CN101960015A

CN101960015A - 在糖化过程中的葡糖淀粉酶和布丘氏菌植酸酶

Info

Publication number: CN101960015A
Application number: CN2009801076664A
Authority: CN
Inventors: S·布莱尼曼; O·兰特罗; B·保尔森; J·舍蒂
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2009-03-09
Publication date: 2011-01-26
Also published as: EP2265720B1; US8354256B2; MX2010009652A; EP2265720A1; CA2718017A1; WO2009114451A1; HUE034509T2; PL2265720T3; JP5564441B2; JP2011512873A; CA2718017C; BRPI0909143A2; US20090246845A1

Abstract

描述了涉及在淀粉加工中葡糖淀粉酶与植酸酶组合使用以降低终产物中的植酸水平的组合物和方法。

Description

在糖化过程中的葡糖淀粉酶和布丘氏菌植酸酶

优先权

本申请要求于2008年3月11日提交的美国临时专利申请号61/035,672的优先权，其通过引用全文并入到本文中。

技术领域

描述的方法涉及葡糖淀粉酶和布丘氏菌(Buttiauxella spp.)植酸酶在淀粉转化过程中的用途，例如，用于生产动物饲料的DDGS或在发酵过程中生产有机化合物，如乙醇。

背景

工业发酵方法主要使用葡萄糖作为生产多种终产物的原料，包括酶、蛋白质、氨基酸、有机酸、糖醇、药物和其他生物化学品。在多种应用中，葡萄糖是由包含淀粉和纤维素的底物(例如，磨碎的全谷物)的酶促转化产生的。加工淀粉产生葡萄糖通常涉及2个步骤，即颗粒状淀粉的液化和液化淀粉的糖化来产生葡萄糖。其他步骤可以包括纯化和异构化，例如当理想的终产物是纯化的葡萄糖或果糖时，或者发酵和蒸馏，例如当理想的终产物是醇类时(例如，乙醇)。

液化作用将淀粉聚合物颗粒的浆液转化为较低粘度的链长较短的糊精溶液。糖化步骤进一步将这些较短链的糊精转化为葡萄糖。通常，淀粉的液化是通过暴露在升高的温度下，并酶促生物转化。常规的酶促液化过程涉及向包含底物的浆液中添加热稳定的细菌α-淀粉酶(例如，

FRED或

XTRA(Danisco US，Inc，Genencor Division)或者

SC或TERMAMYL^TM 120L(Novozymes))，所述底物包括颗粒状淀粉。将pH调节至5.5至6.5之间，温度升高至高于90℃。首先将淀粉凝胶化，然后暴露在糖化酶下。典型地，在存在葡糖淀粉酶(例如，来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶(如，

L-400(DaniscoUS，Inc.Genencor Division)))、处于比液化步骤使用的pH更酸的pH条件下进行糖化作用。典型的糖化步骤的pH是约pH 4.0-5.0。然后，发酵所获得的糖，提供理想的终产物(例如，乙醇)。在生产乙醇的过程中，产生了副产物和废物例如干酒糟及其可溶物(DDGS)，并用于饲料。此外，从该过程中获得的液体(例如，酒槽水)通过与浆液混合而被循环利用。

淀粉底物的液化和糖化作用存在多种变型。然而，对淀粉液化、糖化和发酵的进展仍然存在需要。

概述

描述了在淀粉转化过程中涉及葡糖淀粉酶与植酸酶组合使用的组合物和方法。此类过程可用于生产有机化合物(例如乙醇)，生产用于动物饲料的DDGS，或两者。在一些实施方案中，组合物和方法包括在前糖化、糖化和/或组合的糖化/发酵的过程中，向淀粉转化工序添加包含葡糖淀粉酶和植酸酶的酶混合物。此类组合物和方法提供了优于仅使用葡糖淀粉酶的一些优势。

在一些方面，本发明提供了发酵淀粉的方法，包括向待糖化的组合物添加任意顺序的至少一种葡糖淀粉酶和至少一种布丘氏菌植酸酶的组合。在一些实施方案中，向已经历液化作用的组合物中添加至少一种葡糖淀粉酶和至少一种布丘氏菌植酸酶。在其他方面，淀粉发酵为乙醇。在其他方面，产生具有降低的植酸的DDGS。在其他方面，产生包含活性植酸酶的DDGS。在其他一些方面，产生酒糟水，并具有降低的植酸酶。在一些实施方案中，酒糟水循环进入过程中。在一些方面，提供了生产醇类的方法，包括将包含淀粉底物的浆液与至少一种α-淀粉酶接触产生寡糖；将寡糖与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶接触，其中植酸酶获得自布丘氏菌(Buttiauxella spp.)，产生可发酵的糖；和在存在发酵生物的条件下，发酵可发酵的糖以产生醇。在一些实施方案中，接触是同时发生的。在一些实施方案中，在用α淀粉酶处理之后和添加葡糖淀粉酶之前，将温度提高到高于淀粉底物的凝胶化温度。

在一些实施方案中，淀粉底物是磨碎的谷物，且磨碎的谷物选自玉米、大麦、小麦、稻、高粱、黑麦、粟和/或黑小麦。在一些实施方案中，至少一种葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO：5的序列至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，植酸酶也具有在92位氨基酸的丙氨酸和/或至少一种下列氨基酸：89位的苏氨酸、134位的异亮氨酸、174位的丝氨酸、186位的赖氨酸、188位的脯氨酸、207位的谷氨酸、209位的丝氨酸、248位的亮氨酸、256位的酪氨酸、261位的谷氨酸和269位的赖氨酸。在一些实施方案中，植酸酶具有至少一种下列氨基酸改变：A89T、D92A、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E和N269K。在一些实施方案中，植酸酶是野生型布丘氏菌植酸酶(BP-WT)，或选自BP-11和BP-17的变体。在一些实施方案中，植酸酶具有SEQ ID NO：5、6、7和8中任一项给出的氨基酸序列。

在一些实施方案中，方法还包括将寡糖与至少一种其它/额外酶接触，所述酶选自α-淀粉酶、第二种葡糖淀粉酶、第二种植酸酶、纤维素酶、支链淀粉酶、蛋白酶和/或漆酶。醇可以是乙醇。在一些实施方案中，方法包括回收醇。在一些实施方案中，方法还可以包括回收DDGS。

本发明的其它方面包括降低乙醇发酵过程中的植酸的方法，包括将包含淀粉底物的浆液与至少一种α-淀粉酶接触以产生液化物；在使产生可发酵糖的条件下，将液化物与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶接触，其中植酸酶与SEQ ID NO：5具有至少90％氨基酸序列同一性，且其中植酸酶在92位具有丙氨酸；和在存在发酵生物的条件下，发酵可发酵的糖，从而产生乙醇和/或DDGS。在一些实施方案中，该方法还包括将温度提高到高于淀粉底物的液化温度的步骤。在一些实施方案中，将淀粉底物与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶接触，并同时在存在发酵生物的条件下发酵可发酵的糖。

