencia a una enzima (p. ej., una a-amilasa, una glucoamilasa, una proteasa de acido fungico, una fitasa o similares), se refiere a una enzima derivada de una enzima original pero con una sustitucion, insercion o delecion de uno o mas aminoacidos en comparacion con la enzima original. El termino tambien incluye formas tubridas de la enzima, donde, por ejemplo, la enzima puede tener un extremo C-terminal derivado de una especie de Bacillus (p. ej., B. licheniformis) y un extremo N-terminal derivado de una especie de Bacillus diferente (p. ej., B. stearothermophilus) o viceversa. Una variante puede tener una o mas propiedades alteradas en comparacion con la enzima original, tal como una estabilidad termica aumentada, una estabilidad proteolttica aumentada, una actividad espedfica aumentada, una especificidad de sustrato mas amplia, una actividad mas amplia a lo largo de un rango de pH, una resistencia a la inhibicion (p. ej., sustrato) o combinaciones de las mismas. Una "enzima original" se refiere a una enzima que se utiliza como un punto de comienzo para modificaciones. Una enzima original puede ser una enzima de origen natural o de "tipo salvaje".

[0023] Tal como se entiende en el presente documento, "licuefaccion" o "licuar" se refieren a un proceso mediante el que el almidon se convierte en dextrinas de cadena mas corta y menos viscosas.

[0024] Tal como se entiende en el presente documento, las "dextrinas" se refieren a polfmeros de glucosa de cadena corta (p. ej., de 2 a 10 unidades).

[0025] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "almidon" se refiere a cualquier material formado por los carbohidratos de polisacarido complejos (amilosa y amilopectina) que tienen la formula (C6HioO5)x, donde x es cualquier numero.

[0026] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "almidon granular" significa almidon crudo, es decir, almidon que no se ha sometido a una temperatura en la que se produce la gelatinizacion.

[0027] Tal como se entiende en el presente documento, los terminos "enzima sacarificante" y "glucoamilasa" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a cualquier enzima capaz de catalizar la liberacion de D-glucosa de los extremos no reductores de almidon y de los oligosacaridos y polisacaridos relacionados.

[0028] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "oligosacarido" se refiere a moleculas que tienen de 2 a 10 unidades de monosacaridos unidas mediante enlaces glucosfdicos. Los monosacaridos pueden ser glucosa y/u otros azucares. Los oligosacaridos incluyen dextrinas y almidon.

[0029] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "azucares fermentescibles" se refiere a azucares capaces de fermentarse con un organismo de fermentacion. Los azucares fermentescibles incluyen, pero sin caracter limitativo, oligosacaridos y dextrinas.

[0030] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "dextrosa equivalente" o "DE" se refiere a una norma comun para medir la concentracion de los azucares reductores totales, que se calcula como D-glucosa en peso seco. El almidon granular no hidrolizado tiene una DE que es, fundamentalmente, 0, y la D-glucosa tiene una DE de 100.

[0031] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "contenido total de azucar" se refiere al contenido total de azucar presente en una composicion de almidon. El "contenido total de azucar" puede medirse en diversos momentos o puntos en un proceso.

[0032] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "materia seca" o "ms" se refiere a los solidos totales en una suspension y se expresa como un porcentaje en peso seco.

[0033] Tal como se entiende en el presente documento, "porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de aminoacidos o de nucleotidos se refiere al porcentaje de residuos de aminoacidos o de nucleotidos en una secuencia que son identicos a los residuos de aminoacidos o nucleotidos en otra secuencia, lo que se determina mediante el alineamiento de las secuencias y la introduccion de huecos (gaps), en caso de ser necesario, para conseguir la mejor alineacion posible (es decir, el maximo porcentaje de identidad de secuencia), y sin considerar ninguna sustitucion conservativa en la determinacion de la identidad de secuencia. Se conocen metodos para llevar a cabo el alineamiento de secuencias y determinar la identidad de secuencia

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que pueden llevarse a cabo sin experimentacion indebida para obtener valores definitivos. Se dispone de un numero de algoritmos para alinear secuencias y determinar la identidad de secuencia, incluidos, pero sin caracter limitativo, el algoritmo de alineamiento por homologfa de Needleman et al. (1970) J. Mol Biol. 48:443; el algoritmo de homologfa local de Smith et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; la busqueda de un metodo de similitud de Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; el algoritmo de Smith-Waterman (1997) Meth. Mol. Biol. 70:173-187; los algoritmos de BLASTP, BLASTN, y BLASTX (vease Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). Tambien se dispone de los programas computerizados que utilizan estos algoritmos, incluidos, pero sin caracter limitativo: el software ALIGN o Megalign (DNASTAR), o WU-BLAST-2 (vease, p. ej., Altschul et al. (1996) Meth. Enzym. 266:460-480); o GAP, BESTFIT, BLAST (p. ej., Altschul et al., supra, FASTA y TFASTA, disponibles en el paquete de Genetics Computing Group (GCG), version 8, Madison, Wisconsin, Ee. UU); y CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, EE. UU.

[0034] Los expertos en la materia pueden determinar parametros adecuados para medir el alineamiento, incluidos los algoritmos necesarios para conseguir un alineamiento maximo a lo largo de las secuencias que se comparan. En algunos modos de realizacion, la identidad de secuencia se determina mediante la utilizacion de los parametros por defecto determinados por el programa. En algunos modos de realizacion, la identidad de secuencia puede determinarse mediante el algoritmo de busqueda de homologfa de Smith-Waterman (vease, p. ej., (1997) Meth. Mol. Biol. 70:173-187) implementado en el programa MSPRCH (Oxford Molecular, Accelrys Ltd., Oxford, Inglaterra) mediante la utilizacion de una busqueda de hueco afrn (affine gap) con los los siguientes parametros de busqueda: penalizacion por apertura de hueco (gap open penalty) de 12 y penalizacion por extension de hueco (gap extension penalty) de 1. En algunos modos de realizacion, pueden llevarse a cabo comparaciones de aminoacidos emparejados mediante la utilizacion del programa GAP del paquete de software de analisis de secuencias GCG de Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin, con la matriz de sustitucion de aminoacidos blosum62, con un peso de hueco (gap weight) de 12 y un peso de longitud (length weight) de 2. En algunos modos de realizacion, con respecto a un alineamiento optimo de dos secuencias de aminoacidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoacidos variante puede tener al menos otro residuo de aminoacido mas o al menos un residuo de aminoacido delecionado con respecto a la secuencia de aminoacidos de referencia. El segmento contiguo utilizado para la comparacion con la secuencia de aminoacidos de referencia incluye al menos aproximadametne 20 residuos de aminoacido contiguos y puede incluir al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50 o mas residuos de aminoacido. Las correcciones para el aumento de la identidad de secuencia asociadas a la inclusion de huecos en la secuencia de aminoacidos derivada pueden realizarse mediante la asignacion de penalizaciones de hueco (gap penalties).

[0035] Normalmente, las busquedas de secuencias se llevan a cabo con el programa BLASTN cuando se evalua una secuencia de acido nucleico determinada en relacion con las secuencias de acido nucleico de la base de datos de secuencias de ADN de GENBANK® y de otras bases de datos publicas. Se prefiere el programa BLASTX para buscar secuencias de acido nucleico que se han traducido en todos los marcos de lectura con respecto a las secuencias de aminoacidos de las secuencias de protemas de GENBANK® y otras bases de datos publicas. Tanto BLASTN como BLASTX funcionan, normalmente, con parametros por defecto de una penalizacion por hueco abierto de 11.0 y una penalizacion por hueco extendido de 1.0, y utilizan la matriz BLOSUM-62 (vease, p. ej., Altschul et al. (1997)).

