ES2550477T3

ES2550477T3 - Hidrólisis de almidón utilizando fitasa con una alfa amilasa

Info

Publication number: ES2550477T3
Application number: ES08725297.9T
Authority: ES
Inventors: Bradley Alan Paulson; Scott D. Power; Sandra W. Ramer; Jayarama K. Shetty; Donald E. Ward
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2007-02-07
Filing date: 2008-02-06
Publication date: 2015-11-10
Anticipated expiration: 2028-02-06
Also published as: CA2677643C; JP2010517573A; ES2513217T3; WO2008097619A3; CN101636496A; JP2010517572A; MX2009008000A; EP2115143B1; PL2118276T3; EP2115143A2; BRPI0807757A2; DK2115143T3; WO2008097619A2; DK2118276T3; EP2118276B1; MX307871B; EP2118276A1; CA2677342C; JP5150647B2; CN101636496B

Abstract

Método para licuar almidón, comprendiendo dicho método: (a) incubar una suspensión que comprende un sustrato de almidón granulado con una composición enzimática, a una temperatura que es superior a 55 °C e inferior a la temperatura de gelatinización inicial del almidón del sustrato de almidón granulado, durante aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 4 horas a un intervalo de pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.2; (b) aumentar la temperatura a 0 °C a aproximadamente 45 °C por encima de la temperatura de gelatinización inicial del almidón durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 6 horas a un pH de entre aproximadamente pH 4.0 y aproximadamente 6.2 y obtener almidón licuado; donde la composición enzimática comprende una mezcla de una fitasa y una alfa amilasa, donde la fitasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia BP-WT:**Tabla** o con la secuencia BP-11:**Tabla** o con la secuencia BP-17:**Tabla**

Description

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: o con la secuencia BP-11:

: o con la secuencia BP-17:

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[0009] La alfa amilasa puede provenir de una Bacillus sp., por ejemplo, Bacillus stearothermophilus o Bacillus licheniformis.

[0010] La composición puede ser una composición hidrolizante de almidón.

25 [0011] La fitasa puede tener, por ejemplo, al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia BP-WT, BP-11 o BP-17, o puede tener la secuencia de BP-11 o BP-17.

[0012] El método puede comprender además las etapas de sacarificación del almidón licuado para obtener dextrinas; y recuperación de las dextrinas. El método puede comprender además la etapa de fermentación de las dextrinas bajo condiciones de fermentación adecuadas para obtener productos finales. Dichos productos finales

30 pueden incluir alcohol (por ejemplo, etanol), ácidos orgánicos, polialcoholes, compuestos intermedios de ácido ascórbico, aminoácidos y proteínas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0013]

La Fig. 1 ilustra esquemáticamente un modo de realización de la invención que incluye una etapa de 35 pretratamiento (licuefacción primaria).

La Fig. 2 ilustra la disminución de viscosidad de una suspensión de maíz entero molido de 36 % de residuo seco (ds, por su nombre en inglés) expuesta a fitasa y alfa amilasa a 85 °C, pH 5.8 y se hace referencia al ejemplo 8.

La Fig. 3 ilustra la disminución de viscosidad de una suspensión de harina de maíz de 30 % de residuo 40 seco con pH 5.8 con una combinación de SPEZYME XTRA y BP-17 como se describe adicionalmente en el ejemplo 9.

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N. º: 2 y BP-17, SEQ ID N. º: 3), a un proceso de hidrólisis de almidón que comprende una alfa amilasa proporciona ciertas ventajas con respecto a la utilización de la alfa amilasa sin la fitasa. Además, los inventores han descubierto que la utilización de una fitasa Buttiauxella sp. natural (por ejemplo, P 1-29) y variantes de la misma proporcionan medios para incrementar la eficacia de la hidrólisis del almidón.