在一些实施方案中，该方法包括回收乙醇和/或DDGS。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶来自丝状真菌，所述真菌选自木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、篮状菌属(Talaromyces)、曲霉属(Aspergillus)和/或腐质霉(Humicola)。在一些实施方案中，木霉是里氏木霉。在一些实施方案中，植酸酶是BP-17。在一些实施方案中，DDGS具有活性剩余植酸酶。在一些实施方案中，DDGS可以混合到饲料中。在一些实施方案中，当DDGS与谷类或饲料混合产生动物饲料时，活性植酸酶降低了饲料中的植酸。在一些实施方案中，淀粉底物是磨碎的谷物，例如，玉米、大麦、粟、小麦、稻、高粱、黑麦和/或黑小麦。

本发明的其它方面包括降低DDGS中的植酸的方法，包括将包含淀粉底物的浆液与至少一种α-淀粉酶接触；在使产生可发酵糖的条件下，将淀粉底物与至少一种里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)和至少一种植酸酶接触，其中植酸酶与SEQ ID NO：5具有至少90％氨基酸序列同一性；和在存在发酵生物的条件下，发酵可发酵的糖以产生乙醇和/或DDGS。在一些实施方案中，将淀粉底物与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶接触，与在存在发酵生物的条件下发酵可发酵的糖是同时发生的。在一些实施方案中，植酸酶与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性，且在92位氨基酸具有丙氨酸。在一些实施方案中，植酸酶是野生型布丘氏菌植酸酶(BP-WT)，或选自BP-11和BP-17的变体。

还考虑了包含葡糖淀粉酶混合物与植酸酶的组合的单个组合物。此类混合物可以在淀粉转化过程的前糖化、糖化和/或组合的糖化/发酵步骤的过程中添加。

下文更详细的描述了本组合物和方法的这些和其他方面。

附图简介

图1显示了使用包含不同水平的BP-17植酸酶的酶组合物，在玉米的酵母发酵中获得的DDGS的游离磷含量。

序列简介

SEQ ID NO：1是里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是TrGA的催化结构域的氨基酸序列，对应残基1-453。

SEQ ID NO：3是TrGA的接头区的氨基酸序列，对应残基453-491。

SEQ ID NO：4是TrGA的淀粉结合结构域的氨基酸序列，对应残基492-599。

SEQ ID NO：5是布丘氏菌植酸酶的成熟蛋白质序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是布丘氏菌植酸酶变体D92A的成熟蛋白质序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是布丘氏菌植酸酶变体BP-11的成熟蛋白质序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是布丘氏菌植酸酶变体BP-17的成熟蛋白质序列的氨基酸序列。

发明详述

I.简介

本组合物和方法涉及酶混合物，包括葡糖淀粉酶与至少一种植酸酶的组合，用于淀粉转化过程，例如用于产生用于动物饲料的DDGS，或者用于生产有机化合物(例如，乙醇)的发酵过程。组合物和方法可用于降低在糖化、发酵和/或同时糖化和发酵(SSF)过程中的植酸，导致发酵产物或副产物(例如，DDGS和酒糟水)植酸降低。

在一些实施方案中，植酸酶是布丘氏菌植酸酶或其变体。在一些实施方案中，植酸酶具有与SEQ ID NO：5至少90％序列同一性，包括至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，及高达并包括100％。在一些实施方案中，植酸酶具有与SEQ ID NO：5至少90％序列同一性，包括至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，及达到并包括100％，且还包括在92位的丙氨酸。在一些实施方案中，植酸酶具有与SEQ ID NO：5至少90％序列同一性，包括至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，及达到并包括100％，且还包括在92位的丙氨酸，另外还具有至少一种下列氨基酸序列特征：89位的苏氨酸、134位的异亮氨酸、174位的丝氨酸、186位的赖氨酸、188位的脯氨酸、207位的谷氨酸、209位的丝氨酸、248位的亮氨酸、256位的酪氨酸、261位的谷氨酸和269位的赖氨酸。在一些实施方案中，植酸酶具有至少一种下列氨基酸取代：A89T、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E和N269K，具有或不具额外的取代D92A。在一些实施方案中，植酸酶是野生型布丘氏菌植酸酶，或变体BP-11或BP-17。在一些实施方案中，变体植酸酶具有布丘氏菌植酸酶的至少约50％的植酸酶活性，包括至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，和甚至至少97％的植酸酶活性。

在一些实施方案中，葡糖淀粉酶获得自丝状真菌。在特定的实施方案中，葡糖淀粉酶具有与里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA；SEQ ID NO：1)至少约90％序列同一性，包括至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，及高达100％。

下文更详细的描述了本组合物和方法的这些和其他特征。

II.定义

除非另外说明，制造和使用本组合物和方法涉及在分子生物学、蛋白质工程、重组DNA技术、微生物学、细胞生物学、细胞培养、转基因生物学、免疫学和蛋白质纯化中普遍使用的常规技术。此类技术是本领域技术人员已知的，描述在多种教科书和参考文件中。虽然示例了特定的方法和材料，但可以使用相似或等同的方法和材料制造或使用组合物和方法。

除非另外定义，所有的技术和科学术语都应该符合其通常含义。为了清楚起见，定义下列术语：

“α淀粉酶”是α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)，具有切割或水解淀粉中的内部α-1，4-糖苷键的能力(例如，支链淀粉或直链淀粉聚合物)。

术语“颗粒状淀粉水解(GSH)酶”和“具有颗粒状淀粉水解(GSH)活性的酶”指具有水解颗粒形式淀粉的能力的酶。

术语“功能等同物”指这样的分子(例如酶)，所述分子具有与另一种分子相同的功能特征(如酶促活性)。

术语“变体”当用于指代酶(例如，α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性真菌蛋白酶、植酸酶等)时，指源自亲本酶但与亲本酶相比具有一个或多个氨基酸的取代、插入或缺失的酶。该术语还包括杂交形式的酶，其中例如，酶可以具有源自芽孢杆菌(例如，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))的C末端，和源自不同的芽孢杆菌(例如，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus))的N末端，或反之亦然。与亲本酶相比，变体可以具有一种或多种改变的性质，例如增加的热稳定性、增加的蛋白水解稳定性、增加的比活、更宽的底物特异性、更宽的pH范围内的活性、对抑制的抗性(例如，底物)或其组合。“亲本酶”指用作修饰起点的酶。亲本酶可以是天然存在的或“野生型”的酶。

如本文中使用的，“液化”或“使液化”指将淀粉转化为较短链的、较低粘度的糊精的过程。

如本文中使用的，“糊精”指葡萄糖的短链聚合物(例如，2-10个单位)。

如本文中使用的，术语“淀粉”指包含复杂多糖碳水化合物(淀粉和支链淀粉)的任何物质，其具有通式(C₆H₁₀O₅)_x，其中x是任意值。

如本文中使用的，术语“颗粒状淀粉”意指粗淀粉，即，未经历凝胶化温度的淀粉。

如本文中使用的，术语“糖化酶”和“葡糖淀粉酶”是可互换使用的，指能够催化D-葡萄糖从淀粉和相关的寡糖和多糖的非还原端释放的任意酶。

如本文中使用的，术语“寡糖”指具有以糖苷键连接的2-10个单糖单位的分子。单糖可以是葡萄糖和/或其他的糖。寡糖包括糊精和淀粉。

如本文中使用的，术语“可发酵的糖”指能够被发酵生物发酵的糖。可发酵的糖包括但不限于寡糖和糊精。

如本文中使用的，术语“右旋糖等同物”或“DE”指用于测量总还原糖浓度的工业标准，在干重基础计算为D-葡萄糖。未水解的颗粒状淀粉具有几乎为0的DE，D-葡萄糖具有100的DE。

