BR112021000369A2 - Processos para produção de produtos de fermentação - Google Patents
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Abstract
processos para produção de produtos de fermentação. a presente divulgação se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido, em que uma triacilglicerídeo lipase (por exemplo, uma triacilglicerídeo lipase termoestável) está presente e/ou é adicionada durante a liquefação, pré-sacarificação, sacarificação, fermentação, sacarificação e fermentação simultâneas, ou qualquer sua combinação, para aumentar o amido enzimaticamente acessível, por exemplo por redução da retrogradação do amido, e/ou aumentar o rendimento de produtos de fermentação, tal como rendimento de etanol. a divulgação se relaciona também com o uso de uma triacilglicerídeo lipase nos processos da divulgação, por exemplo, para aumentar o amido enzimaticamente acessível e/ou o rendimento de produtos de fermentação, tal como rendimento de etanol.
Description
Relatório descritivo da patente de invenção para “PROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO”
[0001] Este pedido reivindica prioridade em relação ao Pedido de Patente Provisório dos E.U.A. No, 62/696,515, depositado a 11 de julho, 2018, a divulgação do qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
[0002] A presente divulgação se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido. A divulgação se relaciona também com o uso de uma triacilglicerol lipase (por exemplo, termoestável) durante a liquefação e/ou a sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas em um processo de produção de produtos de fermentação da divulgação para aumentar o amido enzimaticamente acessível, por exemplo por redução da retrogradação do amido, e/ou aumentar o rendimento de produtos de fermentação, tal como especialmente etanol.
[0003] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada aqui por referência.
[0004] A produção de produtos de fermentação, tais como etanol, a partir de material contendo amido é bem conhecida na técnica. Industrialmente são usados hoje em dia dois tipos diferentes de processos. O processo o mais comumente usado, frequentemente referido como um “processo convencional”, inclui liquefação de amido gelatinizado a elevada temperatura usando tipicamente uma alfa-amilase bacteriana, seguida por sacarificação e fermentação simultâneas levadas a cabo na presença de uma glucoamilase e um organismo de fermentação. Outro processo bem conhecido, frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bruto” (processo RSH), inclui sacarificação e fermentação simultâneas de amido granular abaixo da temperatura de gelatinização inicial tipicamente na presença de pelo menos uma glucoamilase.
[0005] Apesar da melhoria significativa dos processos de produção de produtos de fermentação ao longo da última década, uma quantidade significativa de material de amido residual não é convertida no produto de fermentação desejado, tal como etanol.
[0006] Portanto existe ainda um desejo e necessidade de proporcionar processos para produção de produtos de fermentação, tais como etanol, a partir de material contendo amido que possam proporcionar uma quantidade mais elevada de amido enzimaticamente acessível e/ou rendimento de produtos de fermentação, ou outras vantagens, em comparação com processos convencionais.
[0007] O objetivo da presente divulgação é proporcionar processos para produção de produtos de fermentação, tais como etanol, a partir de material contendo amido que possam proporcionar uma quantidade aumentada de amido enzimaticamente acessível e/ou rendimento de produtos de fermentação, ou outras vantagens, em comparação com processos convencionais.
[0008] Em um aspecto, a presente divulgação se relaciona com um método de aumento do amido enzimaticamente acessível, por exemplo por redução da retrogradação do amido, e/ou aumento do rendimento de produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, durante um processo de produção de produtos de fermentação, em que uma triacilglicerol lipase está presente e/ou é adicionada antes do ou durante o passo de liquefação, passo de sacarificação, passo de fermentação ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas do processo de produção dos produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a triacilglicerol lipase está presente e/ou é adicionada antes do ou durante o passo de liquefação e presente e/ou adicionada durante o passo de sacarificação, passo de fermentação ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas.
[0009] Em um aspecto, a divulgação se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação, compreendendo (a) liquefação de um material contendo amido usando uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material contendo amido liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidrato para formar açúcares fermentáveis; e (c) fermentação dos açúcares fermentáveis usando um organismo fermentador para produzir o produto de fermentação, em que uma triacilglicerol lipase está presente e/ou é adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (a), passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em algumas modalidades, a triacilglicerol lipase está presente e/ou é adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (a) e antes do ou durante o passo de sacarificação (a), passo de fermentação (b) ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0010] Em modalidades preferenciais, o produto da produção de fermentação é etanol e o rendimento de amido enzimaticamente acessível e/ou etanol é aumentado em comparação com o desempenho do método na ausência de uso de uma triacilglicerol lipase.
[0011] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerol lipase é uma triacilglicerol lipase termoestável, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) maior do que ou igual a cerca de 60 °C, tal como entre 60 °C e 110 °C, tal como entre 65 °C e 95 °C, tal como entre 70 °C e 90 °C, tal como acima de 70 ºC, tal como acima de 72 °C, tal como acima de 80 °C, tal como acima de 85 °C, tal como acima de 90 °C, tal como acima de 92 °C, tal como acima de 94 °C, tal como acima de 96 °C, tal como acima de 98 °C,
tal como acima de 100 °C.
[0012] Exemplos de triacilglicerol lipases termoestáveis de uso aqui incluem: (i) a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 3 aqui derivada de uma estirpe de Rhizomucor miehei; ou um polipeptídeo tendo atividade de triacilglicerol lipase, tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 aqui; (ii) a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 4 derivada de uma estirpe de Aspergillus oryzae; ou um polipeptídeo tendo atividade de triacilglicerol lipase, tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aqui; (iii) a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 5 derivada de uma estirpe de Moesziomyces antarcticus; ou um polipeptídeo tendo atividade de triacilglicerol lipase, tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 aqui; (iv) a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 6 derivada de uma estirpe de Moesziomyces antarcticus ou um polipeptídeo tendo atividade de triacilglicerol lipase, tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 aqui; (v) a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 7 derivada de uma estirpe de Thermomyces lanuginosus ou um polipeptídeo tendo atividade de triacilglicerol lipase, tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO:7 aqui; e (vi) a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 8 derivada de uma estirpe de Thermomyces lanuginosus ou um polipeptídeo tendo atividade de triacilglicerol lipase, tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8 aqui.
[0013] Outras enzimas tais como endoglucanase, hemicelulases (por exemplo, xilanases, preferencialmente uma xilanase termoestável), enzimas geradoras de fonte de carboidratos (por exemplo, glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase termoestável), proteases, pululanases e fitases podem ser também usadas nos processos da presente divulgação.
[0014] A FIG. 1 é um gráfico ilustrando os resultados do rastreamento primário a 20% de sólidos secos (DS) a um ponto temporal de 24 hr, mostrando que a TG lipase Rm e a TG lipase Ao melhoraram os títulos de etanol em comparação com o tratamento de controle não tendo uma TG lipase.
[0015] A FIG. 2A é um gráfico ilustrando os resultados do rastreamento secundário a 32% de DS a um ponto temporal de 24 hr, mostrando o efeito de TG lipases nos títulos de etanol em comparação com o tratamento de controle.
[0016] A FIG. 2B é um gráfico ilustrando os resultados do rastreamento secundário a 32% de DS a um ponto temporal de 60 hr, mostrando o efeito de TG lipases nos títulos de etanol em comparação com o tratamento de controle.
[0017] A FIG. 3 é um gráfico ilustrando os resultados da incubação de amostras de mosto liquefeito com Alfa-Amilase e Glucoamilase, mostrando um aumento na quantidade de amido enzimaticamente acessível após tratamento com TG lipas para todas as lipases testadas.
[0018] A não ser que definidos de outro modo ou claramente indicado pelo contexto, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um perito na técnica.
[0019] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutações e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações gênicas podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.
[0020] As Alfa-Amilases (alfa-1,4-glucana-4- glucanoidrolases, EC 3.2.1.1) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e outros oligo e polissacarídeos 1,4-glucosídicos lineares e ramificados.
[0021] Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” significa uma beta-D-glucosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glucose não redutores terminais com a liberação de beta-D-glucose. A atividade de beta-glucosidase pode ser determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 µmole de ânion p-nitrofenolato produzida por minuto a 25 °C, pH 4,8 a partir de p-nitrofenil- beta-D-glucopiranosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 50 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01%.
[0022] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.
[0023] Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4-beta-D-glucana celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91 e E.C.
3.2.1.176) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glucose ligada em beta-1,4, liberando celobiose da extremidade redutora (celobioidrolase I) ou extremidade não redutora (celobioidrolase II) da cadeia (Teeri, 1997, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). A atividade de celobioidrolase pode ser determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283- 288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581.
[0024] Enzima celulolítica ou celulase: O termo "enzima celulolítica" ou "celulase" designa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material contendo celulose. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glucosidase(s) ou suas combinações. As duas abordagens básicas para medição da atividade de enzima celulolítica incluem: (1) medição da atividade de enzima celulolítica total e (2) medição das atividades de enzimas celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases) como revisto em Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade de enzima celulolítica total pode ser medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman №1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum da atividade celulolítica total é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtro Whatman №1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).
[0025] A atividade de enzima celulolítica pode ser determinada por medição do aumento na produção/liberação de açúcares durante a hidrólise de um material contendo celulose por enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulose em palha de milho pré-tratada (PCS) (ou outro material contendo celulose pré-tratado) durante 3-7 dias a uma temperatura adequada tal como 40 °C-80 °C, por exemplo, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C ou 70 °C, e a um pH adequado tal como 4-9, por exemplo, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína enzimática celulolítica. Condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5% (peso seco), acetato de sódio a 50 mM, pH 5, MnSO4 a 1 mM, 50 °C, 55 °C ou 60 °C, 72 horas, análise de açúcares por cromatografia em coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).