5 [0063] Los procesos de etanol actuales requieren ajustes de pH antes y después de la licuefacción del almidón para proporcionar las condiciones adecuadas para las enzimas de licuefacción y la fermentación de la levadura. El ajuste del pH ocasiona varias desventajas. Por ejemplo, ajustar el pH causa una gran concentración de sal, lo cual puede inhibir los organismos de fermentación. Si se utiliza ácido sulfúrico, también puede ocasionar problemas de eliminación de azufre. Además, el ajuste de pH requiere etapas adicionales en el proceso, que

10 reducen la eficacia. Al estabilizar enzimas de licuefacción (por ejemplo, alfa amilasas) con una fitasa, se descubrió que la licuefacción podía ocurrir a un pH inferior de lo que requeriría normalmente. De hecho, el tratamiento con fitasas podría provocar licuefacción que ocurriera al pH de la solución de grano entero molido sin ajuste de pH, incluso una suspensión de grano entero molido que contuviera altos niveles de vinaza. Esto permitió la eliminación del ajuste del pH utilizando álcali o ácidos durante la conversión del grano entero molido a

15 etanol. Esto permitió además la conversión del almidón a glucosa en una única etapa de licuefacción sin ajuste de pH o en dos etapas de licuefacción utilizando bajas dosis de la enzima. Como una ventaja añadida, esto permitió que el proceso continuara a la sacarificación y fermentación simultánea sin ningún ajuste de pH adicional. Además, incluso si se permitió que el proceso continuara sin ajustes de pH, ocasionó un aumento de la termoestabilidad de la alfa amilasa.

20 Fitasas

[0064] En algunos modos de realización, la al menos una fitasa útil en la presente invención es una derivada de la bacteria Buttiauxella spp. La Buttiauxella spp. incluye B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae, y B. warmboldiae. Cepas de la especie Buttiauxella están disponibles en DSMZ, el Centro nacional de recursos de material biológico alemán (Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania). La cepa

25 P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 es un ejemplo de una cepa especialmente útil de la que se puede obtener una fitasa y utilizarla de conformidad con la invención. Las fitasas se pueden identificar a partir de Buttiauxella spp. mediante métodos descritos en WO 06/ 043178, por ejemplo, mediante técnicas de hibridación.

[0065] En un modo de realización preferido, una fitasa útil en la presente invención es una que tenga al menos

30 90 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % y al menos 99 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID N. º: 1 (véase la Tabla 1). Más preferiblemente, una fitasa útil en la presente invención es una que tenga al menos de 95 % a 99 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID N. º: 1 o variantes de la misma. En algunos modos de realización, la fitasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID

35 N.º:1.

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[0066] En otros modos de realización, la fitasa es una variante de la fitasa que tiene una secuencia de 45 aminoácidos como se describe en la SEQ ID N. º: 1. Algunas variantes preferidas son las variantes descritas en la publicación de la patente del PCT WO 2006/043178.

[0067] Otras variantes preferidas de la SEQ ID N. º: 1 incluyen polipéptidos que comprenden una mutación en al menos una de las siguientes posiciones de la SEQ ID N. º: 1 de la presente descripción: 26, 37, 89, 92, 134, 160, 164, 171, 176, 178, 188, 190, 192, 207, 209, 211, 235, 248, 256, 261, 270, 306 o 318. En algunos modos de 50 realización, la variante incluirá polipéptidos de fitasa que comprenden una mutación en las siguientes posiciones correspondientes a la SEQ ID N. º: 1: 89, 134, 164, 176, 178, 207, 209, 248, 256, 261 y 270. En otros modos de realización, la variante incluirá al menos una mutación adicional en una posición correspondiente a la SEQ ID

N. º: 1.

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[0068] En otros modos de realización, la fitasa comprenderá al menos una mutación en una posición correspondiente a K26E, T134V/I, F164S, T176K, K207T/E, D211C, o Q256Y. En otros modos de realización, la variante incluye polipéptidos que comprenden una combinación de mutaciones. Por ejemplo, se hace referencia a la Tabla 1 de WO 2006/ 043178, donde la numeración está en referencia a la SEQ ID N. º: 3 de la solicitud

5 publicada del PCT. En algunos modos de realización, la variante tiene al menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de la actividad de fitasa de la fitasa parental o natural de la SEQ ID N. º: 1.