如本文中使用的，术语“总糖含量”指在淀粉组合物中存在的总糖含量。“总糖含量”可以在过程中的多个时间或点测量。

如本文中使用的，术语“干燥固体”或“ds”指在浆液中的总固体，表达为基于干重的百分比。

如本文中使用的，涉及氨基酸或核苷酸序列时，“百分比(％)序列同一性”指在一条序列中与另一条序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比，如通过比对序列并需要时引入空位以实现最佳比对(即，最大百分比序列同一性)而确定，且在确定序列同一性时不考虑保守取代。实施序列比对和确定序列同一性的方法是已知的，并且可以在不进行过度实验的条件下实施而获得确定值。多种算法可用于比对序列和确定序列同一性，包括但不限于：Needleman等人，(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，Smith等人，(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法，(1997)Meth.Mol.Biol.70：173-187；BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(参见，Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。使用这些算法的计算机程序也是可获得的，包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或WU-BLAST-2(参见例如，Altschul等人，(1996)Meth.Enzym.266：460-480)；或GAP、BESTFIT、BLAST(例如，Altschul等人，见上文；FASTA和TFASTA，可获得自Genetics Computing Group(GCG)包，第8版，Madison，Wis.，USA)；和Intelligenetics，Mountain View，CA，USA的PC/Gene程序中的CLUSTAL。

本领域技术人员知道如何确定测量比对的合适参数，包括在待比较的序列全长实现最大比对所需的算法。在一些实施方案中，使用程序的缺省参数确定序列同一性。在一些实施方案中，可以通过在MSPRCH程序(Oxford Molecular，Accelrys Ltd.，Oxford England)实现的Smith-Waterman同源性搜索算法确定序列同一性(参见例如，(1997)Meth.Mol.Biol.70：173-187)，使用按下列搜索参数的仿射空位搜索：空位开放罚分12，空位延伸罚分1。在一些实施方案中，可以使用Genetics ComputerGroup，Inc.，Madison，Wis.的GCG序列分析软件包的GAP程序进行成对氨基酸比较，其中使用blosum62氨基酸取代矩阵，空位权重12且长度权重为2。在一些实施方案中，涉及两条核酸序列的最佳比对时，变体氨基酸序列的连续片段相对于参照氨基酸序列可具有至少一个额外的氨基酸残基，或具有至少一个缺失的氨基酸残基。用于与参照氨基酸序列比较的连续片段包括至少约20个连续的氨基酸残基，并可包括至少约30、至少约40、至少约50或更多个氨基酸残基。可以通过设定空位罚分来校正与衍生物的氨基酸序列中包含空位相关的增加的序列同一性。

当相对于

DNA序列数据库和其它公共数据库中的核酸序列评估给定的核酸序列时，通常使用BLASTN程序进行序列搜索。在一些实施方案中，BLASTX程序优选用于针对

蛋白质序列和其它公共数据库中的氨基酸序列，搜索已经在所有可读框中翻译的核酸序列。BLASTN和BLASTX都通常用缺省参数运行，开放空位罚分为11.0，延伸空位罚分为1.0，并使用BLOSUM-62矩阵(参见例如，Altschul等人，(1997))。

选定序列的比对可用于确定两条或多条序列之间的％同一性(该术语在本文中可与术语％同源性互换使用)。在一些实施方案中，MacVector 6.5版中的CLUSTAL-W程序用缺省参数操作，包括开放空位罚分为10.0，延伸空位罚分为0.1，并使用BLOSUM 30相似性矩阵。

如本文中使用的，术语“磨碎的”指减小了尺寸的植物材料，例如通过研磨、粉碎、分级分离或任何其它减小或分选颗粒尺寸的方法。该术语涵盖了干磨法和湿磨法。“干磨法”指研磨干燥的全谷类，而“湿磨法”指首先在水中浸泡谷类(即，浸透的)使谷类软化的方法。

如本文中使用的，术语“凝胶化”指淀粉分子的增溶作用，通常通过在升高的温度下蒸煮，形成粘稠的悬浮液。

如本文中使用的，术语“凝胶化温度”指含淀粉底物开始凝胶化的温度。在一些实施方案中，这是含淀粉底物开始凝胶化的最低温度。凝胶化的确切温度依赖于存在的淀粉的特定形式，并且可以随这样的因素改变，所述因素是例如植物种类、环境条件、生长条件和其它参数。

如本文中使用的，术语“低于凝胶化温度”指低于凝胶化温度的温度。

如本文中使用的，术语“浆液”指包含不溶性固体(例如，颗粒状淀粉)的水性混合物。

如本文中使用的，术语“发酵”指微生物对有机物质的酶促降解，来产生更简单的有机化合物。当发酵发生在厌氧条件下时，该术语并非意在仅限于严格厌氧条件，发酵也可以在存在氧气的条件下发生(例如，在微量需氧和其它条件下)。

如本文中使用的，短语“同时糖化和发酵”或“SSF”指生产终产物的方法，其中发酵生物(例如，产乙醇微生物)和至少一种酶(例如糖化酶)组合在相同容器中的相同方法步骤中。

如本文中使用的，术语“酒糟水”意指从固体中分离的釜馏物的液体部分(例如，通过筛选或离心)，其含有悬浮的细小颗粒和不溶的材料。术语“涡流(backset)”通常用于意指循环的酒糟水。

如本文中使用的，术语“终产物”指从可发酵底物酶促转化的碳源来源的产物。在一些实施方案中，终产物是醇类(例如，乙醇)。

如本文中使用的，术语“源自”涵盖了术语“起源自”、“获得自”、“可获得自”和“分离自”。

如本文中使用的，术语“发酵生物”指适合在直接或间接生产终产物的发酵方法中使用的微生物或细胞。在一些实施方案中，发酵生物是真核的(例如，真菌)，而在其它情况下是原核的(例如，细菌)。

如本文中使用的，术语“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指能够从单糖或寡糖产生乙醇的发酵生物。

如本文中使用的，术语“回收”、“分离”和“分开”指从其天然相关的至少一种组分中移出蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

如本文中使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换的使用，指通过肽键相连的一系列氨基酸残基。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母密码。3字母密码与IUPAC-IUB生物化学命名法联合委员会(IUPAC-IUB JointCommission on Biochemical Nomenclature(JCBN))一致。可以理解，由于遗传密码的简并性，可通过一种以上的核苷酸序列编码多肽。除非另外说明，氨基酸序列从左至右按氨基至羧基方向书写。

如本文中使用的，术语“植酸酶”指能够催化磷酸酯(包括植酸)水解，并释放无机磷酸和肌醇的酶。在一些实施方案中，除了植酸，植酸酶还能够水解至少一种中等程度磷酸化的肌醇-磷酸酯。

如本文中使用的，术语“野生型”指天然存在的(天然的)多肽或多核苷酸。在一些情况下，术语野生型可与术语“亲本”或“亲本序列”互换使用。

如本文中使用的，术语“接触”和“暴露”指将至少一种酶与其同族底物置于足够接近，使酶能够将底物转化为至少一种终产物。终产物可以是“目标产物”(即，终产物是发酵反应的理想结果)。“接触”包括将包含酶的溶液与同族底物混合。

