BRPI0712112A2 - processo para conversão de amido granular em etanol - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA CONVERSãO DE AMIDO GRANULAR EM ETANOL. A presente invenção refere-se a um método para produção de glicose a partir de um substrato de amido granular, que compreende contatar uma pasta fluida compreendendo amido granular obtido a partir de material de planta com uma alfa-amilase, a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização de amido do amido granular, para produzir oligossacarídeos e hidrolisar os oligossacarídeos para produzir uma massa compreendendo pelo menos 20% de glicose, e que compreende ainda fermentar a massa para obter etanol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA CONVERSÃO DE AMIDO GRANULAR EM ETANOL".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a processos para a produção de um álcool (por exemplo, etanol) a partir de um amido granular, compreen- dendo a exposição de uma pasta fluida que compreende amido granular de material de planta a uma alfa-amilase a uma temperatura abaixo da tempe- ratura de gelatinização do amido granular, seguida por fermentação com um microorganismo de fermentação.

Antecedentes da Invenção

A viabilidade comercial da produção de etanol como uma fonte de combustível a partir de colheitas de agricultura tem gerado interesse mundial renovado devido a uma variedade de razões que incluem depen- dência contínua e aumentada de suprimentos limitados de óleo e o fato de que a produção de etanol é uma fonte de energia renovável.

Processos de produção de fermentação alcoólica e particular- mente processos de produção de etanol são geralmente caracterizados co- mo processos de moagem úmida ou moagem a seco. Referência é feita a Bothast et al., 2005 Appl. Microbiol. Biotechnol. 67:19-25 e The Alcohol Textbook, 3rd Ed (K.A. Jacques et al. Eds) 1999 Mottingham University Press, UK para uma revisão destes processos.

Em geral, o processo de moagem úmida envolve uma série de etapas de impregnação molhagem "steeping" para amaciar o grão de cereal, em que o amido solúvel é removido, seguidas por recuperação do germe, fibra (farelo) e glúten (proteína). O amido remanescente é ainda processado por secagem, tratamentos químicos e/ou de enzima. O amido pode então ser usado para produção de álcool, xarope de milho de alta frutose ou amido de grau puro comercial.

Em geral, a moagem do grão a seco envolve um número de eta- pas básicas, que incluem: trituração, cozimento, liquefação, processo de conversão de um carboidrato em açúcar, fermentação e separação de líqui- do e sólidos para produzir álcool e outros subprodutos. Geralmente, o cereal inteiro, como cereal de milho, é triturado a um tamanho de partícula fina e então misturado com líquido em um tanque de pasta fluida. A pasta fluida está sujeita a temperaturas altas em forno de cozimento contínuo com enzi- mas de liquefação (por exemplo, alfa-amilase) para solubilizar e hidrolisar o amido no cereal em dextrinas. A mistura é resfriada e adicionalmente tratada com enzimas de sacarificação (por exemplo, glicoamilases) para produzir glicose fermentável. A massa contendo glicose é então fermentada por a- proximadamente 24 a 120 horas na presença de microorganismos de produ- ção de etanol. Os sólidos na massa são separados da fase líquida e etanol, e são obtidos subprodutos úteis, tais como grãos do destilador.

Aperfeiçoou-se aos processos de fermentação acima têm sido realizados combinando-se a etapa de sacarificação e a etapa de fermenta- ção em um processo referido como sacarificação e fermentação simultâneas ou sacarificação simultânea, propagação de levedura e fermentação. Estes processos de fermentação aperfeiçoados têm vantagens sobre os processos de fermentação de moagem a seco ou mesmo sobre os processos de fer- mentação de moagem úmida previamente descritos, porque não são desen- volvidas concentrações de açúcar significantes no fermentador, desse modo evitando inibição de açúcar de crescimento de levedura. Além disso, o cres- cimento bacteriano é reduzido devido à falta de glicose facilmente disponí- vel. A produção aumentada de etanol pode resultar do uso dos processos de sacarificação e fermentação simultâneas.

Mais recentemente, processos de fermentação têm sido introdu- zidos, os quais eliminam a etapa de cozimento ou reduzem a necessidade de tratar grãos de cereal a altas temperaturas. Estes processos de fermen- tação, que são algumas vezes referidos como não-cozimento, baixa tempe- ratura ou cozimento a quente, incluem moagem de um grão de cereal a combinação do grão de cereal moído com líquido para formar uma pasta fluida, a qual é então misturada com uma ou mais enzimas hidrolisantes de amido granular e opcionalmente levedura a temperaturas abaixo da tempe- ratura de gelatinização do amido granular para produzir etanol e outros sub- produtos (USP 4,514,496, WO 03/066826, WO 04/081193, WO 04/106533, WO 04/080923 e WO 05/069840).

Enquanto os processos de fermentação acima mencionados u- sando uma pasta fluida de grão moído em combinação com enzimas hidroli- santes de amido granular oferecem certos aperfeiçoamentos sobre proces- sos anteriores, aperfeiçoamentos adicionais no processo de fermentação são necessários pela indústria para a conversão de amido granular resultan- do em maior eficiência de energia e alta produção do produto final. O objeto da presente invenção é fornecer processos aperfeiçoados para a conversão de amido granular em álcool (por exemplo, etanol) e outros produtos finais.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê processos para a produção de um álcool (por exemplo, etanol) a partir de amido granular colocando em contato o amido granular com uma alfa-amilase e proporcionando condições ade- quadas para enzimas hidrolíticas de planta endógenas, as quais hidrolisam amido solubilizado para produzir glicose. A glicose pode então ser usada como uma matéria-prima em fermentações para produzir álcool.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um processo de produ- ção de glicose a partir de um substrato de amido granular que compreende:

a) contatar uma pasta fluida que compreende amido granular obtido a partir de material de planta com uma alfa-amilase a uma temperatu- ra abaixo da temperatura de gelatinização de amido do amido granular para produzir oligossacarídeos e permitir que enzimas endógenas hidrolisantes de carboidrato de planta hidrolisem os oligossacarídeos, e

b) produzir uma massa que compreende pelo menos 10% de glicose.

Em uma modalidade adicional deste aspecto, a massa é fermen- tada na presença de um microorganismo de fermentação e enzimas hidroli- santes de amido a uma temperatura entre 10 °C e 40 °C por um período de tempo de 10 horas a 250 horas, para produzir álcool, particularmente etanol.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para pro- duzir etanol, que compreende:

a) colocar em contato uma pasta fluida que compreende amido granular com uma alfa-amilase capaz de solubilizar amido granular, em que o dito contato é em um pH de 3,5 a 7,0; a uma temperatura abaixo da tem- peratura de gelatinização de amido do amido granular; e por um período de 5 minutos a 24 horas e obter um substrato de massa que compreende mais do que 20% de glicose, e

b) fermentar o substrato na presença de um microorganismo de fermentação e uma enzima hidrolisante de amido a uma temperatura entre 10°C e 40°C, por um período de 10 horas a 250 horas, para produzir eta- nol.

Em modalidades adicionais de cada aspecto descrito acima, o processo inclui recuperar o etanol. Ainda em outras modalidades dos aspec- tos descritos, o processo pode incluir etapas adicionais não-especificadas, que são realizadas antes, durante ou após as etapas enumeradas.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um diagrama esquemático geral que ilustra uma modali- dade da invenção, em que a pasta fluida que compreende um grão moído contendo amido granular e tendo um DS de 20 a 40% é colocada em contato com uma alfa-amilase a uma temperatura entre 55°C e 70°C e um pH de 4,0 a 6,0 por 2 a 24 horas. A mistura resultante que compreende glicose é transferida para um fermentados e fermentada em um pH de 3,0 a 5,0, a uma temperatura de 25°C a 35°C por 24 a 72 horas na presença de leve- dura, nutrientes, ácido e enzimas hidrolisantes de amido para produzir etanol.

Descrição Detalhada da Invenção

A menos que estejam aqui definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence.

Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalen- tes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou testagem da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos.

A invenção será agora descrita em detalhes apenas a título de referência pelo uso das seguintes definições e exemplos. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as seqüências descritas em tais patentes e publicações, referidas aqui são expressamente incorporadas por referência.