[0026] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma 4-(1,3;1,4)-beta-D-glucana 4-glucanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas na celulose, derivados da celulose (tais como celulose de carboximetila e celulose de hidroxietila), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3-1,4 glucanas mistas tais como beta-D-glucanas ou xiloglucanas de cereais e outro material vegetal contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades redutoras determinado por um teste de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452- 481). A atividade de endoglucanase pode ser também determinada usando celulose de carboximetila (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40 °C.
[0027] Glicosídeo hidrolase da família 61: O termo “glicosídeo hidrolase da Família 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo da Família 61 de glicosídeo hidrolases de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino- acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. As enzimas desta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolases com base na medição de atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glucanase em um membro da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas não são canônicos e não podem ser consideradas glicosidases verdadeiras. No entanto são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade de intensificar a degradação de lignocelulose quando usadas em conjunto com uma celulase ou uma mistura de celulases.
[0028] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo tendo um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de triacilglicerol
[0029] As glucoamilases (glucana 1,4-alfa-glucosidase, EC 3.2.1.3) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de resíduos de alfa-D-glucose ligados a terminal (1→4) sucessivamente de extremidades não redutoras das cadeias com liberação de beta-D-glucose.
[0030] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Current Opinion In Microbiology 6
(3): 219-228. As hemicelulases são componentes-chave na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não estão limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloíl esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoíl esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Os substratos para estas enzimas, hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que estão ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando as mesmas em uma rede robusta. As hemiceluloses estão também covalentemente ligadas à lignina, formando em conjunto com a celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e a organização das hemiceluloses requerem a ação concertada de muitas enzimas para a sua degradação completa. Os módulos catalíticos de hemicelulases são glicosídeo hidrolases (GH) que hidrolisam ligações glicosídicas ou carboidrato esterases (CE), que hidrolisam ligações de éster de grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, podem ser atribuídos às famílias GH e CE. Algumas famílias, com um dobramento similar global, podem ser adicionalmente agrupadas em clãs, marcados alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidratos está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzimas hemicelulolíticas podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752, a uma temperatura adequada tal como 40 °C-80 °C, por exemplo, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C ou 70 °C, e um pH adequado, tal como 4-9, por exemplo, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0.
[0031] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação,
transfecção, transdução e similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo descrito aqui (por exemplo, um polinucleotídeo codificando um peptídeo ou transportador de aminoácidos ou seu regulador). O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula parental que não seja idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação. O termo “célula recombinante” é aqui definido como uma célula hospedeira de ocorrência não natural que compreende um ou mais (por exemplo, dois, vários) polinucleotídeos heterólogos.
[0032] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que está pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.
[0033] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo tendo atividade biológica que está em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 95 a 363 de SEQ ID NO: 3, pois é previsto que os aminoácidos 1 a 24 de SEQ ID NO: 3 sejam um peptídeo-sinal e os aminoácidos 25-94 sejam um pró-peptídeo. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 22 a 462 de SEQ ID NO: 5, pois é previsto que os aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 5 sejam um peptídeo-sinal. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 20 a 342 de SEQ ID NO: 5, pois é previsto que os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 5 sejam um peptídeo- sinal. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 18 a 291 de SEQ ID NO: 7, pois é previsto que os aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 7 sejam um peptídeo-sinal. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 18 a 291 de SEQ ID NO: 8, pois é previsto que os aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 8 sejam um peptídeo-sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.
[0034] Protease: O termo “protease” é definido aqui como uma enzima que hidrolisa ligações de peptídeo. O termo inclui qualquer enzima pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas treze subclasses). O número EC se refere à Nomenclatura de Enzimas de 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1-5 publicados em Eur. J. Biochem. 223: 1-5 (1994); Eur. J. Biochem. 232: 1-6 (1995); Eur. J. Biochem. 237: 1-5 (1996); Eur. J. Biochem. 250: 1-6 (1997); e Eur. J. Biochem. 264: 610-650 (1999); respectivamente. O termo “subtilases” se refere a um subgrupo de serina proteases de acordo com Siezen et al., 1991, Protein Engng. 4: 719-737 e Siezen et al., 1997, Protein Science 6: 501-523.
[0035] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas, ou ainda não classificadas, (U) ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.
[0036] Os polipeptídeos tendo atividade de protease, ou proteases, são por vezes também designados peptidases, proteinases, peptídeo hidrolases ou enzimas proteolíticas. As proteases podem ser do tipo exo (exopeptidases) que hidrolisam peptídeos começando em qualquer uma das suas extremidades, ou do tipo endo que atuam internamente em cadeias de polipeptídeos (endopeptidases).
[0037] Em modalidades particulares, as proteases para uso nos processos da invenção são selecionadas do grupo consistindo em: (a) proteases pertencendo às metaloendopeptidases EC 3.4.24; (b) metaloproteases pertencendo ao grupo M do Handbook acima; (c) metaloproteases ainda não atribuídas a clãs (designação: Clã MX) ou pertencendo a qualquer um dos clãs MA, MB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (como definido nas pp. 989-991 do Handbook acima); (d) outras famílias de metaloproteases (como definido nas pp. 1448-1452 do Handbook acima); (e) metaloproteases com um motivo HEXXH; (f) metaloproteases com um motivo HEFTH; (g) metaloproteases pertencendo a qualquer uma das famílias M3, M26, M27, M32, M34, M35, M36, M41, M43 ou M47 (como definido nas pp. 1448-1452 do Handbook acima); e (h) metaloproteases pertencendo à família M35 (como definido nas pp. 1492- 1495 do Handbook acima).
[0038] Identidade de Sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.
[0039] Para propósitos descritos aqui, o grau de identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48, 443-453) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., Trends Genet 2000, 16, 276-277), preferencialmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de lacuna aberta de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usada como a percentagem de identidade e é calculada como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento da Sequência Referenciada – Número Total de Lacunas no Alinhamento)
[0040] Para os propósitos descritos neste documento, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de lacuna aberta de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usada como a percentagem de identidade e é calculada como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento da Sequência Referenciada – Número Total de Lacunas no Alinhamento)
[0041] Peptídeo-sinal: O termo “peptídeo-sinal” é definido aqui como um peptídeo ligado (fundido) em grelha ao terminal amino de um polipeptídeo tendo atividade biológica e dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula.
[0042] Atividade de triacilglicerol: O termo “atividade de triacilglicerol” significa a atividade que catalisa a reação: triacilglicerol + H 2O = diacilglicerol + um carboxilato. A atividade de triacilglicerol pode ser determinada usando um ensaio de atividade de triacilglicerol (ver, por exemplo, em Wilton, Biochem J 15 de maio de 1991; 276 (Pt I): 129-33, que é incorporado por referência). Uma enzima tendo “atividade de triacilglicerol” pode pertencer a EC 3.1.1.3.
[0043] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de triacilglicerídeo compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa reposicionamento do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição. Uma variante pode incluir substituição, inserção e/ou deleção de até 20 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20. Se uma mudança de aminoácidos resulta em um polipeptídeo de triacilglicerol lipase cataliticamente ativo pode ser prontamente determinado por avaliação quanto à atividade de triacilglicerol lipase, como descrito, por exemplo, no Wilton, Biochem J 15 de maio de 1991; 276 (Pt l): 129-33.
[0044] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4- beta-D-xilana-xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanas. A atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em TRITON® X-100 a 0,01% e fosfato de sódio a 200 mM pH 6 a 37 °C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmole de azurina produzida por minuto a 37 °C, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em fosfato de sódio a 200 mM e pH 6.
[0045] A referência a “cerca de” um valor ou parâmetro aqui inclui modalidades que são dirigidas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição se referindo a “cerca de X” inclui a modalidade “X”. Quando usado em combinação com valores medidos, “cerca de” inclui uma gama que engloba pelo menos a incerteza associada ao método de medição do valor particular e pode incluir uma gama de mais ou menos dois desvios padrão em torno do referido valor.
[0046] Do mesmo modo, a referência a um gene ou polipeptídeo que é “derivado de” outro gene ou polipeptídeo X inclui o gene ou polipeptídeo X.
[0047] Como usadas aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um(a)”, "ou” e “o/a” incluem referentes plurais a não ser que o contexto dite claramente de outro modo.
[0048] É entendido que as modalidades descritas aqui incluem “consistindo” e/ou “consistindo essencialmente em” modalidades. Como usada aqui, exceto onde o contexto requeira de outro modo devido à linguagem expressa ou implicação necessária, a palavra “compreendem” ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo” é usada em um sentido inclusivo, i.e., para especificar a presença das características indicadas, mas não para excluir a presença ou a adição de características adicionais em várias modalidades.
[0049] O objetivo da presente divulgação é proporcionar processos para produção de produtos de fermentação, tais como etanol, a partir de material contendo amido que possam aumentar o amido enzimaticamente, ou proporcionar outras vantagens, em comparação com processos convencionais.
[0050] A presente divulgação se relaciona com o uso de uma triacilglicerol lipase durante o passo de liquefação e/ou sacarificação,
fermentação ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas em um processo de produção de produtos de fermentação. O uso de triacilglicerol lipase aumenta o amido enzimaticamente acessível durante a fermentação, por exemplo por redução do retrogradação do amido, resultando em um rendimento de produtos de fermentação, tal como especialmente etanol, mais elevado.
[0051] I. Métodos de Aumento do Amido Enzimaticamente Acessível/Rendimento de Produtos de Fermentação
[0052] Os inventores descobriram que são obtidos amido enzimaticamente acessível e rendimento de produtos de fermentação, tal como especialmente rendimento de etanol, aumentados quando os passo de liquefação e/ou sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de produtos de fermentação são levados a cabo na presença de uma triacilglicerol lipase (por exemplo, termoestável). (ver Exemplos).
[0053] Conformemente, no primeiro aspecto, a presente divulgação se relaciona com um método de aumento do amido enzimaticamente acessível, por exemplo por redução da retrogradação do amido, e/ou rendimento de produtos de fermentação, durante um processo de produção de produtos de fermentação, em que uma triacilglicerol lipase está presente e/ou é adicionada antes de ou durante um passo de liquefação e/ou um passo de sacarificação, um passo de fermentação ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas do processo de produção dos produtos de fermentação.
