CN101460629A - 粒状淀粉转化成乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请的发明名称为“粒状淀粉转化成乙醇的方法”。本发明涉及从粒状淀粉底物生产葡萄糖的方法，其包括：在低于粒状淀粉的淀粉胶凝温度的温度下使包含从植物材料获得的粒状淀粉的浆液与α－淀粉酶接触，以产生寡糖，并且使所述寡糖水解，以产生包含至少20％葡萄糖的醪液，并且进一步包括使所述醪液发酵以得到乙醇。

Description

粒状淀粉转化成乙醇的方法
技术领域
[01]本发明涉及从粒状淀粉生产醇类(如乙醇)的方法，其包括在低于粒状淀粉胶凝温度的温度下使包含来自植物材料的粒状淀粉的浆液暴露于α-淀粉酶，接着用发酵微生物进行发酵。
背景技术
[02]由于包括对有限的石油供应持续且增加的依赖性在内的各种原因，以及乙醇产品是可再生能源这一事实，从农作物中生产作为燃料来源的乙醇的商业生机已经重新引起世界范围内的兴趣。
[03]醇类发酵生产方法，特别是乙醇生产方法的一般特征在于湿磨或干磨法。关于这些方法的综述，参考Bothast等，2005，Appl.Microbiol.Biotechnol.67：19-25和THE ALCOHOL TEXTBOOK，第三版(K.A.Jacques等人著)1999 Nottingham University Press，UK。
[04]一般而言，湿磨法包括一系列的浸泡(浸渍)步骤以软化谷物，其中可溶淀粉被去除，接着是回收胚芽、纤维(糠)和麸质(蛋白质)。通过干燥、化学和/或酶处理，进一步加工剩余的淀粉。然后该淀粉可用于醇类产品、高果糖玉米浆或商业纯级淀粉。
[05]一般而言，干谷物碾磨法包括许多基本步骤，其包括：碾碎、蒸煮、液化、糖化、发酵和固液分离，以生产醇类和其它联产品。一般地，整谷物，例如玉米谷物，被碾磨成细颗粒大小，然后在浆槽内与液体混合。此浆液在喷射式蒸煮器内与液化酶(例如α-淀粉酶)一起受到高温处理，以将谷物中的淀粉溶解并水解成糊精。混合物被冷却，并进一步用糖化酶(例如葡糖淀粉酶)处理以生产可发酵葡萄糖。然后含有葡萄糖的醪液(mash)在产生乙醇的微生物的存在下发酵大约24到120小时。将醪液中的固体从液相中分离出来，得到乙醇和有用的联产品如酒糟。
[06]对上面的发酵方法已经进行了改进，是通过将糖化步骤和发酵步骤结合在一个工艺中实施的，该工艺被称作同步糖化发酵或同步糖化、酵母繁殖和发酵。这些改进的发酵方法相对于前面所描述的干磨发酵或甚至湿磨发酵法具有优势，因为在发酵罐内没有发展出显著的糖浓度，从而避免了糖对酵母生长的抑制。此外，由于缺乏容易利用的葡萄糖，细菌的生长得以减少。通过采用同步糖化发酵法，可使乙醇产量增加。
[07]近来，已经引进这样的发酵方法，其消除了蒸煮步骤，或者其减少了在高温下处理谷物的需要。这些有时被称为无蒸煮、低温或温煮的发酵方法包括碾磨谷物和将磨碎的谷物与液体结合形成浆液，其然后在低于粒状淀粉胶凝温度的温度下与一种或多种粒状淀粉水解酶和任选的酵母混合，以生产乙醇和其它联产品(USP 4,514,496，WO03/066826；WO 04/081193；WO 04/106533；WO 04/080923和WO05/069840)。
[08]尽管上面所述的使用磨碎谷物的浆液与粒状淀粉水解酶的组合的发酵方法提供了优于以前方法的某些改进，但是粒状淀粉转化工业还需要另外的发酵方法改进，以产生更高的能量效率和高的终产物产量。本发明的目标是提供将粒状淀粉转化成醇类(如乙醇)和其它终产物的改进方法。
发明概述
[09]本发明提供从粒状淀粉生产醇(如乙醇)的方法，其通过使粒状淀粉与α-淀粉酶接触并且提供内源性植物水解酶的合适条件而进行，所述植物水解酶使溶解的淀粉水解以产生葡萄糖。该葡萄糖然后可被用作发酵中的原料以生产醇。
[10]一方面，本发明涉及从粒状淀粉底物生产葡萄糖的方法，其包括：
a)在低于粒状淀粉的淀粉胶凝温度的温度下使包含从植物材料中获得的粒状淀粉的浆液与α-淀粉酶接触以生产寡糖，并且使内源性植物糖水解酶水解所述寡糖，和
b)产生包含至少10％葡萄糖的醪液。
[11]在该方面的进一步实施方式中，该醪液在10℃与40℃之间的温度下在发酵微生物和淀粉水解酶的存在下发酵10小时至250小时的一段时间以生产醇，特别是乙醇。
[12]在另一方面，本发明涉及生产乙醇的方法，其包括：
a)使包含粒状淀粉的浆液与能够溶解粒状淀粉的α-淀粉酶接触，其中所述接触在3.5至7.0的pH下；在低于所述粒状淀粉的淀粉胶凝温度的温度下；以及进行5分钟至24小时的一段时间，并得到含有20％以上葡萄糖的醪液底物，以及
b)在10℃与40℃之间的温度下，在发酵微生物和淀粉水解酶的存在下，使所述底物发酵10小时至250小时的一段时间，以生产乙醇。
在上述任一方面的进一步实施方式中，所述方法包括回收乙醇。在所述方面的又进一步的实施方式中，所述方法可以包括未给出的另外步骤，其在所列举的步骤之前、期间或之后进行。
附图说明
[13]图1是图解本发明实施方式的总体示意图，其中浆液——其包括含有粒状淀粉的磨碎谷物并且具有20％至40％的DS——在55℃与70℃之间的温度和4.0至6.0的pH下与α-淀粉酶接触2至24小时。所得的含有葡萄糖的醪液被转移至发酵罐中，并且在25℃至35℃的温度和3.0至5.0的pH下，在酵母、营养物、酸和淀粉水激酶的存在下进行发酵，以生产乙醇。
发明详述
[14]除非本文另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的相同的含义。
[15]尽管与本文所述的那些相似或等价的任何方法和材料均可以应用在本发明的实施或测试中，但是优选的方法和材料被描述。
[16]现在用下面的定义和实施例，仅通过参考的方式对本发明予以详细描述。本文提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中所公开的所有序列，通过引用被明确地并入。
定义：
[17]术语“发酵”指的是有机物通过微生物的酶促厌氧分解，以产生更简单的有机化合物。尽管发酵在厌氧条件下发生，但该术语不意图仅限于严格的厌氧条件，因为发酵在氧存在下也发生。
[18]如本文所使用，术语“淀粉”指的是包括植物的复杂多糖碳水化合物的任何材料，其包括具有式(C6H10O5)X的直链淀粉和支链淀粉，其中x可以是任何数字。
[19]术语“粒状淀粉”指的是生(未蒸煮的)淀粉，其是在植物材料(如谷物和块茎)中发现的天然形式的淀粉。
[20]如本文所使用，术语“干固体含量(dry solids content，DS)”指的是基于干重以百分比(％)计的浆液的总固体。
[21]术语“浆液”指的是含有不溶性固体(例如粒状淀粉)的含水混合物。
[22]术语“糊精”指的是葡萄糖的短链聚合物(如2至10个单元)。
[23]术语“寡糖”指的是具有以糖苷键连接的2-10个单糖单元的任何化合物。简单糖的这些短链聚合物包括糊精。
[24]术语“可溶淀粉”指的是从不溶性淀粉(如粒状淀粉)水解得到的淀粉。
[25]术语“醪液(mash)”指的是在发酵产物生产中使用的液体形式的可发酵底物的混合物，并且被用于指发酵的任何阶段，从可发酵底物与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物的初始混合直到发酵运转完成。
[26]术语“糖化酶”和“淀粉水解酶”指的是任何能将淀粉转化成单糖或寡糖(如己糖或戊糖)的酶。
[27]术语“粒状淀粉水解(GSH)酶”和“具有粒状淀粉水解(GSH)活性的酶”指的是具有水解颗粒形式淀粉的能力的酶。
[28]术语“淀粉的水解”指的是借助水分子的加入而切割糖苷键。
[29]术语“α-淀粉酶(例如E.C.类3.2.1.1)”指的是催化α-1，4-糖苷键水解的酶。这些酶也已经被描述成那些实现含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中的1，4-α-D-糖苷键的外切型水解或内切型水解的酶。
[30]术语“胶凝”意指淀粉分子通过蒸煮而溶解，形成粘性悬浮液。
