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Glicosilación como estabilizador para fitasa
ES2825057T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Mark S Gebert Sang-Kyu Lee Mariliz Ortiz-Maldonado Michael Ward - Current Assignee
- Danisco US Inc
Description
translated from
DESCRIPCIÓN
Glicosilación como estabilizador para fitasa
CAMPO TÉCNICO
[0001] La presente información dada a conocer se refiere al campo de las fitasas modificadas. Más concretamente, la presente información dada a conocer se refiere a la glicosilación de fitasas mediante mutación de las propias fitasas y/o debido a métodos de producción de fitasas que implican células huésped con deglicosilación defectuosa. En algunos modos de realización, las fitasas en cuestión son fúngicas o bacterianas, y pueden ser de Buttiauxella.
ANTECEDENTES
[0002] El fitato es la principal forma de almacenamiento de fósforo en los cereales y las legumbres. Sin embargo, los animales monogástricos como los cerdos, las aves de corral y los peces no pueden metabolizar o absorber el fitato (o ácido fítico) y, por lo tanto, lo excretan, lo que genera una posible contaminación por fósforo en zonas de mucha producción ganadera. Además, el ácido fítico también actúa como un agente antinutricional en los animales monogástricos al quelar agentes metálicos como el calcio, el cobre y el zinc.
[0003] Para proporcionar suficientes fosfatos para el crecimiento y la salud de estos animales, se añade fosfato inorgánico a sus dietas. Esta adición puede ser costosa y aumenta de forma adicional los posibles problemas de contaminación.
[0004] Mediante la acción de la fitasa, el fitato generalmente se hidroliza para proporcionar fosfato inorgánico y fosfatos de inositol inferiores. Las fitasas son útiles como aditivos para los piensos para animales, donde mejoran la disponibilidad del fósforo orgánico para el animal y disminuyen la contaminación por fosfato del medio ambiente (Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)).
[0005] En la literatura se han descrito varias fitasas de origen fúngico (Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R.M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (II), 4423-4427 (1998); Lassen S. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67 (lo), 4701-4707 (2001)) y origen bacteriano (Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 303 (I), 107-1 13 (1 93); Kerovuo et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H.W. et al. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S.J. et al. Enzyme and microbial technol. 18,449-454 (1996); Zinin N.V. et al. fEm S Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004)). Se conocen variantes de fitasa, específicamente BP11 (WO2006/043178), BP17 (WO2008/097619) y BP111 (WO2009/129489), adecuadas para su uso en alimentos y piensos para animales debido a su estabilidad, en especial su estabilidad térmica. Estas fitasas son variantes de la fitasa natural de Buttiauxella P1-29 (depositada con el número de acceso NCIMB 4124). Se sabe que la fitasa sufre una inactivación térmica reversible (Wyss, Appl. Envir. Microbiol. (1998) 64:4446).
[0006] Los piensos para animales pueden fabricarse, producirse y procesarse a altas temperaturas. En particular, pueden estar formados por pellets o gránulos como los descritos en WO99/32595 y WO2007/044968. Por lo tanto, la producción de piensos para animales requiere que los piensos y los ingredientes de los piensos sean termoestables a altas temperaturas. Por consiguiente, resulta ventajoso que una enzima de pienso, en concreto una fitasa, retenga un alto nivel de actividad enzimática tras la exposición a temperaturas altas o elevadas.
[0007] Las enzimas se pueden modificar al nivel de aminoácidos para introducir sitios de glicosilación, que promueven la glicosilación de la enzima. Por ejemplo, un glicano enlazado a N se une al residuo de asparagina dentro del motivo NXS/T en la superficie de una proteína secretada (Weerapana and Imperiali (2006) Glycobiology 16:91 R-101R). Se sabe que la glicosilación de una enzima puede proporcionar una termoestabilidad aumentada (Koseki et al. (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70: 2476-2480). También se sabe que la glicosilación aumentada puede aumentar la estabilidad de la proteasa a pH bajo de algunas fitasas (WO01/90333), así como la termoestabilidad (WO2006/028684). Sin embargo, estas referencias no dan a conocer fitasa de origen Butiiauxella, o que un aumento adicional de la glicosilación mejore la resistencia al tratamiento a vapor durante la peletización del pienso cuando la enzima se encuentra en estado sólido.
[0008] La presente información dada a conocer proporciona fitasas glicosiladas mejoradas con aumento de reversibilidad de inactividad. En algunos modos de realización, las fitasas se pueden utilizar en alimentos o piensos. En algunos modos de realización, las fitasas sufren un proceso de peletización para su inclusión en los alimentos o piensos.
SUMARIO
[0009] En algunos modos de realización, la presente información dada a conocer proporciona un polipéptido de fitasa que comprende la SEQ ID NO: 1 y variantes al menos un 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % idénticas a esta, que comprende aumento de glicosilación y aumento de estabilidad.
[0010] En un primer aspecto, la invención proporciona un polipéptido de fitasa que presenta al menos 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido de fitasa se produce en un huésped de hongo filamentoso de deglicosilación deficiente.
[0011] El polipéptido de fitasa puede comprender al menos un sitio de glicosilación adicional en comparación con la SEQ ID NO: 1, donde el al menos un sitio de glicosilación adicional se consigue introduciendo cambios aminoacídicos para crear un motivo de sitio de glicosilación enlazado a N Asn-Xaa-Ser/Thr, donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.
[0012] En un segundo aspecto, la invención proporciona además un método de producción de un polipéptido de fitasa, comprendiendo el método la producción del polipéptido de fitasa en un huésped de hongo filamentoso de deglicosilación deficiente, donde el polipéptido de fitasa presenta al menos 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.
[0013] En cualquier aspecto de la invención, el polipéptido de fitasa puede presentar al menos 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11. Por ejemplo, puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.
[0014] El polipéptido de fitasa comprende una o más de las siguientes sustituciones o pares de sustituciones: E121T, P394N, d386N, K202N y N204T, Q151N y P153S, P373T o Q76N con referencia a la numeración de las posiciones de la SEQ ID NO:1.
[0015] Por lo tanto, el polipéptido de fitasa puede tener 1 o más, 2 o más, 3 o más, o 4 o más sitios de glicosilación añadidos.
[0016] El polipéptido de fitasa puede presentar uno o más de entre:
(a) aumento de reversibilidad de inactividad después de la exposición a una temperatura elevada en comparación con una fitasa control que carece de aumento de glicosilación, donde la temperatura elevada es al menos 80 0C, al menos 85 0C, al menos 90 0C, o al menos 95 0C, p. ej. donde la reversibilidad de inactividad es al menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % superior a una fitasa control que carece de aumento de glicosilación;
(b) aumento de actividad recuperada después de la exposición a una temperatura elevada de al menos 80 °C, al menos 85 0C, al menos 90 0C o al menos 95 0C, en comparación con una fitasa control que carece de aumento de glicosilación, p. ej., donde el aumento de actividad recuperada en comparación con una fitasa control que carece de aumento de glicosilación es de al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 % o 350 %; y
(c) aumento de actividad recuperada después de la exposición a una temperatura elevada de al menos 80 0C, al menos 85 0C, al menos 90 0C o al menos 95 °C, en comparación con la fitasa antes de la exposición a la temperatura elevada, p. ej., donde la actividad recuperada es de al menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, o 90 %, en comparación con la fitasa antes de la exposición a la temperatura elevada.
[0017] El aumento de reversibilidad de inactividad o el aumento de actividad recuperada puede producirse después del procesamiento en un alimento o pellet de pienso.
[0018] La célula huésped de hongo filamentoso puede ser una Aspergillus spp., una Fusarium spp., una Myceliophthora spp., o una Trichoderma spp, p. ej. A. niger, A. oryzae, A. nidulans, A. tubingensis, o A. awamori, o T. reesei.
[0019] La célula huésped de hongo filamentoso puede ser una en la que se ha delecionado el gen de endoglucosaminidasa.
[0020] El polipéptido de fitasa puede estar contenido en un gránulo, opcionalmente un gránulo multicapa. El gránulo puede estar contenido en un pellet, que puede a su vez estar contenido en un pienso para animales.
[0021] La invención proporciona además un método para aumentar la estabilidad de un polipéptido de fitasa peletizado que comprende;
(a) glicosilación de un polipéptido de fitasa;
(b) formación de un gránulo con el polipéptido de fitasa;
(c) peletización del gránulo a una temperatura de al menos 85 0C, al menos 90 0C, o al menos 95 0C, para formar un polipéptido de fitasa peletizado; donde
(i) el polipéptido de fitasa es un polipéptido de fitasa de la invención; o
(ii) la glicosilación comprende la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fitasa que presenta al menos 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 en un huésped de hongo filamentoso en el que se ha delecionado el gen de endoglucosaminidasa.
[0022] La invención proporciona además un método de fabricación de un alimento o pienso con una actividad de fitasa elevada que comprende la adición de un polipéptido de fitasa de la invención, o producido por un método de la invención, a un ingrediente alimentario o de pienso durante la fabricación.
[0023] También se proporciona un método de alimentación de animales que comprende la administración de una composición de pienso que comprende un polipéptido de fitasa de la invención o producido por un método de la invención.
[0024] Se proporciona, además, una composición de pienso para animales que comprende un polipéptido de fitasa de la invención, o un polipéptido de fitasa producido por un método de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0025] La presente información dada a conocer se describirá por referencia a las siguientes figuras:
La figura 1 proporciona un mapa de plásmido pTrex3g/BP-17.
La figura 2 proporciona una comparación de peso molecular de las variantes de fitasa.
La figura 3 proporciona un análisis de las muestras de BP17 producidas a partir de T. reesei, estando las muestras de BP17 producidas a partir de T. reesei con el gen de endo-N-acetilglucosaminidasa delecionado.
La figura 4 proporciona un estudio de reversibilidad de inactividad que muestra el porcentaje de actividad restante de BP-17, expresado en diferentes huéspedes, mantenido a 95 0C durante 10 minutos a pH 4,0.
La figura 5 proporciona el porcentaje de actividad restante de BP-17 (producida a partir de T. reesei) y BP-17 (producida a partir de T. reesei con el gen de endo-N-acetilglucosaminidasa delecionado) como una función de tiempo después del tratamiento a 95 0C durante 10 minutos.
La figura 6 proporciona un gráfico que muestra la actividad recuperada obtenida después de la peletización de las formulaciones de gránulos de la Tabla 3 a 90 0C y a 95 0C.
SECUENCIAS
[0026]
SEQ ID NO:1= BP17, una variante de fitasa que comprende 12 sustituciones de aminoácidos en comparación con la natural (SEQ ID nO:4), que carece de la secuencia señal (SEQ ID NO:12)
SEQ ID NO:2 = BP11, una variante de fitasa que comprende 11 sustituciones de aminoácidos en comparación con la natural (SEQ ID NO:4), que carece de la secuencia señal (SEQ ID NO:12).
SEQ ID NO:3 = BP111, una variante de fitasa que comprende 21 sustituciones de aminoácidos en comparación con la natural (SEQ ID NO:4), que carece de la secuencia señal (SEQ ID NO:12).
SEQ ID NO:4 = fitasa natural codificada por cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248, que carece de la secuencia señal (SEQ ID NO:12).
una sustitución de aminoácidos adicional E121T.
una sustitución de aminoácidos adicional D386N.
SEQ ID NO:8 = BP17 con sustituciones de aminoácidos adicionales K202N y N204T.
SEQ ID NO:9 = BP17 con sustituciones de aminoácidos adicionales Q151N y P153S.
SEQ ID NO:10 = BP17 con una sustitución de aminoácidos adicional P373T.
SEQ ID NO:11 = BP17 con una sustitución de aminoácidos adicional Q76N.
SEQ ID NO:12 = secuencia señal para la natural (SEQ ID NO:4).
SEQ ID NO:13 = secuencia de ADN de variante BP-17 de fitasa de Buttiauxella que contiene un sitio Spe1 en el extremo 5', y un sitio Asc1 en el extremo 3'.
SEQ ID NO:14-17 = cebadores.
SEQ ID NO:18 = secuencia del producto de la PCR en el ejemplo 1, entre el promotor cbhl y la secuencia señal /secuencia codificante de BP-17.
SEQ ID NO:19 = PCR secuencia del producto de la PCR en el ejemplo 1, entre el extremo 3’ de la secuencia codificante de BP-17 y la región de terminador de cbhl.
SEQ ID NO:20-29 = cebadores.
SEQ ID NO:30-47 = cebadores.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0027] La práctica de la presente información dada a conocer empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica y peletización de pienso para animales, que están dentro de la técnica. Estas técnicas se explican por completo en la literatura, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1994); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990), y Fairfield, D. 1994. Capítulo 10, Pelleting Cost Center. In Feed Manufacturing Technology IV. (McEllhiney, editor), American Feed Industry Association, Arlington, Va., pp. 110-139.
[0028] A menos que se definan de otra forma en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente información dada a conocer. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, segunda ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto en la materia un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente exposición. En la práctica o las pruebas de la presente información dada a conocer puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento.
[0029] Los intervalos numéricos proporcionados en el presente documento incluyen los números que definen el intervalo.
[0030] Salvo que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en una orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en una orientación de amino a carboxi, respectivamente.
Definiciones
[0031] Como se utiliza en el presente documento, el término «secuencia de aminoácidos» es sinónimo de los términos «polipéptido», «proteína» y «péptido», y se utilizan indistintamente. En los casos en los que dichas secuencias de aminoácidos muestran actividad, se puede hacer referencia a estas como una «enzima». Se emplean los códigos convencionales de una letra o de tres letras para los residuos de aminoácidos, estando presentes las secuencias de aminoácidos en la orientación habitual amino-carboxi terminal (es decir, N^C).
[0032] El término «ácido nucleico» abarca ADN, ARN, heterodúplex, y moléculas sintéticas capaces de codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, y pueden ser modificaciones químicas. Los términos «ácido nucleico» y «polinucleótido» se utilizan indistintamente. Dado que el código genético es degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido concreto, y las presentes composiciones y métodos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos concreta. A no ser que se indique lo contrario, las secuencias de ácidos nucleicos se presentan en orientación 5’ a 3’.
[0033] Por «homólogo» se entenderá una entidad que tenga un grado especificado de identidad con las secuencias de aminoácidos objeto y las secuencias de nucleótidos objeto. Una secuencia homóloga ha de incluir una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o incluso un 99 % idéntica a la secuencia objeto, utilizando la herramienta de alineamiento de secuencias convencional Clustal V con parámetros por defecto. Normalmente, los homólogos incluirán los mismos residuos de sitio activo que la secuencia de aminoácidos objeto, aunque puede incluir cualquier número de sustituciones conservadoras de aminoácidos. En la siguiente tabla de sustituciones conservadoras de aminoácidos se enumeran sustituciones conservadoras de aminoácidos de ejemplo.