[0054] Como usado aqui, a frase “presente e/ou adicionada antes de ou durante” um passo particular de um processo de produção de produtos de fermentação significa que uma quantidade de uma enzima (por exemplo, triacilglicerol lipase) é adicionada antes do ou durante o passo particular do processo de produção de produtos de fermentação.
[0055] Em uma modalidade preferencial, o produto da fermentação é etanol e o método aumenta o amido enzimaticamente acessível, por exemplo por redução da retrogradação do amido, resultando em aumentos no rendimento de etanol.
[0056] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerol lipase é uma triacilglicerol lipase fúngica.
[0057] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerol lipase, por exemplo, uma derivada de uma estirpe de Rhizomucor, em particular Rhizomucor miehei, é a parte madura da sequência mostrada como SEQ ID NO: 3 ou uma sequência tendo uma identidade de sequências com ela de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% com a parte madura da sequência mostrada em SEQ ID NO: 3.
[0058] Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 3 está presente e/ou é adicionada durante a liquefação, pré-sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0059] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerol lipase, por exemplo, uma derivada de uma estirpe de Aspergillus, em particular Aspergillus oryzae, é a parte madura da sequência mostrada como SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo uma identidade de sequências com ela de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% com a parte madura da sequência mostrada em SEQ ID NO: 4.
[0060] Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 4 está presente e/ou é adicionada durante a liquefação, pré-sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0061] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerol lipase, por exemplo, uma derivada de uma estirpe de Moesziomyces, em particular Moesziomyces antarcticus, é a parte madura da sequência mostrada como SEQ ID NO: 5 ou uma sequência tendo uma identidade de sequências com ela de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% com a parte madura da sequência mostrada em SEQ ID NO: 5 ou a parte madura da sequência mostrada como SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo uma identidade de sequências com ela de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% com a parte madura da sequência mostrada em SEQ ID NO: 6.
[0062] Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 5 está presente e/ou é adicionada durante a liquefação, pré-sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 6 está presente e/ou é adicionada durante a liquefação, pré-sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0063] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerol lipase, por exemplo, uma derivada de uma estirpe de Thermomyces, em particular Thermomyces lanuginosus, é a parte madura da sequência mostrada como SEQ ID NO: 7 ou uma sequência tendo uma identidade de sequências com ela de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% com a parte madura da sequência mostrada em SEQ ID NO: 7 ou a parte madura da sequência mostrada como SEQ ID NO: 8 ou uma sequência tendo uma identidade de sequências com ela de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% com a parte madura da sequência mostrada em SEQ ID NO: 8.
[0064] Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 7 está presente e/ou é adicionada durante a liquefação. Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase mostrada em SEQ ID NO: 8 está presente e/ou é adicionada durante a liquefação, pré- sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0065] A liquefação é levada a cabo por liquefação de um material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa-amilase, por exemplo, uma alfa-amilase bacteriana e a triacilglicerol lipase (por exemplo, triacilglicerol lipase fúngica).
[0066] Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase tem um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C. Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase tem um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 70 °C. Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase tem um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 73 °C. Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase tem um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 86 °C. Em uma modalidade, a triacilglicerol lipase tem um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 90 °C.
[0067] Exemplos de enzimas adequadas e preferenciais podem ser encontrados em baixo. II. Processo de Produção de Produtos de Fermentação
[0068] Em outro aspecto, a presente divulgação se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação, compreendendo (a) liquefação de um material contendo amido usando uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material contendo amido liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidrato para formar açúcares fermentáveis; e (c) fermentação dos açúcares fermentáveis usando um organismo fermentador para produzir o produto de fermentação, em que uma triacilglicerol lipase é adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (a) e/ou passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0069] O passo de liquefação (a), passo de sacarificação (b) e passo de fermentação (c) são levados a cabo sequencialmente, embora o passo de sacarificação (b) e o passo de fermentação (c) possam ser levados a cabo simultaneamente (SSF).
A. Passo de Liquefação (a)
[0070] Geralmente, o material contendo amido no passo (a) pode conter 10-55% em peso de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% em peso de sólidos secos, mais preferencialmente 30-40% de sólidos secos.
[0071] A alfa-amilase e/ou a triacilglicerol lipase podem ser adicionadas antes do e/ou durante o passo de liquefação (a) opcionalmente com uma protease e/ou uma glucoamilase. Outras enzimas tais como uma pululanase, endoglucanase, hemicelulase (por exemplo, xilanase), fosfolipase C e fitase podem estar também presentes e/ou ser adicionadas na liquefação.
[0072] Em uma modalidade, o pH no passo (a) pode variar entre 4 e 7, tal como pH de 4,5-6,5, pH 5,0-6,5, pH 5,0-6,0, pH 5,2-6,2 ou cerca de 5,2, cerca de 5,4, cerca de 5,6 ou cerca de 5,8.
[0073] O passo (a) pode ser levado a cabo como um passo de liquefação a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial.
[0074] O termo “temperatura de gelatinização inicial” significa a temperatura mais baixa na qual a gelatinização do amido começa. O amido aquecido em água começa a gelatinizar entre 50 °C e 75 °C; a temperatura de gelatinização exata depende do amido específico e pode prontamente ser determinada pelo perito na técnica. Assim, a temperatura de gelatinização inicial pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta bem como com as condições de crescimento. No contexto desta divulgação, a temperatura de gelatinização inicial de um dado material contendo amido é a temperatura à qual a birrefrigência é perdida em 5% dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein. S. e Lii. C, Starch/Starke, Vol. 44 (12), pp. 461-466 (1992).
[0075] Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura entre 60 °C e 100 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura entre 70 °C e 100 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura entre 80-90 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura de cerca de 82 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura de cerca de 83 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura de cerca de 84 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura de cerca de 86 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura de cerca de 87 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura de cerca de 88 °C. Em uma modalidade, o passo (a) é levado a cabo a uma temperatura de cerca de 90 °C.
[0076] Em uma modalidade, um passo de cozimento a jato pode ser levado a cabo antes no passo (a). O cozimento a jato pode ser levado a cabo a uma temperatura entre 95 -140 °C durante cerca de 1-15 minutos, preferencialmente durante cerca de 3-10 minutos, especialmente cerca de 5 minutos.
[0077] Em uma modalidade, um processo da divulgação compreende adicionalmente, antes do passo (a), e passo de cozimento a jato opcional, os passos de: i) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem a seco; e ii) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.
[0078] O material de partida contendo amido, tal como grãos integrais, pode ser reduzido no tamanho das partículas, por exemplo, por moagem, de modo a abrir a estrutura, para aumentar a área superficial e permitir processamento adicional. Geralmente existem dois tipos de processos: moagem a úmido e a seco. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos e usados. A moagem a úmido dá uma boa separação do gérmen e farelo (grânulos de amido e proteína). A moagem a úmido é frequentemente aplicada em localizações onde o hidrolisado de amido é usado na produção de, por exemplo, xaropes. As moagens tanto a seco como a úmido são bem conhecidas na técnica de processamento de amido. De acordo com a presente divulgação é preferencial a moagem a seco. Em uma modalidade, o tamanho das partículas é reduzido até entre 0,05 e 3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm ou tal que pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, do material contendo amido passe através de uma peneira com uma tela de 0,05 a 3,0 mm, preferencialmente uma tela de 0,1-0,5 mm. Em outra modalidade, pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, especialmente pelo menos 90%, do material contendo amido passa através de uma peneira com tela # 6.
[0079] A pasta semifluida pode conter de 10-55% p/p de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% p/p de sólidos secos (DS), mais preferencialmente 30-40% p/p de sólidos secos (DS), de material contendo amido.
[0080] A pasta semifluida pode ser aquecida até acima da temperatura de gelatinização inicial, preferencialmente entre 70-95 °C, tal como entre 80-90 °C, entre pH 5,0-7,0, preferencialmente entre 5,0 e 6,0, durante 30 minutos a 5 horas, tal como em torno de 2 horas.
[0081] Em uma modalidade, o passo de liquefação a) é levado a cabo durante 0,5-5 horas a uma temperatura de 70-95 °C a um pH de 4-6.
[0082] Em uma modalidade preferencial, o passo de liquefação a) é levado a cabo durante 0,5-3 horas a uma temperatura de 80- 90 °C a um pH de 4-6.
[0083] A alfa-amilase e/ou triacilglicerol lipase e opcionalmente uma protease e/ou uma glucoamilase podem ser inicialmente adicionadas à pasta semifluida para iniciar a liquefação (diluição). Em uma modalidade, somente uma porção das enzimas (por exemplo, cerca de 1/4, cerca de 1/3, cerca de 1/2, etc.) é adicionada à pasta semifluida aquosa, enquanto que o resto das enzimas (por exemplo, cerca de 3/4, cerca de 2/3, cerca de 1/2, etc.) é adicionado durante o passo de liquefação a).
[0084] A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida a jato para gelatinizar adicionalmente a pasta semifluida antes de ser sujeita à liquefação no passo a). O cozimento a jato pode ser levado a cabo a uma temperatura entre 95-160 ºC, tal como entre 110-145 °C, preferencialmente 120-140 °C, tal como 125-135 °C, preferencialmente em torno de 130 °C durante cerca de 1-15 minutos, preferencialmente durante cerca de 3-10 minutos, especialmente cerca de 5 minutos.
[0085] Uma lista não exaustiva de alfa-amilases usadas na liquefação pode ser encontrada em baixo na seção “Alfa-Amilases”.