[31]术语“胶凝温度”指的是含淀粉的底物胶凝开始的最低温度。胶凝的确切温度取决于具体淀粉，而且可根据诸如植物种类及环境和生长条件之类的因素而变化。因此，本文所讨论的胶凝温度范围被提供来包括这种变化。
[32]术语“低于胶凝温度”指的是低于胶凝温度的温度。
[33]术语“葡糖淀粉酶”指的是酶中的淀粉葡萄糖苷酶类(例如，E.C.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶(1，4-alpha-D-glucan glucohydrolase))。这些是外型作用的酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原性末端释放葡糖基残基。所述酶也水解α-1，6和α-1，3键，尽管是以比α-1，4键慢得多的速度。
[34]短语“同步糖化发酵(simultaneous saccharification andfermentation，SSF)”指的是生产终产物的工艺，其中发酵生物，例如产生乙醇的微生物，和至少一种酶，例如糖化酶，在同一容器中同一个工艺步骤中被组合。
[351术语“糖化”指的是不能直接利用的多糖向单糖或寡糖的酶促转化，以便发酵转化为终产物。
[36]术语“磨碎(milling)”指的是谷物分解成更小的颗粒。在一些实施方式中，这个术语与碾碎(grinding)可交互使用。
[37]术语“干磨法(dry milling)”指的是干燥的整粒谷物的碾磨，其中谷物的部分，例如胚芽和糠，尚未被有意去除。
[38]术语“液化”指的是淀粉转化中的阶段，其中胶凝化淀粉水解而产生低分子量的可溶性糊精。
[39]术语“稀酒糟(thin-stillage)”指的是所形成的发酵液体部分，其含有溶解的物质和悬浮的细粒，并且其是从发酵所产生的固体部分分离出来的。在工业发酵工艺中再循环的稀酒糟常常被称为“回流(back-set)”。
[40]术语“容器”包括但不限于槽、桶、瓶子、烧瓶、袋、生物反应器及类似物。在一个实施方式中，该术语是指适合于进行本发明所包括的糖化和/或发酵工艺的任何贮器。
[41]术语“终产物”指的是从可发酵底物进行酶促转化的任何碳源衍生产物。在一些优选的实施方式中，终产物是醇，例如乙醇。
[42]如本文所使用，术语“发酵生物”指的是适宜用在发酵中以直接或间接生产终产物的的任何微生物或细胞。
[43]如本文所使用，术语“乙醇生产者(ethanol producer)”或“生产乙醇的微生物”指的是能够从单糖或寡糖中生产乙醇的发酵生物。
[44]术语“衍生的”包括术语“来源于”、“得到的”、“可得自”和“分离自”，而且在如本文所使用的一些实施方式中，是指核苷酸序列所编码的多肽产生自其中所述核苷酸天然存在或所述核苷酸被插入其中的细胞。
[45]涉及蛋白质或多核苷酸的术语“异源的”指的是并非天然存在于宿主细胞中的蛋白质或多核苷酸。
[46]涉及蛋白质或多核苷酸的术语“内源的”指的是在宿主细胞中天然存在的蛋白质或多核苷酸。
[47]短语“能够水解可溶淀粉的内源性植物水解酶”指的是这样的水解酶，其在植物中表达和产生并且可以通过内源或异源基因的表达而产生。在一些实施方式中，内源酶是那些在植物中被天然表达的酶。
[48]短语“外源”酶指的是不在植物或植物细胞中产生的酶。
[49]术语“酶促转化”一般指的是通过酶作用改变底物。如本文所使用，该术语也指通过酶作用改变可发酵底物，例如含粒状淀粉的底物。
[50]如本文所使用，术语“回收”、“分离”、“分开”指的是化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从与其天然相连的至少一个成分中去除。
[51]如本文所使用，“酶单位”是指在特定的测定条件下每分钟生产1微摩尔产物的酶量。例如，在一个实施方式中，术语“葡糖淀粉酶活性单位(glucoamylase activity unit，GAU)”被定义为在60℃和pH 4.2的测定条件下，每小时从可溶淀粉底物(4％ DS)生产1g葡萄糖所需的酶的量。
[52]术语“产量”指的是采用本发明的方法所生产的终产物的量。在一些实施方式中，该术语是指终产物的体积，而在其它实施方式中，该术语是指终产物的浓度。
[53]术语“DE”或“葡萄糖当量”是用于测量总还原糖浓度的工业标准，基于干重以D-葡萄糖计算。未水解的粒状淀粉的DE基本上为0，而D-葡萄糖的DE为100。用于测定浆液或溶液的DE的教导性方法在Schroorl的方法(Fehling分析滴定法)中进行了描述。
[54]如本文所使用，术语“包含(comprising)”及其同类词以其包括在内的含义加以使用；也就是说，等价于术语“包括(including)”及其对应的同类词。
[55]“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文明确地另外规定。
[56]数字范围包括限定该范围的数字。
[57]本文所提供的标题并不是对本发明的各个方面或实施方式的限定，其可以通过参考说明书整体上来理解。
具体实施方式
(A)原材料：
粒状淀粉-
[58]粒状淀粉可以获自植物材料，其包括但不限于小麦、玉米、黑麦、高粱(买罗高粱(milo))、水稻、粟、大麦、黑小麦、木薯(cassava)(木薯(tapioca))、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、和豆类，例如大豆和豌豆。优选的植物材料包括玉米、大麦、小麦、水稻、买罗高粱(milo)和其组合。特别优选的植物材料从玉米(玉蜀黍(Zea mays))中获得。植物材料可以包括杂交品种和基因改造品种(如包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物的任何部分可以用于提供粒状淀粉，包括但不限于植物部分，例如叶、茎、外壳、荚、块茎、玉米芯、谷粒和类似物。在一些实施方式中，基本上整个植物都可以使用，例如，整个的玉米秸秆都可以使用。在一个实施方式中，整粒谷物被用作粒状淀粉来源。优选的整粒谷物包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱和其组合。在其它实施方式中，粒状淀粉可以从分级的谷物中获得，包括纤维、胚乳和/或胚芽部分。植物材料如玉米和小麦的分级(fractionating)方法在本领域中是已知的。在一些实施方式中，从不同来源中获得的植物材料可以被混合在一起以获得在本发明的方法中使用的粒状淀粉(如玉米和买罗高粱或者玉米和大麦)。
[59]在一些实施方式中，包含粒状淀粉的植物材料可以采用诸如磨碎的方法进行制备。特别地，碾磨整粒谷物的方法是熟知的，且包括使用锤磨机和轧制机。
α-淀粉酶-
[60]α-淀粉酶可以是单一酶、杂交酶、或α-淀粉酶的混合物。在本发明所包括的一些实施方式中，α-淀粉酶是具有E.C.编号E.C.3.2.1.1-3的微生物酶，尤其是E.C.3.2.1.1。任何合适的α-淀粉酶可用于本方法。在一些实施方式中，α-淀粉酶衍生自细菌菌株，而在其它实施方式中，α-淀粉酶衍生自真菌菌株。在进一步的实施方式中，优选的α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。在其它实施方式中，α-淀粉酶是耐酸α-淀粉酶。合适的α-淀粉酶可以是天然存在的以及重组(杂种和变种)和突变型α-淀粉酶(WO 99/19467和WO 97/41213)。在特别优选的实施方式中，α-淀粉酶衍生自芽孢杆菌属某种。优选的芽孢杆菌属某种包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)(USP5,093,257；USP 5,763,385；USP 5,824,532；USP 5,958,739；USP 6,008,026，USP 6,361,809；USP 6,867,031；WO 96/23874；WO 96/39528和WO05/001064)。特别优选的α-淀粉酶衍生自芽孢杆菌属菌株嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(USP 6,187,576；USP6,093,562；USP 5,958,739；US 2006/0014265和WO 99/19467)。