如本文中使用的，除非上下文清楚地说明，单数术语“一”、“一个”和“这个”都包括复数形式。因此例如，称组合物含有“一种化合物”包括两种或多种化合物的混合物。术语“或”通常意指“和/或”，除非上下文另外清楚地说明。

出于方便而提供标题，在一处标题下提供的描述可以等价的用于公开文本的其它部分。所有引用的种类和范围都可以通过合适的语言或附加条件清楚地囊括或排除。

数值范围包括了定义该范围的数值。当提供了值的范围时，可以理解也特定的公开了在范围上下限之间的各中间值，到下限单位的十分之一(除非上下文另外清楚地说明)。较小范围的上下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外。

不论上文还是下文，本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物都通过引用全文并入到本文中。

III.示例性实施方案

A.葡糖淀粉酶

多种葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3)都可根据本组合物和方法使用。在一些实施方案中，GA是由细菌、植物和/或真菌内源性表达的，而在其它实施方案中，GA对宿主细胞(例如，细菌、植物和/或真菌)是异源的。在一些实施方案中，GA是由丝状真菌和酵母菌株产生的，例如，由曲霉和木霉的菌株生产的可商购的GA。合适的GA包括天然存在的野生型酶及其变体和遗传改造的突变的酶，例如杂合GA。杂合GA包括具有来自一种生物体的GA(例如，篮状菌(Talaromyces)GA)的催化结构域和来自另一种生物体的GA(例如，木霉GA)的淀粉结合结构域。在一些实施方案中，在淀粉结合结构域(SBD)或催化结构域中包括接头。下列所述是适合使用的示例性GA：黑曲霉(Aspergillus niger)G1和G2GA(参见例如，Boel等人，(1984)EMBOJ.3：1097-1102；WO 92/00381、WO 00/04136和USP 6,352,851)；泡盛曲霉(Aspergillus awamori)GA(参见例如，WO 84/02921)；米曲霉(Aspergillusoryzae)GA(参见例如，Hata等人，(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949)；和Aspergillus shirousami GA(参见例如，Chen等人，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Chen等人，(1995)Prot.Eng.8：575-582；和Chen等人，(1994)Biochem J.302：275-281)。

其他的GA包括从以下菌株获得的GA：篮状菌菌株(例如，埃默森篮状菌(T.emersonii)、T.leycettanus、T.duponti和嗜热篮状菌(T.thermophilus)(参见例如，WO 99/28488；美国专利号RE 32,153；美国专利号4,587,215)；木霉菌株(例如，里氏木霉)；根霉菌株(例如，雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae))；毛霉(Mucor)菌株和腐质霉(Humicola)菌株(例如，灰色腐质霉(H.grisea)(参见例如，Boel等人，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen等人，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor等人，(1978)Carbohydrate Res.61：301-308；美国专利号4,514,496、4,092,434和4,618,579；Jensen等人，(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223；和WO 2005/052148的SEQ ID NO：3)；以及与美国专利公开号2006-0094080中公开的SEQ ID NO：4具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％序列同一性的GA。

在一些实施方案中，GA与WO 05/052148的SEQ ID NO：3氨基酸序列有至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99％的序列同一性。可用于本发明的其它GA包括获得自罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(参见例如，WO 04/111218)和青霉属(Penicillium spp.)(参见例如，产黄青霉(Penicillium chrysogenum))的GA及其变体。

适合如所述使用的可商购GA包括但不限于

L-400和G

G9904X、GC480、G-ZYME 480、

l-400(Danisco US，Inc，Genencor Division)、(Shin Nihon Chemicals，Japan)、GLUCZYME(AmanoPharmaceuticals，Japan(参见例如，Takahashi等人，(1985)J.Biochem.98：663-671))。其它如所述使用的酶包括根霉属生产的三种形式的GA(E.C.3.2.1.3)，即“Gluc1”(MW 74,000)、“Gluc2”(MW 58,600)和“Gluc3”(MW61,400)。通常，任何合适的GA都可用于根据本发明的组合物和方法。

里氏木霉GA(TrGA)的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：1)显示如下。序列具有599个氨基酸，催化结构域(SEQ ID NO：2)是下划线的，对应于残基1-453；接头区(SEQ ID NO：3)对应残基453-491；以及淀粉结合结构域SEQID NO：4(斜体字)对应残基492-599。

里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：1)：

1 SVDDFISTET PIALNNLLCN VGPDGCRAFG TSAGAVIASP STIDPDYYYM

51 WTRDSALVFK NLIDRFTETY DAGLQRRIEQ YITAQVTLQG LSNPSGSLAD

101 GSGLGEPKFE LTLKPFTGNW GRPQRDGPAL RAIALIGYSK WLINNNYQST

151 VSNVIWPIVR NDLNYVAQYW NQTGFDLWEE VNGSSFFTVA NQHRALVEGA

201 TLAATLGQSG SAYSSVAPQV LCFLQRFWVS SGGYVDSNIN TNEGRTGKDV

251 NSVLTSIHTF DPNLGCDAGT FQPCSDKALS NLKVVVDSFR SIYGVNKGIP

301 AGAAVAIGRY AEDVYYNGNP WYLATFAAAE QLYDAIYVWK KTGSITVTAT

351 SLAFFQELVP GVTAGTYSSS SSTFTNIINA VSTYADGFLS EAAKYVPADG

401 SLAEQFDRNS GTPLSALHLT WSYASFLTAT ARRAGIVPPS WANSSASTIP

451 STCSGASVVG SYSRPTATSF PPSQTPKPGV PSGTPYTPLP

501

551

在一些实施方案中，GA与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，GA是美国专利号7,413,887中公开的TrGA。

B.植酸酶

多种植酸酶可根据本组合物和方法使用。有用的植酸酶包括在本文描述的糖化、发酵和/或同时糖化和发酵的定义条件下，能够水解植酸的酶。在一些实施方案中，组合物和方法涉及向糖化和/或SSF中添加至少一种植酸酶，且植酸酶能够从肌醇六磷酸(例如，植酸)中释放至少一个无机磷酸。

根据其对起始水解作用的植酸分子上特定位置的磷酸酯基的偏爱性，可以将植酸酶分类(例如，3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。在一些实施方案中，植酸酶被称为肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶。然而，预期来自任何合适来源(例如，真菌和/或细菌)的植酸酶都可用于本组合物和方法。

在一些实施方案中，植酸酶获得自布丘氏菌属，例如乡间布丘氏菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiase)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺氏布丘氏菌(B.Noackiae)或瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。可从DSMZ(德国国立生物材料资源中心(Inhoffenstrabe 7B，38124Braunschweig，Germany))和其它保藏单位获得布丘氏菌的菌株。在一些实施方案中，植酸酶是由以保藏号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌菌株P1-29生产的。

在一些实施方案中，植酸酶与布丘氏菌植酸酶具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和甚至至少约99％的序列同一性，所述布丘氏菌植酸酶具有SEQ ID NO：5所述的氨基酸序列。

布丘氏菌植酸酶的成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：5)