[0036] Los alineamientos de las secuencias seleccionadas se utilizan en la determinacion del % de identidad (un termino que se utiliza de manera intercambiable en el presente documento con respecto al termino % de homologfa) entre dos o mas secuencias. Puede utilizarse el programa CLUSTAL-W en MacVector, version 6.5, que funciona con parametros por defecto, incluidas una penalizacion por hueco abierto de 10.0, una penalizacion por hueco extendido de 0.1, asf como una matriz de similitud BLOSUM 30.

[0037] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "molido" se refiere a material vegetal cuyo tamano se ha reducido, por ejemplo, mediante molienda, trituracion, fraccionamiento o cualquier otro medio de reduccion o de seleccion del tamano de las partfculas. El termino abarca la molienda en seco y la molienda en humedo. La "molienda en humedo" se refiere a la molienda del grano seco entero, mientras que la "molienda en humedo" se refiere al proceso mediante el que, en primer lugar, se pone el grano en remojo (es decir, se empapa) con agua para reblandecer el grano.

[0038] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "gelatinizacion" se refiere a la solubilizacion de una molecula de almidon, por lo general mediante cocido a una temperatura elevada, para formar una suspension viscosa.

[0039] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "temperatura de gelatinizacion" se refiere a la temperatura a la que comienza la gelatinizacion de un sustrato que contiene almidon. En algunos modos de realizacion, se refiere a la temperatura mas baja a la que comienza la gelatinizacion de un sustrato que contiene almidon. La temperatura exacta de gelatinizacion depende de la forma espedfica del almidon presente y puede

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variar en funcion de factores tales como la especie vegetal, las condiciones ambientales, las condiciones de crecimiento y otros parametros.

[0040] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "por debajo de la temperature de gelatinizacion" se refiere a una temperature que es menor que la temperature de gelatinizacion.

[0041] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "suspension" se refiere a una mezcla acuosa que comprende solidos insolubles (p. ej., almidon granular).

[0042] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "fermentacion" se refiere a la descomposicion enzimatica de las sustancias organicas por medio de microorganismos para producir compuestos organicos mas simples. Si bien la fermentacion se produce en condiciones anaerobicas, no se pretende que el termino se limite unicamente a condiciones anaerobicas estrictas, puesto que la fermentacion tambien se produce en presencia de oxfgeno (p. ej., en condiciones microaerofflicas y otras condiciones).

[0043] Tal como se entiende en el presente documento, la frase "sacarificacion y fermentacion simultaneas" o "SSF" se refiere a un proceso en la produccion de un producto final en el que un organismo de fermentacion, tal como un microorganismo de produccion de etanol y al menos una enzima, tal como una enzima sacarificante, se mezclan en la misma etapa del proceso en el mismo recipiente.

[0044] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "vinaza fina" significa la parte del lfquido de la vinaza separada de los solidos (p. ej., mediante tamizado o centrifugacion) que contiene partmulas finas suspendidas y material disuelto. El termino "backset" se utiliza, por lo general, para referirse a la vinaza fina reciclada.

[0045] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "producto final" se refiere a un producto derivado de una fuente de carbono que se convierte enzimaticamente a partir de un sustrato fermentescible. En algunos modos de realizacion, el producto final es un alcohol (p. ej., etanol).

[0046] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "derivado/a/os/as de" abarca los terminos "originado/a/os/as de", "obtenido/a/os/as de", "que se puede obtener de" y "aislado/a/os/as de".

[0047] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "organismo de fermentacion" se refiere a un microorganismo o una celula adecuados para su utilizacion en metodos de fermentacion para producir, de forma directa o indirecta, un producto final. En algunos modos de realizacion, el organismo de fermentacion es eucariota (p. ej., hongos), mientras que en otros es procariota (p. ej., bacterias).

[0048] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "productor de etanol" o "microorganismo de produccion de etanol" se refiere a un organismo de fermentacion capaz de producir etanol a partir de un monosacarido u oligosacarido.

[0049] Tal como se entiende en el presente documento, los terminos "recuperado", “aislado” y “separado” se refieren a una protema, celula, acido nucleico o aminoacido que se elimina de al menos un componente con el que esta asociado de manera natural.

[0050] Tal como se entiende en el presente documento, los terminos "protema" y "polipeptido" se utilizan indistintamente para hacer referencia a una serie de residuos de aminoacidos enlazados mediante enlaces peptfdicos. Se emplean tanto los codigos de una y tres letras convencionales para residuos de aminoacidos. El codigo de tres letras se ajusta a la comision conjunta de nomenclatura bioqmmica (JBCN, por sus siglas en ingles) de la IUPAC-IUB. Queda entendido que mas de una secuencia de nucleotidos puede codificar un polipeptido debido a la degeneracion del codigo genetico. A menos que se indique lo contrario, los aminoacidos indicados se escriben de izquierda a derecha en orientacion amino a carboxi.

[0051] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "fitasa" se refiere a una enzima capaz de catalizar la hidrolisis de esteres de acido fosforico, incluido el fitato, y de liberar fosfato inorganico e inositol. En algunos modos de realizacion, ademas del fitato, la fitasa puede hidrolizar al menos uno de los inositol fosfatos de grados de fosforilacion intermedios.

[0052] Tal como se entiende en el presente documento, el termino "tipo salvaje" se refiere a un polipeptido o polinucleotido (nativo) de origen natural. El termino tipo salvaje puede, en algunos casos, emplearse de manera intercambiable con los terminos "original" o "secuencia original".

[0053] Tal como se entiende en el presente documento, los terminos "poner en contacto" y "exponer" se refieren a la colocacion de al menos una enzima lo suficientemente cerca de su sustrato similar para posibilitar que la enzima convierta el sustrato en al menos un producto final. El producto final puede ser un "producto de interes" (es decir, un producto final que sea el resultado deseado de la reaccion de fermentacion). "Poner en contacto" incluye mezclar una solucion que comprende una enzima con el sustrato similar.

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[0054] Tal como se entiende en el presente documento, los terminos singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen el plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario. En consecuencia, por ejemplo, una referencia a una composicion que contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o mas compuestos. El termino "o", por lo general, significa "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0055] Los intervalos numericos incluyen los numeros que definen el intervalo. Cuando se proporcione un intervalo de valores, queda entendido que cada valor intermedio entre el ftmite superior e inferior de dicho intervalo tambien se expone espedficamente hasta una decima parte de la unidad del ftmite inferior (a menos que el contexto indique claramente lo contrario). El ftmite superior e inferior de intervalos mas pequenos puede, de forma independiente, incluirse en el intervalo o excluirse del mismo.