Sustituciones conservadoras de aminoácidos
[0034] Como se utiliza en el presente documento, el término «fitasa» se refiere a una proteína o polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis de ésteres de ácido fosfórico, incluido el fitato/ácido fítico, y de liberar fosfato inorgánico. Se analizan fitasas ilustrativas y se hace referencia a ellas a lo largo de la presente información dada a conocer, e incluye fitasa de E. Coli (patente estadounidense 6,110,719), y las obtenidas de cualquiera de una variedad de fuentes, incluidas Ascomycetes, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Thermomyces, Humicola, Basidiomycetes, Bacillus subtilis, y Schwannniomyces occidentalis. Además del fitato, algunas fitasas pueden hidrolizar al menos algunos de los inositol fosfatos de grados de fosforilación intermedios. En un modo de realización, la enzima activa producida o modificada en la presente información dada a conocer es una 6-fitasa. La 6-fitasa también se denomina «4-fitasa» o «fitato 6-fosfatasa». Fitasas adicionales incluyen fitasas ácidas de histidina (HAP), que es un grupo que comprende elementos encontrados de entre procariotas (p. ej. appA fitasa de Escherichia coli) y eucariotas (phyA y B de Aspergillus sp., fitasas de HAP de levadura y plantas. Las fitasas de HAP comparten un motivo de sitio activo común, RHGXRXP, en el extremo N-terminal y un motivo de HD en el extremo C-terminal en sus secuencias de ADN.
[0035] Las presentes fitasas pueden ser «precursoras», «inmaduras», o «de longitud completa», en cuyo caso incluyen una secuencia señal, o «maduras», en cuyo caso carecen de una secuencia señal. Por lo general, las formas maduras de los polipéptidos son las más útiles. A menos que se indique lo contrario, la numeración de residuos de aminoácidos empleada en el presente documento se refiere a las formas maduras de los respectivos polipéptidos de fitasa. Los presentes polipéptidos de amilasa también pueden truncarse para eliminar los N o C-terminales, siempre que los polipéptidos resultantes retengan la actividad de la fitasa.
[0036] Los términos «natural», «parental» o «de referencia», con respecto a un polipéptido, se refieren a un polipéptido de origen natural que no incluye una sustitución, inserción o deleción sintética en una o más posiciones de aminoácidos. De forma similar, los términos «natural», «parental» o «de referencia», con respecto a un polinucleótido, se refieren a un polinucleótido de origen natural que no incluye un cambio de nucleósidos sintético. No obstante, nótese que un polinucleótido que codifica un polipéptido natural, parental o de referencia no está limitado a un polinucleótido de origen natural, y abarca cualquier polinucleótido que codifique el polipéptido natural, parental o de referencia.
[0037] El término «variante», con respecto a un polipéptido, se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido específico natural, parental o de referencia específico en cuanto a que este incluye una sustitución, inserción o deleción sintética en una o más posiciones de aminoácidos. Del mismo modo, el término «variante», con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que difiere en cuanto a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido específico natural, parental o de referencia. La identidad del polipéptido o polinucleótido natural, parental o de referencia resultará evidente a partir del contexto.
[0038] El término «recombinante», cuando se utiliza con referencia a una célula, ácido nucleico, proteína, o vector objeto, indica que el sujeto se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos, o que la célula se deriva de una célula modificada de dicha forma. En consecuencia, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos a distintos niveles o en condiciones distintas de las que se hallan en la naturaleza.
[0039] Como se utiliza en el presente documento, los términos «transformado/a(s)», «transformado/a(s) de forma estable» y «transgénico/a(s)», utilizados en referencia a una célula significan que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (p. ej., heteróloga) integrada en su genoma o portada como un episoma que se mantiene a través de múltiples generaciones.
[0040] El término «introducido/a(s)» en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa «transfección», «transformación» o «transducción», como se conoce en la técnica.
[0041] Una «cepa huésped» o «célula huésped» es un organismo en el que se ha introducido un vector de expresión, fago, virus, u otro constructo de ADN, entre los que se incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (p.ej., una fitasa). Algunas cepas huésped de ejemplo son Trichoderma sp. El término «célula huésped» incluye los protoplastos creados a partir de células.
[0042] El término «heterólogo/a(s)», en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que no está presente de forma natural en una célula huésped.
[0043] El término «endógeno/a(s)», en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que está presente de forma natural en la célula huésped.
[0044] Como se utiliza en el presente documento, el término «expresión» se refiere al proceso por el cual se produce un polipéptido en función de una secuencia de ácido nucleico. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.
[0045] Un «marcador selectivo» o «marcador de selección» se refiere a un gen capaz de ser expresado en un huésped para facilitar la selección de células huésped portadoras del gen. Entre los ejemplos de marcadores de selección se incluyen, sin carácter limitativo, resistencia antimicrobiana (p. ej., higromicina, bleomicina o cloranfenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, como una ventaja nutricional, en la célula huésped.
[0046] Un «vector» se refiere a una secuencia de polinucleótidos diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas de fago, casetes y similares.
[0047] Un «vector de expresión» se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, cuya secuencia de codificación está ligada de forma operativa a una secuencia control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un huésped adecuado. Dichas secuencias control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifique sitios de unión del ribosoma adecuados en el ARNm, potenciadores y secuencias que controlen la terminación de la transcripción y la traducción.
[0048] El término «ligado/a(s) de forma operativa» significa que los componentes específicos se encuentran relacionados (incluida, sin carácter limitativo, la yuxtaposición), permitiéndoles funcionar de una forma prevista. Por ejemplo, una secuencia reguladora está ligada de forma operativa a una secuencia de codificación si la expresión de la secuencia de codificación está controlada por las secuencias reguladoras.
[0049] Una «secuencia señal» es una secuencia de aminoácidos adjunta a la parte N-terminal de una proteína, que facilita la secreción de la proteína fuera de la célula. La forma madura de una proteína extracelular carece de la secuencia señal, que se escinde durante el proceso de secreción.
[0050] El término «hongos filamentosos» se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina y Oomycota (véase Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, Nueva York). Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos de la presente información dada a conocer son distintos morfológica, fisiológica y genéticamente de las levaduras. El crecimiento vegetativo por hongos filamentosos se realiza mediante elongación de las hifas y el catabolismo de carbono es aeróbico obligatoriamente. En la presente información dada a conocer, la célula parental de
hongo filamentoso puede ser una célula de una especie de Trichoderma, p. ej., Trichoderma reesei (anteriormente clasificada como T. longibrachiatum y conocida también actualmente como Hypocrea jecorina), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, o Trichoderma harzianum. Algunos hongos filamentosos adicionales incluyen Aspergillus, Fusarium, Chrysosporium, Penicillium, Humicola, Neurospora, Myceliophthora, o formas sexuales alternativas de estos como Emericella, Hypocrea.
[0051] Los términos «aislado/a(s)» y «separado/a(s)» se refieren a un compuesto, proteína (polipéptidos), célula, ácido nucleico, aminoácido u otro material o componente especificado que se elimina de al menos un otro material o componente al que se asocia de forma natural como se halla en la naturaleza.
[0052] Como se utiliza en el presente documento, el término «purificado/a(s)» se refiere al material (p. ej., un polipéptido o polinucleótido aislado) que se encuentra en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 % puro, al menos aproximadamente 95 % puro, al menos aproximadamente 98 % puro, o incluso al menos aproximadamente 99 % puro.
[0053] Como se utiliza en el presente documento, los términos «modificación» y «alteración» se utilizan indistintamente y significan cambiar o variar. En el contexto de la modificación o alteración de un polipéptido, estos términos pueden significar cambiar la secuencia de aminoácidos, ya sea de forma directa o al cambiar el ácido nucleico codificante, o cambiar la estructura del polipéptido, por ejemplo, al glicosilar la enzima.
[0054] El término «glicosilación» como se utiliza en el presente documento se refiere a la unión de glicanos a moléculas, por ejemplo, a proteínas. La glicosilación puede ser una reacción enzimática. La unión formada puede ser a través de enlaces covalentes. La expresión «altamente glicosilado/a(s)» se refiere a una molécula, como una enzima, que está glicosilada en todos, o prácticamente todos, los sitios de glicosilación disponibles, por ejemplo, sitios de glicosilación enlazados a N.
[0055] El término «glicano» como se utiliza en el presente documento se refiere a un polisacárido u oligosacárido, o la sección de carbohidratos de un glicoconjugado, como una glicoproteína. Los glicanos pueden ser homo o heteropolímeros de residuos de monosacáridos, Pueden ser moléculas lineales o ramificadas.
[0056] Como se utiliza en el presente documento, la «temperatura de fusión aparente» se puede medir incubando enzima a varias temperaturas durante un determinado tiempo. A continuación, se mide la actividad restante a una temperatura de ensayo adecuada para la enzima. Los resultados se presentan en un gráfico. La temperatura de incubación que causa un 50 % de pérdida de actividad residual se calcula como la temperatura de fusión aparente.
[0057] Un «pienso» y un «alimento», respectivamente, se refieren a cualquier dieta, comida o similar, natural o artificial, o componentes de dichas comidas, destinados o adecuados para que los coma, ingiera o digiera un animal no humano y un ser humano, respectivamente.
[0058] Como se utiliza en el presente documento, el término «alimento» se utiliza en un sentido amplio, y cubre alimentos y productos alimenticios para humanos, así como alimentos para animales no humanos (es decir, un pienso).
[0059] El término «pienso» se utiliza con referencia a los productos con los que se alimenta a los animales en la cría de ganado. Los términos «pienso» y «pienso para animales» se utilizan indistintamente. En un modo de realización preferido, el alimento o pienso es para el consumo de no rumiantes y rumiantes. Algunos ejemplos de rumiantes incluyen vacas, ovejas, cabras y caballos. Algunos ejemplos de animales no rumiantes incluyen animales monogástricos como cerdos, aves de corral (como pollos y pavos), peces (como el salmón), perros, gatos y humanos.
[0060] El alimento o pienso puede encontrarse en forma de solución o como un sólido, en función del uso y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración. En algunos modos de realización, las enzimas mencionadas en el presente documento pueden utilizarse como, o en la preparación o producción de, una sustancia de pienso o alimento.
[0061] Como se utiliza en el presente documento, el término «ingrediente alimentario o de pienso» incluye una formulación, que se añade o puede añadirse a alimentos o productos alimenticios e incluye formulaciones que pueden utilizarse a niveles bajos en una amplia variedad de productos. El ingrediente alimentario puede encontrarse en forma de solución o como un sólido, dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración. Las enzimas descritas en el presente documento pueden utilizarse como un ingrediente alimentario o de pienso o en la preparación o producción. Las enzimas pueden ser suplementos alimenticios, o pueden añadirse a estos. Las composiciones para pienso para animales monogástricos incluyen normalmente composiciones que comprenden productos vegetales que contienen fitato. Dichas composiciones incluyen harina de maíz, harina de soja, harina de colza, harina de semilla de algodón, maíz, trigo, cebada y piensos a base de sorgo. Las enzimas descritas en el presente documento pueden ser, o pueden añadirse a, alimentos o sustancias y composiciones para piensos.
[0062] Las composiciones para pienso para animales monogástricos incluyen normalmente una composición que comprende productos vegetales que contienen fitato. Dichas composiciones incluyen harina de maíz, harina de soja,
harina de colza, harina de semilla de algodón, maíz, trigo, cebada y piensos a base de sorgo. Las enzimas descritas en el presente documento pueden ser, o pueden añadirse a, alimentos o sustancias y composiciones para piensos.
[0063] La presente información dada a conocer también proporciona un método para preparar un ingrediente o suplemento alimentario o para pienso, comprendiendo el método la mezcla o adición de enzimas producidas por el proceso de la presente descripción, o enzimas modificadas de la descripción, o una composición que comprende enzimas de acuerdo con la presente descripción con otro ingrediente alimentario. El método para preparar un ingrediente alimentario o de pienso es también otro modo de realización de la presente descripción. Estos métodos pueden implicar la peletización. Para preparar un ingrediente alimentario o de pienso, las enzimas de la descripción pueden añadirse en forma de sólido, una formulación como una premezcla, o un líquido,
[0064] Como se utiliza en el presente documento, los términos «peletización» y «pellet» se refieren a la producción o uso de pellets que son comprimidos sólidos, redondos, esféricos y cilíndricos, en concreto, pellets de pienso y pienso para animales sólido extrudido. Un ejemplo de un proceso conocido de fabricación de pellets de piensos para animales incluye en general mezclar ingredientes alimentarios o de piensos para animales durante aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente, transferir la mezcla a un recipiente de descarga, transportar la mezcla a un acondicionador de vapor, transferir opcionalmente la mezcla acondicionada con vapor a un expansor, transferir la mezcla al molino de pellets o extrusora, y transferir finalmente los pellets a un refrigerador de pellets. Fairfield, D. 1994. Capítulo 10, Pelleting Cost Center. In Feed Manufacturing Technology IV. (McEllhiney, editor), American Feed Industry Association, Arlington, Va., pp. 110-139.
[0065] El término «pellet» se refiere a una composición de pienso para animales (normalmente derivada del grano) que se ha sometido a un tratamiento térmico, como un tratamiento a vapor, y extrudido mediante una máquina. El pellet puede incorporar enzimas en forma de gránulos. El término «gránulo» se utiliza para partículas compuestas por enzimas y otros productos químicos como sales y azúcares, y puede formarse utilizando cualquiera de entre una variedad de técnicas, incluidos los enfoques de granulación de lecho fluidizado para formar gránulos estratificadoss.
[0066] «NCIMB» es el nombre de un depósito de organismos ubicado en Aberdeen, Escocia, llamado The National Collection of Industrial, food, and Marine Bacteria (Colección nacional de bacterias industriales, alimentarias y marinas).
[0067] «Un/una/uno» y «el/la» incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.
[0068] Como se utiliza en el presente documento, «endoglucosaminidasa» (o endoglicosidasa, endoglucosaminidasa, endo N-acetilglucosaminidasa, ENGasa) es una enzima secretada que elimina la glicosilación enlazada a N de otras proteínas como las fitasas (Stals et al. (2010) FEMS Microbiol. Lett. 303:9-17 Como se utiliza en el presente documento, «ETD» indica que la enzima se produce en un huésped que tiene el gen de endo-N-acetilglucosaminidasa delecionado.
[0069] Como se utiliza en el presente documento, el término «estabilidad» se refiere a cualquiera de una variedad de efectos en los que se mantiene o se mejora de forma beneficiosa la actividad enzimática u otra propiedad funcional de una enzima de fitasa. Una fitasa puede exhibir estabilidad al mostrar cualquiera de entre «actividad recuperada», «termoestabilidad» y/o «reversibilidad de inactividad».
[0070] Como se utiliza en el presente documento, el término «actividad recuperada» se refiere a la relación de (i) la actividad de una fitasa después de un tratamiento (que implica uno o más de los siguientes factores estresantes: calentamiento, aumento de presión, aumento de pH, disminución de pH, almacenamiento, secado, exposición a tensioactivo(s), exposición a solvente(s) y tensión mecánica), con respecto a (ii) la actividad de la fitasa antes del tratamiento. La actividad recuperada puede expresarse como un porcentaje.