[61]大部分优选的α-淀粉酶是衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的淀粉酶，包括野生型、杂种和变种α-淀粉酶。参见Suzuki等，(1989)J.Biol.Chem.264：18933-18938和US 2006/0014265，特别是SEQ IDNOs：3、4和16。还可参考具有American Type Culture Collection(ATCC)编号——ATCC 39709；ATCC 11945；ATCC 6598；ATCC 6634；ATCC8480；ATCC 9945A和NCIB 8059——的菌株。
[62]除细菌α-淀粉酶之外，真菌α-淀粉酶也被考虑应用在本发明的方法中。合适的真菌α-淀粉酶衍生自丝状真菌菌株诸如曲霉属(Aspergillus)，如米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger)(例如FUNGAMYL和CLARASE L)，以及木霉属(Trichoderma)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)和青霉属(Penicillium)。
[63]在本发明的方法中考虑使用的商业可得的α-淀粉酶包括SPEZYME AA；SPEZYME FRED；SPEZYME ETHYL；GZYME G997；CLARASE L(Genencor International Inc.)；和TERMAMYL 120-L、LC、SC和SUPRA(Novozymes Biotech)；LIQUOZYME X和SAN SUPER(Novozymes A/S)和ULTRA THIN(/Valley Research)。
植物酶-
[64]植物具有天然存在的淀粉分解酶，如α-淀粉酶(EC 3.1.1.1)；β-淀粉酶(EC 3.1.1.2)、淀粉葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)(EC 3.1.1.3)和淀粉磷酸化酶(EC 2.4.1.1)。此外，植物可以已经被基因工程化以包括编码淀粉分解酶的异源基因，如淀粉酶、葡糖淀粉酶和其它(WO 03/018766和WO 05/096804)。内源性淀粉分解植物酶，不管是天然存在的还是从导入的多核苷酸表达的，在暴露于高温下，如喷射式蒸煮的温度或者甚至高于粒状淀粉凝胶温度的温度下，都将失活。然而，在本方法中进行的温度下，内源性淀粉分解酶被认为没有失活，并且实际上有助于粒状淀粉的水解。尽管不受理论束缚，发明人认为，在接触步骤中所提供的α-淀粉酶使植物材料的粒状淀粉结构发生改变，允许产生包括糊精在内的寡糖。该寡糖在接触步骤所包括的温度(如45℃至70℃)下被植物淀粉分解酶进一步分解。植物淀粉分解酶作用于部分水解的淀粉以产生葡萄糖。尽管外源的葡糖淀粉酶可以被包括在接触步骤中，但外源葡糖淀粉酶的加入对于提供葡萄糖来说不是必需的，葡萄糖然后被任选地用作乙醇发酵的原料。因此，在一种实施方式中，本发明的接触步骤不包括衍生自微生物来源的葡糖淀粉酶的加入。在进一步的实施方式中，接触步骤在未加入外源酶的情况下进行，尤其是外源葡糖淀粉酶或其它寡糖水解酶。在进一步的实施方式中，寡糖仅仅被天然存在的内源植物酶水解，具体为植物属或者可选地具体为植物属和种。然而，外源葡糖淀粉酶和/或其它酶如肌醇六磷酸酶和蛋白酶的加入可以增加溶解的粒状淀粉的产量。
发酵生物-
[65]发酵生物的实例是产乙醇微生物(ethanologenic microorganism)或产生乙醇的微生物如产乙醇细菌，其表达醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶并且其能从运动发酵单胞菌(Zymomonas moblis)中获得(参见如USP5,000,000；USP 5,028,539，USP 5,424,202；USP 5,514,583和USP5,554,520)。在另外的实施方式中，产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，即将木糖转化成木酮糖的酶。在进一步的实施方式中，木糖异构酶被用于将木糖转化成木酮糖。在特别优选的实施方式中，使用的是能使戊糖和己糖都发酵成乙醇的微生物。例如，在一些实施方式中，微生物可以是天然的或非基因工程微生物，或者在其它实施方式中，微生物可以是重组微生物。例如，在一些实施方式中，优选的发酵微生物包括来自自芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、大肠杆菌属(E.coli)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)(例如柠檬泛菌(P.citrea))和克雷白氏杆菌属(Klebsiella)(例如奥克西托克克雷白氏杆菌(K.oxytoca))的细菌菌株(参见，例如USP 5,028,539、USP 5,424,202和WO 95/13362)。
[66]在进一步优选的实施方式中，产生乙醇的微生物是真菌微生物，如酵母并且尤其是酵母属(Saccaromyces)例如酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株(USP 4,316,956)。多种酿酒酵母是商业上可得的并且这些包括但不限于FALI(Fleischmann′s Yeast)，SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSM Specialties)、RED STAR(Lesaffre)和安琪酒精酵母(Angel Yeast Company，China)。
辅助酶-
[67]尽管在一种实施方式中，考虑了另外的淀粉水解酶是不需要的并且因此没有被包括在接触步骤中，但是另外的酶可以被包括在本发明所包含的接触步骤和发酵步骤两者中。在一些实施方式中，这些酶将作为一种或多种辅助酶包括在接触步骤中，所述接触步骤包括使粒状淀粉浆液与α-淀粉酶和一种或多种辅助酶接触。在其它实施方式中，另外的酶将与酵母和其它成分一起被包括在发酵步骤中。
[68]在一些实施方式中，在与α-淀粉酶的接触步骤期间，辅助酶可以包括葡糖淀粉酶、粒状淀粉水解酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、果胶酶(pectinase)、β-葡聚糖酶、β-淀粉酶、环糊精转糖基酶和其组合。在一些优选的实施方式中，接触步骤将包括α-淀粉酶、肌醇六磷酸酶和任选的蛋白酶的组合。在其它实施方式中，接触步骤将包括α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和任选的蛋白酶的组合。在还有其它实施方式中，接触步骤将包括α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶和任选的蛋白酶的组合。
[69]葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3)可以来自细菌、植物和真菌来源的异源或内源蛋白质表达。应用在本发明的组合物和方法中的优选葡糖淀粉酶是由几种丝状真菌和酵母的菌株产生的。特别地，由曲霉属和木霉属的菌株分泌的葡糖淀粉酶在商业上是重要的。合适的葡糖淀粉酶包括天然存在的野生型葡糖淀粉酶以及葡糖淀粉酶变种和基因工程突变型葡糖淀粉酶。下面的葡糖淀粉酶是可以应用在本发明所包括的方法中的葡糖淀粉酶的非限制性实例。黑曲霉(Aspergillus niger)G1和G2葡糖淀粉酶(Boel等，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO92/00381，WO 00/04136和USP 6,352,851)；泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉(Aspergillus oryzae)葡糖淀粉酶(Hata等，(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949)和Aspergillusshirousami葡糖淀粉酶(参见Chen等，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Chen等(1995)Prot.Eng.8：575-582；和Chen等，(1994)Biochem J.302：275-281)。