MI. Ejemplos de modos de realizacion

A. Glucoamilasas

[0056] En la invencion pueden utilizarse diversas glucoamilasas (GA) (E.C.3.2.1.3). En algunos modos de realizacion, las GA se expresan endogenamente por medio de bacterias, plantas y/u hongos, mientras que en otros modos de realizacion las GA son heterologas a las celulas huesped (p. ej., bacterias, plantas y/u hongos). En algunos modos de realizacion, las GA se producen mediante cepas de hongos filamentosos y levadura, por ejemplo, GA disponibles en el mercado producidas mediante cepas de Aspergillus y Trichoderma. Entre las GA adecuadas, se encuentran las enzimas de tipo salvaje de origen natural, asf como variante de enzima y enzima mutante creada geneticamente, tal como Ga tftbrida. Las GA tftbridas incluyen las que tienen un dominio catalftico de una GA de un organismo (p. ej., GA de Talaromyces) y un dominio de union al almidon (SBD, por sus siglas en ingles) de una GA de un organismo diferente (p. ej., GA de Trichoderma). En algunos modos de realizacion, el enlace esta incluido con el dominio de union al almidon (SBD) o el dominio catalftico. A continuacion, se presentan ejemplos de GA adecuados para su utilizacion como se describe: GA de Aspergillus niger G1 y G2 (vease, p. ej., Boel et al. (1984) EMBO J. 3:1097-1102; los documentos de patente WO 92/00381, WO 00/04136 y USP 6,352,851); GA de Aspergillus awamori (vease, p. ej., el documento de patente WO 84/02921); GA de Aspergillus oryzae (vease, p. ej., Hata et al. (1991) Agric. Biol. Chem. 55:941-949), y GA de Aspergillus shirousami (vease, p. ej., Chen et al. (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8:575-582; y Chen et al. (1994) Biochem J. 302:275-281).

[0057] Entre otras GA, se encuentran las que se obtienen a partir de cepas de Talaromyces (p. ej., T. emersonii,

T. leycettanus, T. duponti y T. thermophilus (veanse, p. ej., los documento de patente WO 99/28488; U.S. Pat. N.° RE 32,153; U.S. Pat. N.° 4,587,215); cepas de Trichoderma (p. ej., T. reesei); cepas de Rhizopus, (p. ej., R. niveus y R. oryzae); cepas de Mucor y cepas de Humicola, (p. ej., H. grisea (vease, p. ej., Boel et al. (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136; Chen et al. (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Taylor et al. (1978) Carbohydrate Res. 61:301-308; U.S. Pat. N.° 4,514,496, 4,092,434 y 4,618,579; Jensen et al. (1988) Can. J. Microbiol. 34:218-223; y SEQ ID NO: 3 del documento de patente WO 2005/052148); asf como gA que tienen al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia en relacion con SEQ ID NO: 4 expuesta en el documento de patente U.S. Pat. Pub. N.° 2006-0094080.

[0058] En algunos modos de realizacion, la GA tiene al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, e incluso al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia en relacion con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 del documento de patente WO 05/052148. Otras GA utiles en la presente invencion abarcan las que se obtienen a partir de Athelia rolfsii y sus variantes (vease, p. ej., el documento de patente WO 04/111218) y de especies de Penicillium (vease, p. ej., Penicillium chrysogenum).

[0059] Las GA disponibles en el mercado adecuadas para su utilizacion descritas incluyen, pero sin caracter limitativo, DISTILLASE®, OPTIDEX® L-400 y G ZYME® G990 4X, GC480, G-ZYME 480, FERMGEN® 1-400 (Danisco US, Inc, Genencor Division) CU.CONC® (Shin Nihon Chemicals, Japon), GLUCZYME (Amano Pharmaceuticals, Japon (vease, p. ej., Takahashi et al. (1985) J. Biochem. 98:663-671)). Otras enzimas para su utilizacion como se describe incluyen tres formas de GA (E.C.3.2.1.3) producidas mediante una especie de Rhizopus, a saber "Gluc1" (MW 74.000), "Gluc2" (MW 58.600) y "Gluc3" (MW 61.400). Por lo general, puede utilizarse cualquier GA adecuada de acuerdo con la presente composicion y los presentes metodos.

[0060] A continuacion, se muestra la secuencia de aminoacidos madura (SEQ ID NO: 1) de la GA de Trichoderma reesei (TrGA). La secuencia tiene 599 aminoacidos; el dominio catalftico (SEQ ID NO: 2) esta subrayado y corresponde a los residuos 1-453; la region de enlace (SEQ ID NO: 3) corresponde a los residuos 453-491; y el dominio de union al almidon SEQ ID NO: 4 (en cursiva) corresponde a los residuos 492-599.

Secuencia proteica madura de glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA) (SEQ ID NO: 1)

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1 SVDDFISTET PIALNNLLCN VGPDGCRAFG TSAGAVIASP STIDPDYYYM 51 WTRDSALVFK NLIDRFTETY DAGLQRRIEQ YITAQVTLQG LSNPSGSLAD 101 GSGLGEPKFE LTLKPFTGNW GRPQRDGPAL RAIALIGYSK WLINNNYQST 151 VSNVIWPIVR NDLNYVAQYW NQTGFDLWEE VNGSSFFTVA NQHRALVEGA 201 TLAATLGQSG SAYSSVAPQV LCFLQRFWVS SGGYVDSNIN TNEGRTGKDV 251 NSVLTSIHTF DPNLGCDAGT FQPCSDKALS NLKVVVDSFR SIYGVNKGIP 301 AGAAVAIGRY AEDVYYNGNP WYLATFAAAE QLYDAIYVWK KTGSITVTAT 351 SLAFFQELVP GVTAGTYSSS SSTFTNIINA VSTYADGFLS EAAKYVPADG 401 SLAEQFDRNS GTPLSALHLT WSYASFLTAT ARRAGIVPPS WANSSASTIP 451 STCSGASVVG SYSRPTATSF PPSQTPKPGV PSGTPYTPLP CATPTSVAVT 501 FHELVSTQFG QTVKVAGNAA ALGNWSTSAA VALDAVNYAD NHPLWIGTVN 551 LEAGDVVEYK YINVGQDGSV TWESDPNHTY TVPAVACVTQ VVKEDTWQS

[0061] En algunos modos de realizacion, la GA tiene al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % e incluso al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia en relacion con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NOs: 1 o 2. En algunos modos de realizacion, la GA es la TrGA expuesta en el documento de patente

U.S. Pat. N.° 7,413,887.

B. Fitasas

[0062] En la invencion, pueden utilizarse diversas fitasas, como se define en las reivindicaciones. Entre las fitasas utiles, se encuentran las que pueden hidrolizar acido fftico en las condiciones definidas de sacarificacion, fermentacion y/o sacarificacion y fermentacion simultaneas, que se han descrito en el presente documento. Los metodos conllevan la adicion de al menos una fitasa a una sacarificacion y/o una SSF y la fitasa es capaz de liberar al menos un fosfato inorganico de un inositol hexafosfato (p. ej., acido fftico). Segun sea necesario, la fitasa se obtiene a partir de una especie de Bittiauxella, tal como B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae o B. warmboldiae. El DSMZ, es decir, el Centro de Recursos de Material Biologico aleman (Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania), asf como otros depositos, disponen de especies de Buttiauxella. La fitasa tiene al menos un 90%, por ejemplo, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % e incluso al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia en relacion con la fitasa de especie de Bittiauxella, que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 5.

Secuencia proteica madura de fitasa de Buttiauxella (SEQ ID NO: 5)

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR VVSQSVEPGC QLQ

[0063] En SEQ ID NO: 6 se expone una variante de fitasa de especie de Bittiauxella que tiene una alanina en el aminoacido 92.

Secuencia proteica madura de variante de fitasa de Buttiauxella D92A (SEQ ID NO: 6)

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NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVW’AD VAQRTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR VVSQSVEPGC QLQ

[0064] En algunos modos de realizacion, la fitasa es la variante de fitasa de Buttiauxella BP-11, que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y que incluye sustituciones en los residuos de aminoacido A89, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A261 y N269, en relacion con la secuencia de la enzima de tipo salvaje (SEQ ID NO: 5). Las sustituciones espedficas son A89T, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E y N269K.

