ES2534098T3

ES2534098T3 - Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos

Info

Publication number: ES2534098T3
Application number: ES10785298.0T
Authority: ES
Inventors: Sara Landvik; Marc Dominique Morant; Keiichi Ayabe; Guillermo Coward-Kelly
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes North America Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes North America Inc
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2015-04-17
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: US9624480B2; US20120214197A1; MX2012006096A; EP2507372B1; CA2782154A1; CN102869771A; AU2010276468B2; CA2782154C; US20170204435A1; US10125380B2; CN102869771B; US20150093792A1; AU2010276468A1; US20150344857A1; WO2011066576A1; US9127262B2; DK2507372T3; US8916359B2; EP2507372A1

Abstract

Polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID nº: 2, de SEC ID nº: 4 o de SEC ID nº: 6; (b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con el dominio catalítico mostrado como los aminoácidos 22 a 476 de SEC ID nº: 2, de SEC ID nº: 4 o de SEC ID nº: 6; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia codificante de SEC ID nº: 1, de SEC ID nº: 3 o de SEC ID nº: 5 que codifica los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID nº: 2, de SEC ID nº: 4 o de SEC ID nº: 6.

Description

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[0054] La presente invención también se refiere a variantes artificiales que comprenden una sustitución, eliminación y/o inserción de uno o varios (o diferentes) aminoácidos del polipéptido maduro de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4 o SEC ID nº: 6; o una secuencia homóloga de la misma. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de naturaleza menor, es decir sustituciones de aminoácidos conservadoras o inserciones que no afectan significativamente al plegado y/o la actividad de la proteína, deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos, pequeñas extensiones amino o carboxi terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos o una extensión pequeña que facilite la purificación por cambio de la carga de red u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0055] Ejemplos de sustituciones conservadoras están en el grupo de los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los intercambios que se producen de forma más frecuente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

[0056] Además de los 20 aminoácidos estándar, aminoácidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y alfa-metil serina) se pueden sustituir por residuos de aminoácidos de un polipéptido de tipo salvaje. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden ser sustituidos por residuos de aminoácidos. "Aminoácidos no naturales" se han modificado después de síntesis de proteína y/o tienen una estructura química en sus cadenas laterales diferente de la de los aminoácidos de estándar. Aminoácidos no naturales se pueden sintetizar químicamente y, preferiblemente, están disponibles comercialmente e incluyen ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, dehidroprolina, 3- y 4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.

[0057] Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físico químicas de los polipéptidos se ven alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.

[0058] Aminoácidos esenciales en el polipéptido original se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escaneado de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, las mutaciones de alanina únicas se introducen en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se evalúan para actividad de glucoamilasa para identificar residuos de aminoácidos que sean críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar por análisis físico de estructura, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con la mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también pueden ser inferidas a partir de análisis de identidades con polipéptidos que están relacionados con un polipéptido según la invención.

[0059] Sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples, deleciones y/o inserciones se pueden hacer y evaluar usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o redistribución, seguido de un procedimiento de selección pertinente, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR con tendencia al error, presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente de EE.UU. nº: 5.223.409; WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0060] Métodos de mutagénesis/redistribución se pueden combinar con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente usando métodos estándar de la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

[0061] El número total de sustituciones de aminoácidos, deleciones y/o inserciones del polipéptido maduro, tal como los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4 o SEC ID nº: 6, o el dominio catalítico, tal como los aminoácidos 22 a 476 de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4 o SEC ID nº: 6, o es 10, preferiblemente 9, de forma más preferible 8, de forma más preferible 7, de forma más preferible como mucho 6, de forma más preferible 5, de forma más preferible 4, incluso de forma más preferible 3, de la forma más preferible 2, e incluso de la forma más preferible 1.

Fuentes de polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa

[0062] Un polipéptido de la presente invención se puede obtener a partir de microorganismos de cualquier género. Para fines de la presente invención, el término "obtenido a partir de" como se utilizan en este caso en relación con una fuente dada debe referirse a que el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos es producido por la fuente o por una cepa donde la secuencia de nucleótidos de la fuente ha sido insertada. Preferiblemente, el polipéptido obtenido a partir de una fuente dada es secretado extracelularmente.