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT

PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE

AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA

QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS

IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL

KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI

LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV

SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR

VVSQSVEPGC QLQ

在一些实施方案中，植酸酶与布丘氏菌植酸酶的变体具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和甚至至少约99％的序列同一性，所述变体在92位氨基酸具有丙氨酸，如SEQ ID NO：6所述。

布丘氏菌植酸酶变体D92A的成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：6)

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT

PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VAQRTLKTGE

AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA

QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS

IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL

KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI

LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV

SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR

VVSQSVEPGC QLQ

在一些实施方案中，植酸酶是布丘氏菌植酸酶变体BP-11，具有SEQID NO：7所述的氨基酸序列，且相对于野生型酶(SEQ ID NO：5)，在氨基酸残基A89、T134、F174、T186、A188、K207、A209、S248、Q256、A261和N269上包含取代。具体的取代是A89T、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E和N269K。

布丘氏菌植酸酶变体BP-11的成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：7)

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT

PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWTD VDQRTLKTGE

AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGICSMDKT QVQQAVEKEA

QTPIDNLNQH YIPSLALMNT TLNFSKSPWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS

IKDNGNEVSL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWALLL

KLHNVYFDLM ERTPYIARHK GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI

LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV

SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR

VVSQSVEPGC QLQ

在一些实施方案中，植酸酶与SEQ ID NO：5所述氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和甚至至少约99％的序列同一性，在92位具有丙氨酸(如SEQ ID NO：6中给出)，且具有至少一个下列氨基酸：89位的苏氨酸、134位的异亮氨酸、174位的丝氨酸、186位的赖氨酸、188位的脯氨酸、207位的谷氨酸、209位的丝氨酸、248位的亮氨酸、256位的酪氨酸、261位的谷氨酸和269位的赖氨酸。

在一些实施方案中，植酸酶与SEQ ID NO：5所述氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和甚至至少约99％的序列同一性，且具有至少一个下列氨基酸改变：A89T、D92A、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E和N269K。

在一些实施方案中，植酸酶是布丘氏菌植酸酶变体BP-17，具有SEQID NO：8所示的氨基酸序列，且相对于野生型酶(SEQ ID NO：5)的序列，在氨基酸残基A89、D92、T134、F174、T186、A188、K207、A209、S248、Q256、A261和N269上包含取代。具体的取代是A89T、D92A、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E和N269K。

布丘氏菌植酸酶变体BP-17的成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：8)

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT

PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWTD VAQRTLKTGE

AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGICSMDKT QVQQAVEKEA

QTPIDNLNQH YIPSLALMNT TLNFSKSPWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS

IKDNGNEVSL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWALLI

KLHNVYFDLM ERTPYIARHK GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI

LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV

SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR

VVSQSVEPGC QLQ

在一些实施方案中，植酸酶是与SEQ ID NO：5具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和甚至至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的片段，其中片段包含至少350个氨基酸、至少375个氨基酸或甚至至少400个氨基酸。在一些实施方案中，片段表现出植酸酶活性。在一些实施方案中，片段表现出SEQ ID NO：5的植酸酶的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％和甚至至少约99％的植酸酶活性。

合适的植酸酶(包括布丘氏菌属的植酸酶)的鉴定方法是本领域已知的(参见例如，WO 06/043178)。

C.次要的酶和组分

组合物和方法可任选的包括其它的酶，包括但不限于α-淀粉酶、酸性真菌蛋白酶、其它GA、其它植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、β-葡糖苷酶、半乳糖苷酶、酯酶、环糊精糖基转移酶(CGTase)、氧化还原酶、酯酶、β-淀粉酶及其组合。在一些实施方案中，次要的酶是第二种GA，包括任一上述的GA。在一些实施方案中，其它的酶是第二种植酸酶，包括任一细菌或真菌植酸酶，如上文所述。

在一些实施方案中，其它的酶是α-淀粉酶，例如酸稳定的α-淀粉酶，当以有效量添加时，所述淀粉酶在约3.0至约7.0的pH范围(包括约3.5至约6.5)内具有活性。可用于本发明的α-淀粉酶包括但不限于真菌α-淀粉酶或细菌α-淀粉酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶是野生型α-淀粉酶，其变体或其片段，或者是杂合的α-淀粉酶，其源自例如一种酶的催化结构域和另一种酶的淀粉结合结构域。α-淀粉酶包括酸稳定的α-淀粉酶和具有颗粒状淀粉水解活性(GSHE)的α-淀粉酶。

在一些实施方案中，α-淀粉酶包括从丝状真菌菌株中获得的那些，包括但不限于曲霉(例如，黑曲霉、A.kawachi和米曲霉)；木霉属、根霉属、毛霉属和青霉属的菌株。在一些实施方案中，α-淀粉酶获得自A.kawachi菌株或里氏木霉菌株。在一些实施方案中，α-淀粉酶是GSHE，如TrAA或AKAA。在一些实施方案中，α-淀粉酶是杂合酶，包含源自获得自A.kawachi和黑曲霉的酶的片段。

用作次要酶的其它α-淀粉酶包括获得自细菌例如芽孢杆菌(例如，地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B subtilis)的那些酶，及其杂合体、突变体和变体(参见例如，美国专利号5,763,385、5,824,532、5,958,739、6,008,026和6,361,809))。一些这类淀粉酶是可商购的，例如可从NovoNordisk A/S获得的

SC和

可从Diversa获得的

和可从Danisco US，Inc，GenencorDivision获得的

FRED、XTRA和

G997。

在一些实施方案中，次要的酶是纤维素酶。纤维素酶是水解纤维素(β-1，4-葡聚糖键)和/或其衍生物例如磷酸溶胀纤维素的酶。纤维素酶包括外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)(EC3.2.191、EC3.2.1.4和EC3.2.1.21)。合适的纤维素酶的实例包括但不限于来自青霉、木霉、腐质霉、镰孢(Fusarium)、高温单孢菌(Thermomonospora)、纤维单胞菌(Cellulomonas)、梭菌(Clostridium)和曲霉属的那些。作饲料用途出售的可商购的纤维素酶包括β-葡聚糖酶，例如

(Adisseo)、(BASF)、

BGL(Danisco Genencor)和

(AB Enzymes)。

在一些实施方案中，次要的酶是木聚糖酶。木聚糖酶(例如，内切β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))水解木聚糖主链。合适的木聚糖酶包括从细菌来源(例如，芽孢杆菌、链霉菌、梭菌、热酸菌(Acidothermus)、小四孢菌(Microtetrapsora)和高温单孢菌)和真菌来源(例如，曲霉、木霉、脉孢菌(Neurospora)、腐质霉、青霉和镰孢)获得的酶(参见例如，EP 473545、美国专利号5,612,055、WO 92/06209和WO 97/20920)。可商购的制品包括

和

Y5(Danisco US，Inc.GenencorDivision)、

WX(Novozymes A/S)和

WHEAT(BASF)。

在一些实施方案中，次要的酶是蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶是获得自芽孢杆菌(例如，解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)的蛋白酶。这些酶包括枯草杆菌蛋白酶(参见例如，美国专利号4,760,025)。合适的商业蛋白酶包括