Secuencia proteica madura de la variante de fitasa de Buttiauxella BP-11 (SEQ ID NO: 7)

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWTD VDQRTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGICSMDKT QVQQAVEKEA

QTPIDNLNQH YIPSLALMNT TLNFSKSPWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNEVSL DGAIGLS STL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWALLL KLHNVYFDLM ERTPYIARHK GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR VVSQSVEPGC QLQ

[0065] En algunos modos de realizacion, la fitasa tiene una alanina en la posicion 92 (como se expone en SEQ ID NO: 6) y al menos uno de los siguientes aminoacidos: una treonina en la posicion 89, una isoleucina en la posicion 134, una serina en la posicon 164, una lisina en la posicion 176, una prolina en la posicion 178, un acido glutamico en la posicion 207, una serina en la posicion 209, una leucina en la posicion 248, una tirosina en la posicion 256, un acido glutamico en la posicion 261 y una lisina en la posicion 269.

[0066] En algunos modos de realizacion, la fitasa tiene al menos uno de los siguientes cambios aminoaddicos: A89T, D92A, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E y N269K.

[0067] En algunos modos de realizacion, la fitasa es la variante de fitasa de Buttiauxella BP-17, que tiente la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 8 y que incluye sustituciones en los residuos de aminoacido A89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A261 y N269, en relacion con la secuencia de la enzima de tipo salvaje (SEQ ID NO: 5).

[0068] Las sustituciones espedficas son A89T, D92A, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E y N269K.

Secuencia proteica madura de la variante de fitasa de Buttiauxella BP-17 (SEQ ID NO: 8)

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWTD VAQRTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGICSMDKT QVQQAVEKEA QTPIDNLNQH YIPSLALMNT TLNFSKSPWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNEVSL DGAIGLS STL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWALLL KLHNVYFDLM ERTPYIARHK GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR VVSQSVEPGC QLQ

[0069] En la tecnica, se conocen metodos para la identificacion de fitasas adecuadas, como se define en las reivindicaciones, incluidas las de especies de Buttiauxella (vease, p. ej., el documento de patente WO 06/043178).

C. Enzimas y componentes secundarios

[0070] Los metodos que se describen en el presente documento incluyen, de forma opcional, otras enzimas, incluidas, pero sin caracter limitativo, las a-amilasas, las proteasas de acido fungico, otros GA, otras fitasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, proteasas, pululanasas, beta amilasas, lipasas, cutinasas, pectinasas, p- glucosidasas, galactosidasas, esterasas, ciclodextrina transglicosiltransferasas (CGTasas), oxidorreductasas, esterasas, p-amilasas y combinaciones de las mismas. En algunos modos de realizacion, la enzima secundaria

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es una segunda GA, incluida cualquier GA anteriormente mencionada. En algunos modos de realizacion, la enzima adicional es una segunda fitasa, incluida cualquier fitasa bacteriana o fungica, tales como las anteriormente mencionadas. En los metodos de la invencion, una (primera) a-amilasa esta siempre presente en la etapa (a). En algunos modos de realizacion, la enzima adicional es una a-amilasa, tal como una a-amilasa estable en acido que, cuando se anade en una cantidad eficaz, tiene actividad en el rango de pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, incluido desde aproximadamente 3,5 hasta aproximadametne 6,5. Las a-amilasas que se utilizan en la presente invencion incluyen, pero sin caracter limitativo, a-amilasas fungicas o a-amilasas bacterianas. En algunos modos de realizacion, la a-amilasa es una a-amilasa de tipo salvaje, una variante o un fragmento de la misma, o una a-amilasa tubrida derivada de, por ejemplo, un dominio catalttico de una enzima y un dominio de union al almidon de otra. Las a-amilasas incluyen a-amilasas estables en acido y a- amilasas que tienen actividad hidrolizante de almidon granular (GSHE, por sus siglas en ingles).

[0071] En algunos modos de realizacion, las a-amilasas incluyen las que se obtienen a partir de cepas fungicas filamentosas incluidas, pero sin caracter limitativo, las cepas tales como Aspergillus (p. ej., A. niger, A. kawachi y A. oryzae); especies de Trichoderma, especies de Rhizopus, especies de Mucor y especies de Penicillium. En algunos modos de realizacion, la a-amilasa se obtiene a partir de Aspergillus kawachi o de una cepa de Trichoderma reesei. En algunos modos de realizacion, la a-amilasa es una GSHE, tal como TrAA o AkAA. En algunos modos de realizacion, la a-amilasa es una enzima tubrida que comprende un fragmento derivado de las enzimas obtenidas a partir de A. kawachi y A. niger.

[0072] Otras a-amilasas utiles como enzimas secundarias incluyen las que se obtienen a partir de bacterias tales como Bacillus (p. ej., B. stearothermophilus, B. lentus, B. coagulans, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B subtilis e tubridos, mutantes y sus variantes (veanse, p. ej., los documentos U.S. Pat N°. 5,763,385, 5,824,532, 5,958,739, 6,008,026 y 6,361,809). Algunas de estas amilasas estan disponibles en el mercado; por ejemplo, Novo Nordisk A/S dispone de TERMAMYL®, LIQUEZYME® SC y SUPRA®; Diversa dispone de ULTRATHIN® y Danisco US, Inc, Genencor Division. dispone de SPEZYME® FRED, SPEZYME® XTRA y GZYME® G997.

[0073] En algunos modos de realizacion, la enzima secundaria es una celulasa. Las celulasas son enzimas que hidrolizan celulosa (enlaces p-1, 4-D-glucano) y/o derivados de la misma, tal como celulosa hinchada de acido fosforico. Entre las celulasas, se encuentran exo-celobiohidrolasas (CBH), endoglucanasas (EG) y p- glucosidasas (BG) (EC3.2.191, EC3.2.1.4 y EC3.2.1.21). Entre los ejemplos de celulasas adecuadas, se encuentran, pero sin caracter limitativo, las de Penicillium, Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thermomonospora, Cellulomonas, Clostridium y Aspergillus. Entre las celulasas disponibles en el mercado para aplicaciones alimentarias se encuentran las p-glucanasas tales como ROVABIO® (Adisseo), NATUGRAIN® (BASF), MULTIFECT® BGL (Danisco Genencor) y ECONASE® (AB Enzymes).

[0074] En algunos modos de realizacion, la enzima secundaria es una xilanasa. Las xilanasas (p. ej., las endo-p- xilanasas (E.C. 3.2.1.8)) hidrolizan cadenas principales de xilano. Entre las xilanasas adecuadas, se encuentran las que se obtienen a partir de fuentes bacterianas (p. ej., Bacillus, Streptomyces, Clostridium, Acidothermus, Microtetrapsora y Thermonospora) y de fuentes fungicas (p. ej., Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Humicola, Penicillium y Fusarium (veanse, p. ej., los documentos de patente EP 473 545, U.S. Pat N.° 5,612,055, WO 92/06209 y WO 97/20920). Las preparaciones que se encuentran en el mercado incluyen MULTIFECT® y FEEDTREAT® Y5 (Danisco US, Inc. Genencor Division), RONOZYME® WX (Novozymes A/S) y NATUGRAIN® WHEAT (BASF).