[0071] El porcentaje de actividad recuperada se calcula de la siguiente manera:
r« actividad después tratamienti0^1
actividad recuperada = 1 x 100%
^ actividad antes tratamiento )
En el contexto de los experimentos de peletización, la «actividad antes del tratamiento» puede aproximarse al medir la actividad de fitasa presente en la masa que no se somete a tratamiento de una forma que se corresponde de otra manera con la fitasa que sí se somete a tratamiento. Por ejemplo, la fitasa en la masa sin tratar se manipula y se almacena durante un tiempo similar y en unas condiciones similares a la fitasa en la masa tratada, para controlar las posibles interacciones u otros efectos fuera del tratamiento especificado per se.
[0072] Como se utiliza en el presente documento, el término «reversibilidad de inactividad» es un tipo de estabilidad que se refiera a la capacidad de las enzimas expuestas a temperaturas elevadas, por ejemplo, superiores a 70 qC, superiores a 80 qC, superiores a 90 °C o superiores a 95 qC, de recuperar algo de actividad y mostrar al menos una inversión parcial de la inactivación mediada por calor. La recuperación de la actividad se produce después de eliminar la temperatura elevada. En el ejemplo 5 se analiza con mayor detalle un ensayo de reversibilidad de inactividad.
[0073] Como se utiliza en el presente documento, el término «fitasa control» junto con una fitasa se refiere al mismo tipo de molécula de fitasa (p. ej., fitasa BP17) que a la que se le añade un agente estabilizante (p. ej., glicosilación por expresión en un huésped de deglicosilación deficiente), excepto que carece de agente estabilizante. Por ejemplo, en una muestra la fitasa BP17 se estabiliza por expresión en un huésped de deglicosilación deficiente y en la muestra de fitasa control comparativa la única diferencia es que la fitasa BP 17 no se expresó en el huésped de deglicosilación deficiente, siendo dicha fitasa una «fitasa control».
[0074] Como se utiliza en el presente documento, una «unidad de actividad de fitasa» es la cantidad de enzima que puede liberar 1 pmol de fosfato por minuto. La actividad de fitasa se analiza según el método oficial 2000.12 de la AOAC (Asociación de Químicos Analíticos), según se describe en «Determination of phytase activity in feed by a colorimetric enzymatic method: collaborative interlaboratory study» Engelen A J, van der Heeft F C, Randsdorp P H, Somers W A, Schaefer J, van der Vat B J. J AOAC Int. 2001 mayo-junio; 84(3):629-33. En resumen, las muestras trituradas se extraen en acetato de sodio trihidratado 220 mM, cloruro cálcico deshidratado 68,4 mM, Tween 20 al 0,01 %, pH 5,5. A continuación, se analiza el sobrenadante. El ensayo mide la liberación de fosfato inorgánico de la fitasa de arroz, a pH 5,5, durante 60 minutos a 37 0C. El ensayo se detiene con reactivo de molibdato/vanadato ácido, y se cuantifica el fosfato por la intensidad del complejo de color amarillo del vanadomolibdofósforo.
[0075] El siguiente experimento hipotético se proporciona para ilustrar y explicar de manera adicional la terminología de la presente información dada a conocer. En el presente documento, las unidades de la tabla se representan por conveniencia comenzando con 100 unidades arbitrarias de actividad de fitasa antes de la peletización. En primer lugar, mirando la fila superior de datos, para una composición de fitasa control dada como BP17 expresada de forma nativa, el «porcentaje de actividad recuperada» es del 50 % después del tratamiento de peletización. En segundo lugar, mirando la fila inferior de datos, para una composición de fitasa dada como BP17 expresada con endo T delecionado, el «porcentaje de actividad recuperada» de la fitasa después del tratamiento de peletización es del 80 %. En tercer lugar, mirando la columna más a la derecha, la fitasa BP17 expresada con endo T delecionado tiene una actividad de fitasa que es un 60 % superior (80-50=30; 30/50=0,6=60 %) en comparación con la «fitasa control» que no se expresó en el huésped de expresión de endo T delecionado. En algunos modos de realización, estas mejoras pueden acompañarse de mejoras en la termoestabilidad, por ejemplo, medido por Tm. En algunos modos de realización, estas mejoras pueden acompañarse de mejoras en la reversibilidad de inactividad.
EJEMPLOS DE MODOS DE REALIZACIÓN
[0076] En algunos modos de realización, la presente información dada a conocer se refiere a la producción de enzimas, por ejemplo fitasa, con aumento de estabilidad debido al aumento de glicosilación. En algunos modos de realización, la presente información dada a conocer se refiere a la modificación o alteración de enzimas, por ejemplo fitasas, para introducir o aumentar el número de sitios de glicosilación. En algunos modos de realización, esto implica la introducción en el polipéptido de un motivo de aminoácido conocido por ser reconocido como un sitio de glicosilación enlazado a N.
[0077] En modo de realización adicional, la presente descripción se refiere también al aumento de la glicosilación de una enzima a través de métodos de producción. En algunos modos de realización, el método de producción utilizado es la expresión en un huésped de hongos filamentosos, por ejemplo, un hongo de la especie Trichoderma como T. reesei.
[0078] La presente información dada a conocer se refiere también a la expresión de una enzima, como fitasa, en un huésped alterado, donde la alteración deleciona la función de uno o más genes y, en algunos modos de realización, deleciona la función del gen de endoglucosaminidasa.
[0079] La presente información dada a conocer se refiere además a la producción de alimento y/o pienso que comprende las enzimas modificadas de la presente información dada a conocer. En algunos modos de realización, el producto de alimento o pienso se encuentra en forma de pellets.
[0080] La presente información dada a conocer también proporciona un método para preparar un ingrediente o suplemento alimentario o de pienso, comprendiendo el método la mezcla o adición de fitasas producidas por el proceso de la presente información dada a conocer, o una composición que comprende las fitasas de acuerdo con la presente información dada a conocer, con otro ingrediente alimentario. El método para preparar un alimento o ingrediente alimentario es también otro modo de realización de la presente información dada a conocer. Estos métodos pueden implicar la peletización. Para preparar un ingrediente alimentario o de pienso, las enzimas de la presente información dada a conocer pueden añadirse en forma de sólido, una formulación como una premezcla, o un líquido. Normalmente,
se añade una forma sólida antes de la etapa de mezclado o durante esta; y normalmente se añade una forma líquida después de la etapa de peletización.
[0081] Algunos modos de realización de la presente información dada a conocer son enzimas de fitasa con un rendimiento de peletización mejorado debido a la glicosilación. En concreto, la presente información dada a conocer se refiere a fitasas termoestables que retienen su actividad después de la peletización y, por consiguiente, aumentan los niveles de fosfatos disponibles en el pienso para animales. En algunos modos de realización, la estabilidad surge de la reversibilidad de inactividad. En algunos modos de realización, la estabilidad surge de la actividad recuperada mejorada después del tratamiento, por ejemplo, calor.
[0082] En un modo de realización, la enzima activa que se ha de producir o modificar es BP17. BP17 es una variante de enzima de una fitasa de Buttiauxella sp. La secuencia para BP17 (excluyendo el péptido señal), que se utiliza como referencia para la numeración de la posición de los aminoácidos en todo el documento, es como sigue:
SEQ ID NO:1
NDTPASGYQVEKWILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG
FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSI
YVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVE
KEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNT
TLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMP
QAAWGNIHSEQEWALLLKLHNV
YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRW
TLPGQPDNTPPGGALVFER
LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVV
SQSVEPGCQLQ
[0083] En otro modo de realización, la enzima activa que se ha de producir o modificar es BP11. BP11 es una variante de enzima de una fitasa de Buttiauxella sp. La secuencia para BP11 (excluyendo el péptido señal) es como sigue:
SEQ ID NO:2
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG
FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSI
YVWTDVDQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVE
KEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNT
TLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMP
QAAWGNIHSEQEWALLLKLHNV
YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRW
TLPGQPDNTPPGGALVFER
LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVV
SQSVEPGCQLQ
[0084] En otro modo de realización, la enzima activa que se ha de producir o modificar es BP111. BP111 es una variante de enzima de una fitasa de Buttiauxella sp. La secuencia para BP111 (excluyendo el péptido señal) es como sigue:
SEQ ID NO:3
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPYTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG
FYRQKFQQQGILPRGSCPTPNSI
YVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVE
KEAQTPIDNLNQRYIPELALMNT
ILNFSKSPWCQKHSADKPCDLALSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQ
VAWGNIHSEQEWALLLKLHNV
YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRW
TLPGQPDNTPPGGALVFER
LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPPGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVV
SQSVEPGCQLQ
[0085] Todas estas fitasas son variantes de la secuencia natural, como la derivada de la cepa P 1 -29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248, con la secuencia que sigue:
SEQ ID NO:4
NDTPASGYQVEKWILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG
FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSI
YVWADVDQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGTCSMDKTQVQQAVE
KEAQTPIDNLNQHYIPFLALMNT
TLNFSTSAWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNKVALDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQ
AAWGNIHSEQEWASLLKLHNV
QFDLMARTPYIARHNGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMR
WTLPGQPDNTPPGGALVFER
LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVV
SQSVEPGCQLQ
[0086] Las enzimas de fitasa detalladas anteriormente son proteínas maduras que carecen de una secuencia señal. La secuencia señal adecuada derivada de la cepa P 1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 es como sigue:
SEQ ID NO:12
MTISAFNRKKLTLHPGLFVALSAIFSLGSTAYA
[0087] En un modo de realización adicional, la presente información dada a conocer se refiere a la alteración o modificación de una enzima de fitasa para introducir un motivo conocido por ser reconocido como un sitio de glicosilación enlazado a N. En algunos modos de realización, el motivo es Asn-Xaa-Ser/Thr, donde Asn is asparagina (N), Xaa puede ser cualquier aminoácido, Ser es serina (S) y Thr es treonina (T). Ser y Thr son alternativas iguales. Esta alteración se puede llevar a cabo utilizando técnicas como mutagénesis de sitio dirigido. Esta alteración puede implicar la introducción de uno o dos o los tres aminoácidos del motivo Asn-Xaa-Ser/Thr en el polipéptido.
[0088] La secuencia de aminoácidos de la fitasa BP17 (SEQ ID NO:1) contiene tres sitios potenciales de glicosilación enlazados a N según el análisis realizado por el algoritmo de predicción NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/). Los residuos de asparagina que se predice que se glicosilan son los residuos N169, N173 y N285 de la secuencia de fitasa BP17 madura, SEQ ID NO:1.
[0089] Un modo de realización de la presente información dada a conocer implica la producción y el uso de una fitasa que está altamente glicosilada, por ejemplo BP17 altamente glicosilada, o un homólogo, variante o derivado de esta. En algunos modos de realización, la enzima producida y/o utilizada presenta más del 75 %, por ejemplo más del 80 %, por ejemplo más del 90 % y, para mayor ejemplo, más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,9% de identidad con BP17.
[0090] Algunos modos de realización de la presente información dada a conocer implican la introducción de sitios de glicosilación adicionales en BP17. De manera específica, se puede introducir una o más o todas las siguientes sustituciones en BP17 (con referencia a la numeración de la posición de la SEQ ID NO:1, carente de secuencia señal) para introducir sitios de glicosilación: E121T, P394N, D386N, K202N y N204T, Q151N y P153S, P373T, y Q76N.
[0091] En particular, una secuencia de la presente información dada a conocer puede comprender K202N y N204T en la misma secuencia. En un modo de realización adicional de la presente información dada a conocer, una secuencia de la presente información dada a conocer puede comprender Q151N y P153S en la misma secuencia. En un modo de realización adicional de la presente información dada a conocer, una secuencia de la presente información dada a conocer puede comprender D386N.
[0092] Lo siguiente puede comprender secuencias de la presente información dada a conocer (en cada caso los cambios aminoacídicos en relación con la BP17 se muestran en negrita y subrayados) donde las sustituciones de aminoácidos se han introducido en BP17 (SEQ ID NO:1) para aumentar el número de sitios de glicosilación:
SEQ ID NO:5 (E121T)
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG
FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLTKADP
LFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKS
CDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKL
HNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLN
MRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQL
KIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
SEQ ID NO:6 (P394N)
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADP LFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKS CDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKL HNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLN MRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQL KIPGCNDQTAEGYCNLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
SEQ ID NO:7 (D386N)
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADP LFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKS CDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKL HNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLN MRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQL KIPGCNNQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
SEQ ID NO:8 (K202N and N204T)
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADP LFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKS CDLGLSMPSKLSINDTGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKL HNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLN MRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQL KIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
SEQ ID NO:9 (Q151N and P153S)
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADP LFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEANTSIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKS CDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKL HNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLN MRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQL KIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
SEQ ID NO:10 (P373T)
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG FYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADP LFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKS CDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKL HNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLN MRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQTAGSVQL KIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
SEQ ID NO:11 (Q76N)
NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGG FYRQKFQQQGILSNGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADP LFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKS CDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKL HNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLN MRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQL KIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
[0093] El grado de glicosilación de una enzima puede aumentar la reversibilidad de la inactivación por calor de la enzima modificada en comparación con las enzimas naturales o la enzima parental a partir de la que se deriva la enzima.
[0094] Algunos modos de realización de la presente información dada a conocer proporcionan enzimas de fitasa con un aumento de reversibilidad de inactividad. En algunos modos de realización, estas enzimas son BP17, glicosiladas. En algunos modos de realización, la presente información dada a conocer proporciona enzimas que comprenden las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, u homólogos, variantes o derivados de estas, que presentan un aumento de reversibilidad de inactividad. En algunos modos de realización, estas enzimas presentan más del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 140 %, 160 %, 180 % o 200 % de aumento de reversibilidad de inactividad en comparación con una fitasa control.
[0095] La presente información dada a conocer también proporciona ácidos nucleicos codificantes y capaces de codificar los polipéptidos de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, u homólogos, variantes o derivados de estos.
[0096] La presente información dada a conocer puede referirse también a una enzima de las SEQ ID NO: 1-11 o a un polipéptido derivado de esta enzima (parental) mediante sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 aminoácidos, o más aminoácidos, como 10 o más de 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína parental y que posee la actividad de la proteína parental. En algunos modos de realización, estas enzimas presentan más del 75 %, por ejemplo más del 80 %, por ejemplo más del 90 % y, para mayor ejemplo, más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con las SEQ iD NO:1-11. En algunos modos de realización, esta enzima se glicosila y en algunos modos de realización dicha enzima presenta un aumento de reversibilidad de inactividad y/o un aumento de actividad recuperada después de un tratamiento como el calor.