P 3000(DaniscoUS，Inc.Genencor Division)和

FP(Shin Nihon)。在一些实施方案中，蛋白酶源自真菌来源(例如，木霉NSP-24、曲霉、腐质霉和青霉)。在一些实施方案中，蛋白酶是酸性真菌蛋白酶(AFP)，包括但不限于从曲霉、木霉、毛霉和根霉，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米黑毛霉(M.miehei)获得的酶。可以从细菌、植物和真菌来源的异源或内源蛋白质表达获得蛋白酶。蛋白酶包括天然存在的野生型蛋白酶，以及变体和遗传改造的突变蛋白酶，包括在美国专利号7,429,476中描述的那些。

在一些实施方案中，次要的组分是至少一种发酵生物。

IV.组合物

本组合物和方法的一个方面是包含混合的或配制的酶的组合物，包括至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶。在一些实施方案中，植酸酶指布丘氏菌植酸酶。在特定的实施方案中，植酸酶是BP-WT、BP-11或BP-17植酸酶。在一些实施方案中，植酸酶具有与SEQ ID NO：5至少约90％序列同一性。

在一些实施方案中，植酸酶与SEQ ID NO：5具有至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99％的序列同一性，任选地在92位氨基酸具有丙氨酸。植酸酶还包括本文所述的其它突变。

在一些实施方案中，组合物的酶组分是包含混合在一起的至少两种酶组分的混合制剂。在一些实施方案中，组合物包含配制成稳定的酶制剂的GA和植酸酶。在一些实施方案中，配制的酶组合物提供了特定的预选比例的GA和植酸酶以及任选地其它次要的酶。在一些实施方案中，在一个或多个方法步骤的过程中分别添加酶组分，产生包含两种酶的组合物。这可以涉及以分时或逐步的方式添加组合物的单独的组分，使得维持比例，或者同时添加各组分。

在一些实施方案中，使用的植酸酶的量是从约0.01至约10FTU/g，包括约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.28、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.1、1.5、1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。还可以使用更大量的植酸酶。在一些实施方案中，使用的植酸酶的量是从约0.01至约1.0FTU/g。在一些实施方案中，使用的植酸酶的量是至少约0.01FTU/g，包括至少约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.28、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8FTU/g。

V.使用方法

本组合物和方法的另一个发明涉及在淀粉转化过程的糖化、发酵和/或SSF期间，将葡糖淀粉酶与植酸酶组合使用的方法，获得比使用常规方法产生较少植酸终产物和/或副产物的方法。在一些实施方案中，方法包括在糖化、发酵和/或SSF之前的至少一个液化步骤。在一些实施方案中，过程导致与常规方法比，具有降低的植酸的DDGS。在一些实施方案中，过程获得乙醇并提供与常规方法比，具有降低的植酸的酒糟水。

本方法可使用多种类型的植物材料。在一些实施方案中，植物材料是谷类。在一些实施方案中，植物材料获得自小麦、玉米、黑麦、高粱(例如，蜀黍)、稻、粟、大麦、黑小麦、木薯(例如，木薯淀粉)、土豆、甜薯、甜菜、甘蔗和豆科植物如大豆和豌豆，及其组合。植物材料包括杂交变种和遗传修饰的变体(例如，包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物的任何部分都可用作底物，包括但不限于叶、茎、外壳(hull)、外果壳(husk)、块茎、穗轴(cob)、谷物等。在一些实施方案中，使用基本完整的植物，例如完整的玉米秸秆。在一些实施方案中，使用全谷物作为颗粒状淀粉的来源。全谷物包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱及其组合。在其他实施方案中，颗粒状淀粉获得自分级分离的粮谷，包括纤维、胚乳和/或胚组分。分级分离植物材料例如玉米和小麦的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，混合获得自不同来源的植物材料(例如，玉米和蜀黍，或玉米和大麦)。

在一些实施方案中，通过例如研磨的方式制备植物材料。两种常用的研磨方法是湿磨法和干磨法。在干磨法中，研磨全谷物并使用，而在湿磨法中，将谷物分离(例如，来自粗碾谷物的胚)。研磨粮谷的方法是已知的，包括使用锤磨机(hammer mill)和轧制机(roller mill)。参考T_HE A_LCOHOLT_EXTBOOK：A R_EFERENCE FOR THE B_EVERAGE，F_UEL AND I_NDUSTRIALA_LCOHOL I_NDUSTRIES，第3版，K.A.Jacques等人编著，(1999)NottinghamUniversity Press.的第2和第4章。

在一些实施方案中，使用α-淀粉酶水解和/或液化含有淀粉底物的植物材料，产生寡糖。在一些实施方案中，将α-淀粉酶添加到磨碎的淀粉底物的浆液中(例如，研磨的谷物)，产生含有糊精和/或寡糖的液化物。技术人员将能够确定该过程中使用的α-淀粉酶的有效剂量、pH和接触时间。液化作用的最优使用水平依赖于加工参数，例如植物材料的类型、粘度、加工时间、pH、温度和ds。

VI.顺序和同时糖化和发酵

来自液化作用的含有糊精和/或寡糖的液化物可以随后经历糖化、发酵和/或同时的糖化和发酵(SSF)。糖化作用将含有糊精和/或寡糖的液化物中的糖进一步还原为可发酵的糖。然后，通过发酵微生物转化可发酵的糖，获得终产物，例如醇类和DDGS，其可以使用合适的方法回收。

在一些实施方案中，糖化和发酵在称为同时糖化发酵(SSF)的过程中是同时发生的。在一些实施方案中，糖化和发酵是分别发生的。在一些实施方案中，在前糖化步骤的期间、在糖化过程期间、在发酵过程期间或在SSF过程期间，添加GA/植酸酶组合物。

在一些实施方案中，糖化过程持续12-120小时。然而，通常实施30分钟至2小时(包括例如，30-60分钟)的前糖化步骤，然后在发酵过程中完成糖化。通常在30-65℃的温度下，和4.0-5.0的pH下进行糖化。当包括前糖化步骤时，在前糖化步骤期间添加植酸酶。

任何本文描述的GA都可用作糖化酶。在一些实施方案中，在糖化步骤开始时以GA/植酸酶混合物来添加酶组合物。在其他实施方案中，分别添加GA和植酸酶。在一些实施方案中，在糖化步骤开始时添加GA，其后但在发酵步骤结束前添加植酸酶。在一些实施方案中，糖化和发酵同时进行，且在同时糖化/发酵(SSF)期间添加GA/植酸酶混合物。

在一些实施方案中，将获得的可发酵的糖进行有发酵微生物的发酵。在一些实施方案中，在同一反应容器中同时实施接触步骤和发酵步骤。在其他实施方案中，顺序地实施这些步骤。发酵过程通常描述在The AlcoholTextbook，第3版，A Reference for the Beverage，Fuel and IndustrialAlcohol Industries编著，Jacques等人，(1999)Nottingham University Press，UK中。

从糖化获得的可发酵的糖或糊精(例如，葡萄糖)可用作微生物发酵中的发酵原料，在合适的条件下获得终产物，例如醇类(如，乙醇)、有机酸(如，琥珀酸、乳酸)、糖醇(如，甘油)、抗坏血酸中间物(如，葡糖酸、DKG、KLG)、氨基酸(如，赖氨酸)和/或蛋白质(如，抗体及其片段)。