[0069] En algunos modos de realización de la presente invención, la fitasa comprende o consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º: 2 o fitasas que tienen al menos al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % y al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la misma. La 10 fitasa que comprende o consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º: 2 del presente documento también se describe en WO 2006/043178 como una variante de la Buttiauxella spp. natural. Esta variante se denomina BP-11 en el presente documento. Hay 11 residuos de aminoácidos que son diferentes entre la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º: 1 (BP-WT) y la variante BP-11 (SEQ ID N. º: 2), y estos residuos aparecen en negrita y subrayados en la Tabla 2 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º: 2. En

15 algunos modos de realización, la fitasa incluirá la fitasa BP-11, donde puede haber 1, 2, 3 o más cambios de aminoácidos.

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25 [0070] En algunos modos de realización, de la presente invención, la variante comprenderá o constará de una sustitución en residuos de aminoácidos correspondiente a las posiciones de residuos A89, D92, T134, F174, T186, A188, K207, A209, S248, Q256, A261, y N269 de la SEQ ID N. º: 1. En algunos modos de realización, la fitasa comprende o consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º: 3 o fitasas que tienen al menos al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % y al menos 99 % de identidad de secuencia de

30 aminoácidos con respecto a la misma. La variante de la SEQ ID N. º: 3 se denomina BP-17 en el presente documento. Hay 12 residuos de aminoácidos que son diferentes entre la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID

N. º: 1 y la variante BP-17 (SEQ ID N. º: 3) y se hace referencia a las siguientes sustituciones A89T, D92A, T134I, F174S, T186K, A188P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, y N269K. Además, BP-17 difiere de BP-11 en una sustitución de aminoácido en la posición correspondiente al residuo 92. Por consiguiente, en algunos 35 modos de realización, la variante tiene al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID N. º: 1 y tiene al menos una alanina en el aminoácido 92. En otros modos de realización, la variante tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID N. º: 3 y tiene al menos una alanina en el aminoácido 92. En otros modos de realización, la variante tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID N. º: 1 y

40 tiene al menos una alanina en el aminoácido 92 y tiene al menos otra sustitución de aminoácido seleccionada de entre el grupo de: A89T, T134I, F174S, T186K, A188P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, y N269K. La diferencia entre los residuos de BP-WT y BP-17 aparece en negrita y subrayado en la Tabla 3 que se encuentra a continuación:

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SPEZYME XTRA 2,8 AAU/gds: SPEZYME XTRA 2,8 AAU/gds + Fitasa 7,2 FTU gds SPEZYME XTRA 5,6 AAU/gds