[0063] Un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención también puede ser polipéptido bacteriano, o un polipéptido de levadura, o de forma más preferible un polipéptido fúngico filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Artomyces, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria que tiene actividad de glucoamilasa.

[0064] En un aspecto más preferido, el polipéptido es un polipéptido de Pycnoporus sp. que tiene actividad de glucoamilasa. Particularmente la Pycnoporus sp. es Pycnoporus sanguineus.

[0065] Se entiende que para las especies ya mencionadas la invención abarca tanto el estado perfecto como el imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de especies por el que se conozcan. Expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.

[0066] Cepas de estas especies son de fácil acceso para el público en varias colecciones de cultivo, como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0067] Además, tales polipéptidos se pueden identificar y obtener a partir de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente mencionadas. Técnicas para aislar microorganismos de hábitats naturales se conocen en la técnica. El polinucleótido se puede obtener luego de forma similar por selección de una genoteca de ADNc o genómico de tal microorganismo. Una vez que se ha detectado una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido con la sonda(s), el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la materia de la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0068] Polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles donde otro polipéptido se fusiona en el N-término o el C-término del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido con una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) de la presente invención. Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen la ligadura de las secuencias de codificación que codifican los polipéptidos de modo que estén en marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo promotor(es) y terminador.

[0069] Un polipéptido de fusión puede además comprender un sitio de escisión. En la secreción de la proteína de fusión, el sitio es dividido liberando el polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la proteína de fusión. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, un sitio Kex2 que codifica el dipéptido Lys-Arg (Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-76; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381), un sitio Ile-(Glu o Asp)-Gly-Arg, que es dividido por una proteasa de Factor Xa después del residuo de arginina (Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512), un sitio Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que es dividido por una enteroquinasa después de la lisina (Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987), un sitio His- Tyr-Glu o un sitio His-Tyr-Asp, que se divide por Genenasa I (Carter et al., 1989, proteínas: estructura, función, y genética 6: 240248); un Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser sitio, que es dividido por una trombina después del Arg (Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48), un sitio Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que es dividido por una proteasa TEV después del Gin (Stevens, 2003, supra); y un sitio Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que es dividido por una forma genéticamente modificada de proteasa 3C de rinovirus humano después del Gin (Stevens, 2003, supra).

Polinucleótidos

[0070] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden o consisten en las secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa de la presente invención.

[0071] Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en SEC ID nº: 1. En otro aspecto más preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en la secuencia contenida en el plásmido que está contenido en E. coli DSM 23221. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1. En otro aspecto más preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en la secuencia codificante del polipéptido maduro contenida en el plásmido contenido en E. coli DSM 23221.

[0072] La presente invención también abarca las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2 o el polipéptido maduro de la misma, que difiere de SEC ID nº: 1 o la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la misma en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de SEC ID nº: 1 que codifican fragmentos de SEC ID nº: 2 que tienen actividad de glucoamilasa.

[0073] La presente invención también se refiere a polinucleótidos mutantes que comprenden o consisten en al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, donde la secuencia de nucleótidos mutante codifica el polipéptido maduro de SEC ID nº: 2.

[0074] Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en SEC ID nº: 3. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 3. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o consistentes en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 4 o el polipéptido maduro de la misma, que difiere de SEC ID nº: 3 o la secuencia codificante del polipéptido maduro de la misma en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de SEC ID nº: 3 que codifican fragmentos de SEC ID nº: 4 que tienen actividad de glucoamilasa.

[0075] La presente invención también se refiere a polinucleótidos mutantes que comprenden o consistentes en al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 3, donde la secuencia de nucleótidos mutante codifica el polipéptido maduro de SEC ID nº: 4.

[0076] Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en SEC ID nº: 5. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos comprende o consiste en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 5. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 6 o el polipéptido maduro de la misma, que difiere de SEC ID nº: 5 o la secuencia codificante del polipéptido maduro de la misma en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de SEC ID nº: 5 que codifican fragmentos de SEC ID nº: 6 que tienen actividad de glucoamilasa.