[0097] Un modo de realización adicional de la presente información dada a conocer proporciona un método para la producción de una enzima, por ejemplo, una enzima donde se aumenta la glicosilación o la enzima está altamente glicosilada. Este método implica la alteración de la secuencia de aminoácidos de la enzima, o la alteración del ácido nucleico que codifica la enzima, para aumentar el número de sitios de glicosilación. En algunos modos de realización, esta alteración implica el aumento del número de sitios de glicosilación enlazados a N. En algunos modos de realización, esto implica la introducción del motivo Asn-Xaa-Ser/Thr en la enzima o la introducción de la secuencia que codifica este sitio en el ácido nucleico. En algunos modos de realización, se introducen uno, o dos, o tres, o más sitios de glicosilación en una enzima.
[0098] En algunos modos de realización, las enzimas de la presente información dada a conocer se utilizan en alimentos o piensos, en la preparación de alimentos o piensos y/o en aditivos alimentarios o de pienso o su preparación. En algunos modos de realización, las enzimas pueden formar una composición con otros ingredientes alimentarios o de pienso, o pueden añadirse a una composición de ingredientes alimentarios o de pienso. En algunos modos de realización, las enzimas presentan más reversibilidad de inactividad, y/o actividad recuperada mejorada después de un tratamiento como calor, como enzimas comparativas o similares utilizadas en la producción de alimentos o pienso.
[0099] Las enzimas de fitasa, como BP17 (SEQ ID NO:1) se añaden tradicionalmente al pienso para animales para aumentar la disponibilidad del fosfato, aumentando de esta manera el valor nutricional del producto. El procesamiento del pienso, por ejemplo, con calor y presión alta, puede desnaturalizar la fitasa y reducir su actividad. La presente información dada a conocer proporciona una fitasa más termoestable, lo que, por lo tanto, aumenta los niveles de la actividad de fitasa presentes en el pienso después del procesamiento. En algunos modos de realización, el procesamiento del pienso para animales implica la formación de pellets. En modos de realización adicionales, los pellets que comprenden la fitasa tienen mayores niveles de actividad de fitasa después del procesamiento.
Métodos de producción
[0100] En modos de realización adicionales, la presente información dada a conocer se refiere también al aumento de la glicosilación de una enzima a través de métodos de producción. En algunos modos de realización, el método de producción utilizado es la expresión en un huésped de hongos filamentosos, por ejemplo, la expresión en hongos de la especie Trichoderma y de manera concreta, por ejemplo, en T. reesei.
[0101] La presente información dada a conocer se refiere también a la expresión de una enzima en un huésped alterado, donde la alteración ha delecionado la función de uno o más genes y, en algunos modos de realización, ha delecionado la función del gen de endoglucosaminidasa.
[0102] En un modo de realización, la presente información dada a conocer proporciona la expresión y la producción de una enzima de fitasa, y en algunos modos de realización la fitasa es BP17, que puede modificarse o no, en hongos de la especie Trichoderma, por ejemplo en T. reesei, donde el gen de endoglucosaminidasa se ha delecionado.
[0103] En algunos modos de realización, la presente información dada a conocer se refiere a la producción de enzimas, como fitasa, con aumento de glicosilación. En modos de realización adicionales, se potencia el aumento de glicosilación mediante el uso de un huésped con un gen de endoglucosaminidasa delecionado. En algunos modos de realización, la
enzima producida tiene aumento de reversibilidad de inactividad en comparación con una enzima producida utilizando diferentes métodos, especialmente métodos que utilizan una especie huésped diferente y/o un huésped donde no se deleciona el gen de endoglucosaminidasa. En algunos modos de realización, la enzima producida tiene aumento de estabilidad en comparación con una enzima producida utilizando diferentes métdos, especialmente métodos que utilizan una especie huésped diferente y/o un huésped donde no se deleciona el gen de endoglucosaminidasa.
[0104] El grado de glicosilación de una proteína, como una enzima, es mayor si se produce en un huésped con el gen de endoglucosaminidasa endógeno delecionado. Según algunos modos de realización de la presente información dada a conocer, el gen de endoglucosaminidasa puede delecionarse mediante eliminación, alteración, interferencia o cualquier método que impida o reduzca la expresión y la producción de la endoglucosaminidasa en el huésped.
[0105] En algunos modos de realización, la presente información dada a conocer se refiere a la expresión y la producción de una fitasa en un huésped con la endoglucosaminidasa delecionada. En modos de realización adicionales, la fitasa es BP17 o un homólogo, variante o derivado de esta, por ejemplo, que tenga más del 75 %, por ejemplo más del 80 %, por ejemplo más del 90 % y para mayor ejemplo más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con BP17 (SEQ ID NO:1) o cualquiera de las SEQ ID NO:2-11. En algunos modos de realización, el huésped es un huésped de hongos filamentosos, por ejemplo, un hongo de la especie Trichoderma y, para mayor ejemplo, T. reesei. En algunos modos de realización, la fitasa presenta aumento de reversibilidad de inactividad en comparación con una fitasa producida por otros métodos de producción, o una fitasa que no está glicosilada o no está muy glicosilada.
[0106] En algunos modos de realización, las enzimas producidas por los métodos de la presente información dada a conocer se utilizan en alimentos o piensos, en la preparación de alimentos o piensos y/o en aditivos alimentarios o de pienso o su preparación. En algunos modos de realización, las enzimas de la actual información dada a conocer pueden formar una composición con otros ingredientes alimentarios o de pienso, o pueden añadirse a una composición de ingredientes alimentarios o de pienso. En algunos modos de realización adicionales, las enzimas de la presente información dada a conocer presentan una mayor reversibilidad de inactividad que otras enzimas utilizadas en la producción de alimentos o piensos.
[0107] En algunos modos de realización, los métodos de producción de la presente información dad a conocer proporcionan una fitasa que presenta un aumento de reversibilidad de inactividad, lo que, por lo tanto, aumenta los niveles de la actividad de fitasa presentes en el pienso después del procesamiento. En algunos modos de realización, el procesamiento del pienso para animales implica la formación de pellets. En modos de realización adicionales, los pellets que comprenden la fitasa de la actual información dada a conocer tienen niveles aumentados de la actividad de fitasa después del procesamiento. En otros modos de realización adicionales, la fitasa de la actual información dada a conocer es más capaz de sobrevivir al proceso de peletización y de retener los niveles de la actividad de fitasa después del procesamiento.
Gránulo y gránulo multicapa
[0108] Los núcleos, gránulos y gránulos multicapa pueden producirse mediante una variedad de técnicas de fabricación, incluidas: atomización rotativa, granulación en húmedo, granulación en seco, secado por pulverización, granulación de disco, extrusión, recubrimiento en tolva, esferonización, granulación en tambor, aglomeración de lecho fluidizado, granulación de cizalladura alta, recubrimiento por pulverización de lecho fluidizado, cristalización, precipitación, gelificación en emulsión, atomización de disco giratorio y otros enfoques de moldeado, y procesos de granulado. Dichos procesos se conocen en la técnica y se describen en la patente estadounidense n.° 4689297 y la patente estadounidense n.° 5324649 (procesamiento de lecho fluidizado); EP656058B1 y la patente estadounidense n.° 454332 (proceso de extrusión); la patente estadounidense n.° 6248706 (granulación, cizalladura alta); y EP804532B1 y la patente estadounidense n.° 6534466 (procesos combinados que utilizan un núcleo de lecho fluidizado y un mezclador de recubrimiento).
[0109] El núcleo es el centro interno del gránulo multicapa o es el gránulo. Los materiales utilizados en el núcleo pueden ser adecuados para su utilización en alimentos y/o piensos para animales. US20100124586, WO9932595 y US5324649 detallan los materiales adecuados para el núcleo.
[0110] En un modo de realización, el núcleo comprende uno o más agente(s) dispersable(s) o soluble(s) en agua. Los agentes solubles en agua adecuados incluyen, sin carácter limitativo, sales inorgánicas (p. ej., sulfato sódico, cloruro sódico, sulfato de magnesio, sulfato de zinc y sulfato de amonio), ácido cítrico, azúcares (p. ej., sacarosa, lactosa, glucosa, sacarosa granulada, maltodextrina y fructosa), plastificantes (p. ej., polioles, urea, dibutilftalato y dimetilftalato), material fibroso (p. ej., celulosa y derivados de celulosa tales como hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa e hidroxiletilcelulosa), ácido fítico y combinaciones de estos. Los agentes dispersables adecuados incluyen, sin carácter limitativo, arcillas, nonpareils (combinaciones de azúcar y almidón; p. ej., nonpareils de almidón-sacarosa - ASNP), talco, silicatos, carboximetilcelulosa, almidón, y combinaciones de estos.
[0111] En un modo de realización, el núcleo comprende sulfato sódico. En otro modo de realización, el núcleo consta de sulfato sódico. En algunos modos de realización, el núcleo puede comprender una fitasa y/o un ácido fítico. En algunos modos de realización, el núcleo no comprende fitasa.
[0112] En algunos modos de realización, el núcleo está recubierto de al menos una capa de recubrimiento. En algunos modos de realización, el núcleo está recubierto de al menos dos capas de recubrimiento. En otro modo de realización, el núcleo está recubierto de al menos tres capas de recubrimiento. En un modo de realización adicional, el núcleo está recubierto de al menos cuatro capas de recubrimiento.
[0113] Los materiales utilizados en la(s) capa(s) de recubrimiento pueden ser adecuados para su utilización en alimentos y/o piensos para animales. US20100124586, WO9932595 y US5324649 detallan los materiales adecuados para la capa de recubrimiento.
[0114] En algunos modos de realización, el proceso de granulación de lecho fluidizado se emplea tradicionalmente dirigiendo y pulverizando de forma continua una capa sobre la siguiente capa con solo una breve descarga de las líneas y boquillas de pulverización de agua para fines de limpieza, sin cesar la pulverización. En algunos modos de realización, los gránulos pueden realizarse dejando que se sequen (fluidificar sin pulverización) durante un periodo de tiempo adicional (p. ej., 5 minutos) después de la finalización de cada pulverización intermedia (por ejemplo, a 70 0C), y se puede llevar a cabo un secado adicional opcional después de la pulverización final (por ejemplo, 20 minutos a 70 0C).
[0115] En algunos modos de realización, el periodo de tiempo adicional después de la finalización de la pulverización intermedia es de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, o 25 minutos. En algunos modos de realización, el periodo de tiempo adicional después de la finalización de la pulverización intermedia es de 2-8, 3-7 o 4-6 minutos. En algunos modos de realización, la temperatura del periodo de tiempo adicional después de la finalización de la pulverización intermedia es de al menos 50 0C, 55 0C, 600C, 65 0C, 70 0C, 75 0C u 80 0C. En algunos modos de realización, la temperatura del periodo de tiempo adicional después de la finalización de la etapa intermedia es de 60 °C-80 0C o 65 0C-75 0C. En algunos modos de realización, después de la finalización de la pulverización intermedia se lleva a cabo una etapa de secado durante 4-6 minutos a 65 0C-75 0C.
[0116] En algunos modos de realización, el secado opcional después de la pulverización final puede ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25 o 30 minutos. En algunos modos de realización, el secado opcional después de la pulverización final puede ser de 5-30 o 10-25 minutos. En algunos modos de realización, la temperatura del secado opcional después de la pulverización final es de al menos 50 0C, 55 0C, 60 0C, 65 0C, 70 0C, 75 0C u 80 0C. En algunos modos de realización, la temperatura del secado opcional después de la pulverización final es de 60 °C-80 0C o 65 0C-75 0C. En algunos modos de realización, el secado opcional después de la pulverización final es de 15-25 minutos a 65 0C-75 0C.
[0117] En un modo de realización, una capa de recubrimiento comprende uno o más de los siguientes materiales: una sal inorgánica (p. ej., sulfato sódico, cloruro sódico, sulfato de magnesio, sulfato de zinc y sulfato de amonio), ácido cítrico, un azúcar (p. ej., sacarosa, lactosa, glucosa y fructosa), un plastificante (p. ej., polioles, urea, dibutilftalato y dimetilftalato), material fibroso (p. ej., celulosa y derivados de celulosa como hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa e hidroxiletilcelulosa), arcilla, nonpareil (una combinación de azúcar y almidón), silicato, carboximetilcelulosa, ácido fítico, almidón (p. ej., almidón de maíz), grasas, aceites (p. ej., aceite de colza y aceite de parafina), lípidos, polímeros de vinilo, copolímeros de vinilo, alcohol polivinílico (PVA), plastificantes (p. ej., polioles, urea, dibutilftalato, dimetilftalato y agua), agentes antiaglomerantes (p. ej., talco, arcillas, sílice amorfa y dióxido de titanio), agentes antiespumantes (como Foamblast 882® y Erol 6000K®) y talco. US20100124586, WO9932595 y US5324649 detallan los componentes adecuados para las capas de recubrimiento.
[0118] En un modo de realización, la capa de recubrimiento comprende azúcares, como sacarosa.
[0119] En un modo de realización, la capa de recubrimiento comprende un polímero como alcohol polivinílico (PVA).
[0120] El PVA adecuado para su incorporación a la(s) capa(s) de recubrimiento del gránulo multicapa incluye PVA parcialmente hidrolizado, totalmente hidrolizado e hidrolizado de forma intermedia con grados de viscosidad de bajo a alto.
[0121] En otro modo de realización, la capa de recubrimiento comprende una sal inorgánica, como sulfato sódico.
[0122] En un modo de realización, al menos una capa de recubrimiento es una capa de recubrimiento enzimática. En algunos modos de realización, el núcleo está recubierto de al menos dos capas enzimáticas. En otro modo de realización, el núcleo está recubierto de al menos tres capas enzimáticas.
[0123] En algunos modos de realización, los gránulos de la presente información dada a conocer comprenden una capa de recubrimiento enzimática. En algunos modos de realización, la capa enzimática comprende al menos una enzima. En algunos modos de realización, la capa enzimática comprende al menos dos enzimas. En algunos modos de realización, la capa enzimática comprende al menos tres enzimas. En algunos modos de realización, la enzima se selecciona de entre el grupo consistente en fitasas, xilanasas, fosfatasas, amilasas, esterasas, enzimas redox, lipasas, transferasas, celulasas, hemicelulasas, betaglucanasas, oxidasas (p. ej., hexosa oxidasas y maltosa oxidorreductasas), proteasas y mezclas de estas. En general, al menos una capa de recubrimiento enzimática comprende al menos una fitasa y ácido fítico.
[0124] En un modo de realización, la capa de recubrimiento enzimática comprende al menos una fitasa y al menos una enzima adicional seleccionada de entre el grupo consiste en fitasas, zilanasas, fosfatasas, amilasas, esterasas, enzimas redox, lipasas, transferasas, celulasas, hemicelulasas, betaglucanasas, oxidasas (p. ej., hexosa oxidasas y maltosa oxidorreductasas) y proteasas.
[0125] Las listas de enzimas anteriores son solo ejemplos y no pretenden ser exclusivas. Se puede utilizar cualquier enzima en los gránulos descritos en el presente documento, incluidas las enzimas naturales, recombinantes y variantes de enzimas de fuentes bacterianas, fúngicas, de levadura, vegetales, de insectos y animales, y enzimas ácidas, neutras o alcalinas.