Exemplos de proteases adequadas usadas na liquefação incluem qualquer protease descrita na seção “Proteases”. Exemplos de triacilglicerídeo lipases adequadas usadas na liquefação incluem qualquer triacilglicerídeo lipases descrita na seção “Triacilglicerídeo Lipases”. Exemplos de glucoamilases adequadas usadas na liquefação incluem qualquer glucoamilase encontrada na seção de “Glucoamilases na liquefação”. Alfa-Amilases
[0086] A alfa-amilase usada no passo (a) pode ser qualquer alfa-amilase, mas é preferencialmente uma alfa-amilase bacteriana. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase bacteriana é derivada do gênero Bacillus. Uma alfa-amilase bacteriana preferencial pode ser derivada de uma estirpe de Bacillus stearothermophilus e pode ser uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela mostrada como SEQ ID NO: 1. As alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus são tipicamente truncadas naturalmente durante a produção. Em particular, a alfa-amilase pode ser uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus truncada tendo de 485-495 aminoácidos, tal como uma tendo em torno de 491 aminoácidos em comprimento (SEQ ID NO: 1).
[0087] De acordo com a presente divulgação, a alfa- amilase de Bacillus stearothermophilus pode ser aquela mostrada como SEQ ID NO: 1 ou uma tendo uma identidade de sequências com ela de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%.
[0088] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana pode ser selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus compreendendo uma delação de um ou mais aminoácidos em qualquer uma das posições R179, G180, I181 e/ou G182, preferencialmente a deleção dupla divulgada em WO 96/23873 – ver, por exemplo, página 20, linhas 1-10 (deste modo incorporada por referência),
preferencialmente correspondendo à deleção das posições I181 + G182 em comparação com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus apresentada como SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 1 aqui ou à deleção dos aminoácidos R179 +G180 usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração.
[0089] Em uma modalidade preferencial, a variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus compreende um dos seguintes conjuntos de mutações: - R179*+G180*; - I181*+G182*; - I181*+G182*+N193F; preferencialmente - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; - I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P +N224L+ Q254S; - I181*+G182*+N193F +V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q25 4S (usando SEQ ID NO: 1 para numeração).
[0090] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menor do que 100%.
[0091] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem de 1-12 mutações, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 mutações, em comparação com a alfa-amilase parental, especialmente a alfa-amilase mostrada como SEQ ID NO: 1.
[0092] Produtos de alfa-amilase bacteriana e produtos contendo alfa-amilases comercialmente disponíveis incluem TERMAMYL™ SC, LIQUOZYME™ SC, LIQUOZYME™ LpH, AVANTEC™, AVANTEC™
AMP, BAN (Novozymes A/S, Dinamarca) DEX-LO™, SPEZYME™ XTRA, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ FRED-L, SPEZYME™ ALPHA, GC358™, SPEZYME™ RSL, SPEZYME™ HPA e SPEZYME™ DELTA AA (da DuPont, EUA), FUELZYME®, FUELZYME®-LF (BASF/Verenium, EUA).
[0093] Uma alfa-amilase bacteriana pode ser adicionada no passo (a) em uma quantidade bem conhecida na técnica.
[0094] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana, por exemplo, alfa-amilase de Bacillus, tal como especialmente alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é doseada na liquefação em uma concentração entre 0,01-10 KNU-A/g de DS, por exemplo, entre 0,02 e 5 KNU-A/g de DS, tal como 0,03 e 3 KNU-A, preferencialmente 0,04 e 2 KNU- A/g de DS, tal como especialmente 0,01 e 2 KNU-A/g de DS. Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana, por exemplo, alfa-amilase de Bacillus, tal como especialmente alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é doseada para liquefação em uma concentração de entre 0,0001- 1 mg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, por exemplo, 0,0005-0,5 mg de EP/g de DS, tal como 0,001-0,1 mg de EP/g de DS.
Triacilglicerídeo Lipases
[0095] De acordo com a presente divulgação, triacilglicerídeo lipase (por exemplo, triacilglicerídeo lipase fúngica), preferencialmente uma triacilglicerídeo lipase termoestável tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C, é adicionada antes do ou durante o passo de liquefação a) e/ou passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0096] A termoestabilidade de uma triacilglicerídeo lipase pode ser determinada como descrito na seção Materiais & Métodos aqui.
[0097] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase tem um Ponto de Fusão (DSC) de mais do que ou igual a cerca de 60 °C, tal como entre 60 °C e 110 °C, tal como entre 65 °C e 95 °C, tal como entre 70 °C e 90 °C, tal como acima de 70 ºC, tal como acima de 72 °C, tal como acima de 80 °C, tal como acima de 85 °C, tal como acima de 90 °C, tal como acima de 92 °C, tal como acima de 94 °C, tal como acima de 96 °C, tal como acima de 98 °C, tal como acima de 100 °C.
[0098] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerídeo lipase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, tal como uma estirpe de Rhizomucor miehei.
[0099] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de triacilglicerol lipase. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 363 de SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 25 a 363 de SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a triacilglicerol lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 95-363 de SEQ ID NO: 3.
[0100] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerídeo lipase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus oryzae.
[0101] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de triacilglicerol lipase. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 ou um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 4.
[0102] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerídeo lipase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Moesziomyces, tal como uma estirpe de Moesziomyces antarcticus.
[0103] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de triacilglicerol lipase. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 ou um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 342 de SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 20 a 342 de SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 291 de SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 18-291 de SEQ ID NO: 6.
[0104] Em uma modalidade preferencial, a triacilglicerídeo lipase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Thermomyces, tal como uma estirpe de Thermomyces lanuginosus.
[0105] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de triacilglicerol lipase. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 291 de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade, a triacilglicerídeo lipase compreende os ou consiste nos aminoácidos 18 a 291 de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO:
8.
[0106] Uma triacilglicerídeo lipase pode ser adicionada e/ou estar presente no passo (a) em uma quantidade eficaz para aumentar o amido enzimaticamente acessível e/ou rendimento de produtos de fermentação, tal como especialmente o rendimento de etanol, durante os passos de SSF (b) e (c) ou passo de fermentação (c).
[0107] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase, tal como especialmente triacilglicerídeo lipase de Rhizomucor miehei, ou sua variante, é doseada na liquefação em uma concentração de cerca de 0,1-
50.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, tal como 10.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS ou, especialmente, tal como 5-1000 µg de EP/g de DS.
[0108] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase, tal como especialmente triacilglicerídeo lipase de Aspergillus oryzae, ou sua variante, é doseada na liquefação em uma concentração de cerca de 0,1-
50.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, tal como 10.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS ou, especialmente, tal como 5-1000 µg de EP/g de DS.
[0109] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase, tal como especialmente triacilglicerídeo lipase de Moesziomyces antarcticus, ou sua variante, é doseada na liquefação em uma concentração de cerca de 0,1-50.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, tal como 10.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS ou, especialmente, tal como 5-1000 µg de EP/g de DS.
[0110] Em uma modalidade, a triacilglicerídeo lipase, tal como especialmente triacilglicerídeo lipase de Thermomyces lanuginosus, ou sua variante, é doseada na liquefação em uma concentração de cerca de 0,1-50.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, tal como 10.000 µg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS ou, especialmente, tal como 5-1000 µg de EP/g de DS.
[0111] Opcionalmente, uma endoglucanase (por exemplo, endoglucanase termoestável), hemicelulase (por exemplo, xilanase, preferencialmente uma xilanase termoestável), uma fosfolipase C (por exemplo, uma fosfolipase C termoestável), uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidratos (por exemplo, glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase termoestável), uma pululanase e/ou uma fitase podem estar presentes e/ou ser adicionadas durante o passo de liquefação (a). As enzimas podem ser adicionadas individualmente ou como uma ou mais composições de combinação. Em algumas modalidades, o passo de liquefação (a) é levado a cabo na ausência de uma protease. Em algumas modalidades, o passo de liquefação (a) é levado a cabo na ausência de uma fosfolipase C. Em algumas modalidades, uma fosfolipase C não está presente e/ou é adicionada no passo de liquefação (a). Proteases
[0112] Nos processos descritos aqui, uma protease pode opcionalmente estar presente e/ou ser adicionada à pasta semifluida e/ou liquefação em conjunto com alfa-amilase, triacilglicerol lipase e uma glucoamilase, fosfolipase C, xilanase, endoglucanase, fitase e/ou pululanase opcionais.
[0113] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas, ou ainda não classificadas, (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.
[0114] Em algumas modalidades, o organismo fermentador compreende um polinucleotídeo heterólogo codificando uma protease, por exemplo, como descrito na Patente Provisória dos EUA No. 62/514,636 depositada a 2 de junho, 2017, o conteúdo da qual é deste modo incorporado por referência. Qualquer protease descrita ou referenciada aqui é contemplada para expressão no organismo fermentador.
[0115] A protease pode ser qualquer protease que seja adequada para as células hospedeiras e/ou os métodos descritos aqui, tal como uma protease ocorrendo naturalmente ou uma sua variante que retenha atividade de protease.
[0116] Em algumas modalidades, o organismo fermentador compreendendo um polinucleotídeo heterólogo codificando uma protease tem um nível aumentado de atividade de protease em comparação com as células hospedeiras sem o polinucleotídeo heterólogo codificando a protease, quando cultivado sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, o organismo fermentador tem um nível aumentado de atividade de protease de pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300% ou pelo 500% em comparação com o organismo fermentador sem o polinucleotídeo heterólogo codificando a protease, quando cultivado sob as mesmas condições.
[0117] Proteases exemplificativas que podem ser usadas com as células hospedeiras e/ou os métodos descritos aqui incluem proteases arqueobacterianas, bacterianas, de levedura ou fúngicas filamentosas, por exemplo, derivadas de qualquer um dos microrganismos descritos ou referenciados aqui.
[0118] Em uma modalidade, a protease termoestável usada de acordo com um processo descrito aqui é uma “metaloprotease” definida como uma protease pertencendo a EC 3.4.24 (metaloendopeptidases); preferencialmente EC 3.4.24.39 (metaloproteinases ácidas).