Definições

O termo "fermentação" refere-se à quebra enzimática e anaeró- bica de substâncias orgânicas por microorganismos para produzir compos- tos orgânicos mais simples. Embora a fermentação ocorra sob condições anaeróbicas, não é propositado que o termo seja unicamente limitado a con- dições anaeróbicas estritas, visto que a fermentação também ocorre na pre- sença de oxigênio.

Conforme usado aqui, o termo "amido" refere-se a qualquer ma- terial compreendido dentre os carboidratos polissacarídeos complexos de plantas, compreendidos dentre amilose e amilopectina com a fórmula (CeH10O5), em que X pode ser qualquer número.

O termo "amido granular" refere-se a amido bruto (não-cozido), que é o amido em sua forma natural encontrado em material de planta (por exemplo, grãos e tubérculos).

Conforme utilizado aqui, o termo "teor de sólidos seco (DS)" re- fere-se aos sólidos totais de uma pasta fluida em porcentagem em uma base de peso seco.

O termo "pasta fluida" refere-se a uma mistura aquosa que com- preende sólidos insolúveis (por exemplo, amido granular).

O termo "dextrinas" refere-se a polímeros de glicose de cadeia curta (por exemplo, 2 a 10 unidades).

O termo "oligossacarídeos" refere-se a qualquer composto tendo de 2 a 10 unidades de monossacarídeos juntas em ligações glicosídicas. Estes polímeros de açúcares simples de cadeia curta incluem dextrinas.

O termo "amido solúvel" refere-se ao amido que resulta da hidró- lise de amido insolúvel (por exemplo, amido granular).

O termo "massa" refere-se a uma mistura de um substrato fer- mentável em líquido usada na produção de um produto fermentado e é utili- zado para referir-se a qualquer estágio da fermentação a partir da mistura inicial do substrato fermentável com uma ou mais enzimas hidrolisantes de amido e organismos de fermentação até a conclusão da etapa de fermentação.

Os termos "enzima de sacarificação" e "enzimas hidrolisantes de amido" referem-se a qualquer enzima que é capaz de converter amido em mono ou oligossacarídeos (por exemplo, hexose ou pentose).

Os termos "enzimas hidrolisantes de amido granular (GSH)" e "enzimas que possuem atividade hidrolisante de amido granular (GSH)" refe- rem-se a enzimas que possuem a habilidade de hidrolisar amido em forma granular.

O termo "hidrólise de amido" refere-se à clivagem de ligações glicosídicas com a adição de moléculas de água.

O termo "alfa-amilase (por exemplo, classe E.C. 3.2.1.1)" refere- se a enzimas que catalisam a hidrólise de ligações alfa-1,4-glicosídicas. Es- tas enzimas também foram descritas como aquelas que efetuam exo- ou endohidrólise de ligações 1,4-alfa-D-glicisídicas em polissacarídeos que con- têm unidades D-glicose 1,4-alfa ligadas.

O termo "gelatinização" significa solubilização de uma molécula de amido por cozimento para formar uma suspensão viscosa.

O termo "temperatura de gelatinização" refere-se à temperatura mais baixa na qual começa a gelatinização de um substrato que contém a- mido. A temperatura exata de gelatinização depende do amido específico e pode variar dependendo de fatores tais como espécies de plantas e condi- ções do meio-ambiente e de crescimento. Portanto, a faixa de temperaturas de gelatinização discutida aqui é proporcionada para abranger esta variação.

O termo "abaixo da temperatura de gelatinização" refere-se à temperatura que é menor do que a temperatura de gelatinização.

O termo "glicoamilase" refere-se à classe de amiloglicosidase de enzimas (por exemplo, E.C.3.2.1.3, glicoamilase, 1,4-alfa-D-glucano glicoi- drolase). Estas são enzimas de exoação, que liberam resíduos glicosil das extremidades não-redutoras das moléculas de amilose e amilopectina. As enzimas também hidrolisam ligações alfa-1,6 e alfa-1,3, embora em uma velocidade bem mais lenta do que as ligações alfa-1,4.

A expressão "sacarificação e fermentação simultâneas (SSF)" refere-se a um processo na produção de produtos finais, em que um orga- nismo de fermentação, tal como um microorganismo produtor de etanol, e pelo menos uma enzima, tal como uma enzima de sacarificação, são combi- nados na mesma etapa do processo no mesmo recipiente.

O termo "sacarificação" refere-se à conversão enzimática de um polissacarídeo diretamente não-utilizável em um mono ou oligossacarídeo por conversão fermentativa em um produto final.

O termo "moagem" refere-se à quebra de grãos de cereal em partículas menores. Em algumas modalidades, o termo é usado reciproca- mente com trituração.

O termo "moagem a seco" refere-se à moagem de grãos intei- ros, secos, em que frações do grão, tais como gérmen e farelo, não foram propositadamente removidas.

O termo "liquefação" refere-se ao estágio na conversão de ami- do em que amido gelatinizado é hidrolisado para gerar dextrinas solúveis de baixo peso molecular.

O termo vinhoto fino ("thin-stillage") refere-se à porção líquida resultante de uma fermentação, a qual contém material dissolvido e partícu- las finas suspensas e a qual é separada da porção sólida resultante da fer- mentação. Vinhoto fino ("thin-stillage") reciclado em processos de fermenta- ção industrial é freqüentemente referido como "back-set".

O termo "recipiente" inclui, mas não está limitado a tanques, bar- ris, frascos, garrafas, sacos, biorreatores e semelhantes. Em uma modalida- de, o termo refere-se a qualquer receptáculo apropriado para realizar os pro- cessos de sacarificação e/ou fermentação compreendidos pela invenção.

O termo "produto final" refere-se a qualquer produto derivado de fonte de carbono, o qual é enzimaticamente convertido a partir de um subs- trato fermentável. Em algumas modalidades preferidas, o produto final é um álcool, tal como etanol.

Como utilizado aqui, o termo "organismo de fermentação" refere- se a qualquer microorganismo ou célula apropriada para uso em fermenta- ção para produzir direta ou indiretamente um produto final.

Conforme usado aqui, o termo "produtor de etanol" ou "microor- ganismo produtor de etanol" refere-se a um organismo de fermentação que é capaz de produzir etanol a partir de mono ou oligossacarídeo.

O termo "derivado" abrange os termos "originado de", "obtido" ou "obtenível a partir de" e "isolado de" e em algumas modalidades como aqui usado significa que um polipeptídio codificado pela seqüência de nucleotídeo é produzido a partir de uma célula na qual o nucleotídeo está naturalmente presente ou na qual o nucleotídeo for inserido.

O termo "heterólogo" com referência a uma proteína ou polinu- cleotídeo refere-se a uma proteína ou polinucleotídeo que não ocorre natu- ralmente em uma célula hospedeira.

O termo "endógeno" com referência a uma proteína ou polinu- cleotídeo refere-se a uma proteína ou polinucleotídeo que ocorre natural- mente em uma célula hospedeira.

A expressão "enzimas hidrolíticas de planta endógenas capazes de hidrolisar amido solúvel" refere-se a enzimas hidrolíticas que são expres- sas e produzidas um uma planta e podem ser produzidas pela expressão de genes endógenos ou heterólogos. Em algumas modalidades, enzimas endó- genas são aquelas naturalmente expressas na planta.

A expressão "enzimas exógenas" refere-se a enzimas que não são produzidas em uma planta ou célula de planta.

O termo "conversão enzimática" em geral refere-se à modifica- ção de um substrato por ação enzimática. O termo conforme utilizado aqui também se refere à modificação de um substrato fermentável, tal como um substrato que contém amido granular, pela ação de uma enzima.

Os termos "recuperado", "isolado" e "separado" conforme utiliza- dos aqui se referem a um composto, proteína, célula, ácido nucléico ou ami- noácido removido de pelo menos um componente com o qual ele está natu- ralmente associado.

Conforme utilizado aqui, o termo "unidade de enzima" refere-se à quantidade de enzima que produz 1 micromol de produto por minuto sob as condições especificadas de teste. Por exemplo, em uma modalidade, o termo "unidade de atividade de glicoamilase" (GAU) está definido como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 g de glicose por hora de um substrato de amido solúvel (4% de DS) sob condições de teste de 60 0C e pH 4,2.

O termo "produção" refere-se à quantidade de produto final pro- duzida utilizando os métodos da presente invenção. Em algumas modalida- des, o termo refere-se ao volume do produto final e, em outras modalidades, o termo refere-se à concentração do produto final.