[0075] En algunos modos de realizacion, la enzima secundaria es una proteasa. En algunos modos de realizacion, la proteasa se obtiene a partir de Bacillus (p. ej., B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis y B. subtilis). Estas enzimas incluyen subtilisinas (vease, p. ej., el documento de patente U.S. Pat. N.° 4,760,025). Las proteasas adecuadas que se encuentran en el mercado incluyen MULTIFECT® P 3000 (Danisco US, Inc. Genencor Division) y SUMIZYME® FP (Shin Nihon). En algunos modos de realizacion, la proteasa procede de una fuente fungica (p. ej., Trichoderma NSP-24, Aspergillus, Humicola y Penicillium). En algunos modos de realizacion, la proteasa es una proteasa de acido fungico (AFP, por sus siglas en ingles), incluidas, pero sin caracter limitativo, las que se obtienen a partir de Aspergillus, Trichoderma, Mucor y Rhizopus, tales como A. niger, A. awamori, A. oryzae y M. miehei. Las proteasas pueden obtenerse a partir de la expresion de protemas heterologas o endogenas de las bacterias, plantas y fuentes fungicas. Las proteasas incluyen proteasas de tipo salvaje de origen natural, asf como variantes de proteasa y proteasas mutantes creadas geneticamente, incluidas las que se describen en el documento de patente U.S. Pat. N.° 7,429,476. En algunos modos de realizacion, el componente secundario es al menos un organismo de fermentacion.

IV. Composiciones para su utilizacion en los metodos de la invencion

[0076] Los metodos de la invencion pueden emplear una composicion que comprende enzimas mezcladas o formuladas, incluida al menos una glucoamilasa y al menos una fitasa. La fitasa es una fitasa de especie de Buttiauxella como se define en las reivindicaciones. En modos de realizacion espedficos, la fitasa es una fitasa BP-WT, BP-11 o BP-17.

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[0077] En algunos modos de realizacion, la fitasa tiene una alanina en la posicion 92. La fitasa puede incluir ademas otras mutaciones descritas en el presente documento.

[0078] En algunos modos de realizacion de los metodos, los componentes enzimaticos de la composicion son una formulacion mezclada que comprende al menos los dos componentes enzimaticos mezclados. En algunos modos de realizacion, las composiciones comprenden una GA y una fitasa formuladas en una formulacion enzimatica adecuada. En algunos modos de realizacion, la composicion enzimatica formulada produce una ratio preseleccionada espedfica de GA y fitasa y, opcionalmente, otras enzimas secundarias. En algunos modos de realizacion, los componentes enzimaticos se anaden de forma individual durante una o mas etapas del proceso para producir una composicion que comprende las dos enzimas. Esto puede conllevar la adicion de los componentes separados de la composicion progresivamente para que se mantenga una ratio o mediante la adicion de los componentes simultaneamente.

[0079] En algunos modos de realizacion, la cantidad de fitasa utilizada oscila entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 FTU/g, incluidas aproximadamente las siguientes cantidades: 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,25, 0,28, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,1, 1,5, 1,8, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20. Tambien pueden utilizarse cantidades de fitasa mayores. En algunos modos de realizacion, la cantidad de fitasa utilizada oscila entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,0 FTU/g. En algunos modos de realizacion, la cantidad de fitasa utilizada es al menos aproximadamente 0,01 FTU/g, incluidas al menos aproximadamente las siguientes cantidades: 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,25, 0,28, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8 FTU/g.

V. Metodos de utilizacion

[0080] Los metodos descritos utilizan una glucoamilasa en combinacion con una fitasa durante la sacarificacion, la fermentacion y/o la SSF en procesos de conversion de almidon, lo que da lugar a un proceso que produce menos productos finales y/o productos derivados de acido fftico que los que se producen mediante la utilizacion de metodos convencionales. En algunos modos de realizacion, el proceso da lugar a DDGS con acido fftico reducido en comparacion con los metodos convencionales. En algunos modos de realizacion, el proceso da lugar a etanol y produce vinaza fina con acido fftico reducido en comparacion con los metodos convencionales.

[0081] Pueden utilizarse diversos tipos de material vegetal con los presentes metodos. En algunos modos de realizacion, la material vegetal es grano. En algunos modos de realizacion, el material vegetal se obtiene a partir de trigo, mafz, centeno, sorgo (p. ej., milo), arroz, mijo, cebada, tritical, mandioca (p. ej., tapioca), patata, boniato, remolacha azucarera, cana de azucar, y de legumbres, tales como la soja y los guisantes, asf como de combinaciones de los mismos. Los materiales vegetales incluyen variedades hffbridas y variedades modificadas geneticamente (p. ej., mafz, cebada o granos de soja transgenicos que comprenden genes heterologos). Puede utilizarse cualquier parte de la planta como sustrato, incluidos, pero sin caracter limitativo, las hojas, los tallos, las vainas, las cascaras, los tuberculos, las mazorcas, los granos y similares. En algunos modos de realizacion, se utiliza fundamentalmente la planta entera, por ejemplo, el rastrojo de mafz entero. En algunos modos de realizacion, se utiliza el grano entero como fuente de almidon granular. Entre los granos enteros, se encuentran el mafz, el trigo, el centeno, la cebada, el sorgo y combinaciones de los mismos. En otros modos de realizacion, el almidon granular se obtiene a partir de granos de cereales fraccionados, incluidos la fibra, el endospermo y/o componentes del germen. En la tecnica, se conocen metodos para fraccionar material vegetal, tal como mafz y trigo. En algunos modos de realizacion, se mezcla el material vegetal obtenido a partir de distinas fuentes (p. ej., mafz y milo o mafz y cebada). El material vegetal se prepara mediante molienda, entre otros medios. Los procesos de molienda generales son la molienda en humedo y la molienda en seco. En la molienda en seco, el grano entero se muele y se utiliza, mientras que en la molienda en humedo, el grano se separa (p. ej., el germen de la harina). Se conocen medios de molienda de granos de cereales enteros, que incluyen la utilizacion de molinos de martillos y de molinos de cilindros. Se hace referencia al manual THE ALCOHOL TEXTBOOK: A REFERENCE FOR THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES 3a ed. K.A. Jacques et al., Eds, (1999) Nottingham University Press. Veanse los capftulos 2 y 4. El material vegetal que contiene un sustrato de almidon se hidroliza y/o se licua mediante la utilizacion de una a-amilasa para producir oligosacaridos. En algunos modos de realizacion, se anade una alfa a-amilasa a una suspension de sustrato de almidon molido (p. ej., grano molido) para producir un producto de licuefaccion que contiene dextrinas y/u oligosacaridos. El experto en la materia sera capaz de determinar la dosis, el pH y el tiempo de contacto eficaces de a-amilasa que se han de utilizar en los procesos. El nivel de utilizacion optimo en una licuefaccion depende de parametros de procesamiento tales como el tipo de material vegetal, la viscosidad, el tiempo de procesamiento, el pH, la temperatura y la ms.

VI. Sacarificacion y fermentacion simultaneas y secuenciales

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[0082] El producto de licuefaccion que contiene dextrinas y/u oligosacaridos de la licuefaccion, se somete a sacarificacion, fermentacion y/o sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF). La sacarificacion tambien reduce los azucares en un producto de licuefaccion que contiene dextrinas y/u oligosacaridos en azucares fermentescibles. A continuacion, se convierten los azucares fermentescibles mediante microorganismos de fermentacion para obtener productos finales tales como alcoholes y DDGS, que pueden recuperarse mediante la utilizacion de un metodo adecuado.

[0083] En algunos modos de realizacion, la sacarificacion y la fermentacion se producen simultaneamente, en un proceso llamado sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF). En algunos modos de realizacion, la sacarificacion y la fermentacion se producen por separado. En algunos modos de realizacion, la composicion enzimatica de GA/fitasa se anade durante una etapa previa a la sacarificacion, durante el proceso de sacarificacion, durante el proceso de fermentacion o durante el proceso de SSF.