[0126] En algunos modos de realización, la capa de recubrimiento enzimática puede comprender además uno o más materiales adicionales seleccionados de entre el grupo consistente en: ácido fítico, azúcares (p. ej., sacarosa), almidón (p. ej., almidón de maíz), grasas, aceites (p. ej., aceite de colza y aceite de parafina), lípidos, polímeros de vinilo, copolímeros de vinilo, alcohol polivinílico (PVA), plastificantes (p. ej., polioles, urea, dibutilftalato, dimetilftalato y agua), agentes antiaglomerantes (p. ej., talco, arcillas, sílice amorfa y dióxido de titanio), agentes antiespumantes (como Foamblast 882® y Erol 6000k® disponibles en Ouvrie PMC, Lesquin, Francia) y talco. US20100124586, WO9932595 y US5324649 detallan los componentes adecuados para los gránulos. Foamblast 882® está disponible en Emerald Foam Control, LLC. Foamblast 882® es un antiespumante que se fabrica con ingredientes de uso alimentario.
[0127] En un modo de realización, la capa de recubrimiento enzimática comprende ácido fítico y al menos una fitasa. En otras palabras, la fitasa y el ácido fítico se incorporan a la misma capa de un gránulo multicapa.
[0128] En un modo de realización, el gránulo multicapa comprende una capa de recubrimiento enzimática que comprende una fitasa y una capa de recubrimiento que comprende ácido fítico que es funcionalmente adyacente a la capa enzimática.
[0129] En un modo de realización, la capa de recubrimiento comprende ácido fítico donde dicha capa de recubrimiento es funcionalmente adyacente a un núcleo que comprende fitasa y/o una capa de recubrimiento enzimática que comprende fitasa.
[0130] En un modo de realización, la capa de recubrimiento externa de un gránulo multicapa comprende uno o más de los siguientes materiales de recubrimiento: polímeros (p. ej. polímeros vinílicos, alcohol polivinílico y copolímeros vinílicos), gomas, ceras, grasas, aceites, lípidos, lecitina, pigmentos, lubricantes, nonpareils, sales inorgánicas (p. ej. sulfato sódico, cloruro sódico, sulfato de magnesio, sulfato de zinc y sulfato de amonio), talco y plastificantes (p. ej. azúcares, azúcares alcohólicos y polietilenglicol).
[0131] En un modo de realización, la capa de recubrimiento externa de un gránulo multicapa comprende una sal inorgánica (p. ej., sulfato sódico), alcohol polivinílico (PVA), talco o combinaciones de estos. En un modo de realización, la capa de recubrimiento externa comprende alcohol polivinílico (PVA) y/o talco.
[0132] En un modo de realización, la capa de recubrimiento externa evita o reduce la tasa o el grado de migración de agua, humedad o vapor hacia la capa enzimática.
[0133] Los gránulos multicapa descritos en el presente documento pueden producirse mediante una variedad de técnicas que incluyen: recubrimiento por pulverización de lecho fluidizado, recubrimiento en tolva y otras técnicas para desarrollar un gránulo multicapa mediante la adición de capas consecutivas en la parte superior del material del núcleo inicial (la semilla). Véase, por ejemplo, US 5324649 y US20100124586. En un modo de realización, los gránulos multicapa se producen utilizando un proceso de recubrimiento de pulverización de lecho fluidizado.
[0134] En un modo de realización, los gránulos multicapa comprenden o constan de un núcleo que comprende sulfato sódico; una primera capa de recubrimiento que comprende o consta de fitasa, sacarosa, almidón, ácido fítico y aceite de colza; una segunda capa de recubrimiento que comprende o consta de sulfato sódico; y una tercera capa de recubrimiento que comprende o consta de talco y PVA. La primera capa de recubrimiento se aplica al núcleo, a continuación, la segunda capa de recubrimiento se aplica a la primera capa de recubrimiento y, después, la tercera capa de recubrimiento se aplica a la segunda capa de recubrimiento.
[0135] En otro modo de realización, los gránulos multicapa comprenden o constan de un núcleo que comprende sulfato sódico; una primera capa de recubrimiento que comprende o consta de fitasa, sacarosa, almidón, ácido fítico y un agente antiespumante (como Foamblast 882®); una segunda capa de recubrimiento que comprende o consta de sulfato sódico; y una tercera capa de recubrimiento que comprende o consta de talco y PVA. La primera capa de recubrimiento se aplica al núcleo, a continuación, la segunda capa de recubrimiento se aplica a la primera capa de recubrimiento y, después, la tercera capa de recubrimiento se aplica a la segunda capa de recubrimiento.
Combinaciones de modos de realización
[0136] En un modo de realización adicional, se pueden combinar facetas de la presente información dada a conocer. En otras palabras, una enzima de fitasa de la presente información dada a conocer que ha sido modificada para aumentar
el número de sitios de glicosilación alterando la secuencia de aminoácidos puede producirse en un huésped alterado, por ejemplo, un huésped donde se ha delecionado el gen de endoglucosaminidasa. Esto puede maximizar el grado de glicosilación de la enzima. En algunos modos de realización, el huésped es un hongo de la especie Trichoderma, por ejemplo, T. reesei.
[0137] En algunos modos de realización, la enzima expresada en el huésped alterado es una fitasa, por ejemplo, BP17 (SEQ ID NO:1) o una fitasa natural como la SEQ ID nO:4, o una fitasa modificada de cualquiera de las SEQ iD NO:2, 3, 5-11 o un homólogo, variante o derivado de esta, por ejemplo, que tenga más del 75 %, por ejemplo más del 80 %, por ejemplo más del 90 % y para mayor ejemplo más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con BP17 (SeQ ID NO:1) o cualquiera de las SEQ ID NO:2-11.
[0138] En concreto, las mejoras en las características enzimáticas representadas por las enzimas de la presente información dada a conocer y/o producidas por los métodos de la presente información dada a conocer se pueden dirigir a la estabilidad de las enzimas en condiciones de procesamiento de alimentos y piensos, a la estabilidad de las enzimas durante el tránsito del estómago, y a la estabilidad y la actividad enzimática en el estómago y/o el tracto intestinal de seres humanos o animales, lo que hace que las variantes mejoradas sean particularmente adecuadas para su uso como suplementos para piensos. Por lo tanto, estas mejoras comprenden el aumento de reversibilidad de inactividad y/o actividad recuperada que surge después de la exposición a temperaturas elevadas, en algunos modos de realización a temperaturas superiores a 65 0C, superiores a 75 0C, superiores a 85 0C y en modos de realización adicionales superiores a 950C. De forma adicional, otros parámetros afectados pueden incluir el aumento de la estabilidad frente a la digestión proteolítica, por ejemplo, la proteasa del tracto digestivo como la pepsina, el aumento de la actividad catalítica a pH bajo, por ejemplo, la actividad catalítica por debajo de pH 5,5, y la eficiencia general de la liberación de grupos fosfato de fitato, y en algunos ejemplos además inositol fosfatos.
[0139] En otros modos de realización de la presente información dada a conocer, se proporciona un método para la producción de alimento o pienso para animales. El pienso para animales se produce normalmente en molinos de piensos, en los cuales las materias primas se muelen en primer lugar hasta conseguir un tamaño de partículas adecuado, y a continuación se mezclan con aditivos adecuados. Las enzimas de la presente información dada a conocer, o enzimas producidas por los métodos de la presente información dada a conocer, se pueden añadir a los ingredientes de los piensos. El pienso se puede producir posteriormente como una masa o pellets; este último implica normalmente un método mediante el cual se eleva la temperatura hasta un nivel objetivo y, a continuación, el pienso pasa a través de una matriz para producir pellets de un tamaño concreto. Posteriormente, se pueden añadir aditivos líquidos, tales como grasa y enzima. Los pellets se dejan enfriar antes de su transporte. La producción de pienso para animales puede implicar también una etapa adicional que incluye la extrusión.
[0140] Un modo de realización adicional de la presente información dada a conocer proporciona métodos para la preparación de un pienso para animales que comprende una variante de enzima de fitasa, comprendiendo dicho método las etapas secuenciales de i) realización de uno o más de los métodos anteriores de preparación de una variante de enzima de fitasa, y ii) adición de la variante de enzima de fitasa preparada a un pienso para animales. En algunos modos de realización, la composición de pienso comprende una fitasa a una concentración de 10-10000 U/kg de pienso, 200-2000 U/kg de pienso o 500-1 000 U/kg de pienso.
EJEMPLOS
[0141] Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar algunos modos de realización de la presente información dada a conocer.
Ejemplo 1 Expresión de fitasa BP-17 de Buttiauxella en células huésped de T. reesei
Construcción de un vector de expresión de fitasa BP17.
[0142] El marco abierto de lectura de la variante BP-17 de fitasa de Buttiauxella (US2009098249A1) se amplificó mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando ADN sintetizado por GeneArt AG (Regensburg, Alemania) como molde (SEQ ID NO:13).
ACTAGTGTCGCCGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGAGAA
GGT CGT CAT CCTCAGCCGCCACGGCGT CCGCGCCCCT ACCAAG AT G ACCCAG ACCAT GC
GCG ACGT CACCCCCAACACCT GGCCCG AGTGGCCCGT CAAGCT CGGCT ACAT CACCCCT
CGCGGCGAGCACCTCATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAAGTTCCAGCAGCA
GGGCATCCTCAGCCAGGGCTCGTGCCCCACCCCCAACAGCATCTACGTCTGGACCGACG
TCGCCCAGCGCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCCGGCCTCGCCCCCCAGTGC
GGCCT CACCAT CCACCACCAGCAG AACCT CG AG AAGGCCG ACCCCCT CTTCCACCCCGT
CAAGGCCGGCATCTGCAGCATGGACAAGACCCAGGTCCAGCAGGCCGTCGAGAAGGAG
GCCCAG ACCCCCAT CG ACAACCT CAACCAGCACT ACAT CCCCAGCCT CGCCCT CAT G AAC
ACCACCCT CAACTT CAGCAAG AGCCCCT GGTGCCAG AAGCACAGCGCCG ACAAG AGCT G
CGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAAGCTCAGCATCAAGGACAACGGCAACGAGGTCT
CCCT CG ACGGCGCT AT CGGCCT CAGCT CCACCCT CGCCG AG AT CTT CCT CCT CG AGT ACG
CCCAGGGCATGCCTCAGGCCGCCTGGGGCAACATCCACAGCGAGCAGGAGTGGGCCCT
CCT CCT CAAGCT CCACAACGT CT ACTT CG ACCT CATGG AGCGCACCCCCT ACAT CGCCCG
CCACAAGGGCACCCCCCT CCT CCAGGCCAT CAGCAACGCCCT CAACCCCAACGCCACCG
AG AGCAAGCT CCCCGACAT CAGCCCCG ACAACAAG AT CCT CTT CAT CGCCGGCCACG ACA
CCAACATCGCCAACATCGCCGGCATGCTCAACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCC
G ACAACACCCCCCCT GGCGGCGCT CT CGT CTTT G AGCGCCT CGCCG ACAAGT CCGGCAA
GCAGT ACGT CAGCGT CAGCATGGT CT ACCAG ACCCT CG AGCAGCT CCGCAGCCAG ACCC
CCCTCAGCCTCAACCAGCCTGCCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAACGAC
CAGACCGCCGAGGGCTACTGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCAGAGCGT
CGAGCCCGGCTGCCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC (SEQ ID NO:13).
[0143] La máquina de PCR utilizada fue un termociclador Peltier PTC-200 (MJ Research). La ADN polimerasa utilizada en la PCR fue Herculase (Stratagene). Los cebadores utilizados para amplificar el marco abierto de lectura de la fitasa fueron el cebador SK680 (directo) 5'-CACCAT GCAGACCTT CGGT GCTTTT CT CGTTTCCTT CCTCGCCGCC AGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC -3' (SEQ ID NO:14), y el cebador SK6 5'-CCTTACTGGAGCTGGCAG -3'(SEQ ID NO:15).
[0144] El cebador directo contenía cuatro nucleótidos adicionales (secuencia - CACC) en el extremo 5’ que se requerían para la clonación en el vector pENTRY/D-TOPO (Invitrogen) y una secuencia que codificaba una secuencia señal nativa de T. reesei a una secreción directa de fitasa BP-17.
[0145] Las condiciones de la PCR para la amplificación del marco abierto de lectura de la fitasa de Buttiauxella fueron las siguientes: Etapa 1: 94 qC durante 1 min. Etapa 2: 94 qC durante 30 s. Etapa 3: 58 durante 30 s. Etapa 4: 72 qC durante 5 min. Repetir las etapas 2-4 durante 30 ciclos. Etapa 5: 4 °C durante almacenamiento. El producto de la PCR se purificó utilizando el kit de purificación de gel Qiaquick (Qiagen). El producto de la PCR purificado se clonó inicialmente en el vector pENTRY/D TOPO (Invitrogen), y se transformó en células E. coli químicamente competentes TOP 10 (Invitrogen). Un vector pENTR/D-TOPO con la secuencia correcta del marco abierto de lectura de fitasa se recombinó con el vector pTrex3g utilizando LR clonase II (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante para crear pTrex3g/BP-17 (véase la figura 1).
[0146] Se utilizó el plásmido pTrex3g/BP-17 como molde para la PCR de preparación con los cebadores SK745 5'-GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC (SEQ ID NO:16) y SK746 5'-CTGGAAACGCAACCCTGAAG (SEQ ID NO:17) y el fragmento de ADN de aproximadamente 5,8 kb (el casete de expresión de fitasa BP-17) se purificó utilizando el kit de purificación de PCR de Qiagen.
[0147] Con más detalle, este producto de la PCR contiene los siguientes segmentos de ADN
1. La región promotora cbhl de T. reesei. Esta secuencia promotora empieza en una posición aproximadamente 1500 bp en dirección 5’ del codón de inicio cbhl y termina 16 bp en dirección 5’ del codón de inicio cbhl.
2. La secuencia atcacaagtttgtacaaaaaagcaggctccgcggccgcccccttcacc (SEQ ID NO:18) se encuentra entre el promotor cbhl y la secuencia señal /secuencia codificante de BP-17. La sección de esta secuencia mostrada en negrita es el sitio de recombinación del fago lambda attBI de 25 bp (attBI).
3. La región codificante sintética que codifica la variante de fitasa de Buttiauxella madura (1242 bp), se fusionó directamente con el extremo de la secuencia señal (60 bp).
4. La secuencia ggaagggtgggcgcgccgacccagctttcttgtacaaagtggtgatcgcgcc (SEQ ID NO:19) se encuentra entre el extremo 3’ de la secuencia codificante de BP-17 y la región de terminación de cbhl. La sección de esta secuencia mostrada en negrita es el sitio de recombinación del fago lambda attB de 25 bp (attB2).