O termo "DE" ou "dextrose equivalente" é um padrão industrial para medir a concentração de açúcares de redução totais, calculada como D-glicose em uma base de peso seco. O amido granular não-hidrolisado tem um DE que é essencialmente 0 e D-glicose tem um DE de 100. Um método de instrução para determinar o DE de uma pasta fluida ou solução é descrito no método de Schroorl (titulação de teste de Fehling).

Como utilizado aqui, o termo "compreendendo" e seus cognatos são usados em seu sentido inclusivo, isto é, equivalente ao termo "incluindo" e seus cognatos correspondentes.

"Um", "uma", "o" e "a" incluem referências plurais, a menos que o contexto claramente dite o contrário.

Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa.

Os títulos providos aqui não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção, que podem ser tidos por referência ao relatório descritivo como um todo.

Modalidades da Invenção

(A) Materiais Brutos:

Amido granular

Amido granular pode ser obtido a partir de material de planta, in- cluindo, mas não limitado a trigo, milho, centeio, sorgo, arroz, painço, ceva- da, triticale, mandioca (tapioca), batata, batata doce, beterraba, cana-de- açúcar e legumes, tais como soja e ervilhas. Particularmente, o material de planta preferido é obtido a partir de milho (Zea mays). Material de planta po- de incluir variedades híbridas e variedades geneticamente modificadas (por exemplo, milho transgênico, cevada ou soja que compreende genes heteró- logos). Qualquer parte da planta pode ser usada para prover amido granular, incluindo, mas não se limitado a partes de planta tais como folhas, caules, cascas, bulbos, castanhas, grãos e similares. Em algumas modalidades, es- sencialmente a planta inteira pode ser utilizada, por exemplo, o sabugo de milho inteiro pode ser utilizado. Em uma modalidade, o grão inteiro pode ser utilizado como uma fonte de amido granular. Grãos inteiros preferidos inclu- em milho, trigo,centeio, cevada, sorgo e combinações dos mesmo. Em ou- tras modalidades, amido granular pode ser obtido a partir de grãos de cereal fracionados que incluem fibra, endosperma e/ou componentes de germe. Métodos para fracionar material de planta, tal como milho e trigo, são conhe- cidos na técnica. Em algumas modalidades, material de planta obtido a partir de diferentes fontes pode ser misturado para obter amido granular utilizado nos processos da invenção (por exemplo, milho e sorgo ou milho e cevada).

Em algumas modalidades, material de planta que compreende amido granular pode ser preparado por meios tal como moagem. Em particu- lar, meios de moagem de grãos de cereal inteiros são bem-conhecidos e incluem o uso de moinhos de martelo e moinhos a cilindros.

Alfa-amilases

A alfa-amilase pode ser uma enzima única, uma enzima híbrida ou uma mistura de alfa-amilases. Em algumas das modalidades abrangidas pela invenção, a alfa-amilase é uma enzima microbiana que tem um número E.C., E.C.3.2.1.1-3 e em particular E.C.3.2.1.1. qualquer alfa-amilase apro- priada pode ser usada no presente processo. Em algumas modalidades, a alfa-amilase é derivada de uma linhagem bacteriana e em outras modalida- des a alfa-amilase é derivada de uma linhagem fúngica. Em modalidades adicionais, a alfa-amilase preferida é a alfa-amilase bacteriana. Em outras modalidades, a alfa-amilase é uma alfa-amilase estável em ácido. Alfa- amilases adequadas podem ser de ocorrência natural, assim como alfa- amilases recombinantes (híbridas e variantes) e mutantes (WO 99/19467 e WO 97/41213). Em modalidades particularmente preferidas, a alfa-amilase é derivada de uma espécie Bacillus. Espécies Bacillus preferidas incluem B. subtilis, B. stearothermophilus, B. lentus, B. licheniformis, B. coagulans e B. amyloliquefaciens (USP 5,093,257; USP 5,763,385; USP 5,824,532; USP 5,958,739; USP 6,008,026; USP 6,361,809; USP 6,867,031 WO 96/23874; WO 96/39528 e WO 05/001064). Alfa-amilases particularmente preferidas são derivadas de linhagens de Bacillus B. stearothermophilus, B. amylolique- faciens e B. licheniformis (USP 6,187,576; USP 6,093,562; USP 5,958,739; US 2006/0014265 E WO 99/19467).

Alfa-amilases mais preferidas são amilases derivadas de B. ste- arothermophilus e B. licheniformis incluindo enzimas alfa-amilases do tipo selvagem, híbridas e variantes. Ver Suzuki et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:18933-18938 e US 2006/0014265, particularmente SEQ ID Nos: 3, 4 e 16. Referência é também feita a linhagens que têm American Type Culture Collection (ATCC) números - ATCC 39709; ATCC 11945; ATCC 6598; ATCC 6634; ATCC 8480; ATCC 9945A e NCIB 8059.

Em adição às alfa-amilases bacterianas, alfa-amilases fúngicas são contempladas para uso no processo da invenção. Alfa-amilases fúngicas adequadas são derivadas de linhagens de filamentos fúngicos, tais como Aspergillus, tais como A. oryzae e A. niger (por exemplo, FUNGAMYL e CLARASE L), e Trichoderma, Rhizopus, Mucor e Penicillium. Alfa-amilases comercialmente disponíveis, contempladas para uso nos métodos da inven- ção incluem Spezyme AA1 Spezyme Fred, Spezyme Ethyl, Gzyme G997, Clarase L (Genencor International Inc.); Termamyl 120-L, LC, SC e Supra (Novozymes Biotech); Liquozyme X e San Super (Novozymes A/S) e Ultra Thin (Valley Research).

Enzimas de Planta

Plantas que têm ocorrência natural de enzimas que degradam amido, tais como alfa-amilases (EC 3.1.1.1); beta-amilases (EC 3.1.1.2), amiloglucosidases (glicoamilases) (EC 3.1.1.3) e fosforilases de amido (EC 2.4.1.1). Além disso, as plantas podem ter sido criadas por engenharia gené- tica para incluir genes heterólogos que codificam enzimas de degradação de amido, tais como amilases, glicoamilases e outras (WO 03/018766 e WO 05/096804). Enzimas endógenas de degradação de amido de planta, se de ocorrência natural ou expressas a partir de um polinucleotídeo introduzido, com exposição a temperaturas elevadas, tais como as temperaturas de co- zimento contínuo ou mesmo temperaturas acima da temperatura de gelatini- zação do amido granular se tornarão inativas. Entretanto, a temperaturas conduzidas no presente processo, acredita-se que as enzimas endógenas de degradação de amido não são inativadas e, na realidade, contribuem pa- ra a hidrólise do amido granular. Apesar de não baseados em teoria, os in- ventores acreditam que a alfa-amilase provida na etapa de contato modifica a estrutura do amido granular do material de planta permitindo a produção de oligossacarídeos, incluindo dextrinas. Os oligossacarídeos são ainda de- gradados a temperaturas abrangidas pela etapa de contato (por exemplo, 45 °C a 70 °C) por enzimas de degradação de amido de planta. As enzimas de degradação de amido de planta atuam no amido parcialmente hidrolisado para produzir glicose. Embora fontes exógenas de glicoamilases possam ser incluídas na etapa de contato, a adição de glicoamilase exógena não é ne- cessária para proporcionar glicose, que é então opcionalmente usada como uma matéria-prima para fermentação alcoólica. Desse modo, em uma moda- lidade, a etapa de contato da invenção não inclui a adição de glicoamilases derivadas de fontes microbianas. Em uma modalidade adicional, a etapa de contato é realizada sem a adição de enzimas exógenas, particularmente gli- coamilase exógena ou outras enzimas hidrolisantes de oligossacarídeo. Em modalidades adicionais, os oligossacarídeos são hidrolisados apenas por enzimas de planta endógenas de ocorrência natural, específicas ao gênero da planta ou alternativamente específica ao gênero e espécie da planta. En- tretanto, a adição de glicoamilases exógenas e/ou outras enzimas, tais como fitases e proteases, pode aumentar a produção de amido granular solubilizado.