[0077] La presente invención también se refiere a polinucleótidos mutantes que comprenden o consistentes en al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 5, donde la secuencia de nucleótidos mutante codifica el polipéptido maduro de SEC ID nº: 6.

[0078] Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos de la presente invención de tal ADN genómico se puede efectuar, por ejemplo, usando la conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR) o selección de anticuerpo de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonado con características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como reacción en cadena de ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en secuencias de nucleótidos (NASBA) se pueden utilizar. Los polinucleótidos se pueden clonar a partir de una cepa de Penicillium, u otros organismos u organismos relacionados y así, por ejemplo, pueden ser una variante alélica o de especies del polipéptido que codifica la región de la secuencia de nucleótidos.

[0079] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden o consisten en las secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3 o SEC ID nº: 5 de preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94% e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad, que codifica un polipéptido activo.

[0080] La modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas que no se producen de forma natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna manera diseñada del polipéptido aislado en su fuente nativa, por ejemplo, variantes artificiales que difieren en la actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo o similar. La secuencia variante se puede construir basándose en la secuencia de nucleótidos presentada como la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no den lugar a otra

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utilizar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

[0108] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o varios (diferentes) marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas, modificadas, transducidas o similares. Una etiqueta seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a los metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares.

[0109] Marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Se prefieren para su uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0110] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento(s) que permite la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.

[0111] Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede contar con la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación(es) precisa del cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, preferiblemente de 400 a 10.000 pares de bases y de la forma más preferible de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un grado alto de identidad con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga de la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

[0112] Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita al vector replicar de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plásmido que medie replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "plásmido replicador" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite a un plásmido o vector replicar in vivo.

[0113] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprendan el gen se puede realizar según los métodos descritos en la WO 00/24883.

[0114] Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula huésped para aumentar la producción del producto génico. Un aumento en el número de copias del polinucleótido se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

[0115] Los procedimientos usados para enlazar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células huésped

[0116] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, incluyendo un polinucleótido aislado de la presente invención, que se usan ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se ha descrito anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no sea idéntico a la célula madre debido a mutaciones que se producen durante replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran parte del gen que codifique el polipéptido y su fuente.

[0117] La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, por ejemplo, una procariota o una eucariota.

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Métodos de producción

[0127] La presente divulgación también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivo de una célula, que en su forma de tipo salvaje produce el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido y (b) recuperación del polipéptido. Preferiblemente, la célula es del género Pycnoporus. En un aspecto más preferido, la célula es de la especie Pycnoporus sanguineus.

[0128] La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivo de una célula huésped recombinante, como se describe en este caso, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido y (b) recuperación del polipéptido.

[0129] La presente divulgación también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención, que comprenden: (a) cultivo de una célula huésped recombinante bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido, donde la célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos mutante que tiene al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3 o de SEC ID nº: 5, donde la secuencia de nucleótidos mutante codifica un polipéptido que comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4 o de SEC ID nº: 6, y (b) recuperación del polipéptido.

[0130] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación y fermentación a pequeña escala o gran escala (incluyendo, fermentaciones continuas de lote, de lote alimentado o de estado sólido) en laboratorio o fermentadores industriales realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan al polipéptido ser expresado y/o aislado. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y de carbono y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según las composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se segrega en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se segrega en el medio, se puede recuperar de lisados celulares.

[0131] Los polipéptidos se pueden detectar usando métodos conocidos en la técnica que sean específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimático o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo enzimático se puede utilizar para determinar la actividad del polipéptido como se describe en este caso.

[0132] El polipéptido resultante se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitado a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

[0133] Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.

Plantas

[0134] La presente invención también se refiere a plantas, por ejemplo, una planta transgénica, parte de una planta o célula vegetal, que incluye un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o de la parte de planta. Alternativamente, la planta o parte de planta que contiene el polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, la palatabilidad y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

[0135] La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa de los prados (grama azul, Poa), hierba forrajera tal como Festuca, Lolium, césped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.

[0136] Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, legumbres, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.