[70]葡糖淀粉酶也可以获自踝节菌属(Talaromyces)的菌株，例如来源于埃默森踝节菌(T.emersonii)、T.leycettanus、杜邦踝节菌(T.duponti)、嗜热踝节菌(T.thermophilus)(WO 99/28488；USP No.RE：532，153；USP No.4,587,215)的那些；木霉属的菌株，例如里氏木霉，尤其是与在美国专利公布2006-0094080中所公开的SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉属(Rhizopus)的菌株，例如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉属(Mucor)的菌株和腐质霉属(Humicola)的菌株，例如灰色腐质霉(H.grisea)(参见Boel等，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381；WO00/04136；Chen等.，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor等，(1978)Carbohydrate Res.61：301-308；US专利4,514,496；US专利4,092,434；和Jensen等，(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223)。其它可用于本发明的葡糖淀粉酶包括那些从罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)得到的酶及其变体(WO 04/111218)。
[71]商业使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如从黑曲霉(商品名DISTILLASE、OPTIDEX L-400和G ZYME G990 4X，来自GenencorInternational Inc.)或根霉属某种(商品名CU.CONC，来自日本ShinNihon Chemicals)产生。还有商业消化酶，来自日本AmanoPharmaceuticals，商品名为GLUCZYME(Takahashi等，(1985)J.Biochem.98：663-671)。另外的酶包括根霉属某种的三种形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Gluc1”(MW 74,000)、“Gluc2”(MW 58,600)和“Gluc3”(MW 61,400)。酶制剂GC480(Genencor International Inc.)也在本发明中得到应用。
[72]粒状淀粉水解酶(GSHE)能水解粒状淀粉，且这些酶已经从真菌、细菌和植物细胞中回收，例如芽孢杆菌属某种(Bacillus sp.)、青霉属某种(Penicillium sp.)、腐质霉属某种(Humicola sp.)、木霉属某种(Trichoderma sp.)、曲霉属某种(Aspergillus sp.)、毛霉属某种(Mucorsp.)和根霉属某种(Rhizopus sp.)。在一种实施方式中，具有GSH活性的一组特定的酶包括具有葡糖淀粉酶活性和/或α-淀粉酶活性的酶(参见Tosi等，(1993)Can.J.Microbiol.39：846-855)。米根霉GSHE已经在Ashikari等，(1986)Agric.Biol.Chem.50：957-964和USP 4,863,864中予以描述。灰腐质霉GSHE已经在Allison等，(1992)Curr.Genet.21：225-229、WO 05/052148和欧洲专利171218中予以描述。泡盛曲霉河内变种(Aspergillus awamori var.kawachi)GSHE已经在Hayashida等，(1989)Agric.Biol.Chem.53：923-929中予以描述。Aspergillus shirousamiGSHE已经在Shibuya等，(1990)Agric.Biol.Chem.54：1905-1914中予以描述。
[73]在一种实施方式中，GSHE可具有葡糖淀粉酶活性且衍生自灰腐质霉菌株，特别是灰腐质霉嗜热变种(Humicola grisea var.thermoidea)菌株(参见USP 4,618,579)。在一些优选的实施方式中，具有GSH活性的腐质霉酶与WO 05/0521478的SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。
[74]在另一种实施方式中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，且衍生自泡盛曲霉菌株，尤其是泡盛曲霉河内变种菌株。在一些优选的实施方式中，具有GSH活性的泡盛曲霉河内变种酶与WO 05/052148的SEQID NO：6的氨基酸序列具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。
[75]在另一种实施方式中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，且衍生自根霉属菌株，例如雪白根霉或米根霉。衍生自Koji菌株雪白根霉的酶以商品名“CU CONC”销售，或者来自根霉的酶以商品名GLUZYME销售。
[76]具有葡糖淀粉酶活性的另一有用的GSHE是SPIRIZYME Plus(Novozymes A/S)，其也包括酸性真菌淀粉酶活性。
[77]在另一个实施方式，GSHE可具有α-淀粉酶活性，并衍生自曲霉属的菌株，例如泡盛曲霉、黑曲霉、米曲霉或河内白曲霉(A.kawachi)的菌株，尤其是泡盛曲霉的菌株。
[78]在一些优选的实施方式中，具有GSH活性的河内白曲霉的酶与WO 05/118800和WO 05/003311的SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。
[79]在一些实施方式中，具有GSH活性的酶是杂交酶，例如，一种这样的杂交酶，其含有α-淀粉酶的催化结构域——如黑曲霉α-淀粉酶、米曲霉α-淀粉酶或河内白曲霉α-淀粉酶的催化结构域，和不同的真菌α-淀粉酶或葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域，例如河内白曲霉或灰腐质霉的淀粉结合结构域。在其它的实施方式中，具有GSH活性的杂交酶可以包括葡萄淀粉酶的催化结构域——如曲霉属某种(Aspergillus sp.)、踝节菌属某种(Talaromyces sp.)、Altheasp.、木霉属某种(Trichodermasp.)或根霉属某种(Rhizopus sp.)的催化结构域，和不同的葡糖淀粉酶或α-淀粉酶的淀粉结合结构域。一些具有GSH活性的杂交酶公开在WO 05/003311，WO 05/045018；Shibuya等，(1992)Biosci.Biotech.Biochem 56：1674-1675和Cornett等，(2003)Protein Engineering16：521-520中。
[80]合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌的蛋白酶，例如，酸性真菌蛋白酶，例如NSP24以及GC106(Genencor InternationalInc.)。优选的真菌蛋白酶衍生自曲霉属(例如来自黑曲霉和米曲霉的蛋白酶)、毛霉属(例如米黑毛霉(M.miehei))、木霉属、根霉属和念珠菌属(Candida)的菌株。优选的细菌蛋白酶衍生自芽孢杆菌属的菌株，如液化淀粉芽孢杆菌。添加到发酵中的蛋白酶可以增加游离氨基氮的水平和增加酵母的代谢速率并进一步提供更高的发酵效率。