[0084] En algunos modos de realizacion, el proceso de sacarificacion dura entre 12 y 120 horas. Sin embargo, es habitual llevar a cabo una etapa previa a la sacarificacion durante entre 30 minutos y 2 horas (incluido, por ejemplo, entre 30 y 60 minutos) y, a continuacion, completar la sacarificacion durante la fermentacion. La sacarificacion se suele llevar a cabo a temperaturas de entre 30 y 65 °C y, normalmente, a un pH de entre 4,0 y 5,0. En los casos en que se incluye una etapa previa a la sacarificacion, la fitasa se anade durante la etapa previa a la sacarificacion.

[0085] Cualquiera de las GA descritas en el presente documento se pueden utilizar como enzimas sacarificantes. En algunos modos de realizacion, las composiciones enzimaticas se anaden al principio de la etapa de sacarificacion como mezcla de GA/fitasa. En otros modos de realizacion, la GA y la fitasa se anaden por separado. En algunos modos de realizacion, la GA se anade al principio de la etapa de sacarificacion y la fitasa se anade mas adelante, pero antes de que se complete la etapa de fermentacion. En algunos modos de realizacion, la sacarificacion y la fermentacion se llevan a cabo a la vez y se anade una mezcla de GA/fitasa durante la sacarificacion/fermentacion simultaneas (SSF). Los azucares fermentescibles resultantes se someten a fermentacion con microorganismos de fermentacion. En algunos modos de realizacion, la etapa de puesta en contacto y la etapa de fermentacion se llevan a cabo simultaneamente en el mismo recipiente en el que tiene lugar la reaccion. En otros modos de realizacion, estas etapas se llevan a cabo de forma secuencial. En el libro The Alcohol Textbook 3a ed., A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds. Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, Reino Unido. se describen, de forma general, procesos de fermentacion.

[0086] Los azucares fermentescibles o dextrinas (p. ej., glucosa) obtenidos a partir de la sacarificacion se utilizan como materia prima de fermentacion en fermentaciones microbianas en condiciones adecuadas para obtener productos finales, tales como alcohol (p. ej., etanol), acidos organicos (p. ej., acido succmico, acido lactico), polialcoholes (p. ej., glicerol), intermedios de acido ascorbico (p. ej., gluconato, DKG, KLG) aminoacidos (p. ej., lisina) y/o protemas (p. ej., anticuerpos y fragmentos de los mismos).

[0087] Los azucares fermentescibles pueden fermentarse con levadura a temperaturas entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 °C, aproximadamente 20 y aproximadamente 38 °C e incluso aproximadamente 25 y aproximadamente 35 °C; a un rango de pH de aproximadamente 3,0 y aproximadamente 6,5; aproximadamente 3,0 y aproximadamente 6,0; aproximadamente 3,0 y aproximadamente 5,5, aproximadamente 3,5 y aproximadamente 5,0, e incluso aproximadamente 3,5 y aproximadamente 4,5; y durante un periodo temporal de aproximadamente 5 h y aproximadamente 120 h, incluidos periodos de aproximadamente 12 y aproximadamente 120 y desde aproximadamente 24 y aproximadamente 90 horas, para producir un producto alcoholico, tal como etanol.

[0088] Las celulas de levadura pueden suministrarse en una cantidad de entre aproximadamente 104 y aproximadamente 1012 celulas o desde aproximadamente 107 y aproximadamente 1010 celulas de levadura viables por ml de medio de fermentacion. El proceso de fermentacion puede incluir la adicion de materias primas, tales como nutrientes, acidos y otras enzimas, asf como de suplementos, tales como vitaminas (p. ej., biotina, acido folico, acido nicotmico, riboflavina), cofactores, macronutrientes, micronutrientes y sales (p. ej., (NH4)2SO4; K2HPO4; NaCl; MgSO4 H3BO3; ZnCh; y CaCh).

VII. Organismos de fermentacion

[0089] Puede utilizarse cualquier organismo de fermentacion adecuado con los presentes metodos. Entre los ejemplos de organismos de fermentacion adecuados se encuentran los microorganismos etanologenicos o microorganismos de produccion de etanol, tales como las bacterias etanologenicas que expresan alcohol deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa, que pueden obtenerse a partir de Zymomonas moblis (veanse, p. ej., los documentos de patente U.S. Pat. Nos. 5,000,000, 5,028,539, 5,424,202, 5,514,583y 5,554,520). Los microorganismos etanologenicos pueden expresar xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, que son enzimas que convierten xilosa en xilulosa. De forma alternativa o adicional, se utiliza xilosa isomerasa para convertir xilosa en xilulosa. Puede utilizarse un microorganismo capaz de fermentar tanto pentosas como hexosas en

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etanol. El microorganismo puede ser un microorganismo de origen natural o no creado geneticamente o un microorganismo modificado o recombinante. Los microorganismos de fermentacion incluyen cepas bacterianas de Bacillus, Lactobacillus, E. coli, Erwinia, Pantoea (p. ej., P. citrea), Pseudomonas y Klebsiella (p. ej., K. oxytoca) (veanse, p. ej. los documento de patente U.S. Pat. N.° 5,028,539 y 5,424,202, y el documento de patente WO 95/13362). El microorganismo de fermentacion seleccionado depende del producto final que se produzca.

[0090] El microorganismo de produccion de etanol puede ser un microorganismo fungico, tal como una cepa de Saccharomyces, incluida, pero sin caracter limitativo, S. cerevisiae (vease, p. ej., el documento de patente U.S. Pat. N.° 4,316,956). En el mercado, hay diversas S. cerevisiae disponibles, incluidas, pero sin caracter limitativo, FALI® (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART® (Alltech), FERMIOL® (DSM Specialties), RED STAR® (Lesaffre) y ANGEL ALCOHOL YEAST® (Angel Yeast Company, China).

VIII. Recuperacion de alcohol, DDGS y otros productos finales

[0091] El producto final del proceso de fermentacion es un alcohol (p. ej., etanol o butanol), que pueden separarse y/o purificarse de los medios de fermentacion. En la tecnica, se conocen metodos de separacion y purificacion, que incluyen metodos tales como someter los medios a extraccion, destilacion, cromatograffa en columna, deshidratacion mediante tamiz molecular o ultrafiltracion. El producto final puede identificarse directamente al someter los medios a cromatograffa de ftquidos de alta resolucion (CLAR) o a analisis de cromatograffa de gases (CG).

[0092] En los casos en que el producto final sea etanol, puede utilizarse para combustible, limpieza o smtesis qrnmica, o inyectarse como bebida. Los productos derivados de la fermentacion, tales como los residuos desecados de destilena (DDG) y los residuos desecados y solubles de destilena (DDGS), pueden utilizarse como pienso para animales.

[0093] Los presentes metodos pueden reducir el contenido de acido fftico del medio de fermentacion, de la vinaza fina y/o de los productos derivados de la fermentacion, tales como los residuos desecados de destilena (DDG); los residuos desecados y solubles de destilena (DDGS); residuos humedos de destilena (DWG, por sus siglas en ingles) y residuos humedos y solubles de destilena (DWGS, por sus siglas en ingles). Por ejemplo, las composiciones y metodos pueden reducir el contenido de acido fftico del filtrado de fermentacion al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 % e incluso al menos aproximadamente un 90 % o mas en comparacion con, esencialmente, el mismo proceso pero sin la fitasa. La cantidad de fitasa encontrada en los DDGS puede reducirse al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 % y al menos aproximadamente un 90 % en comparacion con el contenido de fitato en los DDGS de un proceso correspondiente, que es esencialmente el mismo que el proceso reivindicado, pero sin una incubacion de tratamiento previo de fitasa. Por ejemplo, si bien el porcentaje de contenido de fitato en las muestras comerciales de DDGS puede variar, un rango general de porcentaje de fitato oscila entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 3 % o mas. En comparacion, el porcentaje de fitato en los DDGS obtenido mediante la utilizacion del presente proceso es menor que aproximadamente un 1,0 %, menor que aproximadamente un 0,8 % e incluso menor que aproximadamente un 0,5 %. Los DDGS pueden anadirse a un pienso para animales antes o despues de la peletizacion y pueden incluir fitasa activa.