[0137] Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesofilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Compartimentos de células vegetales específicos, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondria,

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Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplasto como describen Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

[0147] Tras la transformación, los transformantes que han incorporado el constructo de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente, el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección bien durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de T-ADN separados o escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.

[0148] La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido y (b) recuperación del polipéptido.

Composiciones

[0149] La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad de glucoamilasa de la composición ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1.

[0150] La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tal como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, glicosiltransferasa de ciclodextrina, desoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, betagalactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La(s) enzima(s) adicional(es) se puede producir, por ejemplo, por un microorganismo del género Aspergillus, preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae; Fusarium, preferiblemente Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum; Humicola, preferiblemente Humicola insolens o Humicola lanuginosa; o Trichoderma, preferiblemente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0151] Las composiciones de polipéptido se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden ser en forma de líquido o de composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede ser en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que se va a incluir en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0152] Se dan ejemplos más adelante de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las que la composición se usa se pueden determinar basándose en métodos conocidos en la técnica.

Combinación de glucoamilasa y alfa-amilasa ácida

[0153] Según este aspecto de la invención, una glucoamilasa de la invención se puede combinar con una alfa-amilasa, preferiblemente una alfa-amilasa ácida en una proporción de entre 0,3 y 5,0 AFAU/AGU. De forma más preferible, la proporción entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa es al menos 0,35, al menos 0,40, al menos 0,50, al menos 0,60, al menos 0,7, al menos 0,8, al menos 0,9, al menos 1,0, al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,85, o incluso al menos 1,9 AFAU/AGU. No obstante, la proporción entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa debería preferiblemente ser menor que 4,5, menor que 4,0, menor que 3,5, menor que 3,0, menor que 2,5, o incluso menor que 2,25 AFAU/AGU. En AUU/AGI las actividades de alfa-amilasa ácida y glucoamilasa están preferiblemente presentes en una proporción entre 0,4 y 6,5 AUU/AGI. De forma más preferible la proporción entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa es al menos 0,45, al menos 0,50, al menos 0,60, al menos 0,7, al menos 0,8, al menos 0,9, al menos 1,0, al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,9, al menos 2,0, al menos 2,1, al menos 2,2, al menos 2,3, al menos 2,4, o incluso al menos 2,5 AUU/AGI. No obstante, la proporción entre actividad de alfa-amilasa ácida y actividad de glucoamilasa es preferiblemente menor que 6,0, menor que 5,5, menor que 4,5, menor que 4,0, menor que 3,5, o incluso menor que 3,0 AUU/AGI.

[0154] La composición anterior es adecuada para su uso en un proceso de conversión de almidón mencionado más adelante para producir jarabe y productos de fermentación, tales como etanol.

[0155] Se dan ejemplos más adelante de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las que la composición se usa se pueden determinar basándose en métodos conocidos en la técnica.

Usos

[0156] La presente invención está también dirigida a procesos/métodos para el uso de los polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa de la invención.

[0157] Usos según la invención incluyen conversión amilácea de almidón en por ejemplo, jarabe y productos de fermentación, incluyendo etanol y bebidas. Ejemplos de procesos donde se pueden usar una glucoamilasa de la invención incluyen los descritos en la WO 92/20777, WO 03/066816, WO 03/066826, WO 2004/080923, y WO 2004/081193 que son incorporados en la presente todos por referencia.

Producción de productos de fermentación

Proceso para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón gelatinizado

[0158] En este aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, a partir de material que contiene almidón, cuyo proceso incluye un paso de licuefacción y pasos de sacarificación y fermentación realizados consecutiva o simultáneamente.

[0159] La invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón que incluye las etapas de:

(a): licuefacción del material que contiene almidón, preferiblemente utilizando una alfa-amilasa;

(b): sacarificación del material licuado obtenido en el paso (a) utilizando una glucoamilasa de la invención; y

(c): fermentación del material sacarificado utilizando un organismo fermentador.