[81]可以应用在本发明的方法中的酶包括β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。这些酶是外切作用的生麦芽糖淀粉酶(exo-acting maltogenic amylase)，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物中1，4-α-糖苷键的水解。商业β-淀粉酶可从Genencor International Inc.得到，而且例子包括SPEZYME BBA和OPTIMAL BBA。
[82]纤维素酶(E.C.3.2.1.4)，例如内切葡聚糖酶，可以应用在本发明的方法中。纤维素酶的例子包括来自丝状真菌如木霉属、腐质霉属、镰刀菌属(Fusarium)和曲霉属的纤维素酶。商业纤维素酶可以以SPEZYME CP(Genencor International Inc.)以及CELLUZYME和ULTRAFLO(Novozymes A/S)获得。
[83]在本发明的方法中可用的木聚糖酶可以来自细菌或真菌来源，例如曲霉属、木霉属、脉孢菌属(Neurospora)和镰刀菌属。商业制剂包括SPEZYME CP和LAMINEX(Genencor International Inc.)以及ULTRAFLOW(Novozymes A/S)。
[84]许多细菌和真菌肌醇六磷酸酶(E.C.3.1.3.8和3.1.3.26)是已知的，并且在一些实施方式中肌醇六磷酸酶的加入在这些方法中特别有用。酵母肌醇六磷酸酶可以衍生自酵母属(例如酿酒酵母)和许旺酵母属(Schwanniomyces)(例如西方许旺酵母(S.occidentalis))的菌株(Wodzinski等，Adv.Apple.Microbiol.，42：263-303)。其它真菌肌醇六磷酸酶已经在文献中有所描述，并且参考Wyss等，(1999)Appl.EnvironMicrobiol.65：367-373；Berka等，(1998)Appl.Environ.Microbiol.64：4423-4427；Yamada等，(1986)Agric.Biol.Chem.322：1275-1282；PCT公布WO 98/28408；WO 98/28409；WO 97/38096和WO 9844125；以及美国专利6,734,004；6,350,602；和5,863,533)。真菌肌醇六磷酸酶已经从曲霉属(例如黑曲霉、泡盛曲霉、土曲霉、米曲霉和烟曲霉(A.fumigatus))；疏绵状嗜热丝孢菌(腐质霉属)(Thermomyces(Humicola)lanuginousus)、镰刀菌属(爪哇镰刀菌(F.javanicum)和F.versillibodes)中衍生得到。细菌肌醇六磷酸酶也可用在本发明中(Greiner R.等(1993)Arch.Biochem.Biophys.303：107-113；Yoon S.J.等(1996)Enzyme andMicrobial Technol.18：449-454；和WO 06/043178)。
[85]根据本发明可被使用的商业可得的肌醇六磷酸酶包括PHYZYMEXP 5000(Danisco A/S)；FINASE(Altech)；GC 491；FINASE、SPEZYME HPA(Genencor)、BIO-FEED PHYTASE和PHYTASE NOVO(Novozymes)以及NATUPHOS(DSM)。
[86]本领域技术人员可以容易地确定在本发明所包括的工艺步骤中可以使用的酶的有效量。
(B)工艺步骤-
[87]要加工的粒状淀粉(如研磨的谷物)与水溶液混合以得到浆液。水溶液可以从例如水、稀酒糟和/或回流得到。
[88]浆液的DS可以在下列范围：5-60％；10-50％；15-45％；15-30％；20-45％；20-30％并且还有25-40％。与α-淀粉酶的接触步骤可以在3.5至7.0的pH范围内进行；还可以在3.5至6.5的pH范围内；优选地在4.0至6.0的pH范围内；并且更优选地在4.5至5.5的pH范围内。浆液在低于粒状淀粉的淀粉胶凝温度的温度下与α-淀粉酶保持接触。在一些实施方式中，该温度被保持在45℃与70℃之间；在其它实施方式中，该温度被保持在50℃与70℃之间；在55℃与70℃之间；在60℃与70℃之间；在60℃与65℃之间；在55℃与65℃之间以及在55℃与68℃之间。在进一步的实施方式中，该温度为至少45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、63℃、65℃和68℃。在其它实施方式中，该温度不大于65℃、68℃、70℃、73℃、75℃和80℃。
[89]按照本文的工艺可用的许多粒状淀粉的初始淀粉胶凝温度范围包括大麦(52℃到59℃)、小麦(58℃到64℃)、黑麦(57℃到70℃)、玉米(62℃到72℃)、高直链淀粉玉米(67℃到80℃)、水稻(68℃到77℃)、高粱(68℃到77℃)、马铃薯(58℃到68℃)、木薯(59℃到69℃)和甘薯(58℃到72℃)(J.J.M.Swinkels，第32-38页，在STARCH CONVERSION TECHNOLOGY，Eds Van Beynum等，(1985)Marcel Dekker Inc.New York和The Alcohol Textbook 3rd ED.AReference for the Beverage，Fuel and Industrial Alcohol Industries，EdsJacques等，(1999)Nottingham University Press，UK)。
[90]在接触步骤中，浆液可以与α-淀粉酶保持接触5分钟至48小时的期间；并且还可以为5分钟至24小时的期间。在一些实施方式中，该时间期间为在15分钟与12小时之间，15分钟与6小时之间，15分钟与4小时之间以及还有30分钟与2小时之间。
[91]在接触步骤中所用的α-淀粉酶的有效浓度将根据所用的具体工艺条件和粒状淀粉而变化。然而，一般而言，所用的α-淀粉酶的量将在0.001至50AAU/g DS之间、0.01至30AAU/g DS、0.01至10AAU/g DS以及还有0.05至5.0AAU/g DS。
[92]在一些实施方式中，接触步骤和/或发酵步骤中α-淀粉酶的有效剂量将为0.01至15SSU/g DS；还有0.05至10SSU/g DS；还有0.1至10SSU/g DS；以及0.5至5SSU/g DS。
[93]在一些实施方式中，接触步骤和/或发酵步骤中葡糖淀粉酶的有效剂量将在0.01至15GAU/g DS的范围内；还有0.05至10GAU/g DS；还有0.1至10GAU/g DS以及甚至0.5至5GAU/g DS。
[94]在一些实施方式中，将在接触步骤和/或发酵步骤中使用的肌醇六磷酸酶的有效剂量将在0.001至15FTU/g DS的范围内；还有0.005至10FTU/g DS；以及还有0.05至5FTU/g DS。一个肌醇六磷酸酶单位(FTU)为这样的酶量，其在37℃和pH 5.0下每分钟从0.0051摩尔/升的肌醇六磷酸钠中释放1微摩尔无机磷。
[95]在一些实施方式中，将在接触步骤和/或发酵步骤中使用的蛋白酶的有效剂量将在0.01至15 SAPU/g DS的范围内；还有0.01至10SAPU/g DS；以及还有0.05至5SAPU/g DS。SAPU是指分光光度酸性蛋白酶单位，其中1SAPU为在分析条件下每分钟从酪蛋白底物中释放1微摩尔酪氨酸的蛋白酶酶活性的量。
[96]在接触步骤期间，25-90％的粒状淀粉被溶解以产生包含糊精的寡糖。在一些实施方式中，大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％和90％的粒状淀粉被溶解。
[97]在粒状淀粉与α-淀粉酶接触如上所指出的一段时间后，获得可溶淀粉底物(醪液)，其包含大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％和80％的葡萄糖。