[0119] Para se determinar se uma dada protease é uma metaloprotease ou não é feita referência ao “Handbook of Proteolytic Enzymes” acima e aos princípios indicados aí. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.
[0120] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio adequado, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeos relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio são do mesmo modo para ser adaptados à protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80 °C.
[0121] Exemplos de substratos de proteases são caseína, tal como Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína).
[0122] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos
95%, tal como pelo menos 100%, da atividade de protease da variante 196 de Protease ou Protease Pfu.
[0123] Não existem nenhumas limitações quanto à origem da protease usada em um processo descrito aqui desde que ela atenda às propriedades de termoestabilidade definidas em baixo.
[0124] Em uma modalidade, a protease tem origem fúngica.
[0125] A protease pode ser uma variante de, por exemplo, uma protease de tipo selvagem desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade definidas aqui. Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante de uma metaloprotease como definida acima. Em uma modalidade, a protease termoestável usada em um processo descrito aqui tem origem fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica derivada de uma estirpe do gênero Thermoascus, preferencialmente uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 (classificada como EC 3.4.24.39).
[0126] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da parte madura da metaloprotease mostrada em SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou da parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 adicionalmente com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: S5*+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; A37P+D79L+S87P+A112P+D142L; S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L; Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; e D79L+S87P+D142L.
[0127] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841, com uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; e A27K+ D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.
[0128] Em uma modalidade, a variante de protease tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente, pelo menos, 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841.
[0129] A protease termoestável pode ser também derivada de qualquer bactéria desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade.
[0130] Em uma modalidade, a protease termoestável é derivada de uma estirpe da arqueobactéria (previamente classificada como bactéria) Pyrococcus, tal como uma estirpe de Pyrococcus furiosus (protease pfu), for exemplo, a protease de Pyrococcus furiosus de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade, com ela.
[0131] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma mostrada como SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA No. 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company).
[0132] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade, com SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA no. 6,358,726-B1. A protease de Pyrococcus furiosus pode ser adquirida a partir da Takara Bio, Japão.
[0133] A protease de Pyrococcus furiosus é uma protease termoestável. Foi descoberto que o produto comercial protease de Pyrococcus furiosus (PfuS) tem uma termoestabilidade de 110% (80 °C/70 °C) e 103% (90 °C/70 °C) a pH 4,5.
[0134] Em uma modalidade, uma protease termoestável usada em um processo descrito aqui tem um valor de termoestabilidade de mais do que 20% determinada como Atividade Relativa a 80 ºC/70 ºC.
[0135] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, tal como mais do que 105%, tal como mais do que 110%, tal como mais do que 115%, tal como mais do que 120%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.
[0136] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de entre 20 e 50%, tal como entre 20 e 40%, tal como 20 e 30%, determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C. Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 50 e 115%, tal como entre 50 e 70%, tal como entre 50 e 60%, tal como entre 100 e 120%, tal como entre 105 e 115%, determinada como Atividade Relativa a
80 °C/70 °C.
[0137] Em uma modalidade, a protease tem um valor de termoestabilidade de mais do que 10% determinada como Atividade Relativa a 85 ºC/70 ºC.
[0138] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 10%, tal como mais do que 12%, mais do que 14%, mais do que 16%, mais do que 18%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, mais do que 110%, determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.
[0139] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 10 e 50%, tal como entre 10% e 30%, tal como entre 10% e 25%, determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.
[0140] Em uma modalidade, a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Restante a 80 °C; e/ou a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Restante a 84 °C.
[0141] A determinação da “Atividade Relativa” e “Atividade Restante” é feita como descrito na técnica (por exemplo, PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017).
[0142] Em uma modalidade, a protease pode ter uma termoestabilidade acima de 90, tal como acima de 100, a 85 °C como determinada usando o teste de Zeína-BCA.
[0143] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110%, a 85 °C como determinada usando um ensaio de Zeína-BCA.
[0144] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 60-120, tal como entre 70-120%, tal como entre 80- 120%, tal como entre 90-120%, tal como entre 100-120%, tal como 110- 120%, a 85ºC como determinada usando um ensaio de Zeína-BCA.
[0145] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 100%, da atividade da variante da protease JTP196 ou Protease Pfu determinada por um ensaio de AZCL-caseína.
[0146] Proteases adicionais contempladas para uso com a presente invenção podem ser encontradas na Patente Provisória dos EUA No. 62/514,636 depositada a 2 de junho, 2017 (o conteúdo da qual é incorporado aqui).
[0147] Polinucleotídeos adicionais codificando proteases adequadas podem ser obtidos de microrganismos de qualquer gênero, incluindo aqueles prontamente disponíveis dentro da base de dados UniProtKB (www.uniprot.org).
[0148] As sequências codificando proteases podem ser também usadas para desenhar sondas de ácidos nucleicos para identificar e clonar DNA codificando proteases de estirpes de gêneros ou espécies diferentes, como descrito supra.
[0149] Os polinucleotídeos codificando proteases podem ser também identificados e obtidos de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) como descrito supra.
[0150] As técnicas usadas para isolar ou clonar polinucleotídeos codificando proteases são descritas supra.
[0151] A protease pode também incluir polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão clivável, como descrito supra.
[0152] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma serina protease, por exemplo, uma protease S8, tal como uma divulgada em US 62/567,841, depositada a 4 de outubro, 2017 (No. de Registro do Procurador 14484-US-PRO), que é deste modo incorporada aqui por referência em sua totalidade.
[0153] Em uma modalidade, a protease S8 é derivada de Palaeococcus, por exemplo Palaeococcus ferrophilus, tal como a protease S8 de Palaeococcus ferrophilus de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 65% de identidade, pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade, com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[0154] Em uma modalidade, a protease S8 é derivada de Thermococcus, por exemplo Thermococcus litoralis ou Thermococcus thioreducens, tal como a protease S8 de Thermococcus litoralis de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 65% de identidade, pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade, com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou a protease S8 de Thermococcus thioreducens de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 65% de identidade, pelo menos 70% de identidade, pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade, com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Glucoamilase na Liquefação
[0155] Uma glucoamilase pode opcionalmente estar presente e/ou ser adicionada no passo de liquefação e/ou à pasta semifluida antes do cozimento a jato e/ou liquefação opcionais. Em uma modalidade, a glucoamilase é adicionada em conjunto com a ou separadamente da alfa- amilase e/ou a protease, endoglucanase, fosfolipase C, xilanase, fitase e/ou pululanase opcionais.
[0156] Em algumas modalidades, o organismo fermentador compreende um polinucleotídeo heterólogo codificando uma glucoamilase, por exemplo, como descrito em WO 2017/087330, o conteúdo do qual é deste modo incorporado por referência. Qualquer glucoamilase descrita ou referenciada aqui é contemplada para expressão no organismo fermentador.
[0157] A glucoamilase pode ser qualquer glucoamilase que seja adequada para as células hospedeiras e/ou os métodos descritos aqui, tal como uma glucoamilase ocorrendo naturalmente ou uma sua variante que retenha atividade de glucoamilase.
[0158] Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma Atividade Relativa com estabilidade térmica a 85 °C de pelo menos 20%, pelo menos 30% ou pelo menos 35%, determinada como descrito no Exemplo 4 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017 (estabilidade térmica).
[0159] Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma atividade relativa a pH ótimo de 5,0 de pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou 100%, determinada como descrito no Exemplo 4 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017 (pH ótimo).
[0160] Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma estabilidade de pH a pH 5,0 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, determinada como descrito no Exemplo 4 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017(estabilidade do pH).
[0161] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, usada na liquefação tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,0 como descrito no Exemplo 15 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017, de pelo menos 70 °C, preferencialmente pelo menos 75 °C, tal como pelo menos 80 °C, tal como pelo menos 81 °C, tal como pelo menos 82 °C, tal como pelo menos 83 °C, tal como pelo menos 84 °C, tal como pelo menos 85 °C, tal como pelo menos 86 °C, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88 °C, tal como pelo menos 89 °C, tal como pelo menos 90 °C. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,0 como descrito no Exemplo 15 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017, na gama entre 70 °C e 95 °C, tal como entre 80 °C e 90 °C.
[0162] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, usada na liquefação tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,8 como descrito no Exemplo 15 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017, de pelo menos 70 °C, preferencialmente pelo menos 75 °C, tal como pelo menos 80 °C, tal como pelo menos 81 °C, tal como pelo menos 82 °C, tal como pelo menos 83 °C, tal como pelo menos 84 °C, tal como pelo menos 85 °C, tal como pelo menos 86 °C, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88 °C, tal como pelo menos 89 °C, tal como pelo menos 90 °C, tal como pelo menos 91 °C. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, tem uma termoestabilidade determinada como Td por DSC a pH 4,8 como descrito no Exemplo 15 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017, na gama entre 70 °C e 95 °C, tal como entre 80 °C e 90 °C.
[0163] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, usada na liquefação tem uma atividade residual determinada como descrito no Exemplo 16 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017, de pelo menos 100%, tal como pelo menos 105%, tal como pelo menos 110%, tal como pelo menos 115%, tal como pelo menos 120%, tal como pelo menos 125%. Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, tem uma termoestabilidade determinada como atividade residual como descrito no Exemplo 16 de PCT/US2017/063159, depositada a 22 de novembro, 2017, na gama entre 100% a 130%.
[0164] Em uma modalidade, a glucoamilase, por exemplo, de origem fúngica tal como um fungo filamentoso, de uma estirpe do gênero Penicillium, por exemplo, uma estirpe de Penicillium oxalicum, em particular a glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 (que é deste modo incorporada por referência) e mostrada em SEQ ID NO: 12.
[0165] Em uma modalidade, a glucoamilase tem pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade com o polipeptídeo maduro mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 12 aqui.