[0160] El producto de fermentación, tal como especialmente etanol, se puede recuperar opcionalmente después de la fermentación, por ejemplo, por destilación. Materias primas que contienen almidón adecuadas se enumeran en la sección "materiales que contienen almidón" que aparece más adelante. Las enzimas contempladas se enumeran en la sección "enzimas" más adelante. La licuefacción se realiza preferiblemente en presencia de una alfa-amilasa. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en presencia de levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces. Organismos fermentativos adecuados se enumeran en la sección "organismos de fermentación" más adelante. En formas de realización preferidas, los pasos (b) y (c) se realizan consecutiva o simultáneamente (es decir, como proceso SSF).

[0161] En una forma de realización particular, el proceso de la invención comprende además, antes del paso (a), los pasos de:

x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente por molienda; y

y) formar un lodo que comprende el material que contiene almidón y agua.

[0162] La suspensión acuosa puede contener de 10-40% en peso, preferiblemente 25-35% en peso de material que contiene almidón. El lodo se calienta por encima de la temperatura de gelatinización y la alfa-amilasa, preferiblemente alfa-amilasa bacteriana y/o fúngica ácida se puede añadir para iniciar licuefacción (aclarado). El lodo puede se puede cocer por chorro en una forma de realización para gelatinizar más el lodo antes de ser sometido a una alfa-amilasa en el paso (a) de la invención.

[0163] Más específicamente, la licuefacción se puede realizar como un proceso de lodo en caliente de tres pasos. El lodo se calienta a entre 60-95°C, preferiblemente 80-85°C, y se añade la alfa-amilasa para iniciar licuefacción (aclarado). Luego el lodo se puede cocer por chorro a una temperatura entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C, durante 1-15 minutos, preferiblemente durante 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos. El lodo se enfría a 60-95°C y se añade más alfa-amilasa para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El proceso de licuefacción se realiza normalmente a pH 4,5-6,5, en particular a un pH entre 5 y 6. Granos enteros molidos y licuados se conocen como trituración.

[0164] La sacarificación del paso (b) se puede realizar utilizando condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completa puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, no obstante,

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Productos de fermentación

[0181] El término "producto de fermentación" se refiere a un producto producido por un proceso que incluye un paso de fermentación que utiliza un organismo fermentador. Los productos de fermentación contemplados según la invención incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2); antibióticos (por ejemplo, penicilina y etraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. En una forma de realización preferida, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol de combustible; etanol potable, es decir, licores neutros potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria lechera (por ejemplo, productos lácteos fermentados), industria del cuero e industria del tabaco. Tipos de cerveza preferidos comprenden cerveza inglesa de malta, cerveza negra, cerveza porters, cerveza rubia, amarga, licores de malta, cerveza happoushu, cerveza alta en alcohol, cerveza baja en alcohol, cerveza baja en calorías o cerveza ligera. Procesos de fermentación preferidos usados incluyen procesos de fermentación de alcohol, como se conocen en la técnica. Procesos de fermentación preferidos son procesos de fermentación anaeróbicos, como se conocen bien en la técnica.

Organismos de fermentación

[0182] "Organismo de fermentación" se refiere a cualquier organismo, incluyendo organismos bacterianos y fúngicos, adecuados para usar en un proceso de fermentación y capaces de producir un producto de fermentación deseado. Los organismos de fermentación especialmente adecuados se pueden fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de organismos de fermentación incluyen organismos fúngicos, tal como levadura. La levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces spp., en particular, Saccharomyces cerevisiae. Levadura disponible comercialmente incluye, por ejemplo, Red Star™/Lesaffre Ethanol Red (disponible de Red Star/Lesaffre, EE.UU.) FALI (disponible de Fleischmann's Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., EE.UU.), SUPERSTART (disponible de Alltech), GERT STRAND (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties).

ENZIMAS

Glucoamilasa

[0183] La glucoamilasa es preferiblemente una glucoamilasa de la invención. No obstante, como se ha mencionado anteriormente, una glucoamilasa de la invención también se puede combinar con otras glucoamilasas. El término "glucoamilasa" (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa a partir de las extremidades no reducidas de moléculas de oligosacáridos relacionados o almidón.