[98]在接触步骤的一些优选实施方式中，具有20-40％ DS的含有粒状玉米淀粉的浆液在55℃至70℃之间的温度下与衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶接触1至6小时，得到包含至少30％葡萄糖的可溶淀粉底物。在接触步骤的其它优选实施方式中，具有20-40％ DS的含有粒状买罗高粱淀粉的浆液在55℃至70℃之间的温度下与衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶接触1至6小时，得到包含至少50％葡萄糖的可溶淀粉底物。
[99]在接触步骤——其导致包含葡萄糖的醪液的产生——之后，该醪液与发酵微生物(如产生乙醇的微生物)一起经历发酵。
[100]然而，在使包含至少10％葡萄糖的醪液经历发酵之前，醪液可以进一步暴露于包含例如回流和/或玉米浸渍液的水溶液，并且被调节至在pH 3.0至6.0、pH 3.5至5.5或pH 4.0至5.5的范围内的pH。在本发明的该实施方式中，醪液的％DS可以被稀释。例如，经稀释的醪液的DS可以在5至35％；5至30％；5至25％；5至20％；5至20％；5至15％；以及5至10％，其小于接触步骤中浆液的％DS。在一个非限制性实例中，如果接触步骤中浆液的％DS为约32％并且醪液进一步暴露于稀释用水溶液——其将DS稀释在5至10％之间，则待发酵的醪液的DS将在22％与27％之间。在一些优选的实施方式中，如果接触浆液的DS在30至35％之间，稀释过的浆液的DS将为约20至30％。
[101]在优选的实施方式中，包含至少10％葡萄糖的醪液然后经历采用如上所述的发酵微生物的发酵工艺。这些发酵工艺在The AlcoholTextbook 3rd ED，A Reference for the Beverage，Fuel and IndustrialAlcohol Industries，Eds Jacques等，(1999)Nottingham University Press，UK中被描述。
[102]在一些优选实施方式中，该醪液在这样的温度范围内——15至40℃以及还有25至35℃，在这样的pH范围内——pH 3.0至6.5；还有pH 3.0至6.0；pH 3.0至5.5，pH 3.5至5.0以及还有pH 3.5至4.5，在酵母的存在下发酵12至240小时的时间期间，优选12至120小时并且更优选24至90小时，产生醇类产物，优选乙醇。
[103]酵母细胞一般以每ml发酵液104至1012活酵母数的量被供给，并且优选107至1010。除了发酵微生物(如酵母)养料外，发酵将任选地包括酸和另外的酶。
[104]在一种优选的实施方式中，接触步骤在与发酵步骤分开的容器中进行。还可以考虑，接触步骤和发酵步骤可以在SSF工艺中在同一容器中进行。
[105]在一些实施方式中，除了上述原料外，发酵介质将包含补充剂，其包括但不限于维生素(例如生物素、叶酸、烟碱酸、核黄素)、辅因子和大量养料和微量养料以及盐(如(NH4)2SO4；K2HPO4；NaCl；MgSO4；H3BO3；ZnCl2；和CaCl2)。
[106]将被包括在发酵步骤中的另外的酶可以与接触步骤中使用的酶相同或不同。在一些实施方式中，酶将包括α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，包括粒状淀粉水解酶。在一些优选的实施方式中，葡糖淀粉酶和α-淀粉酶可以以掺混物的形式出现。特别优选的酶掺混物包括STARGEN001(Genencor International Inc.)，其是来自河内白曲霉(A.kawachi)的α-淀粉酶和来自黑曲霉的葡糖淀粉酶的掺混物。在一些优选的实施方式中，葡糖淀粉酶将衍生自里氏木霉葡糖淀粉酶、罗耳阿太菌葡糖淀粉酶、踝节菌属葡糖淀粉酶、曲霉属葡糖淀粉酶以及从它们衍生出的杂交和变种葡糖淀粉酶。在一些优选的实施方式中，该酶选自纤维素酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶。
醇和其它终产物的回收-
[107]本发酵方法的优选终产物为醇产物，优选地为乙醇。根据该方法所生产的终产物可以与发酵介质分离和/或从中纯化。分离和纯化的方法是已知的，例如使介质经历萃取、蒸馏和柱层析。在一些实施方式中，终产物直接通过将介质送到高压液相色谱(HPLC)分析进行鉴别。
[108]在进一步的实施方式中，醪液可以通过例如离心分成液相和固相而进行分离并且回收终产物如醇和固体。醇可以通过手段诸如蒸馏和分子筛脱水或超滤进行回收。
[109]在一些实施方式中，乙醇的收率按体积计将大于8％、10％、12％、14％、16％和18％。根据本发明的方法获得的乙醇可以被用作燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇。
[110]在进一步的实施方式中，终产物可以包括发酵联产品如谷物干酒糟(distillers dried grains，DDG)和含可溶物的谷物干酒糟(distiller′sdried grain plus solubles，DDGS)，其可被用作动物饲料。
实验
[111]提供下面的实施例，以证明和进一步阐明本发明的某些优选实施方式和方面，而且不被解释为对其范围的限制。实际上，预期这些教导将在进一步优化本文所描述的工艺系统中起作用。
[112]在本公开内容和接下来的实验部分，用到了下面的缩写：GA(葡糖淀粉酶)；wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dI H2O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或者gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μl(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；DO(溶解氧)；W/V(重量与体积之比)；W/W(重量与重量之比)；V/V(体积与体积之比)；Genencor(Genencor International，Inc.，Palo Alto，CA)；MT(公吨)；和ETOH(乙醇)。
下列酶制剂在下面的实施例中被使用：
[113]SPEZYME Ethyl(可从Genencor得到)-从地衣芽孢杆菌的基因改造菌株得到的细菌α-淀粉酶。
[114]GC100-在US 2006/0014265中公开的实验用细菌α-淀粉酶。
[115]灰腐质霉葡糖淀粉酶(HGA)，其具有如WO 2005/052148的SEQID NO：3所公开的氨基酸序列。
[116]STARGEN 001(可从Genencor得到)-黑曲霉葡糖淀粉酶和河内白曲霉α-淀粉酶的掺混物。
下面的测定在下面的实施例中被使用：
[117]α-淀粉酶活性被表示为α-淀粉酶单位(AAU)，并且酶活性通过淀粉水解的速率来测定，淀粉水解的速率体现为碘着色能力下降的速率，其由分光光度法进行测量。一个AAU的细菌α-淀粉酶活性为在标准条件下每min水解10mg淀粉所需的酶量。
[118]也将α-淀粉酶活性测定为可溶淀粉单位(soluble starch unit，SSU)，并且基于在pH4.5和50℃下，可溶性马铃薯淀粉底物(4％ DS)被试样量的酶样品水解的程度。还原糖含量采用如在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428中所述的DNS方法进行测定。一个酶活性单位(SSU)相当于在特定温育条件下每分钟所释放的1mg葡萄糖的还原能力。
[119]葡糖淀粉酶活性采用公知的试验进行测定，其基于葡糖淀粉酶催化对硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷(p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside，PNPG)水解生成葡萄糖和对硝基苯酚的能力。在碱性pH下，该硝基苯酚形成黄颜色，其与葡糖淀粉酶活性成比例，并在400nm处监测，且与以GAU测定的酶标准进行比较。