5. La región de terminación de cbhl de T. reesei nativa (356 bp) sigue inmediatamente a la región codificante de la fitasa.
6. Un fragmento de 2,75 kb de ADN genómico de Aspergillus nidulans que incluye el promotor, la región codificante y el terminador del gen amdS (acetamidasa). Este fragmento empieza en un sitio SspI de origen natural y termina inmediatamente antes de un sitio XbaI de origen natural.
Transformación de una cepa de T. reesei con casetes de expresión de fitasa BP-17
[0148] En WO05/001036 se describe una cepa con deleción cuádruple de T. reesei (Acbh1, Acbh2, Aeg/1, Aeg/2). La cepa se transformó con el casete de expresión de la fitasa BP-17 utilizando el método de transformación descrito por Penttila et al. (Penttila M., Nevalainen, H., Ratto, M., Salminen, E. y Knowles, J. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus T richoderma reesei. Gene 61: 155-164).
[0149] Los transformantes se seleccionaron en un medio selectivo que contenía acetamida como única fuente de nitrógeno (218 g/l de sorbitol,; 0,6 g/l de acetamida; 1,68 g/l de cloruro de cesio; 20 g/l de glucosa; 15 g/l de fosfato dihidrógeno de potasio; 0,6 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado; 0,6 g/l de cloruro de calcio deshidratado; 5 mg/l de sulfato de hierro (II); 1,4 mg/l de sulfato de zinc; 1 mg/l de cloruro de cobalto (II); 1,6 mg/l de sulfato de manganeso (II); 20 g/l de agar; pH 4,25). Aparecieron colonias transformadas en aproximadamente 1 semana. Los transformantes individuales se transfirieron a placas selectivas de acetamida nuevas y se dejaron crecer durante 2-4 días.
[0150] Se utilizaron cepas aisladas que mostraban un crecimiento estable en un medio selectivo para inocular 50 ml de medio definido de lactosa 5 g/l de (NH4)2SO4 ; 33 g/l de tampón PIPPS; 9 g/l de casaminoácidos Bacto; 4,5 g/l de KH2 PO4 ; 1,32 g/l de CaCl2*2H2O; 1 g/l de MgSO4*7H2O; 5 ml/l de Mazu DF204; 2,5 ml/l de oligoelementos 400X; pH 5,5; 16 g/l de lactosa (esterilizada por separado). Solución de oligoelementos 400X: 175 g/l de ácido cítrico (anhidro); 200 g/l de FeSO4*7H2O; 16 g/l de ZnSo4*7H2O; 3,2 g/l de CuSO4*5H2O; 1,4 g/l de MnSO4*4H2O; 0,8 g/l de H3BO3 en matraces de agitación de 250 ml. Los matraces se agitaron durante 4-5 días a 28 0C.
[0151] El medio de cultivo se separó por filtración y se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Se observó una banda de proteínas nueva con aproximadamente la mobilidad esperada para la fitasa BP-17 basada en la secuencia de aminoácidos. Se identificó un transformante que produjo una gran cantidad de fitasa. En los estudios posteriores se utilizó una fitasa producida por este transformante en biorreactores de 14 L utilizando los métodos descritos en W02004/035070.
Ejemplo 2 Expresión de fitasa BP-17 de Buttiauxella en células huésped de T. reesei con una deleción del gen de endoglucosaminidasa
Construcción de un casete de alteración para el gen de endoglucosaminidasa de T. reesei.
[0152] El gen de endoglucosaminidasa de Trichoderma reesei codifica una enzima secretada que escinde los glicanos enlazados a N de las glicoproteínas. Se identificó en la secuencia genómica de T. reesei (http://genome.jgipsf.org/Trire2/Trire2.home.html) utilizando información proporcionada en WO 2006/050584. Se amplificó su región flanqueante 5' (1,9 Kb) mediante PCR utilizando los cebadores SK915 (5'-CTGATATCCTGGCATGGTGAATCTCCGTG-3') (SEQ ID NO:20) y SK916 (5'-CATGGCGCGCCGAGGCAGATAGGCGGACGAAG-3') (SEQ ID NO:21). Se amplificó la región flanqueante 3' (1,7 Kb) mediante PCR utilizando los cebadores SK917 (5'-CATGGCGCGCCGTGTAAGTGCGTGGCTGCAG-3') (SEQ ID NO:22) y SK918 (5'-CTGATATCGATCGAGTCGAACTGTCGCTTC-3') (SEQ ID NO:23). Se utilizó Pfull Ultra (Stratagene) como polimerasa en todas las reacciones PCR.
[0153] Los productos de la reacción PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) siguiendo el protocolo indicado en el manual. Ambos fragmentos de ADN amplificados se digirieron con endonucleasa de restricción AscI, seguido de la purificación del ADN digerido utilizando un kit QIAquick. Los dos fragmentos de ADN se mezclaron y se utilizaron como molde para una reacción PCR de fusión con los cebadores SK915 y SK918. El producto de esta reacción, un fragmento de ADN de 3,6 kb, se clonó en un vector pCR-Blunt II TOPO utilizando el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen). La estructura del plásmido resultante (pCR-Bluntll-TOPO(flanco 5'-3')) se confirmó mediante análisis de restricción.
[0154] Una forma mutante del gen de la acetolactato sintasa (ALS) de T. reesei que confería resistencia al clorimurón etilo (WO 2008/039370) se amplificó utilizando los cebadores de PCR SK949 (5'-GTTTCGCATGGCGCGCCTGAGACAATGG-3') (SEQ ID NO:24) y SK946 (5'-CACAGGCGCGCCGATCGCCATCCCGTCGCGTC-3') (SEQ ID NO:25) y el vector de pTrex-Glucoamilasa (WO 2008/039370, Ejemplo 2) como molde. El producto de la reacción PCR se purificó con el kit QIAuick, se digirió con AscI, se purificó de nuevo y se ligó con pCR-Bluntll-TOPO (flanco 5'-3') digerido con la misma enzima y purificado de manera similar. La orientación del inserto en el plásmido resultante pCR-Bluntll-TOPO(flanco 5'-marcador ALS-flanco 3') se estableció mediante análisis de restricción.
[0155] Un fragmento adicional de la secuencia cromosómica de T. reesei (denominada «repetición 3'») se amplificó utilizando las mismas técnicas y cebadores MC40 (5'-CTATGACATGCCCTGAGGCGATGCTGGCCAGGTACGAGCTG-3') (SEQ ID NO:26) y
MC41 (5’-CAGCCTCGCGGTCACAGTGAGAGGAACGGGGT
GAAGTCGTATAAG-3’) (SEQ ID NO:27).
[0156] Esta secuencia está colocada en el cromosoma de T. reesei más alejado en dirección 3' de la zona del flanco 3’ que está contenida dentro del pCR-Bluntll-TOPO (flanco 5'-3’). El producto de 0,46 kb de esta PCR (repetición 3') se clonó en dirección 5’ del gen de ALS en el pCR-Bluntll-TOPO(flanco 5'-marcador ALS-flanco 3') utilizando el kit de clonación de PCR In-Fusion Dry-Down (Clontech). El pCR-Bluntll-TOPO(flanco 5'-marcador ALS-flanco 3') se digirió con Pas I y BstEII para utilizarse como vector para clonación en la repetición 3'. El constructo resultante pCR-Bluntll-TOPO(flanco 5'-marcador ALS-repetición 3'-flanco 3') se utilizó como molde para una PCR con los cebadores SK1008
(CTAGCGATCGCGTGTGCACATAGGTGAGTTCTCC) (SEQ ID NO:28) y
SK1009:(CTAGCGATCGCGCAGACTGGCATGCCTCAATC
AC) (SEQ ID NO:29).
[0157] El producto de ADN de 7,5 kb se clonó en el vector pCR-Bluntll-TOPO utilizando el kit correspondiente de Invitrogen. El plásmido resultante se digirió con AsiSI y un fragmento de ADN de 7,5 kb (el casete de deleción de endoglucosaminidasa) se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa de preparación.
Alteración del gen de endoglucosaminidasa en T. reesei.
[0158] En WO05/001036 se describe una cepa con deleción cuádruple de T. reesei (Acbh1, Acbh2, Aegl1, Aegl2). Esta cepa se transformó con el casete de deleción enumerado como SEQ ID NO:30 utilizando el método de transformación descrito por Penttila et al. (Penttila M., Nevalainen, H., Ratto, M., Salminen, E. y Knowles, J. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61: 155-164). Los transformantes se seleccionaron en un medio de Vogel modificado que contenía 200 ppm de clorimurón etilo (WO 2008/039370). Los transformantes se cultivaron en un medio líquido y se analizaron los sobrenadantes de cultivo mediante electroforesis en gel SDS.
[0159] Se identificaron dos clones (#11 y #74) que mostraban un desplazamiento hacia arriba en la movilidad de la mayoría de las bandas de proteínas en el gel. Se aisló el ADN cromosómico de estas dos cepas, así como las cepas con deleción cuádruple parentales de T. reesei. Se realizaron análisis de PCR en estas preparaciones de ADN utilizando pares de cebadores MC 42 más MC 48 (5'-CTCGCCATCTGACAACCTACAAATC-3' (SEQ ID NO:30) y 5'-CTAGTACCCTGAGTTGTCTCGCCTCC-3') (SEQ ID NO:31) y MC 45 más MC 50 (5'-CCTCTACCATAACAGGATCCATCTG-3' (SEQ ID NO:32) y 5'-CGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGG-3') (SEQ ID NO:33).
[0160] Se obtuvieron productos del tamaño esperado (2,9 y 2,3 kb) con ADN aislado del clon # 74. Este clon se sometió a dos rondas de purificación sucesivas (mediante aislamiento de la progenie de una única espora). Se aisló el ADN del transformante purificado #74. Se repitieron los análisis de PCR confirmando una deleción satisfactoria del gen de endoglucosaminidasa.
Transformación de la cepa con endoglucosaminidasa delecionada de T. reesei con casete de expresión de fitasa BP-17
[0161] Esporas recién recolectadas de la cepa con la endoglucosaminidasa delecionada de T. reesei se suspendieron en sorbitol helado 1,2 M, se lavaron dos veces con la misma solución y se sometieron a electroporación con el casete de expresión de la fitasa BP-17. Los parámetros de electroporación fueron los siguientes: tensión: -16 kV/cm; capacitancia: -25 pF; resistencia: -50 Q. Después de la electroporación, las esporas se colocaron en placas en un medio selectivo que contenía acetamida como única fuente de nitrógeno (0,6 g/l de acetamida; 1,68 g/l de cloruro de cesio; 20 g/l de glucosa; 15 g/l de fosfato dihidrógeno de potasio; 0,6 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado; 0,6 g/l de cloruro de calcio deshidratado; 5 mg/l de sulfato de hierro (II); 1,4 mg/l de sulfato de zinc; 1 mg/l de cloruro de cobalto (II); 1,6 mg/l de sulfato de manganeso (II); 20 g/l de agar; pH 4,25). Aparecieron colonias transformadas en aproximadamente 1 semana. Los transformantes individuales se transfirieron a placas selectivas de acetamida nuevas y se dejaron crecer durante 2-4 días.
[0162] Se utilizaron cepas aisladas que mostraban un crecimiento estable en un medio selectivo para inocular 0,17 ml de medio definido de lactosa 5 g/l de (NH4)2SO4 ; 33 g/l de tampón PIPPS; 9 g/l de casaminoácidos Bacto; 4,5 g/l de KH2PO4 ; 1,32 g/l de CaCl2*2H2O; 1 g/l de MgSO4*7H2O; 5 ml/l de Mazu DF204; 2,5 ml/l de oligoelementos 400X; pH 5,5; 16 g/l de lactosa (esterilizada por separado). Solución de oligoelementos 400X: 175 g/l de ácido cítrico (anhidro); 200 g/l de FeSO4*7H2O; 16 g/l de ZnSO4*7H2O; 3,2 g/l de CuSO4*5H2O; 1,4 g/l de MnSO4*4H2O; 0,8 g/l de H3BO3) en pocillos
de placas de microtitulación provistas de microfiltros en el fondo de los pocilios (Millipore MultiScreen -GV™). Las placas se incubaron durante 4-5 días a 25 qC-28 °C en una atmósfera de oxígeno puro.
[0163] El medio de cultivo se separó por filtración y se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Se observó una nueva banda de proteínas con una mobilidad esperada para una proteína ligeramente mayor que la predicha por la secuencia de aminoácidos de BP-17. Se supuso que el mayor peso molecular observado se debía a la glicosilación. Se identificó un transformante que produjo una gran cantidad de fitasa. En los estudios posteriores se utilizó una fitasa producida por este transformante en biorreactores de 14 L utilizando los métodos descritos en WO2004/035070.
Ejemplo 3 - Generación de mutantes de glicosilación de fitasa BP-17
[0164] La secuencia de aminoácidos de la fitasa BP-17 contiene tres sitios potenciales de glicosilación enlazados a N según el análisis realizado por el algoritmo de predicción NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/). Estos sitios de glicosilación son los residuos N169, N173 y N285 de la secuencia de fitasa BP-17 madura de la SEQ ID NO:1 (con referencia a la numeración de la posición de la SEQ ID NO:1).
[0165] Se introdujeron mutaciones en el ADN de la región codificadora de la fitasa BP-17 utilizando un método de mutagénesis de sitio dirigido. El plásmido pENTRY/D TOPO que contenía la secuencia señal y el marco abierto de lectura de la fitasa BP-17, según se describe en el ejemplo 1, se utilizó como molde para la PCR utilizando cebadores diseñados para introducir cambios en la secuencia de ADN de la BP-17. Las mutaciones pretendían introducir nuevos sitios de glicosilación en la superficie de la molécula de BP-17. Por lo tanto, cada variante de BP-17 presenta cambios en la secuencia de aminoácidos que introducen un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser/Thr conocido por ser reconocido como un sitio de glicosilación enlazado a N. Se produjeron siete variantes diferentes de BP-17. La siguiente tabla enumera los cambios aminoacídicos y los oligonucleótidos que se utilizaron para la mutagénesis de sitio dirigido. La numeración de aminoácidos se basa en la secuencia BP-17 madura (SEQ ID nO:1 )
[0166] Las condiciones de la PCR para la mutagénesis de sitio dirigido fueron las siguientes. La mezcla de PCR contenía 37 ul de H2O, 5 ul de tampón de reacción Pfuüitra II 10X, 2 ul de 10mM mezcla de dNTP, 1 ul (9 ng) de pENTR/D TOPO BP-17, 2 ul de 10 uM oligonucleótido 1, 2 ul de 10 uM oligonucleótido 2, 1 ul (2,5 unidades) de AdN polimerasa Pfuüitra II Fusion HS (Stratagene). Las condiciones de PCR fueron 30 segundos a 95 0C; seguido de 18 ciclos de 30 segundos a 95 0C, 1 minuto a 55 0C, 8 minutos a 68 0C. Después de la PCR se añadió 1 ul de endonucleasa de restricción DpnI y se incubó durante 1 hora a 37 0C. El producto de la PCR se purificó utilizando una columna de purificación de PCR Qiagen según las indicaciones del fabricante. Finalmente, se trasformaron células E. coli(E. Coliquímicamente competente One Shot TOP10, Invitrogen) con el producto de la PCR.