Viscosidad
Viscosidad
Viscosidad

Tiempo (min): °C Ncm °C Ncm °C Ncm

4,0: 72,3 63,4 72,5 55,0 72,7 44,4

4,5: 72,8 67,8 73,2 57,7 73,3 43,3

5,0: 72,9 68,1 73,7 58,0 74,2 43,4

5,5: 73,5 66,2 74,7 53,9 75,1 42,1

6,0: 74,3 64,0 76,1 51,4 76,0 39,8

6,5: 75,2 61,3 77,0 48,2 76,8 37,3

7,0: 76,4 58,5 77,6 44,6 77,7 34,8

7,5: 77,8 55,2 78,3 41,0 78,4 33,0

8,0: 79,2 53,0 79,3 36,8 79,1 31,0

8,5: 80,0 49,9 79,8 34 80,1 29,6

9,0: 80,4 47,9 80,6 30,4 80,7 28,3

9,5: 81,1 45,2 81,2 29,2 81,4 27,1

10,0: 81,5 44,1 81,8 27,8 81,9 26,3

14,0: 84,1 38,5 83,9 19,9 84,6 25,8

18,0: 84,3 37,6 84,1 15,9 84,8 24,3

22,0: 84,0 37,5 84,0 13,6 84,2 24,3

26,0: 84,4 37,4 84,3 12,5 84,4 24,0

30,0: 84,9 36,5 84,8 11,6 84,8 23,8

34,0: 85,3 36,3 85,3 10,6 85,3 23,7

38,0: 85,5 35,8 85,4 9,8 85,3 23,8

42,0: 85,6 35,8 85,7 9,0 85,3 23,8

48,0: 85,7 35,6 84,8 8,8 85,4 23,7

50,0: 85,8 35,5 84,6 8,6 85,4 23,9

55,0: 85,8 35,2 85,6 8,4 85,4 23,8

58,0: 85,6 35,4 86,0 8,2 85,4 23,8

62,0: 85,3 36,2 86,1 7,7 85,4 23,7

[0135] Los datos de viscosidad de la Tabla 4 demuestran que la incubación de maíz entero molido a 85 °C con una dosis estándar de SPEZYME XTRA (5,6 AAU/gds) produjo el licuefacto con una viscosidad estabilizada a 23,8 Ncm. En cambio, el pretratamiento de maíz entero molido con la mitad de la dosis de SPEZYME XTRA (2,8

5 AAU/g ds) y 7,2 FTU de BP-WT dio como resultado una viscosidad inferior del licuefacto a 85 °C.

Ejemplo 2: SPEZYME ETHYL y BP-WT

[0136] Se estudio el efecto de SPEZYME ETHYL durante la incubación de maíz entero molido con fitasa Buttiauxella (BP-WT). Las condiciones fueron las mismas que se describen en el ejemplo 1, a pH 5.8. Además, la incubación de maíz entero molido se llevó a cabo a un pH inferior, (pH 4.5, 65 °C) antes de aumentar la

10 temperatura a 85 °C. Empezando en tiempo 0, se tomaron muestras cada 30 seg durante los primeros 10 min y cada 4 minutos a partir de entonces hasta 62 min. Algunos de los resultados se resumen en la Tabla 5A, (pH 5.8, 65 °C 30 min de incubación) y Tabla 5B (pH 4.5, 65 °C 30 min de incubación).

Tabla 5A -Efecto de la fitasa en la reducción de la viscosidad a 85 °C durante la incubación de maíz entero molido (35 % de residuo seco) con SPEZYME ETHYL

SPEZYME ETHYL (5,6 AAU/gds): SPEZYME ETHYL (2,8 AAU/gds + Fitasa (7,2 FTU/g ds)

°C: Ncm °C Ncm

65,0: 9,6 65,0 9,3

66,3: 11,2 66,0 9,4

67,8: 16,0 67,2 11,0

68,9: 24,4 68,2 15,0

69,8: 41,2 69,6 31,8

70,3: 46,6 70,4 50,6

71,1: 49,7 70,7 58,3

71,7: 52,9 71,4 54,0

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°C: Ncm °C Ncm

72,3: 55,3 72,0 69,5

73,0: 57,0 72,4 78,2

73,6: 55,2 72,9 8,10

74,8: 52,8 73,7 81,3

76,2: 49,9 74,8 78,1

77,0: 46,7 75,7 73,2

77,7: 43,7 76,4 67,7

78,4: 39,1 77,2 61,8

79,1: 36,0 77,9 55,8

79,9: 32,6 79,4 51,8

80,5: 30,5 80,7 47,9

81,5: 27,7 81,3 44,1

81,9: 26,3 81,8 41,2

84,2: 20,0 85,3 26,5

84,2: 18,1 85,0 21,9

83,9: 16,9 84,4 18,9

84,2: 16,1 84,5 16,1

84,8: 15,2 84,7 14,4

84,8: 14,8 84,9 13,0

84,4: 13,7 85,1 11,8

84,3: 13,3 85,3 10,8

84,5: 13,1 85,5 10,2

85,0: 13,2 85,5 9,7

85,2: 13,0 85,5 9,2

85,3: 12,9 85,4 8,8

85,3: 12,7 85,2 8,6

85,5: 12,5 85,5 7,5

86,0: 12,4 85,4 7,1

Tabla 5B -Efecto de la fitasa en la reducción de la viscosidad a 85 °C durante la incubación de maíz entero molido (35 % de residuo seco) con SPEZYME ETHYL

SPEZYME ETHYL (1,85 AAU/g ds): SPEZYME ETHYL (1,85 AAU/g ds) + Fitasa (7,2 FTU/gds SPEZYME ETHYL (5,6 AAU/gds) SPEZYME ETHYL (5,6 AAU/gds) + Fitasa (7,2 FTU/gds)