[120]一个“葡糖淀粉酶活性单位(Glucoamylase Activity Unit)”(GAU)是在pH 4.2和60℃下每小时从可溶淀粉底物(4％ DS)产生1gm还原糖的酶量，还原糖以葡萄糖计算。
[121]白利糖度(Brix)——在给定温度下总溶解固体含量的量度，通过采用折射计测量加以测定。
[122]总淀粉含量的测定：用酶-酶淀粉液化和糖化方法测定总淀粉含量。在典型的分析中，在100ml Kohlraucsh烧瓶内放入2g干样品，并且加入45ml pH 7.0的MOPS缓冲液。将该浆液充分搅拌30min。加入1.0ml的SPEZYME FRED(以1:50稀释在水中)并加热至煮沸3-5min。将该烧瓶放在高压灭菌器内，在121℃下保持15min。高压灭菌处理之后，将该烧瓶放置在95℃的水浴中，加入1ml的以1:50稀释的SPEZYME FRED并且温育45min。调节pH到pH 4.2，而温度降到60℃。接着加入20ml pH4.2的乙酸盐缓冲液。通过加入1.0ml的以1:100稀释的OPTIDEX L-400(Genencor)进行糖化，且在60℃下继续温育18小时。通过在95℃下加热10min终止此酶反应。采用葡萄糖作为标准，通过HPLC分析，测定总糖组分。来自在室温下不经过酶处理的样品的水萃取液的可溶淀粉水解产物被从总糖中扣除。
[123]溶解固体的百分含量(％)的测定—7ml样品被放入小螺丝帽试管中(pH被调节至5.0至6.0)并且向管中加入0.007ml SPEZYME Fred。试管被放在沸水浴中10min并且在温育期间于不同时间下轻轻混合。10min后取出管并且被放在80℃水浴中1小时。管被冷却并且离心分离。测定上清夜的白利糖度并且与对照样品比较。溶解的固体％＝对照白利糖度x100/样品白利糖度。
[124]样品的乙醇和碳水化合物测定采用如下HPLC法进行测量：
[125]将1.5ml Eppendorf离心管装满发酵罐醪液并在冰上冷却10min；该样品管在Eppendorf台式离心机中离心1min；0.5ml上清液样品被转移到含有0.05ml 1.1N H2SO4的试管中，并使其静置5min；向试管中加入5.0ml水，然后通过0.2μm尼龙针头式过滤器(NylonSyringe Filter)将其过滤到HPLC小瓶内；并在HPLC上运行。HPLC条件包括：
[126]乙醇体系：柱：Phenomenex Rezex有机酸柱(RHM-单糖)#00H0132-KO(相当于Bio-Rad 87H)；柱温：60℃；流动相：0.01N H2SO4；流速：0.6mL/min；检测器：RI；和注射体积：20μL。
[127]碳水化合物体系：柱：Phenomenex Rezex碳水化合物(RCM-单糖)#00H-0130-KO(相当于Bio-Rad 87H)；柱温：70℃；流动相：纳米纯DI H2O；流速：0.8mL/min；检测器：RI；注射体积：10μL(3％DS材料)。
[128]柱基于糖的分子量进行分离，糖被标为DP1(单糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)；以及DP>3(聚合度大于3的寡糖)。
实施例1
整粒磨碎玉米和分级玉米的粒状淀粉的溶解及从中生产乙醇
[129]该实验在三种不同的玉米粒状淀粉底物上进行：(A)370g含水量13.3％的整粒磨碎玉米；(B)354.2g含水量9.2％的玉米胚乳；和(C)从含水量11.8％得到的精制玉米淀粉。每种底物被称重并且转移至不锈钢容器中，与水制成最终1000g的浆液，对应于32％ DS。[130]浆液的pH用6N H2SO4调节至pH 5.5。加入GC100(4.0AAU/gDS)。将温度保持在60℃。在温育期间，浆液用顶部搅拌器轻轻搅拌。在2、4、6、12和24小时的时间间隔后，测定BRIX(白利糖度)、溶解淀粉％和糖组成(％W/W)，且结果显示在表1中。在24小时，来自整粒磨碎玉米、胚乳和精制糖的粒状淀粉在接触步骤期间分别溶解了79.1％、71.1％和60.0％。在24小时，水解产物中葡萄糖％对于整粒磨碎玉米为65.22％，对于胚乳为49.64％，而对于精制淀粉仅为5.79％。
[131]
表1
 
谷物 时间 BRIX 溶解淀粉％ 葡萄糖 ％DP2 ％DP3 ％DP>3
整玉米 2 11.5 31.60 21.36 13.48 33.56
4 14.0 37.56 24.31 13.65 24.48
6 16.3 4133 25.42 13.36 19.88
12 18.2 46.23 26.18 12.63 14.96
24 20.0 79.1 65.22 22.50 7.36 4.92
胚乳 2 13.4 27.12 13.85 8.88 50.15
4 16.1 33.01 16.45 9.39 41.15
6 17.5 36.56 18.18 9.59 35.67
12 21.7 47.43 20.98 9.65 21.94
24 22.9 71.1 49.64 21.33 9.52 19.51
精制玉米淀粉 2 14.4 1.40 10.37 15.27 72.96
4 16.8 2.34 11.60 15.22 70.84
6 17.8 5.14 12.27 15.13 67.45
12 19.1 4.94 13.21 15.62 66.22
24 20.9 60.0 5.79 14.40 17.42 62.39
[132]24小时后，使用来自整粒磨碎玉米的样品(32％ DS)，在125ml烧瓶中，在400ppm尿素、Red Star Red酵母(Fermentus)、STARGEN001和0.1SAPU/g DS蛋白酶的存在下，在pH 4.2，32℃下进行酵母发酵。HPLC数据显示在表2中。
表2
 
STARGEN 001GAU/g       ％V/V ETOH24小时   ％V/V ETOH48小时   ％V/VETOH72小时  
0.1 10.11 11.74 13.64
0.2 10.36 12.19 14.62
0.4 10.83 12.73 15.35
实施例2
买罗高粱粒状淀粉的溶解及从中生产乙醇
[133]进行两种预处理：(A)称量160g含水量11.6％且总淀粉含量53.3％的整粒磨碎买罗高粱，并转移至含有340g水的不锈钢容器中。浆液的pH用6N硫酸调节至pH 5.5。加入SPEZYME Ethyl(1.0AAU/gDS)。温度被保持在62℃并且32％ DS。(B)HGA以0.1GAU HGA/g DS的当量被包括在上文(A)中上述的预处理中。溶解的固体％和葡萄糖％被示于表3中。
表3
 
酶 时间(小时) ％DP1(葡萄糖) ％DP2 ％DP3 ％DP>3 溶解的淀粉％    
SPEZYMEEthyl    2 57.71 24.60 10.42 7.27
4 64.41 22.50 9.13 3.95
6 67.16 21.83 8.16 2.85
24 86.50 9.91 2.95 0.63 54.7
SPEZYMEEthyl+HGA 2 84.34 9.48 1.47 4.72
4 87.72 8.07 1.18 3.03
6 88.91 7.68 1.03 2.37
24 93.10 5.26 0.59 1.05 69.3
[134]来自上述HGA预处理的原料(醪液)在125ml烧瓶中在常规酵母发酵条件(例如Red Star Yeast，pH 4.2，32℃，在400ppm尿素、STARGEN 001和0.05 SAPU/g DS存在下)下进行评价。HPLC结果显示在表4中。
表4
 
预处理 GAU/gSTARGEN 001 ％V/V乙醇24小时    ％V/V乙醇48小时   
SPEZYMEEthyl+HGA 0.1 10.02 11.98
0.2 10.22 12.75
实施例3
温度对从整粒磨碎买罗高粱生产葡萄糖的影响