Organismos de Fermentação

Exemplos de organismos de fermentação são microorganismos etanologênicos ou microorganismo produtor de etanol, tal como bactéria e- tanologênica, que expressa álcool desidrogenase e piruvato desidrogenase e que também pode ser obtida a partir de Zymomonas mobilis (vide, por e- xemplo, USP 5,000,000; USP 5,028,539; USP 5,424,202; USP 5,514,583 E USP 5,554,520). Em modalidades adicionais, os microorganismos etanolo- gênicos expressam xilose redutase e xilitol desidrogenase, enzimas que convertem xilose em xylulose. Em outras modalidades, xilose isomerase é usada para converter xilose em xilulose. Em modalidades particularmente preferidas, um microorganismo capaz de fermentar tanto pentoses como hexoses em etanol é utilizado. Por exemplo, em algumas modalidades o mi- croorganismo pode ser um microorganismo natural ou um microorganismo não produzido por engenharia genética ou, em outras modalidades, o micro- organismo pode ser um microorganismo recombinante. Por exemplo, em algumas modalidades, os microorganismos de fermentação preferidos inclu- em linhagens bacterianas de Bacillus1 Lactobacillus, E. coli, Erwinia, Pantoea (por exemplo, P. citrea) e Klebsiella (por exemplo, K. oxytoca). (Ver, por e- xemplo, USP 5,028,539; USP5,424,202 E WO 95/13362).

Em modalidades preferidas adicionais, o microorganismo produ- tor de etanol é um microorganismo fúngico, tal como levedura e especifica- mente Saccharomyces, tais como linhagens de S. cerevisiae (USP 4,316,956). Uma variedade de S. cerevisiae está comercialmente disponível e estas incluem, mas não estão limitadas a, FALI (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), Red Star (Lesaffre) e levedura de álcool Angel (Angel Yeast Company, China).

Enzimas Secundárias

Embora em uma modalidade seja contemplado que enzimas hi- drolisantes de amido adicionais não são necessárias e, portanto não incluí- das na etapa de contato, enzimas adicionais podem ser incluídas tanto na etapa de contato quanto na etapa de fermentação abrangidas pela invenção. Em algumas modalidades, estas enzimas serão incluídas como uma ou mais enzimas secundárias na etapa de contato, que compreende contatar a pasta fluida de amido granular com uma alfa-amilase e uma ou mais enzimas se- cundárias. Em outras modalidades, as enzimas adicionais serão incluídas na etapa de fermentação junto com levedura e outras componentes.

Em algumas modalidades, durante a etapa de contato com a alfa-amilase, a enzima secundária pode incluir uma glicoamilase, enzimas hidrolisantes de amido granular, uma protease, uma fitase, uma celulase, uma hemicelulase, uma pululanase, uma xilanase, uma lipase, uma cutina- se, uma pectinase, uma beta-glucanase, uma beta amilase, uma ciclidextrina trans glicosil transferase e combinações das mesmas. Em algumas modali- dades preferidas, a etapa de contato irá incluir uma combinação de uma al- fa-amilase, uma fitase e opcionalmente uma protease. Em outras modalida- des, a etapa de contato irá incluir uma combinação de uma alfa-amilase, uma glicoamilase e opcionalmente uma protease. Ainda em outras modali- dades, a etapa de contato irá incluir uma combinação de uma alfa-amilase, uma glicoamilase, uma fitase e opcionalmente uma protease.

Glicoamilases (GA) (E.C. 3.2.1.3) podem ser derivadas de ex- pressão de proteína heteróloga ou endógena de fontes de bactéria, de plan- tas e de fungo. Glicoamilases preferidas úteis nas composições e métodos da invenção são produzidas por diversas linhagens de fungos e leveduras filamentosos. Em particular, glicoamilases separadas de linhagens de As- pergillus e Trichoderma são comercialmente importantes. Glicoamilases a- dequadas incluem glicoamilases do tipo selvagem de ocorrência natural as- sim como glicoamilases criadas por engenharia genética variantes e mutan- tes. As glicoamilases seguintes são exemplos não Iimitantes de glicoamila- ses que podem ser usadas no processo abrangido pela invenção. Glicoami- lase de Aspergillus niger G1 e G2 (Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097; WO 92/00381, WO 00/04136 e USP 6,352,851); glicoamilases de Aspergillus awamori (WO 84/02921); glicoamilases de Aspergillus oryzae (Hata et al., (1991) Agric. Biol. Chem. 55:941-949) e Aspergillus shirousami. (Ver Che net al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8:575-582 e Che net al., (1994) Biochem J. 302:275-281).

Glicoamilases são também obtidas a partir de linhagens de Tala- romyces, tais como aquelas derivadas de T. emersonii, T. leycettanus, T. duponti e Τ. thermophilus (WO 99/28488; USP N5 RE: 32,153; USP Ne 4,587,215); linhagens de Trichoderma, tais como T. reesei e particularmente glicoamilases que possuem pelo menos 80%, 85%, 90% e 95% de identida- de de seqüência com a SEQ ID N0:4 descritas na Publicação da Patente US Ne 2006/0094080; linhagens de Rhizopus, tais como R. niveus e R. oryzae; linhagens de Mucor e linhagens de Humicola, tais como H. grisea (Ver, Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136; Che net al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Taylor et al., (1978) Carbohydrate Res. 61:301-308; Patente US NQ, 4,514,496, Pat. US Nq 4,092,434 e Jensen et al., (1988) Can J. Microbiol. 34:218-223). Outras glicoamilases úteis na presente invenção incluem aquelas obtidas a partir de Athelia rolfsii e variantes das mesmas (WO 04/111218).

As enzimas que possuem atividade de glicoamilase comercial- mente utilizadas são produzidas, por exemplo, a partir de Aspergillus niger (nome comercial DISTILLASE, OPTIDEX L-400 e G ZYME G990 4X da Ge- nencor International Inc.) ou espécie Rhizopus (nome comercial CU.CONC da Shin Nihon Chemicals, Japão). Também a enzima digestiva comercial, nome comercial GLUCZYME da Amano Pharmaceuticals, Japão (Takahashi et al., (1985) J. Biochem. 98:663-671). Enzimas adicionais incluem três for- mas de glicoamilase (E.C.3.2.1.3) de um Rhizopus sp., a saber "Glucl" (MW 74.000), "Gluc2" (mw 58.600) e "Gluc3" (MW 61.400). A preparação de en- zima GC480 (Genencor International Inc.) também encontra uso na invenção.

Enzimas hidrolisantes de amido granular (GSHEs) são capazes de hidrolisar amido granular, e estas enzimas têm sido recuperadas a partir de células fúngicas, bacterianas e de planta, tais como Bacillus sp., Penicilli- um sp., Humicola sp., Trichoderma sp., Aspergillus sp., Mucor sp. e Rhizo- pus sp. Em outra modalidade, um grupo particular de enzimas que possuem atividade GSH incluem enzimas que possuem atividade de glicoamilase e/ou atividade de alfa-amilase (Ver, Tosi et al., (1993) Can. J. Microbiol. 39:846- 855). Uma GSHE de Rhizopus oryzae foi descrita em Ashikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957-964 e USP 4,863,864. Uma GSHE de Humicola grisea foi descrita em Allison et al., (1992) Curr. Genet. 21:225-229; WO 05/052148 e Patente Européia N9 171218. Uma GSHE de Aspergilus awa- mori var. kawachi foi descrita por Hayashida et al., (1989) Agric. Biol. Chem 53:923-929. Uma GSHE de Aspergillus shirousami foi descrita por Shibuya et al., A (1990) Agric. Biol. Chem. 54:1905-1914.

Em uma modalidadei uma GSHE pode ter atividade de glicoami- Iase e é derivada de uma linhagem de Humicola grisea, particularmente uma linhagem de Humicola grisea var. thermoidea (vide, USP 4,618,579). Em algumas modalidades preferidas, a enzima de Humicola que tem atividade de GSH terá pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 do WO 05/052148.

Em outra modalidade, uma GSHE pode ter atividade de glicoa- milase e é derivada de uma linhagem de Aspergillus awamori, particularmen- te uma A. awamori var. kawachi. Em algumas modalidades preferidas, a en- zima de A. awamori var. kawachi que tem atividade de GSH terá pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüên- cia com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 do WO 05/052148.

Em outra modalidade, uma GSHE pode ter atividade de glicoa- milase e é derivada de uma linhagem de Rhizopus, tal como R. niveus ou R. oryzae. A enzima derivada da linhagem de Koji R. niveus é vendida sob o nome comercial "CU CONC" ou a enzima de Rhizopus vendida sob o nome comercial GLUZYME.