[0166] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada em SEQ ID NO: 12, tendo uma substituição K79V. A variante de glucoamilase K79V tem uma sensibilidade reduzida à degradação por proteases em relação ao parente como divulgado em WO 2013/036526 (que é deste modo incorporada por referência).
[0167] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Penicillium oxalicum.
[0168] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802. Em uma modalidade, a glucoamilase de Penicillium oxalicum é aquela divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 tendo Val (V) na posição 79.
[0169] Variantes de glucoamilase de Penicillium oxalicum contempladas são divulgadas em WO 2013/053801 que é deste modo incorporada por referência.
[0170] Em uma modalidade, estas variantes têm sensibilidade reduzida à degradação por proteases.
[0171] Em uma modalidade, estas variantes têm termoestabilidade melhorada em comparação com o parente.
[0172] Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 2 de WO 2011/127802 para numeração), correspondendo à variante PE001, e compreende adicionalmente uma das seguintes alterações ou combinações de alterações. T65A; Q327F; E501V; Y504T; Y504*; T65A + Q327F; T65A + E501V; T65A + Y504T; T65A + Y504*; Q327F + E501V; Q327F + Y504T; Q327F + Y504*; E501V + Y504T; E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V; T65A + Q327F + Y504T; T65A + E501V + Y504T; Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + Y504*; T65A + E501V + Y504*; Q327F + E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; T65A + K161S; T65A + Q405T; T65A + Q327W; T65A + Q327F; T65A + Q327Y; P11F + T65A + Q327F; R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; P11F + T65A + Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + S105P + Q327W; T65A + S105P + Q327F; T65A + Q327W + S364P; T65A + Q327F + S364P; T65A + S103N + Q327F; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + N564D + K571S; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A +
Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + V79A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79G + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79I + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79L + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; S255N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + E74N + V79K + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + G220N +
Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Y245N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S465N + E501V + Y504T; e P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.
[0173] Em uma modalidade, a variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 2 de WO 2011/127802 para numeração), correspondendo à variante PE001, e compreende adicionalmente uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: P11F + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; e P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T.
[0174] A glucoamilase pode ser adicionada em quantidades de 0,1-100 microgramas de EP/g, tal como 0,5-50 microgramas de EP/g, tal como 1-25 microgramas de EP/g, tal como 2-12 microgramas de EP/g de DS.
[0175] Em uma modalidade, a glucoamilase tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com qualquer glucoamilase descrita ou referenciada aqui. Em um aspecto, a sequência de glucoamilase difere em não mais do que dez aminoácidos, por exemplo, em não mais do que cinco aminoácidos, em não mais do que quatro aminoácidos, em não mais do que três aminoácidos, em não mais do que dois aminoácidos ou em um aminoácido de qualquer glucoamilase descrita ou referenciada aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer glucoamilase descrita ou referenciada aqui, variante alélica ou um seu fragmento tendo atividade de glucoamilase. Em uma modalidade, a glucoamilase tem uma substituição, deleção, e/ou inserção de aminoácidos de um ou mais (por exemplo, dois, vários) aminoácidos. Em alguns aspectos, o número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos é não mais do que 10, por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1.
[0176] Em algumas modalidades, a glucoamilase tem pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% da atividade de glucoamilase de qualquer glucoamilase descrita ou referenciada aqui sob as mesmas condições.
[0177] Em algumas modalidades, a glucoamilase compreende uma variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum tendo as seguintes mutações: K79V + P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando SEQ ID NO: 11 aqui para numeração). Fosfolipase C na liquefação
[0178] Uma fosfolipase C pode opcionalmente estar presente e/ou ser adicionada no passo de liquefação e/ou à pasta semifluida antes do cozimento a jato e/ou liquefação opcionais. Em uma modalidade, a fosfolipase C é adicionada em conjunto com a ou separadamente da alfa- amilase, triacilglicerol lipase e/ou a protease, endoglucanase, fosfolipase C, xilanase, fitase e/ou pululanase opcionais.
[0179] Exemplos de polipeptídeos de fosfolipase C adequados são descritos em WO2017/112542, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a fosfolipase C é uma PLC de Penicillium emersonii (PePLC) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 aí ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 aí. Em uma modalidade, a fosfolipase C é uma PLC de Trichoderma harzianum tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 aí ou SEQ ID NO: 8 aí ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 aí ou SEQ ID NO: 8 aí. Em uma modalidade, a lipase adicionada à liquefação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas não é uma fosfolipase C. Em uma modalidade, a liquefação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas são levadas a cabo na ausência de uma fosfolipase C, opcionalmente na ausência de uma PePLC ou uma fosfolipase C de Trichoderma harzianum. B. Passo de Sacarificação (b)
[0180] O passo de liquefação (a) é seguido por sacarificação de dextrinas no passo (b). De acordo com a presente divulgação, uma triacilglicerídeo lipase é adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (b). A triacilglicerídeo lipase pode ser adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (b), independentemente da adição de uma triacilglicerídeo lipase ao passo de liquefação (a) ou subsequente à adição da triacilglicerídeo lipase ao passo de liquefação (a).
[0181] Em uma modalidade, um processo da divulgação pode compreender um passo de pré-sacarificação, i.e., após o passo (a), mas antes do passo de sacarificação (b), levado a cabo durante 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C.De acordo com a presente divulgação, uma triacilglicerídeo lipase é adicionada durante o passo de pré- sacarificação entre o passo de liquefação (a) e o passo de sacarificação (b). A triacilglicerídeo lipase pode ser adicionada durante o passo de pré- sacarificação independentemente da adição de uma triacilglicerídeo lipase ao passo de liquefação (a) ou passo de sacarificação (b) ou subsequente à adição da triacilglicerídeo lipase ao passo de liquefação (a) e antes da adição subsequente de uma triacilglicerídeo lipase ao passo de sacarificação (b).
[0182] De acordo com a presente divulgação, o passo de sacarificação (b) pode ser levado a cabo a uma temperatura de 20-75 °C, preferencialmente de 40-70 °C, tal como em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5.
[0183] Em uma modalidade preferencial, o passo de fermentação (c) ou a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) (i.e.,
passos (b) e (c) combinados) podem ser levados a cabo a uma temperatura entre 20-60 °C, preferencialmente entre 25-40 °C, tal como em torno de 32 °C. Em uma modalidade, o passo de fermentação (c) ou a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) decorrem durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.
[0184] De acordo com a presente divulgação, uma triacilglicerídeo lipase, preferencialmente uma triacilglicerídeo lipase termoestável (por exemplo, uma tendo um ponto de fusão (DSC) de pelo menos 65 C),está presente e/ou é adicionada durante o passo de sacarificação (b) e/ou passo de fermentação (c) ou passo de sacarificação (b) e passo de fermentação (c) simultâneos (SSF). A triacilglicerídeo lipase adicionada desta maneira pode ser adicionalmente a uma triacilglicerídeo lipase adicionada durante o passo de liquefação (a) e/ou durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b) e/ou (c).
[0185] De acordo com a presente divulgação, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, preferencialmente uma glucoamilase, está presente e/ou é adicionada durante o passo de sacarificação (b) e/ou passo de fermentação (c) ou passo de sacarificação (b) e passo de fermentação (c) simultâneos (SSF).
[0186] O termo “enzima geradora de fonte de carboidratos” inclui quaisquer enzimas gerando açúcares fermentáveis. Uma enzima geradora de fonte de carboidratos é capaz de produzir um ou mais carboidratos que podem ser usados como uma fonte de energia pelo(s) organismo(s) fermentador(es) em questão, por exemplo, quando usados em um processo da divulgação para produção de etanol. Os carboidratos gerados podem ser convertidos diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado, preferencialmente etanol. De acordo com a divulgação pode ser usada uma mistura de enzimas geradoras de fonte de carboidratos.
[0187] Exemplos específicos de atividades da enzima geradora de fonte de carboidratos incluem glucoamilase (sendo geradoras de glucose), beta-amilase e amilase maltogênica (sendo geradoras de maltose). Uma “alfa-amilase maltogênica” (glucana 1,4-alfa-maltoidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa. Uma amilase maltogênica da estirpe de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponível a partir da Novozymes A/S. Alfa-amilases maltogênicas são descritas nas Patentes dos EUA nos. 4,598,048, 4,604,355 e 6,162,628, que são deste modo incorporadas por referência. A amilase maltogênica pode em uma modalidade preferencial ser adicionada em uma quantidade de 0,05-5 mg de proteína total/grama de DS ou 0,05-5 MANU/g de DS.
[0188] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidratos é uma glucoamilase.
[0189] O processo da divulgação, incluindo os passos (b) e/ou (c), podem ser levados a cabo usando qualquer glucoamilase adequada. A glucoamilase pode ter qualquer origem, em particular, origem fúngica.
[0190] Glucoamilases contempladas incluem aquelas do grupo consistindo em glucoamilases de Aspergillus, em particular glucoamilase G1 ou G2 de A. niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), ou suas variantes, tais como aquelas divulgadas em WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (da Novozymes, Dinamarca); a glucoamilase de A. awamori divulgada em WO 84/02921, glucoamilase de A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949) ou suas variantes ou fragmentos. Outras variantes de glucoamilase de Aspergillus incluem variantes com estabilidade térmica intensificada: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281);
ligações de dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698- 8704; e introdução de resíduos de Pro nas posições A435 e S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199-1204).
[0191] Outras glucoamilases contempladas incluem glucoamilase derivada de uma estirpe de Athelia, preferencialmente uma estirpe de glucoamilase de Athelia rolfsii (previamente denotada Corticium rolfsii) (ver patente dos EUA no. 4,727,026 e Nagasaka,Y. et al. (1998) “Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii”, Appl Microbiol Biotechnol 50: 323-330), glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente dos EUA no. Re. 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente dos EUA no. 4,587,215). São também contempladas glucoamilases de Trichoderma reesei incluindo aquela divulgada como SEQ ID NO: 4 em WO 2006/060062 e glucoamilases sendo pelo menos 80% ou pelo menos 90% idênticas a ela (deste modo incorporadas por referência).