可以用酵母发酵可发酵的糖，在下列温度范围：约15至约40℃，约20至约38℃，和甚至约25至约35℃；在pH范围：约3.0至约6.5，约3.0至约6.0，约3.0至约5.5，约3.5至约5.0，和甚至约3.5至约4.5；持续时间：约5小时至约120小时，包括约12至约120小时，和约24至约90小时；以产生醇类产物，例如乙醇。

酵母细胞可以提供的量是约10⁴至约10¹²个细胞，或约10⁷至约10¹⁰个活酵母细胞/ml的发酵液。发酵过程可包括添加原料，例如营养物、酸和其它的酶，以及补充物如维生素(如，生物素、叶酸、烟酸、核黄素)、辅因子、大量营养物、微量营养物和盐(例如，(NH4)₂SO₄；K₂HPO₄；NaCl；MgSO₄；H₃BO₃；ZnCl₂和CaCl₂)。

VII.发酵生物

本组合物和方法可使用任何合适的发酵生物。合适的发酵生物的实例是产乙醇微生物或乙醇生产微生物，例如表达醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶的产乙醇细菌，其可获得自运动发酵单孢菌(Zymomonas moblis)(参见例如，美国专利号5,000,000、5,028,539、5,424,202、5,514,583和5,554,520)。产乙醇微生物可以表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，其可以将木糖转化为木酮糖。备选地或任选地，使用木糖异构酶将木糖转化为木酮糖。可以使用能够将戊糖和己糖发酵为乙醇的微生物。微生物可以是天然存在的或非遗传改造的微生物，或者是工程化的或重组的微生物。

发酵微生物包括来自芽孢杆菌、乳杆菌(Lactobacillus)、大肠杆菌、欧文氏菌(Erwinia)、泛菌(Pantoea)(例如，柠檬泛菌(P.citrea))、假单胞菌(Pseudomonas)和克雷伯氏菌(Klebsiella)(例如，产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))的细菌菌株(参见例如，美国专利号5,028,539和5,424,202和WO95/13362)。选择的发酵生物取决于待生产的终产物。

生产乙醇的微生物可以是真菌微生物，例如酵母(Saccharomyces)菌株，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)(参见例如，美国专利号4,316,956)。酿酒酵母的变种是可商购的，包括但不限于

(Fleischmann’s Yeast)、

(Alltech)、

(DSMSpecialties)、RED

(Lesaffre)和ANGEL ALCOHOL

(Angel Y east Company，China)。

VII.回收醇类、DDGS和其他终产物

发酵过程的终产物可以是醇类(例如，乙醇或丁醇)，所述醇类可以从发酵培养基中分离和/或纯化。分离和纯化的方法是本领域已知的，包括这样的方法，例如将培养基进行抽提、蒸馏、柱层析、分子筛脱水或超滤。可以通过将培养基进行高压液相色谱(HPLC)或气相色谱(CG)分析，直接鉴别终产物。

当终产物是乙醇时，其可用于燃料、清洁或化学合成，或作为饮料注射。发酵副产物例如干酒槽(DDG)以及干酒槽和可溶物(DDGS)可用作动物饲料。

本组合物和方法可降低发酵液、酒糟水和/或发酵的副产物的植酸含量，所述副产物为例如干酒槽(DDG)、干酒槽和可溶物(DDGS)、湿酒糟(DWG)，和湿酒槽和可溶物(DWGS)。例如，与基本相同但不含植酸酶的过程相比，本组合物和方法可降低发酵滤液的植酸含量至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、甚至至少约90％或更多。与来自所要求保护的方法基本相同但不含植酸酶预处理孵育的相应方法的DDGS中的植酸含量相比，DDGS中发现的植酸的量可以降低至少约50％、至少约70％、至少约80％和至少约90％。例如，当DDGS的可商购样品中的％植酸含量可以改变时，％植酸的一般范围是约1％至约3％或更高。相比较，在用目前方法获得的DDGS中的％植酸少于约1.0％，少于约0.8％，甚至少于约0.5％。可以在制粒之前或之后向动物饲料中添加DDGS，并且其可以包括活性植酸酶。

在一些工业乙醇方法中，从滤液中蒸馏乙醇，获得适合循环进入发酵蒸汽的酒糟水部分。使用本组合物和方法，酒糟水具有比常规方法获得的酒糟水更低的植酸含量。植酸的降低可以是在预处理步骤过程中、在糖化过程中、在糖化/发酵过程中添加植酸酶的结果，或其组合。与基本相同但无植酸酶的方法相比，酒糟水的植酸含量可以降低至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或甚至至少约90％或更多。相似地，与其它方面相似但缺少植酸酶的方法所获得的酒糟水中的植酸含量相比，本酒糟水中发现的植酸含量可以降低至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或甚至至少约90％。

根据公开文本，组合物和方法的其它方面和实施方案对本领域技术人员是显而易见的。

实施例

提供下列实施例用于阐明，但不限制组合物和方法。

在下文的公开文本和实验部分，使用下列缩写：wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；dIH₂O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；ds(干固体)；DO(溶解氧)；W/V(重量比体积)；W/W(重量比重量)；V/V(体积比体积)；Genencor(Danisco US，Inc.，Genencor Division，Palo Alto，CA)；IKA(IKAWorks Inc.2635North Chase Parkway SE，Wilmington，NC)；MT(公吨)；Ncm(牛顿厘米)；GAU(葡糖淀粉酶活性单位)；FTU(植酸酶活性单位)和ETOH(乙醇)。

实施例1：粘度测量

使用玻璃蒸煮装置-粘度计LR-2.ST系统IKA测定粘度。简而言之，粘度计组成为具有锚式搅拌器的2000ml的双层壁玻璃容器，所述搅拌器由Eurostar Labortechnik动力控制粘度计搅拌。粘度计的粘度范围是0-600Ncm。

通常，将包含淀粉底物和合适量的酶的浆液倒入粘度计容器中。在加热至85℃的期间记录温度和粘度，并且再持续温育60-120分钟。不时以Ncm测量并记录粘度。

实施例2：在乙醇发酵中使用葡糖淀粉酶和植酸酶

该实施例显示了葡糖淀粉酶(GA)和植酸酶在乙醇发酵生产DDGS和酒糟水中的功效，所述DDGS和酒糟水与使用常规方法获得的相比具有较低的植酸含量。使用的GA是对应于SEQ ID NO：1的里氏木霉GA(TrGA)(参见例如，美国专利号7,354,752和7,413,887)。使用的植酸酶是对应于SEQ ID NO：8的布丘氏菌植酸酶BP-17。

葡糖淀粉酶活性单位(GAU)定义为在pH4.2和60℃下，从可溶性淀粉底物产生1g还原糖(按葡萄糖/小时计算)需要的酶量。PNPG测定用于测量葡糖淀粉酶的活性。

通过无机磷酸的释放来测量植酸酶活性(FTU)，无机磷酸与酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色络合物，其可以在分光光度计中在415nm波长测量。用磷酸标准曲线定量释放的无机磷酸。一个单位的植酸酶(FTU)定义为在欧洲标准(CEN/TC 327，2005-TC327WI 003270XX)给定的反应条件下，每分钟从植酸释放1毫摩尔无机磷酸需要的酶量。