Uma outra GSHE útil que tem atividade de glicoamilase é SPI- RIZYME Plus (Novozymes A/S), que também inclui atividade de amilase fúngica ácida.

Em outra modalidade, uma GSHE pode ter atividade de alfa- amilase e é derivada de uma linhagem de Aspergillus, tal como uma linha- gem de A. awamori, A. niger, A. oryzae ou A. kawachi e particularmente uma linhagem de A. kawachi.

Em algumas modalidades preferidas, a enzima de A. kawachi que tem atividade de GSH terá pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de ami- noácido da SEQ ID NO: 3 do WO 05/118800 e WO 05/003311.

Em algumas modalidades, a enzima que tem atividade de GSH é uma enzima híbrida, por exemplo uma que contém um domínio catalítico de uma alfa-amilase, tal como um domínio catalítico de uma alfa-amilase de Aspergillus niger, uma alfa-amilase de Aspergillus oryzae ou uma alfa- amilase de Aspergillus kawachi e um domínio de ligação de amido de uma alfa-amilase ou glicoamilase fúngica diferente, tal como um domínio de liga- ção de amido de Aspergillus kawachi ou Humicola grisea. Em outras modali- dades, a enzima híbrida que tem atividade de GSH pode incluir um domínio catalítico de uma glicoamilase, tal como um domínio catalítico de um Asper- gillus sp., um Talaromyces sp., am Althea sp., um Trichoderma sp. ou um Rhizopus sp e um domínio de ligação de amido de uma glicoamilase ou uma alfa-amilase diferente. Algumas enzimas híbridas que têm atividade de GSH estão descritas em WO 05/003311, WO 05/045018; Shibuya et al., (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56: 1674 - 1675 and Cornett et al., (2003) Protein Engineering 16:521 - 520.

Proteases adequadas incluem proteases microbianas, tais como proteases fúngicas e bacterianas, por exemplo, proteases fúngicas ácidas tais como NSP24 e também GC106 (Genencor International Inc.). Proteases fúngicas preferidas são derivadas de linhagens de Aspergillus (por exemplo, proteases de A. niger e A. oryzae), Mucor (por exemplo, M. miehei), Tricho- derma, Rhizopus e Candida. Proteases bacterianas preferidas são derivadas de linhagens de Bacillus, tal como B. amyloliquefaciens. Proteases adicionas à fermentação podem aumentar o nível de nitrogênio e amino livres e au- mentar a velocidade do metabolismo da levedura e ainda proporcionar maior eficiência de fermentação.

Enzimas que podem ser usadas nos métodos da invenção inclu- em beta-amilases (E.C. 3.2.1.2). Estas são amilases maltogênicas de ação- exo, que catalisam a hidrólise das ligações 1,4-alfa-glicosídicas em amilose, amilopectina e polímeros de glicose relacionados. Beta-amilases comerciais estão disponíveis de Genencor International Inc., e exemplos incluem SPEZYME BBA e OPTIMALT BBA.

Celulases (E.C.3.2.1.4), tais como endoglucanases, podem ser usadas nos métodos da invenção. Exemplos de celulases incluem celulases de fungos filamentosos, tais como Trichoderma, Humicola, Fusarium e As- pergillus. Celulases comerciais estão disponíveis como SPEZYME CP e LAMINEX (Genencor International, lnc) e CELLUZYME e ULTRAFLO (No- vozymes A/S).

Xilanases úteis nos métodos da invenção podem ser de fontes bacterianas ou fúngicas, tais como Aspergillus, Trichoderma, Neurospora e Fusarium. Preparações comerciais incluem SPEZYME CP e LAMINEX (Ge- nencor International, Inc.) e ULTRAFLO (Novozymes A/S).

Um número de fitases bacterianas e fúngicas (E.C.3.1.3.8 e 3.1.3.26) é conhecido e em algumas modalidades a adição de fitases é par- ticularmente útil nos métodos. Fitases de leveduras podem ser derivadas de linhagens de Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae) e Schwanniomy- ces (por exemplo, S. occidentalis) (Wodzinski et a!., Adv. Apple. Microbiol., 42:263-303). Outras fitases fúngicas foram descritas na literatura e referên- cia é feita a Wyss et al., (1999) Appl. Environ Microbiol. 65:367 - 373; Berka et al., (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64: 4423 - 4427; Yamada et ah, (1986) Agric. Biol. Chem. 322:1275 - 1282; (Publicação Nos. WO 98/28408; WO 98/28409; WO 97/38096 e WO 9844125; e Patentes U.S. Nos. 6,734,004; 6,350,602 e 5,863,533). Fitases fúngicas são derivadas de Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. awamori, A. terreus, A. oryzea e A. fumigatus); Ther- momyces (Humicola) lanuginousus; Fusarium (F. javanicum e F. versillibo- des). Fitases bacterianas também podem ser úteis na invenção (Greiner R. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 303: 107 -1 13; Yoon S.J. et al. (1996) Enzyme and Microbial Technol. 18: 449 - 454; e WO 06/043178).

Fitases comercialmente disponíveis que podem ser usadas, de acordo com a invenção, incluem PHYZYMEXP 5000 (Danisco AJS); FINASE (Altech); GC 491; FINASE, SPEZYME HPA (Genencor), BIO-FEED PHYTA- SE e PHYTASE NOVO (Novozymes) e NATUPHOS (DSM).

Um versado na técnica pode prontamente determinar a quanti- dade eficaz das enzimas que pode ser utilizada nas etapas de processo a- brangidas pela invenção.

Etapas de Processo

O amido granular (por exemplo, grão de cereal moído) a ser pro- cessado é misturado com uma solução aquosa para obter uma pasta fluida. A solução aquosa pode ser obtida, por exemplo, a partir de água, "thin stilla- ge" e/ou "backset".

Uma pasta fluida pode ter um DS entre 5 - 60%, 10 - 50%; 15 - 45%; 15- 30%; 20 - 45%; 20 - 30% a também 25 - 40%. A etapa de contato com uma alfa-amilase é conduzida em uma faixa de pH de 3.5 a 7,0; tam- bém em uma faixa de pH de 3,5 a 6,5; preferencialmente em uma faixa de pH de 4,0 a 6,0 e mais preferencialmente em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5. A pasta fluida é mantida em contato com a alfa-amilase a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização de amido do amido granular. Em algumas modalidades, esta temperatura é mantida entre 45°C e 70°C; em outras modalidades, a temperatura é mantida entre 50°C e 70°C; entre 55°C e 70°C; entre 60°C e 70°C, entre 60°C e 65°C; entre 55°C e 65°C e entre 55°C e 68 °C. Em modalidades adicionais, a temperatura é pelo me- nos 45 °C, 48 °C, 50°C, 53°C, 55°C, 58°C, 60°C, 63°C, 65°C e 68°C. Em outras modalidades, a temperatura não é maior do que 65°C, 68°C, 70°C, 73°C, 75°C e 78 °C.

As faixas de temperatura inicial de gelatinização do amido para vários amidos granulares que podem ser utilizados de acordo com os pre- sentes processos incluem cevada (52°C a 59°C), trigo (58°C a 64°C), cen- teio (57°C a 70°C), milho (62 0C a 72°C), milho de alta amilose (67°C a 80 °C), arroz (68°C a 77°C), sorgo (68°C a 77°C), batata (58°C a 68°C), ta- pioca (59°C a 69°C) e batata doce (58°C a 72°C). (J.J.M. Swinkels pp 32 - 38 em STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Eds Van Beymim et al., (1985) Mareei Dekker Inc. New York e The Alcohol Textbook 3rd ED. A Refe- rence for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK).

Na etapa de contato, a pasta fluida pode ser mantida em contato com a alfa-amilase por um período de 5 minutos a 48 horas; e também por um período de 5 minutos a 24 horas. Em algumas modalidades, o período de tempo é entre 15 minutos e 12 horas, 15 minutos e 6 horas, 15 minutos e 4 horas e também 30 minutos e 2 horas.

A concentração eficaz de alfa-amilase usada na etapa de conta- to irá variar de acordo com as condições específicas do processo e o amido granular utilizado. Entretanto, em geral a quantidade de alfa-amilase usada irá variar de 0.001 a 50 AAU/g DS, 0,01 a 30 AAU/g DS, 0,01 a 10 AAU/g DS e também 0,05 e 5,0 AAU/g DS.