[0192] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma estirpe de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou uma estirpe de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii.
[0193] Em uma modalidade, a glucoamilase presente e/ou adicionada durante o passo de sacarificação (b) e/ou passo de fermentação (c) tem origem fúngica, tal como de uma estirpe de Pycnoporus ou uma estirpe de Gloephyllum. Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus sanguineus descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), tal como aquela mostrada como SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576.
[0194] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de
Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular uma estirpe de Gloeophyllum como descrito em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é o Gloeophyllum sepiarium mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803.
[0195] Outras glucoamilases contempladas incluem glucoamilase derivada de uma estirpe de Trametes, preferencialmente uma estirpe de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 34 em WO 2006/069289 (que é deste modo incorporada por referência).
[0196] Glucoamilases bacterianas contempladas incluem glucoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138), e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).
[0197] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL, SPIRIZYME™ ACHIEVE, SPIRIZYME™ B4U e AMG™ E (da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300 (da Genencor Int.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (da Genencor Int.).
[0198] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas em uma quantidade de 0,02-20 AGU/g de DS, preferencialmente 0,05-5 AGU/g de DS (no vinhoto inteiro), especialmente entre 0,1-2 AGU/g de DS.
[0199] A glucoamilase pode ser adicionada em uma quantidade eficaz, preferencialmente na gama de 0,001-1 mg de proteína enzimática por g de DS, preferencialmente 0,01-0,5 mg de proteína enzimática por g de sólido seco (DS).
[0200] Opcionalmente, uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1) pode ser adicionada durante o passo de sacarificação (b) e/ou passo de fermentação (c). A alfa-amilase pode ter qualquer origem, mas tem tipicamente origem fúngica filamentosa. De acordo com a divulgação, uma alfa-amilase adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação é tipicamente uma alfa-amilase ácida fúngica.
[0201] As alfa-amilases ácidas fúngicas podem ser uma alfa-amilase fúngica ácida derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae e Aspergillus niger.
[0202] Uma alfa-amilase ácida fúngica adequada é uma derivada de uma estirpe de Aspergillus niger. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase ácida fúngica é aquela de A. niger divulgada como “AMYA_ASPNG” na base de dados Swiss-prot/TeEMBL sob o no. de acesso primário P56271 e descrita com mais detalhe em WO 89/01969 (Exemplo 3). A alfa-amilase ácida de Aspergillus niger é também mostrada como SEQ ID NO: 1 em WO 2004/080923 (Novozymes) que é deste modo incorporada por referência. São também contempladas variantes da referida amilase fúngica ácida tendo pelo menos 70% de identidade, tal como pelo menos 80% ou mesmo pelo menos 90% de identidade, tal como pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade com SEQ ID NO: 1 em WO 2004/080923. Uma alfa- amilase fúngica ácida comercialmente disponível adequada derivada de Aspergillus niger é SP288 (disponível a partir da Novozymes A/S, Dinamarca).
[0203] A alfa-amilase ácida fúngica pode ser também pode ser uma enzima de tipo selvagem compreendendo um módulo de ligação a carboidratos (CBM) e um domínio catalítico de alfa-amilase (i.e., um não híbrido) ou uma sua variante. Em uma modalidade, a alfa-amilase ácida fúngica de tipo selvagem é derivada de uma estirpe de Aspergillus kawachii.
[0204] Um exemplo específico de uma alfa-amilase híbrida contemplada inclui a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger (que é divulgada na Tabela 5 como uma combinação das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 96 no pedido dos EUA no. 11/316,535) (deste modo incorporado por referência). Em outra modalidade, a alfa-amilase ácida fúngica híbrida é uma alfa-amilase de Meripilus giganteus com ligante de glucoamilase e SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 102 em US 60/638,614) (deste modo incorporada por referência). Outros exemplos específicos de alfa-amilases híbridas contempladas incluem aquelas divulgadas na Publicação da Patente dos E.U.A. no. 2005/0054071, incluindo aquelas divulgadas na Tabela 3 na página 15, tais como alfa-amilase de Aspergillus niger com ligante e domínio de ligação ao amido de Aspergillus kawachii.
[0205] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase ácida fúngica é uma divulgada em WO 2013/006756 incluindo as seguintes variantes: Variante de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger que compreende adicionalmente pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H + Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C.
[0206] Uma alfa-amilase ácida pode de acordo com a divulgação ser adicionada em uma quantidade de 0,1 a 10 AFAU/g de DS, preferencialmente 0,10 a 5 AFAU/g de DS, especialmente 0,3 a 2 AFAU/g de DS.
C. Organismos Fermentadores
[0207] O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, especialmente levedura, adequado para uso em um processo de fermentação e capaz de produzir o produto de fermentação desejado.
[0208] Exemplos de organismos fermentadores usados no passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas (i.e., SSF) para converter açúcares fermentáveis no meio de fermentação em produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, incluem organismos fúngicos, tais como especialmente levedura. A levedura preferencial inclui estirpes de Saccharomyces spp., em particular, Saccharomyces cerevisiae.
[0209] Concentrações adequadas do organismo fermentador viável durante a fermentação, tal como SFS, são bem conhecidas na técnica ou podem ser facilmente determinadas pelo perito na técnica. Em uma modalidade, o organismo fermentador, tal como levedura fermentadora de etanol (p. ex., Saccharomyces cerevisiae), é adicionado ao meio de fermentação tal que a contagem do organismo fermentador viável, tal como levedura, por mL de meio de fermentação esteja na gama de 105 a 1012, preferencialmente de 107 a 1010, especialmente cerca de 5 x 107.
[0210] “Meio de fermentação” se refere ao ambiente no qual a fermentação é levada a cabo. O meio de fermentação inclui o substrato da fermentação, isto é, a fonte de carboidratos que é metabolizada pelo organismo fermentador. De acordo com a presente divulgação, o meio de fermentação pode compreender nutrientes e estimulante(s) do crescimento para o(s) organismo(s) fermentador(es). Nutrientes e estimulantes do crescimento são amplamente usados na técnica de fermentação e incluem fontes de nitrogênio, tais como amônia; ureia, vitaminas e minerais ou suas combinações.
[0211] Exemplos de leveduras comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, levedura RED STAR™ e ETHANOL RED (disponível a partir da Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI (disponível a partir da Fleischmann’s Yeast, EUA), leveduras frescas SUPERSTART e THERMOSACC™ (disponíveis a partir da Ethanol Technology, WI, EUA), BIOFERM AFT e XR (disponíveis a partir da NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), GERT STRAND (disponível a partir da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL (disponível a partir da DSM Specialties). D. Materiais contendo amido
[0212] Qualquer material que contém amido adequado pode ser usado como material de partida de acordo com a presente divulgação. Exemplos de materiais contendo amido adequados para uso em um processo da divulgação incluem grãos integrais, milho, trigo, cevada, centeio, sorgo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijões ou batatas doce ou suas misturas ou amidos derivados dos mesmos ou cereais. São também contemplados tipos cerosos e não cerosos de milho e cevada.
[0213] Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido, usado para produção de produtos de fermentação, tal como especialmente produção de etanol, é milho ou trigo. E. Produtos de Fermentação
[0214]O termo “produto de fermentação” significa um produto produzido por um processo incluindo um passo de fermentação usando um organismo fermentador. Os produtos de fermentação contemplados de acordo com a invenção incluem álcoois (p. ex., etanol, metanol, butanol; polióis tais como glicerol, sorbitol e inositol); ácidos orgânicos (p. ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido lático, ácido succínico, ácido glucônico); cetonas (p. ex., acetona); aminoácidos (p. ex., ácido glutâmico); gases (p. ex., H2 e CO2); antibióticos (p. ex., penicilina e tetraciclina);
enzimas; vitaminas (p. ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol, p. ex., etanol combustível; etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (p. ex., cerveja e vinho), indústria dos laticínios (p. ex., produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Preferencialmente, os processos da presente divulgação são usados para produção de um álcool, tal como etanol. O produto de fermentação, tal como etanol, obtido de acordo com a presente divulgação, pode ser usado como combustível, que é tipicamente combinado com gasolina. No entanto, no caso do etanol, pode ser também usado como etanol potável. F. Recuperação
[0215]Subsequente à fermentação, ou SFS, o produto de fermentação pode ser separado a partir do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser destilada para se extrair o produto de fermentação desejado (por exemplo, etanol). Alternativamente, o produto de fermentação desejado pode ser extraído a partir do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração com membranas. O produto de fermentação pode ser também recuperado por separação ou outro método bem conhecido na técnica. III. Usos
[0216] Ainda em outro aspecto, a presente divulgação se relaciona com o uso de uma triacilglicerol lipase durante a liquefação, pré- sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas em um processo de produção de produtos de fermentação para aumento do amido enzimaticamente acessível e/ou rendimento de um produto de fermentação (por exemplo, rendimento de etanol).
[0217] Qualquer triacilglicerol lipase, por exemplo uma triacilglicerol lipase descrita acima, pode ser usada em um passo de liquefação, pré-sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de etanol para aumentar o amido enzimaticamente acessível e/ou rendimento de etanol.
[0218] Em modalidades preferenciais, a triacilglicerol lipase tem origem fúngica (por exemplo, uma triacilglicerol lipase fúngica termoestável).
[0219] Em modalidades preferenciais, a triacilglicerol lipase usada no passo de liquefação, passo de pré-sacarificação, passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, tal como uma estirpe de Rhizomucor miehei.
[0220] Em modalidades preferenciais, a triacilglicerol lipase usada no passo de liquefação, passo de pré-sacarificação, passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus oryzae.