为了测量植酸含量，通过调节5％浆液(针对干燥样品)的pH至pH 10.0从样品中提取植酸，然后使用HPLC离子交换柱结合植酸，使用NaOH梯度系统从柱上洗脱。通过将植酸与标准比较来计算液体中的植酸含量。

实施例3：在酵母发酵中使用TrGA和BP17——对DDGS的影响

DDGS(干酒糟固体及可溶物)是一些动物饲料中的组分，其源自乙醇加工植物，含有非反刍动物(例如，家禽、鱼和猪)不能消化的植酸。然后，通过粪肥排放植酸，导致磷酸污染。如该实施例所示，在同时糖化/发酵过程中添加植酸水解酶(如植酸酶)与葡糖淀粉酶的组合，降低了DDGS中的植酸水平。

使用玉米作为原料，从常规的淀粉液化方法制备液化物并冷冻用于实验。解冻液化物，添加200ppm尿素，将固体调节至32.9％ds后，用6N硫酸调节pH至4.2。在含有200gm醪液(即，含有液化物的混合物)的等分试样的250ml烧瓶中进行发酵。稀释酶使烧瓶中添加1.0ml各指定活性的酶。各种条件以一式两份进行。在使用前约一个小时，将烧瓶通过加入1ml含1％葡萄糖的10％酵母浆液进行接种。在同时糖化/发酵期间，在1.0ml样品中添加不同活性水平的BP-17植酸酶(0、0.1、0.25、0.5、1.0、3.0和5.0FTU/dgs玉米)。还添加木霉GA以水解可溶性糊精用于提供葡萄糖。在发酵后，分析DDGS的游离磷/游离磷酸。按照Fiske-Subbarow的比色方法测定游离磷酸(参见例如，Fiske，C.H.和Subbarow，Y.(1925)J.Biol.Chem.66：375-400)。在Tekmar分析研磨机中磨碎样品，通过将1g样品添加到含80ml水的100ml容量瓶中，在水中提取游离磷酸盐。每个烧瓶加一根磁棒，并且它们在室温搅拌1小时。然后用水补充烧瓶的容积，充分混匀，通过Whatman 1号滤纸过滤。将烧瓶置于32℃水浴中，偶尔混合。然后，如下测定滤液的磷酸盐。向3.0ml样品中添加1ml酸性钼酸盐试剂，然后加入1ml还原试剂，在室温显色20分钟，在660nm下测量所显颜色的吸光度。然后，从磷酸盐标准曲线计算样品中的磷酸盐水平。最终结果计算为μg磷/g样品。

图1是显示在酵母发酵期间，BP-17植酸酶浓度对植酸降低的影响的图。在这些实验中，在pH4.2下使用含50％酒糟水的32％磨碎的全玉米，其含0.325GAU/gds，GC147。该图显示在添加约0.7FTU/g植酸酶的条件下，游离磷的水平达到约0.75％游离磷的平台。因此，添加极小量的植酸酶，即0.1FTU/dgs，就可降低植酸的水平，从而去除超过80％的植酸。

本文提及的所有出版物和专利都通过引用明确地并入。的条件下，多种修饰和变型对本领域技术人员是显而易见的，而不背离发明的范围和精神。

Claims

1.生产醇的方法，其包括：

a)将包含淀粉底物的浆液与至少一种α-淀粉酶接触，产生寡糖；

b)将所述寡糖与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶接触以产生可发酵的糖，其中植酸酶获自布丘氏菌(Buttiauxella spp.)；和

c)在发酵生物存在下，发酵可发酵的糖以产生醇。

2.权利要求1的方法，其中步骤(b)和(c)同时发生。

3.权利要求1的方法，还包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前将温度升高到高于淀粉底物的凝胶化温度。

4.权利要求1的方法，其中淀粉底物是磨碎的谷物，且磨碎的谷物选自玉米、大麦、小麦、稻、高粱、黑麦、粟和黑小麦。

5.权利要求1的方法，其中所述至少一种葡糖淀粉酶具有与SEQ IDNO：5的序列至少90％的序列同一性。

6.权利要求5的方法，其中所述植酸酶具有在氨基酸92位的丙氨酸和/或至少一种下列氨基酸：89位的苏氨酸、134位的异亮氨酸、174位的丝氨酸、186位的赖氨酸、188位的脯氨酸、207位的谷氨酸、209位的丝氨酸、248位的亮氨酸、256位的酪氨酸、261位的谷氨酸和269位的赖氨酸。

7.权利要求5的方法，其中所述植酸酶具有至少一种下列氨基酸改变：A89T、D92A、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E和N269K。

8.权利要求5的方法，其中所述植酸酶是BP-WT、BP-11或BP-17。

9.权利要求1的方法，还包括将所述寡糖与至少一种其它酶接触，所述其它酶选自α-淀粉酶、第二种葡糖淀粉酶、第二种植酸酶、纤维素酶、支链淀粉酶、蛋白酶和漆酶。

10.权利要求1的方法，其中所述醇是乙醇。

11.权利要求1的方法，还包括回收所述醇。

12.权利要求1的方法，还包括回收DDGS。

13.在乙醇发酵期间减少植酸的方法，包括：

a)将包含淀粉底物的浆液与至少一种α-淀粉酶接触；

b)在使得产生可发酵糖的条件下，将淀粉底物与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶接触，其中植酸酶与SEQ ID NO：5具有至少90％氨基酸序列同一性，且其中该植酸酶在92位具有丙氨酸；和

c)在发酵生物存在下，发酵可发酵的糖以产生乙醇和/或DDGS。

14.权利要求13的方法，还包括将温度升高到高于淀粉底物的液化温度的步骤。

15.权利要求13的方法，其中步骤(b)和(c)同时发生。

16.权利要求13的方法，还包括回收乙醇和/或DDGS。

17.权利要求13的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自丝状真菌，所述真菌选自木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、篮状菌属(Talaromyces)、曲霉属(Aspergillus)和腐质霉属(Humicola)。

18.权利要求18的方法，其中所述木霉是里氏木霉。

19.权利要求13的方法，其中所述植酸酶是BP-17。

20.权利要求13的方法，其中所述DDGS包含活性植酸酶。

21.权利要求20的方法，其中当DDGS与谷类或饲料混合以产生动物饲料时，活性植酸酶降低了饲料中的植酸。

22.权利要求13的方法，其中所述淀粉底物是磨碎的谷物。

23.权利要求22的方法，其中所述谷物选自玉米、大麦、粟、小麦、稻、高粱、黑麦和黑小麦。

24.降低DDGS中植酸的方法，包括：

a)将包含淀粉底物的浆液与至少一种α-淀粉酶接触；

b)在使得产生可发酵糖的条件下，将淀粉底物与至少一种里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)和至少一种植酸酶接触，其中植酸酶与SEQ ID NO：5具有至少90％氨基酸序列同一性；和

c)在发酵生物存在下，发酵可发酵的糖以产生乙醇和/或DDGS。

25.权利要求24的方法，其中步骤(b)和(c)同时发生。

26.权利要求24的方法，其中所述植酸酶与SEQ ID NO：5的氨基酸序列有至少95％序列同一性，并且在氨基酸92位具有丙氨酸。

27.权利要求24的方法，其中所述植酸酶是BP-17。