Em algumas modalidades, a dose eficaz de uma alfa-amilase na etapa de contato e/ou etapa de fermentação será 0,01 a 15 SSU/g DS; tam- bém 0.05 a 10 SSU/g DS; também 0,1 a 10 SSU/g DS; e 0,5 a 5 SSU/g DS.

Em algumas modalidades, a dose eficaz de uma glicoamilase para a etapa de contato e/ou etapa de fermentação será na faixa de 0,01 a 15 GAU/g DS; também 0,05 a 10 GAU/g DS; também 0,1 a 10 GAU/g DS e até 0,5 a 5 GAU/g DS.

Em algumas modalidades, a dose eficaz de uma fitase a ser u- sada na etapa de contato e/ou fermentação será na faixa de 0,001 a 15 FTU/g DS; também 0,005 a 10 FTU/g DS; e também 0,05 a 5 FTU/g DS. Uma unidade de fitase (FTU) é a quantidade de enzima que libera 1 micro- mol de fósforo inorgânico por minuto de fitato de sódio, 0,0051 moles/litro, a 37 °C e em um pH 5,0.

Em algumas modalidades, a dose eficaz de uma protease a ser utilizada na etapa de contato e/ou fermentação será na faixa de 0,01 a 15 SAPU/g DS; também 0,01 a 10 SAPU/g DS; e também 0,05 a 5 SAPU/g DS. SAPU refere-se a unidade de protease ácida espectrofotométrica, em que 1 SAPU é a quantidade de atividade da enzima protease que libera um micro- mol de tirosina por minuto a partir de um substrato caseína, sob condições de teste.

Durante a etapa de contato, entre 25 - 90% do amido granular é solubilizado para produzir oligossacarídeos que compreendem dextrina. Em algumas modalidades, mais do que 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% e 90% do amido granular é solubilizado.

Após contato do amido granular com a alfa-amilase por um perí- odo de tempo como indicado acima, um substrato de amido solúvel (massa) é obtido, o qual compreende mais do que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% e 80% de glicose.

Em algumas modalidades preferidas da etapa de contato, uma pasta fluida compreendendo amido de milho granular que tem um DS de 20 - 40% é contatada com uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearother- mophilus ou Bacillus licheniformis por 1 a 6 horas, a uma temperatura entre 55°C a 70°C para obter um substrato de amido solúvel que compreende pelo menos 30% de glicose. Em outras modalidades preferidas da etapa de con- tato, uma pasta fluida compreendendo amido de sorgo granular que tem um DS de 20 - 40% é contatada com uma alfa-amilase derivada de Bacillus ste- arothermophilus ou Bacillus Iieheniformis por 1 a 6 horas, a uma temperatura entre 55 °C a 70 °C para obter um substrato de amido solúvel que compre- ende pelo menos 50% de glicose.

Após a etapa de contato, que resulta na produção de uma mas- sa que compreende glicose, a massa é submetida à fermentação com um microorganismo de fermentação (por exemplo, um microorganismo produtor de etanol).

Entretanto, antes de submeter a massa incluindo pelo menos 10% de glicose à fermentação, a massa pode ser ainda exposta a uma solu- ção aquosa que compreende, por exemplo, "backset" e/ou maceração de milho e ajustada a um pH na faixa de pH 3,0 a 6,0; pH 3,5 a 5,5, ou pH 4,0 a 5,5. Nesta configuração da invenção, a % de DS da massa pode ser diluída. Por exemplo, o DS da massa diluída pode estar entre 5 a 35%; 5 a 30%; 5 a 25%; 5 to 20%; 5 to 20%; 5 to 15%; e 5 a 10% menos do que a % de DS da pasta fluida na etapa de contato. Em um exemplo não-limitativo, se a % de DS da pasta fluida na etapa de contato é aproximadamente 32% e a massa é adicionalmente exposta a uma solução aquosa de diluição que dilui o DS entre 5 a 10%, o DS da massa a ser fermentada estará entre 22% e 27%. Em algumas modalidades preferidas, se o DS da pasta fluida de contato está entre 30 a 35%, o DS da pasta fluida diluída será cerca de 20 a 30%.

Em uma modalidade preferida, a massa que compreende pelo mesmo 10% de glicose é então submetida a processos de fermentação u- sando microorganismos de fermentação como descrito acima. Estes proces- sos de fermentação estão descritos em The Alcohol Textbook 3rd ED, A Re- ference forthe Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK.

Em algumas modalidades preferidas, a massa é fermentada com uma levedura a temperaturas na faixa de 15 a 40°C e também 25 a 35°C, em uma faixa de pH de pH 3,0 a 6,5, também pH 3,0 a 6,0, pH 3,0 a 5,5, pH 3,5 a 5,0 e também pH 3,5 a 4,5 por um período de tempo de 12 a 240 ho- ras, preferentemente 12 a 120 e mais preferentemente de 24 a 90 horas pa- ra produzir um produto alcoólico, preferivelmente etanol.

Células de levedura são geralmente providas em quantidades de 104 a 1012, e preferivelmente de 107 a 1010 de contagem de levedura viável por ml de caldo de fermentação. A fermentação irá incluir, além de um mi- croorganismo de fermentação (por exemplo, levedura), nutrientes, opcional- mente ácido e enzimas adicionais.

Em uma modalidade preferida, a etapa de contato é conduzida em um recipiente separado da etapa de fermentação. Também é esperado que a etapa de contato e a etapa de fermentação possam ser conduzidas em um processo SSF no mesmo recipiente.

Em algumas modalidades, em adição aos materiais brutos des- critos acima, o meio de fermentação irá conter suplementos que incluem, mas não estão limitados a vitaminas (por exemplo, biotina, ácido fólico, ácido nicotínico, riboflavina), cofatores e macro e micronutrientes e sais (por e- xemplo, (NH4)2SO4; K2HPO4; NaCI; MgSO4; H3BO3; ZnCI2 e CaCI2).

Enzimas adicionais a serem incluídas na etapa de fermentação podem ser as mesmas ou diferentes das enzimas usadas na etapa de conta- to. Em algumas modalidades, a enzima irá incluir alfa-amilases e glicoamila- ses, incluindo enzimas hidrolisantes de amido granular. Em algumas modali- dades preferidas, a glicoamilase e alfa-amilase pode ocorrer em uma combi- nação. Combinações de enzima particularmente preferidas incluem STAR- GEN 001 (Genencor International Inc.), que é uma combinação de uma alfa- amilase de a. kawachi e uma glicoamilase de A. niger. Em algumas modali- dades preferidas, a glicoamilase será derivada de uma glicoamilase de Tri- choderma reesei, uma glicoamilase de Athelia rolfi, uma glicoamilase de Ta- laromyces, uma glicoamilase de Aspergillus e glicoamilases híbridas e vari- antes derivadas das mesmas. Em algumas modalidades preferidas, a enzi- ma é selecionada dentre uma celulase, uma fitase e uma protease.

Recuperação de Álcool e Outros Produtos Finais

O produto final preferido do processo de fermentação imediato é um produto alcoólico, preferivelmente etanol. O produto final produzido de acordo com o processo pode ser separado e/ou purificado do meio de fer- mentação. Métodos para separação e purificação são conhecidos, por e- xemplo submetendo-se o meio à extração, destilação e cromatografia em coluna. Em algumas modalidades, o produto final é diretamente identificado submetendo-se o meio à análise de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

Em modalidades adicionais, a massa pode ser separada, por exemplo, por centrifugação em fase líquida e fase sólida e produtos finais tais como álcool e sólidos recuperados. O álcool pode ser recuperado por meios tais como destilação e desidratação em peneira molecular ou ultra- filtração.

Em algumas modalidades, a produção de etanol será maior do que 8%, 10%, 12%, 14%, 16% e 18% por volume. O etanol obtido de acordo com o processo da invenção pode ser usado como etanol combustível, eta- nol potável ou etanol industrial.

Em modalidades adicionais, o produto final pode incluir os sub- produtos de fermentação, tais como grãos secos destilados (DDG) e grãos secos destilados mais solúveis (DDGS), que podem ser usados como ali- mentação animal.

Experimental Os exemplos seguintes são proporcionados a fim de demonstrar e também ilustrar certos aspectos e modalidades preferidas da presente in- venção e não devem ser tidos como Iimitantes da mesma. De fato, é espe- rado que estes ensinamentos sejam utilizados para otimizar os sistemas de processo descritos aqui.