°C: Ncm °C Ncm °C Ncm °C Ncm

59,9: 5,7 65,0 9,0 65,0 10,9 65,0 8,9

61,4: 5,8 66,2 9,7 66,1 11,6 66,0 9,2

62,8: 5,8 67,5 11,6 67,3 13,8 67:2 10,8

64,5: 6,4 68,6 17,1 68,5 18,8 68,5 14,3

65,8: 8,5 70,2 47,4 69,8 36,7 69,7 22,9

66,3: 10,6 70,6 59,9 70,6 52,9 70,7 38,9

67,4: 18,9 71,1 68,9 71,0 60,2 71,4 46,3

68,6: 42,1 71,6 77,0 71,8 66,9 72,0 49,3

69,3: 65,8 72,5 90,3 72,4 72,3 72,6 50,8

69,8: 91,6 73,1 99,6 73,0 82,8 73,3 54,6

70,5: 124,8 73,5 114,9 73,5 89,8 73,8 56,2

71,0: 170,0 73,9 128,5 74,0 95,9 74,6 57,0

71,5: 215,0 74,6 132,9 74,5 98,7 75,4 55,9

71,8: 291,0 75,4 130,1 75,3 98,9 76,5 54,8

71,6: 360,0 75,9 126,2 76 96,5 77,7 52,6

72,0: 405,0 76,4 119,9 76,9 94,2 78,7 50,3

77,2: 114,1 77,3 92,6 79,6 47,7

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°C: Ncm °C Ncm °C Ncm °C Ncm

77,9: 108,3 78,2 90,2 80,3 45,1

78,9: 102,8 79,0 89,0 80,9 43,4

79,8: 98,0 79,8 88,1 81,5 41,5

80,4: 94,9 80,5 86,4 82,1 39,9

84,3: 74,0 84,9 87,3 84,7 33,3

85,3: 67,3 86,0 86,6 84,7 31,9

85,1: 64,2 85,6 88,2 84,3 31,6

84,9: 61,7 84,9 89,9 84,5 31,7

84,9: 60,3 84,4 90,4 84,8 31,6

85,0: 59,5 84,2 90,2 85,1 31,0

85,1: 59,2 84,6 90,1 84,8 31,5

84,7: 59,0 85,0 89,6 84,5 31,6

84,6: 58,9 85,5 89,6 84,7 31,7

84,8: 58,9 85,3 90,2 85 31,5

84,9: 58,3 84,7 91,3 85,2 31,6

Ejemplo 3: SPEZYME FRED y BP-WT

[0137] Se estudió el efecto de SPEZYME FRED durante la incubación de maíz entero molido con fitasa Buttiauxella (BP-WT). Las condiciones fueron las mismas que se describen en el ejemplo 1 (pH 5.8, 65 °C 30 min de incubación) antes de aumentar la temperatura a 85 °C. Empezando en tiempo 0, se tomaron muestras cada 30 seg durante los primeros 10 min y cada 4 minutos a partir de entonces hasta 62 min. Los resultados se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6 -Efecto de la fitasa en la reducción de la viscosidad a 85 °C durante la incubación de maíz entero molido (35 % de residuo seco) con SPEZYME FRED

SPEZYME FRED, pH 5.8 10 LU/gds, 65 °C, 30 min ( -fitasa): SPEZYME FRED, pH 5.8 10 LU/gds, 65 °C, 30 min ( + fitasa BP-WT 7,2 FTU/g ds)) SPEZYME FRED, pH 5.8 20 LU/gds, 65 °C, 30 min (-fitasa)