[0184] La glucoamilasa se puede añadir en una cantidad de 0,001 a 10 AGU/g DS, preferiblemente de 0,01 a 5 AGU/g DS, tal como alrededor de 0,1, 0,3, 0,5, 1 o 2 AGU/g DS, especialmente 0,1 a 0,5 AGU/g DS o 0,02-20 AGU/g DS, preferiblemente 0,1-10 AGU/g DS.

Alfa-amilasa

[0185] La alfa-amilasa puede ser según la invención de cualquier origen. Se prefieren las alfa amilasas de origen fúngico

o bacteriano.

[0186] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, por ejemplo, alfa-amilasa ácida fúngica o alfa-amilasa ácida bacteriana. El término "alfa-amilasa ácida" se refiere a una alfa amilasa (EC 3.2.1.1) que añadida en una cantidad eficaz tiene actividad óptima en un pH en la gama de 3 a 7, preferiblemente de 3,5 a 6, o de la forma más preferible de 4-5.

Alfa-amilasas bacterianas

[0187] Según la invención, una alfa-amilasa bacteriana se puede derivar preferiblemente del género Bacillus.

[0188] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa de Bacillus se deriva de una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis o B. stearothermophilus, pero también se puede derivar de otra especie de Bacillus sp. Ejemplos específicos de alfa-amilasas contempladas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (BLA) mostrada en SEC ID nº: 4 en la WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) mostrada en SEC ID nº: 5 en la WO 99/19467, y la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (BSG) mostrada en SEC ID nº: 3 en la WO 99/19467. En una forma de realización de la invención, la alfa-amilasa es una enzima que tiene un grado de identidad de al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferido al menos 80%, más preferiblemente incluso al menos 90%, tal como al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias mostradas como SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4 o 5, respectivamente, en la WO 99/19467.

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[0197] La alfa-amilasa ácida fúngica también puede ser una enzima de tipo salvaje que comprende un módulo de unión a carbohidratos (CBM) y un dominio catalítico de alfa-amilasa (es decir, un no híbrido), o un variante de los mismos. En una forma de realización, la alfa-amilasa ácida de tipo salvaje se deriva de una cepa de Aspergillus kawachii.

Alfa-amilasas híbridas fúngicas

[0198] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa ácida fúngica es una alfa-amilasa híbrida. Ejemplos preferidos de alfa-amilasas híbridas fúngicas incluyen aquellos descritos en la WO 2005/003311 o la publicación de solicitud de EE.UU. nº 2005/0054071 (Novozymes) o solicitud de EE.UU. nº 60/638,614 (Novozymes) que se incorpora en la presente por referencia. Una alfa-amilasa híbrida puede comprender un dominio catalítico (CD) de alfa-amilasa y un dominio/módulo de unión a carbohidratos (CBM) y opcional un enlazador.

[0199] Ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la solicitud de EE.UU. nº 60/638,614 incluyendo variante de Fungamyl con dominio catalítico JA118 y SBD de Athelia rolfsii (SEC ID nº: 100 en la solicitud de EE.UU. nº 60/638,614), alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador AMG y SBD de Athelia rolfsii (SEC ID nº: 101 en la solicitud de EE.UU. nº 60/638,614) y alfa-amilasa de Meripilus giganteus con enlazador y SBD de glucoamilasa de Athelia rolfsii (SEC ID nº: 102 en la solicitud de EE.UU. nº 60/638.614).

[0200] Otros ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la publicación de solicitud de EE.UU. nº: 2005/0054071, incluyendo aquellas descritas en la tabla 3 de la página 15, tal como alfaamilasa de Aspergillus niger con enlazador de Aspergillus kawachii y dominio de unión al almidón.

Productos de alfa-amilasa comerciales

[0201] Composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen MYCOLASE de DSM (Gist Brocades), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X y SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40,000, DEX-LOT™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ Ethyl, GC358, GC980, SPEZYME™ RSL, y SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.), y la alfa-amilasa fúngica ácida vendida bajo el nombre comercial SP288 (disponible en Novozymes A/S, Dinamarca).

[0202] Una alfa-amilasa ácida se puede añadir según la invención en una cantidad de 0,1 a 10 AFAU/g DS, preferiblemente 0,10 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0,3 a 2 AFAU/g DS.