Na seção descrição e experimental que segue, as seguintes a- breviações se aplicam: GA (glicoamilase); wt% (por cento em peso); °C (graus Centrígrados); H2O (água); dH20 (água deionizada); dlH20 (água deionizada, filtragem Milli-Q); g ou gm (gramas); pg (microgramas); mg (mili- gramas); kg (kilogramas); μΙ (microlitros); ml e mL (mililitros); mm (milíme- tros); pm (micrômetros); M (molar); mM (milimolar); μΜ (micromolar); U (uni- dades); MW (peso molecular); sec (segundos); min(s) (minuto/minutos); hs(s) (hora/horas); DO (oxigênio dissolvido); P/V (peso por volume); P/P (pe- so por peso); V/V (volume por volume); Genencor (Genencor International, Inc., Palo Alto, CA); MT (tonelada) e ETOH (etanol).

As seguintes preparações de enzima foram usadas nos exem- plos abaixo:

SPEZYME Ethyl (disponível pela Genencor) - uma alfa-amilase bacteriana obtida a partir de uma linhagem geneticamente modificada de Bacillus licheniformis.

GC100 - uma alfa-amilase bacteriana experimental descrita em US 2006/0014265.

Glicoamilase de Humicola grisea (HGA) que tem a seqüência de aminoácido descrita como SEQ ID NO: 3 do WO 2005/052148.

STARGEN 001 (disponível pela Genencor) - uma combinação de glicoamilase de Aspergillus nigere alfa-amilase de Aspergillus kawachi.

Os seguintes testes foram usados nos exemplos abaixo:

A atividade de alfa-amilase é expressa como unidades de alfa- amilase (AAU) e a atividade enzimática foi determinada pela velocidade de hidrólise do amido, como refletido na velocidade de diminuição da capacida- de de coloração por iodo, que foi medida espectrofotometricamente. Uma AAU de atividade de alfa-amilase bacteriana é a quantidade de enzima ne- cessária para hidrolisar 10 mg de amido por minuto, sob condições padronizadas.

Atividade de alfa-amilase feita também determinada como uni- dade de amido solúvel (SSU) e é baseada no grau de hidrólise do substrato de amido de batata solúvel (4% de DS) por uma alíquota da amostra de en- zima em pH 4,5, 50 °C. O teor de açúcar redutor é medido usando o método DNS, como descrito em Miller, G.L. (1959) Anal. Chem. 31:426-428. Uma unidade de atividade enzimática (SSU) é equivalente ao poder de redução de 1 mg de glicose liberado por minuto nas condições de incubação específicas.

Atividade de glicoamilase foi medida usando um teste bem co- nhecido, que é baseado na habilidade da glicoamilase para catalisar a hidró- lise de p-nitrofenil-alfa-D-glicopiranosídeo (PNPG) em glicose e p-nitrofenol. Em um pH alcalino, o nitrofenol forma uma coloração amarela que é propor- cional à atividade de glicoamilase e é monitorada a 400 nm e comparada com um padrão de enzima medido como um GAU.

Uma "Unidade de Atividade de Glicoamilase" (GAU) é a quanti- dade de enzima que irá produzir 1 gm de açúcar redutor, calculado como glicose por hora de um substrato de amido solúvel (4% de DS), em pH 4,2 e 60 °C.

Brix, a medida de teor de sólido solubilizado total a uma dada temperatura foi determinada por medição com um Refratômetro.

Determinação do teor de amido total: o processo de liquefação e sacarificação do amido enzima-enzima foi usado para determinar o teor de amido total. Em uma análise típica, 2 g de amostra seca foram tomados em um balão tipo Kohlrausch de 100 ml e 45 ml de tampão MOPS (122), pH 7,0 foram adicionados. A pasta fluida foi bem agitada por 30 minutos. SPEZYME FRED (diluído em água a 1:50) (Genencor), 1,0 ml foi adicionado e aquecido até a fervura por 3-5 minutos. O balão foi colocado em uma autoclave manti- da a 121 °C for 15 minutos. Após autoclave, o balão foi colocado em um ba- nho de água a 95 °C e 1 ml de SPEZYME FRED diluído a 1:50 foi adiciona- do e incubado por 45 minutos. O pH foi ajustado para pH 4.2 e a temperatu- ra foi reduzida para 60 °C. Isto foi seguido pela adição de 20 ml de tampão acetato, pH 4,2. A sacarificação foi realizada adicionando-se 1,0 ml de OP- TIDEX L-400 diluído a 1:100 (Genencor) e a incubação foi continuada por 18 horas a 60°C. A reação da enzima foi terminada pelo aquecimento a 95°C por 10 minutos. A composição de açúcar total foi determinada por análise da HPLC usando glicose como um padrão. O hidrolisado de amido solúvel de extração de água de uma amostra à temperatura ambiente sem tratamento enzimático foi subtraído do açúcar total.

Determinação da porcentagem de sólidos solubilizados - uma amostra de 7 ml foi colocada em um pequeno tubo de ensaio com tampa de rosca (pH ajustado para 5,0 a 6,0) e 0,007 ml de SPEZYME Fred foi adicio- nado ao tubo. O tubo de ensaio foi colocado em um banho de água fervente por 10 minutos e suavemente misturado em diferentes tempos durante a incubação. Após 10 minutos, o tubo foi removido e colocado em um banho de água a 80 0C por 1 hora. O tubo foi resfriado e centrifugado. O Brix do sobrenadante foi determinado e comparado com uma amostra de controle. A porcentagem de sólidos solubilizados = Brix de controle χ 100/Brix de amos- tra.

Determinações de etanol e carboidrato das amostras foram esti- puladas usando o método de HPLC, como segue:

Um tubo de centrífuga Eppendorf de 1,5 mL foi preenchido com a massa do fermentador e resfriado com gelo por 10 minutos; o tubo de a- mostra foi centrifugado por 1 minuto em uma centrífuga de mesa Eppendorf; uma amostra de 0,5 mL do sobrenadante foi transferida para um tubo de ensaio contendo 0,005 mL a 1,1 N H2SO4 e deixado descansar por 5 minu- tos; 5,0 mL de água foi adicionado ao tubo de ensaio e então a amostra foi filtrada em um frasco de HPLC através do filtro para seringa de náilon de 0,2 pm; e continua em HPLC. As condições de HPLC incluem:

Sistema de etanol: Coluna: coluna de ácido orgânico Phenome- nex Rezex (RHM-Monossacarideo) nQ00H 0132-KO (Equivalente a Bio-Rad 87H); Temperatura da coluna: 60°C; Fase Móvel: 0,01 N H2SO4; Vazão: 0,6 mL/min; Detector: RI; e Volume de Injeção: 20 pL. Sistema de carboidrato: Coluna: carboidrato Phenomenex Rezex (RCM-Monossacarídeo) n°00H-0130-K0 (Equivalente a Bio-Rad 87H); Tem- peratura da coluna: 70 °C; fase móvel: Dl H2O Nanopure; Vazão: 0,8 mL/min; Detector: RI; Volume de Injeção: 10 μl (3% de material DS).

A coluna separada com base no peso molecular dos sacarídeos, que foram designados como DP1 (glicose); DP2 (dissacarídeos); DP3 (tris- sacarídeos) e DP>3 (açúcares de oligossacarídeo que têm um grau de poli- merização maior do que 3).

Exemplo 1

Solubilização e Produção de Etanol a Partir de Amido Granular de Milho Moído Inteiro e Milho Fracionado

Esta experiência foi realizada em três diferentes substratos de amido granular de milho (A) 370 g de milho moído inteiro que tem um teor de umidade de 13,3%; (B) 354,2 g de endosperma de milho que tem um teor de mistura de 9,2%; e (C) amido de milho refinado obtido a partir de um teor de umidade de 11,8%. Cada substrato foi pesado e transferido para um recipi- ente de aço inoxidável para formar 1000 g de pasta fluida final com água correspondendo a 32% de DS.

O pH da pasta fluida foi ajustado para pH 5.5 usando 6N H2SO4. GC100 (4,0 AAU/g DS) foi adicionado. A temperatura foi mantida em 60 °C. Durante a incubação, a pasta fluida foi suavemente agitada com um agitador mecânico (overhead mixer). Após intervalos de tempo de 2, 4, 6, 12 e 24 horas, o Brix, porcentagem de amido solubilizado e composições de açúcar (% P/P) foram determinados e os resultados estão ilustrados na Tabela 1.