[0167] Después de la mutagénesis de sitio dirigido, clones individuales de pENTR/D TOPO con las variantes de BP-17 diferentes se sometieron a un análisis de secuencia de ADN para confirmar que se habían conseguido las mutaciones esperadas. Cada vector pENTR/D-TOPO con la secuencia verificada de un marco abierto de lectura de variante de fitasa BP-17 se recombinó con el vector pTrex3g utilizando LR clonasa II (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante para crear pTrex3g/BP-17E121T, pTrex3g/BP-17P394N, pTrex3g/BP-17D386N, pTrex3g/BP-17K202N N204T, pTrex3g/BP-17Q151N P153S, pTrex3g/BP-17P373T y pTrex3g/BP-17Q76N.
[0168] Las secuencias de aminoácidos de las siete variantes de BP-17 maduras diferentes se dan a conocer como SEQ ID NO:5 (E121T), SEQ ID NO:6 (P394N), SEQ ID NO:7 (D386N). SEQ ID NO:8 (K202N y N204T), SEQ ID NO:9 (Q151N y P153S), SEQ ID NO:10 (P373T) y SEQ ID NO:11 (Q76N). En cada caso, los cambios aminoacídicos relativos a la BP-17 se muestran entre paréntesis, con referencia a la numeración de la posición de la SEQ ID NO:1.
[0169] Los diferentes vectores de expresión de la variante BP-17 resultantes se insertaron en la cepa con la endoglucosaminidasa delecionada (cepa ETD) de T. reesei utilizando el sistema de suministro de partículas Biolistic PDS-1000/He de Bio-Rad (Hercules, CA). El protocolo de transformación utilizado fue tal cual lo describe Foreman (WO 2005/001036). El medio selectivo utilizado para aislar los transformantes contenía acetamida como única fuente de nitrógeno (0,6 g/l de acetamida; 1,68 g/l de cloruro de cesio; 20 g/l de glucosa; 15 g/l de fosfato dihidrógeno de potasio; 0,6 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado; 0,6 g/l de cloruro de calcio deshidratado; 5 mg/l de sulfato de hierro (II); 1,4 mg/l de sulfato de zinc; 1 mg/l de cloruro de cobalto (II); 1,6 mg/l de sulfato de manganeso (II); 20 g/l de agar; pH 4,25). Aparecieron colonias transformadas en aproximadamente 5 días. Los transformantes individuales se transfirieron a placas selectivas de acetamida nuevas y se dejaron crecer durante 2-4 días.
[0170] Se utilizaron cepas aisladas que mostraban un crecimiento estable en un medio selectivo para inocular 0,17 ml de medio definido de lactosa 5 g/l de (NH4)2SO4; 33 g/l de tampón PIPPS; 9 g/l de casaminoácidos Bacto; 4,5 g/l de KH2PO4; 1,32 g/l de CaCl2*2H2O; 1 g/l de MgSO4*7H2O; 5 ml/l de Mazu DF204; 2,5 ml/l de oligoelementos 400X; pH 5,5; 16 g/l de lactosa (esterilizada por separado). Solución de oligoelementos 400X: 175 g/l de ácido cítrico (anhidro); 200 g/l de FeSO4*7H2O; 16 g/l de ZnSO4*7H2O; 3,2 g/l de CuSO4*5H2O; 1,4 g/l de MnSO4*4H2O; 0,8 g/l de H3BO3) en pocillos de placas de microtitulación provistas de microfiltros en el fondo de los pocillos (Millipore MultiScreen -GV™). Las placas se incubaron durante 4-5 días a 25 0C-28 0C en una atmósfera de oxígeno puro. El medio de cultivo se separó por filtración y se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Se observó una nueva banda de proteínas con una mobilidad esperada para una proteína ligeramente mayor que la prevista por la secuencia de aminoácidos de BP-17. Se supuso que el mayor peso molecular observado se debía a la glicosilación.
[0171] Se seleccionó un transformante con cada variante BP-17 diferente que produjo una elevada cantidad de fitasa. El sobrenadante de cada uno de estos transformantes de la variante BP-17 se comparó con el sobrenadante que contenía fitasa BP17-ETD, producido en la cepa ETD, por SDS-PAGE (Figura 2). A juzgar por la movilidad de la banda de fitasas en SDS-PAGE, las diferentes variantes de BP-17 tenían todas un contenido de glicano aumentado en relación con BP17-ETD, pero en diferentes grados. Se escogieron dos de las variantes BP-17 (D386N y K202N N204T) que mostraron el mayor aumento de peso molecular aparente en SDS-PAGE en relación con BP17-ETD. En los estudios posteriores se utilizó una fitasa producida por estos transformantes en biorreactores de 14 L utilizando los métodos descritos en WO2004/035070.
[0172] También se realizaron reacciones de mutagénesis de sitio dirigido para crear variantes BP-17 codificantes de ADN que tuvieran dos sitios de glicosilación enlazados a N adicionales. El plásmido pENTR/D TOPO con la variante de BP-17 D386N se utilizó como molde en las reacciones de mutagénesis de sitio dirigido con los pares de cebadores E121T y E121T-r, o K202NN204T y K202NN204T-r, o BP17R76N y BP17R76N-r utilizando las condiciones descritas anteriormente. De esta manera, las variantes de BP-17 D386N E121T, D386N K202N N204T, y D386N Q76N se sintetizaron y se insertaron en el vector de expresión pTrex3g.
[0173] El plásmido pENTR/D TOPO con la variante de BP-17 Q76N se utilizó como molde en las reacciones de mutagénesis de sitio dirigido con el par de cebadores K202NN204T y K202NN204T-r utilizando las condiciones descritas anteriormente. De esta manera, la variante de BP-17 Q76N K202N N204T se sintetizó y se insertó en el vector de expresión pTrex3g.
[0174] Los diferentes vectores de expresión de la variante BP-17 resultantes se insertaron en la cepa ETD de T. reesei utilizando el sistema de suministro de partículas Biolistic PDS-1000/He como se ha descrito anteriormente. Se
identificaron los transformantes de T. reesei que produjeron variantes de BP-17 D386N E121T, D386N K202N N204T, D386N Q76N y Q76N K202N N204T en cultivo líquido. Estas variantes presentaban cada una dos sitios de glicosilación enlazados a N adicionales en comparación con la BP-17.
[0175] Utilizando técnicas similares, se pueden crear variantes de BP-17 con tres o más sitios de glicosilación enlazados a N adicionales en comparación con la BP-17.
Ejemplo 4. Grado de glicosilación determinado por espectometría de masas
[0176] Se llevó a cabo un estudio de espectometría de masas para caracterizar de forma adicional la glicosilación encontrada en la fitasa BP-17 (SEQ ID NO:1) producida en T. reesei (BP17-nativa) en comparación con la BP-17 producida en T. reesei con la deleción del gen de endoglucosaminidasa (BP17-ETD). De forma adicional, se caracterizaron las variantes de fitasa BP-17 D386N (SEQ ID NO:7) y K202N N204T (SEQ iD NO:8), ambas producidas en la cepa ETD.
Reacción de desglicosilación (Endo H) enlazada a N de proteínas
[0177] La N-desglicosilación de todas las muestras de BP-17 se llevó a cabo enzimáticamente utilizando Endoglicosidasa H (Endo-H, Endo-p-N-acetilglucosaminidasa H) en acetato de sodio 50 mM, pH 5,5. Se añadieron 2,0 mg/mL de Endo-H a la solución de fitasa con una proporción de proteínas de 1/100 (p/p). La reacción de desglicosilación se llevó a cabo a 37 °C durante 2-3 horas. Las muestras de proteínas sometidas a reacción se sometieron a una etapa de limpieza ZipTip® (columma de fase inversa Micro C4) (Millipore, Bedford, MA) antes de un análisis MALDI-TOF/Ms según un protocolo estándar sugerido por el vendedor (www.millipore.com). La digestión con endoH elimina la cadena de glicano enlazado a N excepto una única N-acetilglucosamina (203 Da) que permanece unida al residuo de asparagina de la proteína en el sitio de glicosilación.
Análisis MALDI-TOF/MS para la determinación del peso molecular de proteínas intactas
[0178] Se prepararon muestras de proteínas desalinizadas para el análisis MALDI-TOF/MS mediante la cocristalización de un volumen igual (1 pL) de muestra con matriz de ácido sinapínico (saturado en acetonitrilo al 50 %, ácido fórmico al 0,1 %) utilizando el método de gota seca. Se obtuvieron espectros de masas de proteínas mediante la utilización de un espectrómetro de masas Voyager DE-STR MALDI-TOF (Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.). La configuración instrumental MS para el rango 20000-80000 m/z era un modo de funcionamiento lineal, modo de extracción retrasado, polaridad positiva, tensión de aceleración de 25 kV, tensión de rejilla de un 93 % y tiempo de demora de extracción de 750 nanosegundos. Se utilizaron 300 disparos láser/espectro y BSA como calibrador externo.
[0179] Utilizando el análisis MALDI-TOF/MS se realizó una comparación entre BP17-nativa, BP17-ETD y las variantes BP-17 producidas en la cepa ETD antes y después de la digestión con endoH. En cada muestra había una población de proteínas fitasa que variaba en masa debido a la heterogeneidad de la glicosilación. Sin embargo, se podría identificar una especie importante para cada muestra, lo que indica las posibles diferencias en la masa total de glicano enlazado a N entre las muestras. La fitasa (BP-17) producida en T. reesei con y sin deleción de gen de endoglucosaminidasa se glicosilan ambas, pero el grado de glicosilación es diferente. (Tabla 1). La molécula BP17-ETD principal mostró un aumento de aproximadamente 900 Da en masa en comparación con la BP17-nativa (47254 Da en comparación con 48127 Da) supuestamente debido al aumento de masa de los glicanos enlazados a N unidos. El grado de glicosilación era incluso mayor para las variantes de BP-17 producidas en la cepa con la endoglucosaminidasa delecionada, siendo la masa total de las enzimas de aproximadamente 50000 Da.
Análisis (columna de difenilo) de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC/MS) para la determinación precisa del peso molecular de proteínas (BP-17)
[0180] Todos los datos de espectometría de masas (MS) se adquirieron utilizando un sistema de cromatografía líquida (LC) Surveyor™ acoplado a un sistema de espectometría de masas LCQ Advantage (ThermoFinnigan, San José, CA). Se utilizó una columna de difenilo Vydac (2,1 X 150 mm) para todas las muestras de BP-17 utilizando el gradiente de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de Solvente B del 0 % al 70 % durante 40 minutos a una velocidad de flujo de 200 pL/min. Solvente A: TFA al 0,1 % en agua y Solvente B: TFA al 0,08 % en acetonitrilo. Se realizó un procesamiento de datos utilizando el programa de software Xcalibur (ThermoFinnigan, San José, CA) y el programa MagTran para la deconvolución de masa intacta de proteínas.
[0181] Se utilizó la LC/MS para obtener una masa más precisa de la proteína fitasa depués de la digestión con endoH para eliminar la glicosilación. Con el tratamiento de Endo-H, tanto la muestra de BP17-nativa como la de BP17-ETD mostraron dos especies de fitasa con una masa molar de 45815 Da y 46020 Da equivalentes a la secuencia de aminoácidos de BP-17 (peso molecular teórico de 45410,8) con 2 y 3 N-acetilglucosaminas (GlcNAc) unidas. Esto respalda la hipótesis de que incialmente algunas moléculas de fitasa tenían glicanos enlazados a N unidos a dos posiciones en la superficie y algunas moléculas tenían glicanos enlazados a N unidos a tres posiciones en la superficie.
[0182] Las dos variantes de BP-17 (D386N y K202N N204T), después de la digestión con endoH, mostraron masas molares equivalentes a la secuencia de aminoácidos de BP-17 con 3 y 4 N-acetilglucosaminas (GlcNAc) unidas. Como se ha indicado anteriormente, después del tratamiento con endoH, la BP-17 mostró masas molares equivalentes a la secuencia de aminoácidos de BP-17 con 2 y 3 residuos de GlcNAc unidos. Por lo tanto, se confirmó que las dos moléculas de variantes de BP-17 tenían cada una un glicano enlazado a N adicional unido a la superficie en comparación con la BP-17-nativa y la BP17-ETD.
[0183] La tabla 1 resume la distribución y los pesos moleculares identificados de diversas especies encontradas en cada muestra utilizando las técnicas de MALDI-TOF/MS y LC/MS.
Tabla 1: Análisis de MS de diversas muestras de BP-17 y BP-17 ETD con y sin el tratamiento con Endo-H
Ejemplo 5 - Enzimología
[0184] Se utilizó el siguiente procedimiento para purificar fitasa BP17-nativa y fitasa BP17-ETD. Se aplicó sobrenadante de fermentación concentrado (50 ml) a una columna de cromatografía de desalación de 600 mL (GE Healthcare PN 17 0034-02, G-25 medios gruesos) equilibrada con acetato de sodio 25 mM, tampón de pH 5,0. La muestra desalada (150 mL) se diluyó 10 veces hasta 1500 mL con agua ultrapura y se cargó en una columna de cromatografía de intercambio catiónico de 90 ml (GE Healthcare PN 17-1087-01, SP Sepharose HP). Después del lavado con acetato de sodio 25 mM, tampón de pH 5,0, se eluyó la fitasa utilizando un gradiente del tampón base hasta cloruro de sodio 200 mM en acetato de sodio 25 mM, tampón de pH 5,0. La fitasa se eluyó a una concentración de cloruro de sodio de 150-175 mM. Las fracciones de fitasa se agruparon, se concentraron y se intercambió el tampón con acetato de sodio 50 mM, tampón de pH 5,5 (utilizando la columna de desalación como antes), y se determinó la concentración y la pureza. Se encontró que las muestras de fitasa tenían una pureza >95 % utilizando este procedimiento.
[0185] Se determinó la actividad de la fitasa en placas de microtitulación (MTP) de 96 pocillos utilizando ensayos enzimáticos, como sigue.
[0186] A menos que se indique lo contrario, todas las muestras de fitasa se diluyeron hasta 0,153 mg/mL en un tampón de acetato de sodio (NaOAc) que contenía NaOAc 0,25 M (pH 5,5), CaCI2 1,3 mM y Tween 20 al 0,01 %. Cuando se observó, la conductividad se equilibró a 12 mS/cm utilizando NaCl 2M y se reequilibró el pH. Se determinó la actividad de las muestras de fitasa en placas MTP de 96 pocillos mediante un ensayo pNPP (para-nitrofenilfosfato, Sigma Chemical) enzimático. El pNPP se realizó a 60 mM en tampón de NaOAc (pH 5,5). En caso necesario, las muestras se centrifugaron a 2500 rpm durante 2 minutos para eliminar cualquier precipitado. Se añadieron 15 uL de muestra de fitasa a las MTP de 96 pocillos utilizando seguido de 181 uL de pNPP 60 mM (equilibrado a 30 0C). Las placas MTP se leyeron cinéticamente utilizando un espectrofotómetro (Spectromax) preconfigurado a 30 0C a una absorbancia de 430 nm.