Producción de jarabe

[0203] La presente invención también proporciona un proceso del uso de una glucoamilasa de la invención para producir jarabe, tal como glucosa y similares, a partir de material que contiene almidón. Materias primas adecuadas se ejemplifican en la sección "materiales que contienen almidón" anterior. Generalmente, el proceso comprende los pasos de hidrolización parcial del material que contiene almidón (licuefacción) en presencia de alfa-amilasa y luego más sacarificación de la liberación de glucosa a partir de las extremidades no-reducidas de las moléculas de oligo y polisacáridos relacionadas o almidón en presencia de glucoamilasa de la invención.

[0204] La licuefacción y la sacarificación se pueden llevar a cabo como se ha descrito anteriormente para la producción de producto de fermentación.

[0205] La glucoamilasa de la invención también se puede usar de forma inmovilizada. Esto es adecuado y frecuentemente se usa para producir jarabes especiales, tales como jarabes de maltosa, y además para la corriente de refinado de oligosacáridos en relación con la producción de jarabes de fructosa, por ejemplo, jarabe rico en fructosa (HFS).

[0206] Consecuentemente, este aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de producción de jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende:

(a): licuefacción de material que contiene almidón en presencia de una alfa-amilasa, y

(b): sacarificación del material obtenido en el paso (a) utilizando una glucoamilasa de la invención.

[0207] Un jarabe se puede recuperar a partir del material sacarificado obtenido en el paso (b).

[0208] Detalles de condiciones adecuadas se pueden encontrar por encima.

Elaboración de cerveza

[0209] Una glucoamilasa de la invención también puede usarse en un proceso de elaboración de cerveza. La glucoamilasa de la invención se añade en cantidades eficaces que pueden ser fácilmente determinadas por el experto en la materia de la técnica.

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Incubación AMG:

Substrato:: maltosa 23,2 mM

Tampón:: acetato 0,1 M

pH:: 4,30 ± 0,05

Temperatura de incubación:: 37°C ± 1

Tiempo de reacción:: 5 minutos

Gama de trabajo de enzima:: 0,5-4,0 AGU/mL

Reacción de color:

GlucDH:: 430 U/L

Mutarotasa:: 9 U/L

NAD:: 0,21 mM

Tampón:: fosfato 0,12 M; 0,15 M NaCl

pH:: 7,60 ± 0,05

Temperatura de incubación:: 37°C ± 1

Tiempo de reacción:: 5 minutos

Longitud de onda:: 340 nm

[0222] Una carpeta (EB-SM-0131,02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible en la solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta se incluye en la presente por referencia. 5

Actividad de alfa-amilasa (KNU)

[0223] La actividad de alfa-amilasa se puede determinar usando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la descomposición de almidón de patata modificado por la enzima, y la reacción está seguida de muestras de mezcla

10 de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón el color azul se hace más débil y gradualmente cambia a marrón rojizo, que se compara con un vidrio coloreado estándar.

[0224] Una Unidad Kilo Novo (KNU) de alfa-amilasa se define como la cantidad de enzima que, bajo condiciones

15 estándar (es decir, a 37°C +/- 0,05, 0,0003 M Ca2+; y pH 5,6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble.

[0225] Una carpeta EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo pedido en Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta se incluye en la presente por referencia.

20 Actividad de alfa-amilasa ácida

[0226] Cuando se usa según la presente invención, la actividad de cualquier alfa-amilasa ácida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa fúngica ácida). Alternativamente, la actividad de alfa-amilasa ácida se puede medir en

25 AAU (unidades de alfa-amilasa ácida).

Unidades de alfa-amilasa ácida (AAU)

[0227] La actividad de alfa-amilasa ácida se puede medir en AAU (unidades de alfa-amilasa ácida), que es un método

30 absoluto. Una unidad de amilasa ácida (AAU) es la cantidad de enzima que convierte 1 g de almidón (100% de sustancia seca) por hora bajo condiciones estandarizadas en un producto que tiene una transmisión a 620 nm después de reacción con una solución de yodo de fuerza conocida igual a la de una referencia de color.