Em 24 horas, 79,1%, 71,1% e 60,0% do amido granular de milho moído in- teiro, endosperma e açúcar refinado foram respectivamente solubilizados durante a etapa de contato. A % de glicose do hidrolisado em 24 horas foi 65,22% para milho moído inteiro, 49,64% para endosperma e apenas 5,79% para amido refinado.

Tabela 1 <table>table see original document page 29</column></row><table>

Após 24 horas, usando as amostras de milho moído inteiro (32% de DS), fermentações de levedura foram conduzidas em pH 4,2, 32°C na presença de 400 ppm de uréia; levedura Red Star Red (Fermentus); STAR- GEN 001 e 0.1 SAPU/g DS de protease em um balão de 125 ml. Dados da HPLC estão ilustrados na tabela 2.

Tabela 2

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Exemplo 2 Solubilizacão e Produção de Etanol a Partir de Amido Granular de Sorqo

Dois pré-tratamentos foram realizados: (A) 160 g de sorgo moído inteiro que tem um teor de umidade de 11,6% e um teor de amido total de 53,3% foram pesados e transferidos para um recipiente de aço inoxidável contendo 340 g de água. O pH da pasta fluida foi ajustado para pH 5,5 u- sando ácido sulfúrico a 6 N. SPEZYME Ethyl (1.0 AAU/g DS) foi adicionado. A temperatura foi mantido em 62 °C e 32% de DS. (B) HGA foi incluído no pré-tratamento, conforme descrito acima em (A), no equivalente de 0,1 GAU HGA/g DS. A porcentagem de sólidos solubilizados e a porcentagem de gli- cose estão apresentadas na Tabela 3.

Tabela 3

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A matéria-prima (massa) do pré-tratamento de HGA descrito a - cima foi avaliada sob condições de fermentação de levedura regulares (por exemplo, Levedura Red Star, pH 4.2, 32 °C, na presença de 400 ppm de uréia; STARGEN 001 e 0.05 SAPU/g DS) em um balão de 125 ml. Os resul- tados da HPLC estão ilustrados na Tabela 4. Tabela 4

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Exemplo 3

Efeito da Temperatura na Produção de Glicose a Partir de Sorgo Moído In- teiro

Incubação de 30% de DS de uma pasta de fluida aquosa de sor- go moído inteiro, em pH 5,5, que contém GC100 (4,0 AAU/g DS), foi realiza- da a 60°C, 65 0C e 70°C. Após 6 horas da incubação, as amostras foram retiradas e centrifugadas para separar os insolúveis. A composição do Brix e da HPLC do sobrenadante claro foi medida. A porcentagem de amido solubi- lizado e a porcentagem de glicose foram determinadas e os resultados estão ilustrados na Tabela 5.

Tabela 5

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Como a temperatura de incubação aumentou de 60°C para 70°C durante a etapa de contato com o sorgo moído inteiro, o teor de solubili- zação do amido e da glicose diminui. Isto sugere que a alfa-amilase pode ser inativada a 70°C. Mais do que 50% do amido solubilizado foi hidrolisado em glicose a 65°C, que sugere que as enzimas hidrolisantes de amido de plan- ta endógenas são capazes de hidrolisar os oligossacarídeos em glicose.

A matéria-prima do pré-tratamento descrito acima a 65°C foi avaliada sob condições de fermentação regulares, conforme essencialmente descrito no exemplo 2; com exceção da porcentagem de DS que foi de 30%. Os resultados estão ilustrados na Tabela 6.

Tabela 6 <table>table see original document page 32</column></row><table>

Exemplo 4

Solubilização de Produção de Etanol a Partir de Amido Granular de Milho

Grão de milho (116 g) tendo um teor de amido de 81,5%; um teor de umidade de 14% e um tamanho de partícula que passa através de uma tela de malha 30 foi misturado com 284 g de água para formar uma pasta fluida de 25% de DS. GC100 (4,0 AAU/g DS) foi adicionado à pasta fluida. A temperatura foi mantida em 65 °C e o pH ajustado para pH 5.5. O Brix foi medido em 2, 4, 6 e 24 horas. A porcentagem de amido solúvel e a porcentagem de glicose foram determinadas e os resultados estão ilustrados na Tabela 7.

Tabela 7

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Após 24 horas, fermentações de levedura foram conduzidas em pH 4,2, 30 °C, na presença de 0,75 GAU/g DS de STARGEN 001, 400 ppm de uréia e levedura Angel (Jiangxi, China) a 0,4%.

Amostras da HPLC foram tomadas em 24, 48 e 67 horas (Tabela 8). Tabela 8

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Claims (31)

1. Método de produção de glicose a partir de substrato de amido granular que compreende, a) contatar uma pasta fluida que compreende amido granular obtido a partir de um material de planta com uma alfa-amilase a uma tempe- ratura abaixo da temperatura de gelatinização do amido granular para pro- duzir oligossacarídeos e permitir que enzimas hidrolisantes de amido de planta endógenas hidrolisem os oligossacarídeos, e b) produzir uma massa que compreende pelo menos 10% de glicose, em que a etapa de contato é conduzida por um período de 5 minutos a 48 horas, em um pH de 3,5 a 7,0.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, também compreen- dendo: c) fermentar a massa na presença de microorganismos de fer- mentação e enzimas hidrolisantes de amido a temperaturas entre 10°C e 40°C, por um período de tempo de 10 horas a 250 horas para produzir álcool.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a alfa- amilase é derivada de um Bacillus stearothermophilus, um Bacillus Iicheni- formis ou um Bacillus amyloliquefaeiens.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a quantida- de de alfa-amilase fornecida na etapa de contato é entre 0,001 a 10,0 AAU/g DS.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a tempera- tura é entre 50°C e 70°C.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a massa compreende pelo 30% de glicose.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o material de planta é milho, sorgo, cevada, trigo, arroz ou combinações dos mesmos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o material de planta é milho fracionado.

9. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que o álcool é etanol.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, também compre- endendo recuperação do etanol.

11. Processo para produção de etanol compreendendo: a) contatar uma pasta fluida que compreende amido granular obtido a partir de material de planta com uma alfa-amilase capaz de solubili- zar amido granular, em que o dito contato é em um pH de 3,5 a 7,0, a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização de amido do amido gra- nular, e por um período de 5 minutos a 24 horas. b) obter um substrato compreendendo mais do que 20% de glicose, e c) fermentar o substrato na presença de um microorganismo de fermentação e enzimas hidrolisantes de amido, a uma temperatura entre 10 °C e 40 °C, por um período de 10 horas a 250 horas, para produzir etanol.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, também com- preendendo a recuperação do etanol.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que a alfa- amilase é uma alfa-amilase bacteriana.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, em que a alfa- amilase é derivada de um Bacillus stearothermophilus, um Bacillus Iicheni- formis ou um Bacillus amyloliquefaeiens.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que a etapa de contato é conduzida a uma temperatura entre 50 °C e 70 °C.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, em que a tem- peratura está entre 60 °C e 70 °C.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que a etapa de contato é conduzida em um pH entre 5,0 e 6,0.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que a etapa de contato é por um período de 15 minutos a 12 horas.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que o subs- trato compreende mais do que 30% de glicose após contato entre 15 minutos e 6 horas.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, em que o subs- trato compreende mais do que 40% de glicose após contato entre 15 minu- tos e 6 horas.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 11, também com- preendendo clarificação do substrato antes da etapa de fermentação.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 11, também com- preendendo adição de enzimas adicionais à etapa de contato.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, em que as en- zimas adicionais são selecionadas do grupo de glicoamilases, fitases, prote- ases, celulases e/ou hemicelulases.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 23, em que a en- zima adicional é uma fitase.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 23, em que a en- zima adicional é uma protease.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que a pasta fluida tem entre 5-60% de DS de amido granular.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, em que a por- centagem de DS de amido granular está entre 20-40% de DS.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 11, que também compreende contatar o substrato com uma solução aquosa compreendendo "backset" para diluir a porcentagem de DS antes da etapa de fermentação.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que o a- mido granular é obtido a partir de milho, sorgo, cevada, trigo, arroz ou com- binações dos mesmos.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 29, em que a por- centagem de glicose após 6 horas é de 30%.

31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, em que a por- centagem de glicose após 6 horas é de 40%.