Ensayo de reversibilidad de inactividad.
[0187] Se añadieron muestras de 100 pL de 0,153 mg/mL de fitasa a los tubos PCR. A continuación, las muestras se trataron térmicamente a diversas temperaturas de incubación hasta 95 0C utilizando un termociclador de PCR. Las
muestras se recogieron después de 10 minutos y se enfriaron y se mantuvieron en hielo hasta el momento del ensayo. Después de haber recogido todas las muestras, se evaluó la actividad restante mediante ensayos de pNPP a 30 0C.
[0188] En estudios de estabilidad con la fitasa BP-17 se observó que a temperaturas por encima de aproximadamente 70 °C la actividad restante de algunas de las muestras de fitasas mejoró sorprendentemente al aumentar la temperatura (Figura 3). Esta actividad mejorada después del tratamiento a temperaturas más elevadas (véase especialmente 90 °C y 95 °C) era más pronunciada para la fitasa BP17-ETD que para la BP17 nativa. La deleción del gen de endoglucosaminidasa condujo a una actividad sustancialmente mejorada de la fitasa BP17-ETD. Esto respalda la hipótesis de que la reversibilidad de inactividad puede correlacionarse con el grado de glicosilación, y la glicosilación puede estar relacionada con el huésped de expresión.
Temperatura de fusión aparente (Tm app )
[0189] Se calcularon los valores de temperatura de fusión aparente (Tm app ) para la BP17-nativa y la BP17-ETD a pH 4,0 y pH 5,5 a partir de estudios de estabilidad (estudio de pH 4,0 mostrado en la figura 3) y se muestran en la tabla 2. El huésped de expresión no afectó significativamente a la Tmapp, como se muestra mediante la observación de que la BP17-nativa o la BP17-ETD producidas en la cepa ETD tenían la misma Tmapp.
Tabla 2: Valores de temperatura de fusión aparente (Tm app ) para BP17 a pH 4,0 y pH 5,5. (Porcentaje de actividad restante a 95 °C entre paréntesis)
Tm °C / reversibilidad [Actividad restante]
Muestra (cepa huésped)
pH 4,0 pH 5,5
BP17-nativa ~63 [~ 6 %] 70
BP17-ETD ~63 [~19%] 70
Índice de reversibilidad de inactividad de las fitasas
[0190] Para caracterizar el ritmo de los cambios en la actividad de la fitasa, se llevaron a cabo estudios de estabilidad y se midió la actividad restante de las muestras como función del tiempo después de la retirada del calor.
[0191] La figura 4 muestra el porcentaje de actividad restante de la BP17-nativa y la BP17-ETD como función del tiempo después del tratamiento a 95 0C durante 10 minutos, y retirada a temperatura ambiente para medirse en los diversos puntos de tiempo indicados durante 5 horas dejada reposar a temperatura ambiente. Estos valores son porcentajes calculados en relación con una muestra control no calentada.
[0192] La BP17-nativa no mostró ningún aumento de la actividad a temperatura ambiente. Sin embargo, la BP17-ETD mostró un aumento de actividad que alcanzó el 19 % de la actividad de la muestra no tratada, un aumento del 8,5 % en el punto de tiempo inicial inmediatamente después del tratamiento térmico.
[0193] Las muestras no ganaron actividad adicional después de 24 o 48 horas cuando se mantuvieron a 40C (datos no mostrados).
Ejemplo 6 - Ensayos de peletización y granulación de lecho fluidizado
[0194] Se incorporó fitasa en gránulos, un proceso que generalmente se entiende que proporciona cierta protección contra el posterior tratamiento a vapor. A continuación, se mezclaron estos gránulos de enzimas con pienso para animales y se hicieron pasar por un peletizador de pienso para animales que incorporaba un tratamiento a vapor. Es deseable que la enzima de fitasa retenga actividad después de este proceso de peletización.
[0195] Para determinar la estabilidad de la enzima de fitasa durante el proceso de peletización, se produjeron gránulos de enzima utilizando un proceso de pulverización de lecho fluidizado descrito en la patente estadounidense n.° 5324649. Se cargaron semillas de sulfato sódico (también denominadas el núcleo) en una cámara de lecho fluidizado. La solución de «pulverización 1» se preparó disolviendo o dispersando sacarosa y almidón de maíz en un concentrado de fitasa ultrafiltrado (UFC). Se añadió agua adicional a esta mezcla para mantener la concentración total de sólidos alrededor del 40 %. Se requirió una agitación constante para mantener el almidón de maíz y el aceite de parafina o el antiespumante bien dispersado en el UFC enzimático.
[0196] La pulverización 1 se aplicó al núcleo de sulfato sódico ya cargado en el granulador de lecho fluidizado utilizando un proceso de pulverización superior. La temperatura, la velocidad de pulverización, la presión del aire de atomización y otros parámetros se ajustaron para obtener un buen rendimiento del recubrimiento de pulverización 1 sobre el núcleo sin aglomerar las partículas.
[0197] Se prepararon pulverizaciones posteriores (pulverización 2, pulverización 3, etc.) disolviendo y/o dispersando todos los componentes de esta solución de pulverización en agua para formar una solución con un contenido de sólidos de aproximadamente del 18 % al 40 %. Las pulverizaciones que contenían aceite no soluble en agua, antiespumante o almidón de maíz requirieron agitación continua para mantener estos materiales bien dispersados.
[0198] Se recogieron gránulos después de la pulverización final y se determinó la actividad de fitasa utilizando un ensayo de fitasa.
[0199] Después, los gránulos multicapa se combinaron con una mezcla de harina de maíz al 60 % y harina de soja al 40 % (es decir, la masa) a una proporción de 60 gramos de gránulos hasta 120 kilogramos de harina de maíz-soja de manera que la actividad final de la fitasa en la mezcla antes de la peletización fue de aproximadamente 5 unidades/gramo.
[0200] Esta mezcla se peletizó después en un peletizador de pienso para animales. Los gránulos y la harina de maízsoja se mezclaron en una mezcladora de cinta horizontal, durante aproximadamente 15 minutos. La prensa de pellets era una Simon Heesen, de tipo monorrodillo, equipada con una matriz de 17,3 cm de diámetro interior, con un diámetro de orificio de pellet de 3 mm. La velocidad de la matriz era de 500 rpm y se accionó mediante un motor de 7,5 kW. La velocidad normal de alimentación era de 300 kg por hora. La temperatura en el acondicionador se mantuvo a /-0,1 grados Celsius, medida a la salida del pienso del acondicionador. El acondicionador tenía un sistema de mezclado de tipo cascada. Se utilizaron dos temperaturas de acondicionamiento: 90 0C y 95 0C. La presión de entrada del vapor era de 2 atm, y la temperatura en el acondicionador se controló mediante el ajuste manual de tres válvulas que regulaban el suministro de vapor. El tiempo de permanencia en el acondicionador fue de aproximadamente 30 segundos. Cuando se alcanzó la temperatura objetivo, el sistema se llevó a cabo durante aproximadamente 5 a 10 minutos antes de que tuviera lugar el muestreo. Se tomaron muestras durante periodos de 1-1,5 minutos, correspondientes a 5-7,5 kg de pienso peletizado, y se colocaron inmediatamente en un recipiente de refrigeración con un fondo perforado y un flujo de aire de 1500 metros cúbicos por hora. Después de refrigerarse durante 15 minutos, se redujo el tamaño de las muestras dos veces utilizando un divisor de muestras, y se tomó 1 kg para pruebas de laboratorio.
[0201] Después de la peletización y la refrigeración, los pellets se trituraron y se analizaron para determinar la actividad de la fitasa. La mezcla no peletizada de harina de maíz-soja y gránulos de fitasa se denomina el control de «masa» y se analizó también para determinar la actividad de la fitasa. La proporción de actividad recuperada en el gránulo enzimático peletizado a 90 0C o 95 0C con respecto a la actividad del control de masa es el porcentaje de actividad recuperada. Peletización y granulación a escala de laboratorio
[0202] La tabla 3 resume las formulaciones de los gránulos preparados y analizados en los ensayos de peletización. Se cargaron aproximadamente 720 gramos de semillas de sulfato sódico en el recubridor y se prepararon y se pulverizaron las diversas soluciones de pulverización según se ha descrito anteriormente para preparar los gránulos. La masa del lote terminado de gránulos fue de aproximadamente 2000 gramos.
Tabla 3
Tabla 4
Resultados
[0203] La actividad recuperada obtenida después de peletizar las formulaciones de la Tabla 3 a 90 0C y 95 0C se representa en la figura 5. Aquí, se puede observar que la fitasa BP17-ETD da lugar a un aumento de la actividad recuperada a 900C y 95 0C. Por otro lado, la fitasa BP17-nativa mostró una disminución considerable de actividad después de la peletización. (La pequeña diferencia en los niveles de almidón o sólidos enzimáticos en las formulaciones de la tabla 3 tendrían muy poco impacto en el rendimiento de la peletización de estas formulaciones).
[0204] La actividad recuperada obtenida después de peletizar las formulaciones de la Tabla 4 a 90 0C y 95 0C se representa en la figura 6. Aquí, se puede observar que el efecto de la glicosilación adicional debido a la creación de sitios de glicosilación adicionales en la proteína BP17 es de nuevo un aumento en la actividad recuperada tanto a 90 0C como a 95 0C. (Las pequeñas diferencias en los niveles de sólidos enzimáticos en las formulaciones de la tabla 4 tendrían muy poco impacto en el rendimiento de la peletización de estas formulaciones).
[0205] Aunque las composiciones y métodos anteriores se han descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplos con fines de claridad de comprensión, los expertos en la materia podrán observar que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones. Por consiguiente, la descripción no debe interpretarse como limitativa en cuanto al alcance de la presente información dada a conocer, que se encuentra delimitado por las reivindicaciones adjuntas.
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1. Polipéptido de fitasa que presenta al menos 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido de fitasa se produce en un huésped de hongo filamentoso de deglicosilación deficiente.
2. Polipéptido de fitasa según la reivindicación 1, que comprende al menos un sitio de glicosilación adicional en comparación con la SEQ ID NO: 1, donde el al menos un sitio de glicosilación adicional se consigue introduciendo cambios aminoacídicos para crear un motivo de sitio de glicosilación enlazado a N Asn-Xaa-Ser/Thr, donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.
3. Método de producción de un polipéptido de fitasa, comprendiendo el método la producción del polipéptido de fitasa en un huésped de hongo filamentoso de deglicosilación deficiente, donde el polipéptido de fitasa presenta al menos 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.
4. Polipéptido de fitasa de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o método de la reivindicación 3, donde el polipéptido de fitasa presenta al menos 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11, opcionalmente donde el polipéptido de fitasa presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.
5. Polipéptido de fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, o método de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, donde el polipéptido de fitasa comprende una o más de las siguientes sustituciones: E121T, P394N, D386N, K202N y N204T, Q151N y P153S, P373T, Q76N con referencia a la numeración de las posiciones de la SEQ ID NO:1.
6. Polipéptido de fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 5, o método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el polipéptido de fitasa comprende 1 o más, 2 o más, 3 o más, o 4 o más sitios de glicosilación añadidos.
7. Polipéptido de fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 a 6, o método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, donde el polipéptido de fitasa presenta uno o más de entre:
(a) aumento de reversibilidad de inactividad después de la exposición a una temperatura elevada en comparación con una fitasa control que carece de aumento de glicosilación, donde la temperatura elevada es al menos 80 °C, al menos 85 °C, al menos 90 °C, o al menos 95 °C, p. ej. donde la reversibilidad de inactividad es al menos un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % superior a una fitasa control que carece de aumento de glicosilación;
(b) aumento de actividad recuperada después de la exposición a una temperatura elevada de al menos 80 0C, al menos 85 0C, al menos 90 0C o al menos 95 °C, en comparación con una fitasa control que carece de aumento de glicosilación, p. ej., donde el aumento de actividad recuperada en comparación con una fitasa control que carece de aumento de glicosilación es de al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 % o 350 %; y
(c) aumento de actividad recuperada después de la exposición a una temperatura elevada de al menos 80 0C, al menos 85 0C, al menos 90 0C o al menos 95 0C, en comparación con la fitasa antes de la exposición a la temperatura elevada, p. ej., donde la actividad recuperada es de al menos el 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, o 90 %, en comparación con la fitasa antes de la exposición a la temperatura elevada.
8. Polipéptido de fitasa según la reivindicación 7, o método de la reivindicación 7, donde el aumento de reversibilidad de inactividad o el aumento de actividad recuperada se produce después del procesamiento en un alimento o pellet de pienso.
9. Polipéptido de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 a 8, o método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, donde la célula huésped de hongo filamentoso es una Aspergillus spp., una Fusarium spp., una Myceliophthora spp., o una Trichoderma spp, p. ej., donde la Aspergillus es A. niger, A. oryzae, A. nidulans, A. tubingensis o A. awamori o donde la Trichoderma es T. reesei.
10. Polipéptido de fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 a 9, o método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, donde la célula huésped de hongo filamentoso es una en la que se ha delecionado el gen de endoglucosaminidasa.
11. Polipéptido de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 a 10, donde la fitasa está contenida en un gránulo, opcionalmente donde el gránulo es un gránulo multicapa, opcionalmente donde el gránulo está contenido en un pellet, y opcionalmente donde el pellet está contenido en un pienso para animales.
12. Método para aumentar la estabilidad de un polipéptido de fitasa peletizado que comprende:
(a) la glicosilación de un polipéptido de fitasa;
(b) la formación de un gránulo con el polipéptido de fitasa;
(c) la peletización del gránulo a una temperatura de al menos 85 0C, al menos 90 0C, o al menos 95 0C, para formar un polipéptido de fitasa peletizado; donde
(i) el polipéptido de fitasa es el polipéptido de fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 a 11; o
(ii) la glicosilación comprende la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fitasa que presenta al menos 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 en un huésped de hongo filamentoso en el que se ha delecionado el gen de endoglucosaminidasa.
13. Método de fabricación de un alimento o pienso con una actividad de fitasa elevada que comprende la adición de un polipéptido de fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 a 11, o un polipéptido de fitasa producido por el método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, a un ingrediente alimentario o de pienso durante la fabricación.
14. Método de alimentación de animales que comprende la administración de una composición de pienso que comprende un polipéptido de fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 a 10, o un polipéptido de fitasa producido por el método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10.
15. Composición de pienso para animales que comprende un polipéptido de fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 a 10, o un polipéptido de fitasa producido por el método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10.