[0094] En algunos procesos de etanol industriales, se destila el etanol del filtrado, lo que da lugar a una porcion de vinaza fina, que es adecuada para reciclarse en el flujo de fermentacion. Mediante la utilizacion de las presentes composiciones y metodos, la vinaza fina tiene un contenido de acido fftico inferior en comparacion con el que se obtiene mediante la utilizacion de un metodo convencional. La reduccion de acido fftico puede ser consecuencia de la adicion de fitasa durante una etapa de tratamiento previo, durante la sacarificacion, durante la sacarificacion/fermentacion o una combinacion de los mismos. La reduccion del contenido de acido fftico de la vinaza fina puede ser al menos aproximadamente de un 60 %, al menos aproximadamente de un 65 %, al menos aproximadamente de un 70 %, al menos aproximadamente de un 75 %, al menos aproximadamente de un 80 %, al menos aproximadamente de un 85 % e incluso al menos aproximadamente de un 90 % o mas, en comparacion con, esencialmente, el mismo proceso pero sin la fitasa. De forma similar, la cantidad de fitasa encontrada en la vinaza fina puede reducirse al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 % o incluso al menos aproximadamente un 90 % en comparacion con el contenido de fitato en la vinaza fina como consecuencia de un proceso similar, de cualquier otro modo, que carece de una fitasa.

EJEMPLOS

[0095] Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo, pero no limitan los metodos.

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[0096] En la exposicion y la seccion de experimentos, que se muestran a continuacion, se aplican las siguientes abreviaturas: %p/p (% en peso); °C (grados cenffgrados); H2O (agua); dH2O (agua desionizada); dIH2O (agua desionizada, filtracion Milli-Q); g o gm (gramos); pg (microgramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); pL (microlitros); ml y mL (mililitros); mm (miffmetros); pm (micrometro); M (molar); mM (milimolar); pM (micromolar); U (unidades); MW (peso molecular); s (segundos); min (minuto/minutos); h (hora/horas); ms (materia seca); DO (oxfgeno disuelto); W/V (porcentaje en masa); W/W (peso por peso); % v (porcentaje en volumen); Genencor (Danisco US, Inc., Genencor Division, Palo Alto, California); IkA (IKA Works Inc. 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, Carolina del Norte); MT (tonelada metrica); Ncm (cenffmetro Newton); GAU (unidad de actividad de glucoamilasa; FTU (unidad de actividad de fitasa) y ETOH (etanol).

EJEMPLO 1: Mediciones de viscosidad

[0097] Se utilizo una cocina de vidrio -viscosfmetro, LR-2.ST system, IKA, para determinar la viscosidad. En resumen, el viscosfmetro consiste en un recipiente de vidrio de doble pared de 2.000 ml con un agitador tipo ancla que se remueve con un viscosfmetro de control de potencia Eurostar Labortechnik. El rango de viscosidad del viscosfmetro es 0-600 Ncm.

[0098] En general, se vertio una suspension que comprende un sustrato de almidon y una cantidad adecuada de enzima en el recipiente del viscosfmetro. Se registro la temperatura y la viscosidad durante el calentamiento a 85 °C y se continuo la incubacion durante otros 60-120 min. Se midio la viscosidad en Ncm y se registro en intervalos.

EJEMPLO 2: Utilizacion de una glucoamilasa y una fitasa en fermentacion de etanol

[0099] Este ejemplo muestra la eficacia de la glucoamilasa (GA) y la fitasa en la fermentacion de etanol para producir DDGS y vinaza fina con un contenido inferior de fitato en comparacion con el obtenido mediante la utilizacion de un metodo convencional. La GA que se utilizo fue la GA de Trichoderma reesei (TrGA) correspondiente a SEQ ID NO: 1 (veanse, p. ej. los documento de patente U.S. Pat N.° 7,354,752 y 7,4l3,887). La fitasa utilizada fue fitasa de Buttiauxella BP-17, correspondiente a SEQ ID NO: 8.

[0100] Las unidades de actividad de la glucoamilasa (GAU, por sus siglas en ingles) se definieron como la cantidad de enzima requerida para producir 1 g de azucar reductor, calculado como glucosa por hora de un sustrato de almidon soluble a un pH de 4,2 y a 60 °C. El ensayo PNPG se utiliza para medir la actividad de la glucoamilasa.

[0101] La actividad de la fitasa (FTU, por sus siglas en ingles) se midio mediante la liberacion de fosfato inorganico, que forma un complejo amarillo con reactivo de vanadato/molibdato acido, que puede medirse a una longitud de onda de 415 nm en un espectrofometro. El fosfato inorganico liberado se cuantifico con una curva patron de fosfato. Una unidad de fitasa (FTU) se definio como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de fosfato inorganico de fitato por minuto en las condiciones de reacccion determinadas en la norma europea (CEN/TC 327, 2005-TC327WI 003270XX).

[0102] Para medir el contenido de acido fftico, se extrajo acido fftico de una muestra mediante el ajuste del pH de una suspension del 5 % (para muestras secas) a un pH del 10,0 y, a continuacion, mediante la utilizacion de una columna de intercambio ionico HPLC para unir el acido fftico, que se eluyo de la columna mediante la utilizacion de un sistema de gradiente de NaOH. El contenido de acido fftico en el lfquido se calculo mediante la comparacion del acido fftico con un patron.

EJEMPLO 3: Utilizacion de TrGA y BP17 en fermentacion de levadura - efecto en DDGS

[0103] Los DDGS (residuos desecados y solubles de destileffa), un componente presente en algunos piensos para animales, que se obtiene a partir de plantas de procesamiento de etanol, contiene acido fftico, que las especies no rumiantes como las aves, los peces y los cerdos no digieren. A continuacion, el acido fftico se descarga a traves del estiercol, lo que da lugar a una contaminacion de fosfato. Como se muestra en este ejemplo, la adicion de una enzima hidrolizante de acido fftico, como la fitasa, en combinacion con glucoamilasa durante el proceso de sacarificacion/fermentacion simultaneas reduce las concentraciones de acido fftico en los DDGS.