Condiciones estándar/condiciones de reacción: 35 [0228] Substrato: Almidón soluble, Concentración aprox, 20 g DS/L,

Tampón: Citrato, aprox, 0,13 M, pH=4,2

Solución de yodo: 40,176 g yoduro potásico + 0,088 g yodo /L

Agua de ciudad: 15°-20°dH (dureza de grado alemán)

pH: 4,2

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Métodos

[0238] 1) diluir AMG y JA126AN purificada con milliQ hasta la conc. prevista siguiente.

5 AMG: A280 = 0.12 AMG de T. cingulata: 0.34 AGU/ml (correspondiente a A280=0.12) JA126AN:: A280 = 0.0024

10 Ensayo 1 (sin JA126) Muestra: (20 microlitros AMG + 20 microlitros milliQ) x 4 pocillos Control: (20 microlitros T. cingulata AMG + 20 microlitros milliQ) x 4 pocillos

Ensayo 2 (con JA126) 15 Muestra: (20 microlitros AMG + 20 microlitros JA126) x 4 pocillos Control: (20 microlitros AMG de T. cingulata + 20 microlitros JA126) x 4 pocillos

2) añadir 760 microlitros de 3% suspensión de almidón crudo a los pocillos.

20 3) Las placas fueron incubadas a 32°C durante 18h con agitación. La conc. de glucosa fue medida usando el kit de prueba de Glucosa CII (Wako) después de la dilución apropiada, antes y 18 horas después de la incubación.

4) La cantidad de glucosa producida en 18 horas fue calculada. La actividad de RSH fue expresada como un valor relativo a aquel de AMG de T. cingulata . 25 Ensayo 1: actividad RSH (%, sin JA126) = (Glc. Producida de AMG) / (Glc. Producida de AMG de T. cingulata)

Ensayo 2: actividad RSH (%, con JA126) = (Glc. Producida de AMG+JA126) / (Glc. Producida de AMG+JA126 de T. cingulata) 30

Condición de ensayo: AMG (A280=0.003)

Con o sin JA126 (A280=0.00006) 3% almidón crudo (maíz) 100 mM Na-acetato, pH 4.0 1 mM CaCl2,0.025% NaN3 32°C, 18 horas

[0239] La actividad de la hidrólisis de almidón crudo (RSH) de glucoamilasas de Pycnoporus sanguineus fue evaluada en las siguientes condiciones:

35 Sustrato: 3% almidón crudo (maíz, Sigma catalog#S9679) suspendido en 100 mM acetato sódico, 1 mM cloruro de calcio y 0.025% azida sódica, pH 4.0 Dosis enzimática: AMG purificada de Pycnoporus sanguineus ajustada para tener una absorbancia A280 final de

0.003. Las pruebas de hidrólisis fueron realizadas como pruebas comparativas fueron el Pycnoporus purificado o Talaromyces emersonii AMG fue en comparación con una muestra purificada de AMG de Trametes cingulata

40 (A280=0.003) en presencia (con JA126) o ausencia (sin JA126) de alfa-amilasa purificada JA126AN (A280=0.00006). La glucosa producida durante la reacción fue determinada. Medición de glucosa: prueba de glucosa CII (Wako Chemical, catalog# 301-67002) Temperatura: 32°C Período de incubación: 18 horas

45 [0240] Los resultados de las pruebas se muestran en la tabla 3 siguiente.

Tabla 3. Pruebas RSH: RSH (%)

Sin JA126: Con JA126

Pycnoporus sanguineus AMG, P421 B - SEC ID nº: 6: 90% 110%

Pycnoporus sanguineus AMG, P2379 - SEC ID nº: 4: 98% 119%

Talaromyces emersonii T-AMG, P28N - SEC ID nº: 10: 75% 50%

Pycnoporus sanguineus AMG, P1TD - SEC ID nº: 2: 87% 106%

Trametes cingulata AMG G1; P13P - SEC ID nº: 8: 100% 100%

Depósito de Material biológico

[0241] El siguiente material biológico ha sido depositado según las condiciones del tratado de Budapest con Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig,

Claims

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