°C Ncm
°C Ncm
°C Ncm

65,3: 8,4 65,0 7,5 65,2 7,9

66,4: 8,7 66,3 8,7 67,1 10,9

67,7: 12,4 67,6 11,6 68,0 14,7

68,8: 36,7 68,9 29,3 69,0 38,7

69,5: 61,5 69,7 62,8 69,6 56,0

70,0: 82,3 70,0 76,8 70,1 62,9

70,6: 98,9 70,8 92,9 70,7 70,2

71,1: 118,6 71,6 104,5 71,3 77,0

71,7: 135,5 72,0 116,4 71,8 84,9

72,2: 146,9 72,6 122,6 72,4 87,6

73,1: 138,8 73,0 122,0 73,0 86,6

74,0: 128,9 73,6 114,6 73,7 82,4

74,7: 117,5 74,1 103,5 74,7 77,1

75,5: 105,3 74,7 95,6 75,5 70,3

75,9: 93,8 75,8 87,3 76,3 63,4

76,4: 84,1 76,8 78,2 76,8 56,6

77,5: 77,3 77,8 70,8 78,7 51,6

78,6: 70,7 78,6 65,3 79,9 47,5

79,3: 65,1 79,3 60,4 80,3 42,7

80,0: 60,7 80,9 54,5 80,8 39,5

80,5: 56,5 82,1 51,0 81,6 35,3

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°C Ncm
°C Ncm
°C Ncm

85,0: 35,8 84,7 31:3 84,4 23,5

85,6: 29,2 85,3 23,3 84,6 18,5

84,6: 26,1 84,7 19,2 84,3 15,0

83,8: 23,9 84,4 17,1 84,6 13,4

84,0: 22,0 84,6 15,0 85,2 12,0

84,2: 21,2 85,0 13,1 85,6 11,3

84,3: 20,4 85,4 11,6 85,5 10,3

84,2: 19,5 85,4 10,5 85,4 9,9

84,5: 18,8 85,4 10,3 85,5 9,5

84,6: 17,8 85,5 9,2 85,6 9,2

84,5: 17,3 85,4 8,8 85,5 9,0

84,4: 117,2 85,4 8,7 85,4 9,1

85,9: 16,3 85,4 8,1 85:1 8,7

[0138] Los resultados ilustrados en la Tabla 6 demuestran que la incubación a pH 5.8, 65 °C durante 30 min con fitasa y SPEZYME FRED dio como resultado un licuefacto con viscosidad reducida.

Ejemplo 4: Efectos de viscosidad en presencia de BP-WT

[0139] Se ajustó el pH de una suspensión que comprendía 36 % de maíz entero molido a pH 5.8, pH 5.4, pH 5.2

o pH 5.0 utilizando HCL diluido. Se añadió SPEZYME XTRA (2,0 AAU/g ds) y BP-WT (3,6 FTU/g ds) a la suspensión y se mantuvo a 65 °C durante 30 min. Se utilizó SPEZYME XTRA (4,0 AAU/g ds a pH 5.8) sin fitasa como un control. Se midió la viscosidad de la suspensión durante el calentamiento a 85 °C (Tabla 7).

Tabla 7

SPEZYME XTRA (4 AAU/gds) pH 5.8 (Ncm): SPEZYME XTRA (2 AAU/gds) + BP-WT pH 5.8 (Ncm) SPEZYME XTRA (2 AAU/gds) + BP-WT pH 5.4 (Ncm) SPEZYME XTRA (2 AAU/gds) + BP-WT pH 5.2 (Ncm)

Tiempo (min)

0: 7,4 8,4 6,3 7,4

0,5: 9,2 8,5 6,5 9,2

1,0: 12,9 10,0 8,8 12,9

1,5: 26,6 15,4 15,0 26,6

2,0: 40,0 32,5 22,2 40,0

2,5: 48,2 42,4 34,3 48,2

3,0: 50,9 47,9 43,7 50,9

3,5: 54,6 51,1 48,7 54,6

4,0: 58,3 54,1 52,5 58,3

4,5: 60,9 57,1 55,6 60,9

5,0: 61,2 58,4 58,5 61,2

5,5: 58,2 56,5 59,2 58,2

6,0: 54,7 53,3 56,2 54,7

6,5: 51,4 50,1 53,8 51,4

7,0: 48,4 46,7 49,9 48,4

7,5: 45,4 43,3 46,2 45,4

8,0: 41,9 39,9 43,1 41,9

8,5: 38,5 36,5 39,9 38,5

9,0: 36,8 33,9 36,0 36,8

9,5: 34,3 31,5 34,3 34,3

10: 32,6 29,7 31,8 32,6

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NuPAGE al 4-12 %, y tampón de corrida MOPS (Invitrogen Carlsbad, CA). Se tiñeron los geles para la detección de proteínas con Simply Blue Stain (Invitrogen Carlsbad, CA). Se observó una banda de proteínas con una masa molecular aparente de aproximadamente 96 kDa sobre el gel teñido. La masa molecular esperada de la proteína de fusión es de aproximadamente 96 kDa. Se encontró que la proteína se expresaba a más de 10 g/l.