[0104] Se preparo un producto de licuefaccion a partir de un proceso de licuefaccion de almidon convencional mediante la utilizacion de mafz como materia prima y se congelo para su utilizacion en el experimento. Se descongelo el producto de licuefaccion, se anadieron 200 ppm de urea y se ajustaron los solidos a un 32,9 % de ms antes de ajustar el pH a 4,2 con acido sulfurico 6N. Las fermentaciones tuvieron lugar en matraces de 250 ml que conteman una affcuota de 200 gm de mezcla (es decir, la mezcla que contiene el producto de licuefaccion). Se diluyeron las enzimas de modo que se anadiera 1,0 ml de cada una en la actividad designada a los matraces. Se repitio cada condicion. Se inocularon los matraces mediante la adicion de 1 ml de 10 % de suspension de levadura que contema un 1 % de glucosa aproximadamente una hora antes de la utilizacion. Se anadio la fitasa

BP-17 en la muestra de 1,0 ml a diferentes concentraciones de actividad (0, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 3,0 y 5,0 FTU/g ms de mafz) durante la sacarificacion/fermentacion simultaneas. Tambien se anadio GA de Trichoderma para hidrolizar las dextrinas solubles para proporcionar glucosa. Despues de la fermentacion, se analizaron los dDgS para observar el fosforo libre/fosfato libre. Se determino el fosfato libre con el metodo colorimetrico de Fiske- 5 Subbarow (vease, p. ej., Fiske, C.H. y Subbarow, Y. (1925) J. Biol.Chem. 66:375-400). Se molieron las muestras en un molino analftico Tekmar y se extrajo el fosfato libre en agua mediante la adicion de 1 g de muestra a un matraz aforado de 100 ml con 80 ml de agua. Se anadio una barra magnetica a cada matraz y se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuacion, se enrasaron los matraces con agua, se mezclaron bien y se filtraron a traves de papel de filtro Whatman n.° 1. Se colocaron los matraces en un bano Marfa a 32 °C y se 10 mezclaron de vez en cuando. A continuacion, se analizaron los filtrados para observar el fosfato de la siguiente manera. A 3,0 ml de muestra, se le anadio 1 ml de reactivo de molibdato acido, seguido de 1 ml de reactivo reductor, y la absorbancia del color desarrollado a temperatura ambiente durante 20 minutos se midio a 660 nm. A continuacion, se calculo la concentracion de fosfato en las muestras a partir de una curva patron de fosfato. Los resultados finales se calcularon como |jg de fosforo por g de muestra.

15 [0105] En la figura 1, aparece un grafico que muestra el efecto de la concentracion de fitasa BP-17 durante la

fermentacion de levadura en las reducciones de acido fftico. En estos experimentos, se utilizo un 32 % de mafz de grano entero que contema un 50 % de vinaza fina a un pH de 4,2 que contema 0,325 GAU/g ms, GC147. El grafico muestra que la concentracion de fosforo libre alcanzo un estancamiento de aproximadamente un 0,75 % de fosforo libre con la adicion de aproximadamente un 0,7 % de FTU/g de fitasa. En consecuencia, las 20 concentraciones de acido fftico se redujeron con la adicion de una cantidad muy pequena de fitasa, es decir, 0,1

FTU/g ms, de manera que se eliminara mas de un 80 % del acido fftico.

Claims (28)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de produccion de un alcohol que comprende:

   a) poner en contacto una suspension que comprende un sustrato de almidon con al menos una a- amilasa que produce oligosacaridos;

   b) poner en contacto los oligosacaridos con al menos una glucoamilasa y al menos una fitasa, donde la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5, para producir azucares fermentescibles;

   c) fermentar los azucares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentacion para producir alcohol; y opcionalmente

   d) recuperar el alcohol y/o los residuos desecados y solubles de destilena (DDGS).
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas elevar la temperatura por encima de la temperatura de gelatinizacion del sustrato de almidon despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b).
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1, donde el sustrato de almidon es un grano molido seleccionado del grupo que consiste en mafz, cebada, trigo, arroz, sorgo, centeno, mijo y tritical.
4. 4. El metodo segun la reivindicacion 1, donde la fitasa tiene una alanina en el aminoacido 92 y/o al menos uno de los siguientes aminoacidos: una treonina en la posicion 89, una isoleucina en la posicion 134, una serina en la posicon 164, una lisina en la posicion 176, una prolina en la posicion 178, un acido glutamico en la posicion 207, una serina en la posicion 209, una leucina en la posicion 248, una tirosina en la posicion 256, un acido glutamico en la posicion 261 y una lisina en la posicion 269.
5. 5. El metodo segun la reivindicacion 4 donde la fitasa comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 8.
6. 6. El metodo segun la reivindicacion 5 donde la fitasa consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 8.
7. 7. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas poner en contacto los oligosacaridos con al menos otra enzima seleccionada entre una a-amilasa, una segunda glucoamilasa, una segunda fitasa, una celulasa, una pululanasa, una proteasa y una lacasa.
8. 8. El metodo segun la reivindicacion 1 donde el alcohol es etanol.
9. 9. Un metodo de reduccion de acido ftico durante la fermentacion de etanol, que comprende:

   a) poner en contacto una suspension que comprende un sustrato de almidon con al menos una a- amilasa para producir un producto de licuefaccion;

   b) poner en contacto el producto de licuefaccion con al menos una glucoamilasa y al menos una fitasa, donde la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a SEQ ID NO:5, y donde la fitasa tiene una alanina en la posicion 92, en condiciones tales que se producen azucares fermentescibles

   c) fermentar los azucares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentacion en condiciones que producen etanol y/o DDGS; y opcionalmente

   d) recuperar el etanol y/o los DDGS.
10. 10. El metodo segun la reivindicacion 9, que comprende ademas una etapa de elevar la temperatura por encima de la temperatura de licuefaccion del sustrato de almidon.
11. 11. El metodo segun la reivindicacion 9, donde la glucoamilasa proviene de un hongo filamentoso seleccionado del grupo que consiste en Trichoderma, Penicillium, Taleromyces, Aspergillus y Humicola.
12. 12. El metodo segun la reivindicacion 11, donde la Trichoderma es Trichoderma reesei.
13. 13. El metodo segun la reivindicacion 9, donde la fitasa comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8.
14. 14. El metodo segun la reivindicacion 13, donde la fitasa consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8.
15. 15. El metodo segun la reivindicacion 9, donde los DDGS comprenden fitasa activa.
16. 16. El metodo segun la reivindicacion 15 donde, cuando se mezclan los DDGS con granos o pienso para producir un pienso para animales, la fitasa activa reduce el acido fftico en el pienso.
17. 17. El metodo segun la reivindicacion 9, donde el sustrato de almidon es un grano molido.

    10

    15
18. 18. El metodo segun la reivindicacion 17, donde el grano molido se selecciona entre mafz, cebada, mijo, trigo, arroz, sorgo, centeno y tritical.
19. 19. Un metodo de reduccion de acido fftico en DDGS, que comprende:

    a) poner en contacto una suspension que comprende un sustrato de almidon con al menos una a- amilasa para producir un producto de licuefaccion;

    b) poner en contacto el producto de licuefaccion con al menos una glucoamilasa de Trichoderma

    reesei (TrGA) y al menos una fitasa, donde la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de

    secuencia de aminoacidos con respecto a SEQ ID NO:5, en condiciones tales que se producen

    azucares fermentescibles; y

    c) fermentar los azucares fermentescibles en presencia de un organismo de fermentacion para producir etanol y/o DDGS.
20. 20. El metodo segun la reivindicacion 19, donde la fitasa tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:5 y tiene una alanina en el aminoacido 92.
21. 21. El metodo segun la reivindicacion 19 donde la fitasa comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8.
22. 22. El metodo segun la reivindicacion 21 donde la fitasa consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8.

    Contenido de fosforo libre en DDGS a partir de fitasa BP-17 con diferentes concentraciones en fermentacion de levadura: metodo colorimetrico (metodo Fiske-Subbarow)

    Fitasa Promedio

    FTU/q %P

23. 0

    0.4Q8

24. 0.10

    0.703

25. 0.25

    0.724

26. 0.50

    0.727

    1.00

    0.742

27. 3.00

    0.755

28. 5.00

    0.786

    Contenido de fosfato libre en DDGS

    imagen1

    FIGURA 1