[135]在60℃、65℃和70℃下对含有GC100(4.0AAU/g DS)、pH 5.5、30％ DS的整粒磨碎买罗高粱的含水浆液进行温育。温育6小时后，取出样品并离心以分离不溶物。测量澄清上清液的白利糖度和HPLC组成。测定溶解的淀粉％和葡萄糖％，并且结果显示在表5中。
表5
 
℃ 溶解的淀粉％         ％W/WDP1(葡萄糖) ％W/WDP2   ％W/WDP3   ％W/WDP>3 
60 69.9 52.48 27.07 12.08 8.36
65 68.2 52.61 23.42 10.41 13.56
70 61.9 36.49 18.98 10.27 34.26
[136]随着在与整粒磨碎买罗高粱的接触步骤期间温育温度从60℃升高至70℃，淀粉溶解和葡萄糖含量下降。这表明α-淀粉酶可能在70℃下失活。大于50％的溶解的淀粉在65℃被水解成葡萄糖，这表明内源性植物淀粉水解酶能够将可溶寡糖水解成葡萄糖。
[137]来自上述在65℃的预处理的原料在基本上如实施例2中描述的常规发酵条件下进行评价；除了％DS为30。结果显示在表6中。
表6
 
STARGEN 001(GAU/g DS)   ％V/V ETOH24小时   ％V/V ETOH48小时   ％V/V ETOH72小时  
0.1 9.19 11.00 11.29
0.2 9.32 11.07 12.80
0.4 9.61 11.47 13.32
实施例4
水稻粒状淀粉的溶解及从中生产乙醇
[138]水稻谷物(116g)——其具有淀粉含量81.5％；含水量14％以及穿过30目筛的颗粒大小——与284g水混合以制备25％DS浆液。向该浆液中加入GC100(4.0AAU/g DS)。温度被保持在65℃并且pH被调节至pH 5.5。在第2、4、6和24小时测量白利糖度。测定可溶淀粉％和葡萄糖％并且结果显示在表7中。
表7
 
时间小时 白利糖度 溶解淀粉％ ％W/VDP1(葡萄糖) ％W/VDP2   ％W/VDP3   ％W/V.DP3 
1 11 39.2 27.5 19.8 12.7 39.6
2 12.5 44.6 31.2 22.2 13.4 32.6
4 14.8 52.8 33.4 24.0 13.8 28.7
6 16.2 57.5 33.8 24.4 13.9 27.7
24 16.4 58.4 36 26.2 14.6 23.2
[139]24小时后，在0.75GAU/g DS STARGEN 001、400ppm尿素和0.4％的安琪酵母(中国江西)的存在下在pH 4.2、32℃下进行酵母发酵。在第24、48和67小时下取出HPLC样品(表8)。
表8
 
时间小时 ％W/V葡萄糖 ％W/WETOH  
24 2.15 6.62
48 0.32 10.4
67 0.35 12.0

Claims (31)

1.从粒状淀粉底物生产葡萄糖的方法，其包括：
a)在低于所述粒状淀粉的淀粉胶凝温度的温度下使包含获自植物材料的粒状淀粉的浆液与α-淀粉酶接触以产生寡糖，并且使内源植物淀粉水解酶水解所述寡糖，和
b)产生包含至少10％葡萄糖的醪液。
其中所述接触步骤在pH 3.5至7.0下进行5分钟至48小时的一段时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
c)使所述醪液在10℃与40℃之间的温度下在发酵微生物和淀粉水解酶的存在下发酵10小时至250小时的一段时间，以产生醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述α-淀粉酶衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述接触步骤中供给的α-淀粉酶的量在0.01至10.0AAU/g ds之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度在50℃与70℃之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述醪液包含至少30％葡萄糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物材料是玉米、买罗高粱、大麦、小麦、水稻或其组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物材料是分级玉米。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述醇是乙醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括回收所述乙醇。
11.生产乙醇的方法，其包括：
a)使包含获自植物材料的粒状淀粉的浆液与能够溶解粒状淀粉的α-淀粉酶接触，其中所述接触在3.5至7.0的pH下在低于所述粒状淀粉的淀粉胶凝温度的温度下进行5分钟至24小时的一段时间，
b)获得含有20％以上葡萄糖的底物，和
c)在10℃与40℃之间的温度下在发酵微生物和淀粉水解酶的存在下使所述底物发酵10小时至250小时的一段时间，以生产乙醇。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括回收所述乙醇。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述α-淀粉酶衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述接触步骤在50℃与70℃之间的温度下进行。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述温度在60℃与70℃之间。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述接触步骤在5.0至6.0的pH下进行。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述接触持续15分钟至12小时的一段时间。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述底物在接触15分钟至6小时之间的时间后包含30％以上的葡萄糖。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述底物在接触15分钟与6小时之间的时间后包括40％以上的葡萄糖。
21.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括在发酵步骤前使所述底物澄清。
22.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括将另外的酶加入所述接触步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述另外的酶选自葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、纤维素酶和/或半纤维素酶。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述另外的酶是肌醇六磷酸酶。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述另外的酶是蛋白酶。
26.根据权利要求11所述的方法，其中所述浆液含有5-60％ DS的粒状淀粉。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述％DS粒状淀粉在20-40％DS之间。
28.根据权利要求11所述的方法，其在所述发酵步骤前进一步包括使所述底物与包含回流的水溶液接触，以稀释所述％DS。
29.根据权利要求11所述的方法，其中所述粒状淀粉获自玉米、买罗高粱、大麦、小麦、水稻或其组合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中6小时后葡萄糖％为30％。
31.根据权利要求30所述的方法，其中6小时后葡萄糖％为40％。
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