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20 Ejemplo 12 -Construcción y expresión de la fitasa Buttiauxella natural en T. reesei como una proteína de fusión con un sitio Kex2

[0157] Se amplificó el marco de lectura abierto de la fitasa Buttiauxella natural mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles) utilizando el ADN sintetizado por GENEART como patrón (véase la 25 Tabla 13, SEQ ID N. º: 4). La máquina de PCR utilizada fue un ciclador térmico Peltier PTC-200 (MJ Research). La ADN polimerasa utilizada en la PCR fue HERculase (Stratagene). Los cebadores utilizados para amplificar el marco de lectura abierto de la fitasa fueron el cebador SK667 (directo) 5' CACTACTAGTGTCGCTGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAG-3' (SEQ ID N. º: 6) y el cebador SK664 5’ GAGTTCGGCGCGCCTTACTGGA-3' (SEQ ID N. º: 7). El cebador directo contenía la secuencia de 30 aminoácidos VAVEKR (SEQ ID N. º 8) para lograr la escisión eficaz mediante la proteasa Kex2, junto con un sitio SpeI para fines de clonación. Las condiciones de la PCR para amplificar el marco de lectura abierto de la fitasa Buttiauxella natural fueron las siguientes: Etapa 1: 94 °C durante 1 min. Etapa 2: 94 °C durante 30 seg. Etapa 3: 58 °C durante 30 seg. Etapa 4: 72 °C durante 1 min. Se repitieron las etapas 2, 3 y 4 durante 24 ciclos adicionales. Etapa 5: 72 °C durante 5 min. Etapa 6: 4 °C durante el almacenamiento. Se purificó el producto de la 35 PCR utilizando el kit de purificación de gel Qiaquick (Qiagen), y se digirió con las enzimas de restricción SpeI y AscI (Roche). Se purificó el ADN digerido utilizando el kit de purificación de PCR Qiaquick, y se ligó en el vector pTrex4 en los sitios SpeI y AscI (véase la Figura 4). Se transformó la reacción de ligación en células de E. coli químicamente competentes TOP 10 (Invitrogen). El constructo resultante se transformó biolísticamente en una cepa derivada de T. reesei, utilizando el sistema de liberación de partículas Biolistic PDS-1000/He de Bio-Rad

40 (Hercules, CA). El protocolo de transformación utilizado fue el que describe Foreman (WO 2005/001036). Tras obtener transformantes estables, se cultivaron estos transformantes y se identificó la expresión de la proteína como se describe en el ejemplo 11. Se observó una banda de proteínas con una masa molecular aparente de aproximadamente 96 kDa en el gel teñido. La masa molecular esperada de la proteína de fusión es de aproximadamente 96 kDa. La proteína se expresó a más de 10 g/l.

45 Ejemplo 13 -Construcción y expresión de la fitasa Buttiauxella natural en T. reesei como un constructo directo

[0158] Se amplificó el marco de lectura abierto de la fitasa Buttiauxella natural mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) utilizando el ADN sintetizado por GENE ART como patrón (véase la

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Tabla 13, SEQ ID N. º: 4). La máquina de PCR utilizada fue un ciclador térmico Peltier PTC-200 (MJ Research). La ADN polimerasa utilizada en la PCR fue HERculase (Stratagene). Los cebadores utilizados para amplificar el marco de lectura abierto de la fitasa fueron el cebador SK680 (directo) 5'-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCC

5 GCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC -3' (SEQ ID N. º: 9) y el cebador SK6 5'-CCTTACTGGAGCTGGCAG -3' (SEQ ID N. º: 10). El cebador directo contenía cuatro nucleótidos adicionales (secuencia -CACC) en el extremo 5' que se requerían para la clonación en el vector pENTRY/D-TOPO (Invitrogen). Las condiciones de la PCR para amplificar el marco de lectura abierto de la fitasa Buttiauxella natural fueron las siguientes: Etapa 1: 94 °C durante 1 min. Etapa 2: 94 °C durante 30 seg. Etapa 3: 58 °C durante 30 seg. Etapa 4: 72 °C durante 1 min. Se

10 repitieron las etapas 2, 3 y 4 durante 24 ciclos adicionales. Etapa 5: 72 °C durante 5 min. Etapa 6: 4 °C durante el almacenamiento. Se purificó el producto de la PCR utilizando el kit de purificación de gel Qiaquick (Qiagen). Se clonó inicialmente el producto de la PCR purificado en el vector pENTRY/D TOPO (Invitrogen), y se transformó en células de E. coli químicamente competentes TOP 10 (Invitrogen). Se recombinó un vector pENTR/D-TOPO con la secuencia correcta del marco de lectura abierto de la fitasa con el vector pTrex3g utilizando LR clonase II

15 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante (véase la Figura 5). Se transformó el constructo resultante y se identificó la proteína como se describe en el ejemplo 11. Se observó una banda de proteínas con una masa molecular aparente de aproximadamente 46 kDa en el gel teñido. La masa molecular esperada de la proteína de fusión es de aproximadamente 46 kDa. La proteína se expresó a más de 10 g/l.

Ejemplo 14 -Construcción y expresión de la variante BP-17 de la fitasa Buttiauxella en T. reesei como 20 una proteína de fusión con un sitio Kex2

[0159] Se sintetizó ADN que codifica el marco de lectura abierto de la variante BP-17 de la fitasa Buttiauxella por GENEART AG (BioPark Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Alemania) (véase la Tabla 14, SEQ ID

N. º: 5). Se incluyó la secuencia de aminoácidos VAVEKR (SEQ ID N. º: 8) para la escisión de la proteasa Kex2 de la proteína de fusión, junto a los sitios de restricción SpeI y AscI para fines de clonación. Se insertó el marco

25 de lectura abierto de la fitasa en el vector, pTrex4, en los sitios Spe1 y Asc1 (véase la Figura 4). Se transformó el constructo resultante y se identificó la proteína como se describe en el ejemplo 11. Se observó una banda de proteínas con una masa molecular aparente de aproximadamente 96 kDa en el gel teñido. La masa molecular esperada de la proteína de fusión es de aproximadamente 96 kDa. La proteína se expresó a más de 10 g/l.

Tabla 14: Secuencia de ADN de la variante BP-17 de la fitasa Buttiauxella que contiene un sitio Spel en el extremo 5' y un sitio Ascl en el extremo 3'.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para licuar almidón, comprendiendo dicho método:

(a) incubar una suspensión que comprende un sustrato de almidón granulado con una composición enzimática, a una temperatura que es superior a 55 °C e inferior a la temperatura de gelatinización inicial

5 del almidón del sustrato de almidón granulado, durante aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 4 horas a un intervalo de pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.2;

(b) aumentar la temperatura a 0 °C a aproximadamente 45 °C por encima de la temperatura de gelatinización inicial del almidón durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 6 horas a un pH de entre aproximadamente pH 4.0 y aproximadamente 6.2 y obtener almidón licuado;

10 donde la composición enzimática comprende una mezcla de una fitasa y una alfa amilasa, donde la fitasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia BP-WT:

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o con la secuencia BP-11:

o con la secuencia BP-17:

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2. Método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la alfa amilasa proviene de una Bacillus sp.

35 3. Método de conformidad con la reivindicación 2, en el que la Bacillus sp. es Bacillus stearothermophilus o Bacillus licheniformis.
4. Método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la composición es una composición hidrolizante de almidón.
5. Método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la fitasa tiene al menos 95 % de identidad de 40 secuencia con la secuencia BP-WT, BP-11 o BP-17.
6. Método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la fitasa tiene la secuencia de BP-11 o BP-17.

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