[0221] Em modalidades preferenciais, a triacilglicerol lipase usada no passo de liquefação, passo de pré-sacarificação, passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO:5 aqui ou SEQ ID NO: 6 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Moesziomyces, tal como uma estirpe de Moesziomyces antarcticus.
[0222] Em modalidades preferenciais, a triacilglicerol lipase usada no passo de liquefação, passo de pré-sacarificação, passo de sacarificação, passo de fermentação e/ou passo de sacarificação e fermentação simultâneas tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO:7 aqui ou SEQ ID NO: 8 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Thermomyces, tal como uma estirpe de Thermomyces lanuginosus. IV. Exemplos de Modalidades Preferenciais da Divulgação
[0223] Em uma modalidade preferencial, a presente divulgação se relaciona com um processo para produção de etanol a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,0-6,5 a uma temperatura na gama de 70-100 °C usando: - uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; - uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C; (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; e (c) fermentação usando um organismo fermentador. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (a), passo de fermentação (b) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0224] Em uma modalidade preferencial, a presente divulgação se relaciona com um processo para produção de etanol a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,0-6,5 a uma temperatura na gama de 70-100 °C usando uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus; (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; e (c) fermentação usando um organismo fermentador, em que uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C, é adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (b). Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0225] Em uma modalidade preferencial, o processo da divulgação compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,5-6,2 a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: - uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, tendo um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM de pelo menos 10; - uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C; (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; e (c) fermentação usando um organismo fermentador. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (a), passo de fermentação (b) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0226] Em uma modalidade preferencial, o processo da divulgação compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,5-6,2 a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa-amilase, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, tendo um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM de pelo menos 10; (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; e (c) fermentação usando um organismo fermentador, em que uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C, é adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (b). Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0227] Em uma modalidade preferencial, o processo da divulgação compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,0-6,5 a uma temperatura entre 70-100 °C usando: - uma alfa-amilase bacteriana, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, tendo um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM de pelo menos 10; - uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C; (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; e (c) fermentação usando um organismo fermentador. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (a), passo de fermentação (b) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0228] Em uma modalidade preferencial, o processo da divulgação compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,0-6,5 a uma temperatura entre 70-100 ºC usando uma alfa-amilase bacteriana, preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus, tendo um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM de pelo menos 10; (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; e (c) fermentação usando um organismo fermentador, em que uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C, é adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (b). Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0229] Em uma modalidade preferencial, o processo da divulgação compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,0-6,5 a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando: - uma alfa-amilase mostrada em SEQ ID NO: 1 tendo uma deleção dupla nas posições R179 + G180 ou I181 + G182 e substituição opcional N193F; e opcionalmente adicionalmente um dos seguintes conjuntos de substituições: - E129V+K177L+R179E; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração); - uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 80 °C, tal como uma triacilglicerol lipase tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui; (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; (c) fermentação usando um organismo fermentador. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (a), passo de fermentação (b) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré- sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0230] Em uma modalidade preferencial, o processo da divulgação compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,0-6,5 a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma alfa-amilase mostrada em SEQ ID NO: 1 tendo uma deleção dupla nas posições R179 + G180 ou I181 + G182 e substituição opcional N193F; e opcionalmente adicionalmente um dos seguintes conjuntos de substituições: - E129V + K177L + R179E; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração); (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; (c) fermentação usando um organismo fermentador, em que uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 80 °C, tal como uma triacilglicerol lipase tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui, é adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (a), passo de fermentação (b) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (b). Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0231] Em uma modalidade preferencial, o processo da divulgação compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,0-6,5 a uma temperatura entre 70-100 °C usando: - uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus tendo uma deleção dupla nas posições I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente adicionalmente um dos seguintes conjuntos de substituições: - V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + H208Y + K220P + N224L + Q254S; ou - V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração); - uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C, cerca de 73 ºC, cerca de 86 ºC ou cerca de 90 ºC; tal como uma triacilglicerol lipase tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui; e - opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum em SEQ ID NO:12 aqui, preferencialmente tendo substituições selecionadas do grupo de: - K79V; ou - K79V + P11F + T65A + Q327F; ou - K79V + P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando SEQ ID NO: 12 aqui para numeração; (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; (c) fermentação usando um organismo fermentador. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (a), passo de fermentação (b) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0232] Em uma modalidade preferencial, o processo da divulgação compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a um pH na gama entre 4,0-6,5 a uma temperatura entre 70-100 °C usando: - uma alfa-amilase derivada de Bacillus stearothermophilus tendo uma deleção dupla nas posições I181 + G182 e uma substituição opcional N193F; e opcionalmente adicionalmente um dos seguintes conjuntos de substituições: - V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + H208Y + K220P + N224L + Q254S; ou - V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V (usando SEQ ID NO: 1 aqui para numeração); e opcionalmente uma glucoamilase de Penicillium oxalicum em SEQ ID NO: 12 aqui, preferencialmente tendo substituições selecionadas do grupo de: - K79V; ou - K79V + P11F + T65A + Q327F; ou - K79V + P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando SEQ ID NO: 12 aqui para numeração); (b) sacarificação usando uma enzima glucoamilase; (c) fermentação usando um organismo fermentador, em que uma triacilglicerol lipase, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de pelo menos cerca de 65 °C, cerca de 73 ºC, cerca de 86 ºC ou cerca de 90 ºC; tal como uma triacilglicerol lipase tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui, é adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (a), passo de fermentação (b) ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (b). Em uma modalidade, uma triacilglicerol lipase é também adicionada durante um passo de pré-sacarificação entre os passos (a) e (b).
[0233] Em outra modalidade preferencial, a divulgação se refere a processos de produção de etanol, compreendendo: (a) liquefação de um material contendo amido usando a alfa-amilase mostrada como SEQ ID NO: 1 ou uma alfa-amilase tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1; (b) sacarificação do material contendo amido liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular uma glucoamilase, para formar açúcares fermentáveis; (c) fermentação dos açúcares fermentáveis em etanol usando um organismo fermentador; em que a triacilglicerídeo lipase mostrada como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, ou uma triacilglicerídeo lipase tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, é adicionada antes do ou durante o passo (a), após o passo (a) e antes do passo (b), antes do ou durante o passo (b), antes do ou durante o passo (c) ou antes dos ou durante os passos (b) e (c) simultâneos.
[0234] Em uma modalidade preferencial, uma celulase ou composição de enzimas celulolíticas está presente e/ou é adicionada durante a fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0235] Em uma modalidade preferencial, uma celulase ou composição de enzimas celulolíticas derivada de Trichoderma reesei está presente e/ou é adicionada durante a fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).
[0236] Em uma modalidade preferencial, uma celulase ou composição de enzimas celulolíticas e uma glucoamilase estão presentes e/ou são adicionadas durante a fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0237] Em uma modalidade, a celulase ou composição de enzimas celulolíticas é derivada de Trichoderma reesei, Humicola insolens, Chrysosporium lucknowense ou Penicillium decumbens.
[0238] A invenção é adicionalmente resumida nos seguintes parágrafos:
[0239] 1. Um processo para aumento do amido enzimaticamente acessível, por exemplo por redução da retrogradação do amido, e/ou aumento do rendimento de produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, durante um processo de produção de produtos de fermentação, em que uma triacilglicerol lipase está presente e/ou é adicionada antes de ou durante um passo de liquefação e/ou antes de ou durante um passo de sacarificação, um passo de fermentação ou um passo de sacarificação e fermentação simultâneas do processo de produção dos produtos de fermentação.
[0240] 2. Um processo para produção de um produto de fermentação, compreendendo os passos de: (a) liquefação de um material contendo amido usando uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material contendo amido liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos para formar açúcares fermentáveis; e
(c) fermentação dos açúcares fermentáveis usando um organismo fermentador para produzir o produto de fermentação, em que uma triacilglicerol lipase é adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (a) e/ou adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas.
[0241] 3. O processo do parágrafo 1 ou 2, em que a triacilglicerol lipase é uma triacilglicerol lipase termoestável, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de mais do que ou igual a cerca de 60 °C, tal como entre 60 °C e 110 °C, tal como entre 65 °C e 95 °C, tal como entre 70 °C e 90 °C, tal como acima de 70 ºC, tal como acima de 72 °C, tal como acima de 80 °C, tal como acima de 85 °C, tal como acima de 90 °C, tal como acima de 92 °C, tal como acima de 94 °C, tal como acima de 96 °C, tal como acima de 98 °C, tal como acima de 100 °C.
[0242] 4. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-3, em que a triacilglicerol lipase tem: (i) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, tal como uma estirpe de Rhizomucor miehei; (ii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus oryzae; (iii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 98 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Moesziomyces, tal como uma estirpe de Moesziomyces antarcticus; ou (iii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 98 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Thermomyces, tal como uma estirpe de Thermomyces lanuginosus.
[0243] 5. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-4, em que uma alfa-amilase e uma triacilglicerídeo lipase tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 72 graus centígrados, preferencialmente acima de 80 graus centígrados, preferencialmente acima de 82 graus centígrados, especialmente pelo menos 86 graus centígrados, em particular 90 graus centígrados, estão presentes e/ou são adicionadas no passo de liquefação (a), passo de sacarificação (b), sacarificação e fermentação simultâneas ou após o passo (a) e antes do passo (b) durante a pré-sacarificação.
[0244] 6. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-5, compreendendo adicionalmente, antes do passo de liquefação a), os passos de: i) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem a seco; ii) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.
[0245] 7. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-6, em que o pH durante a liquefação é entre 4,0-6,5, tal como 4,5-6,2, tal como acima de 4,8-6,0, tal como entre 5,0-5,8.
[0246] 8. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-7, em que a temperatura durante a liquefação está na gama de 70-100 graus centígrados, tal como entre 70-95 graus centígrados, tal como entre 75-90 graus centígrados, preferencialmente entre 80-90 graus centígrados, tal como em torno de 85 graus centígrados.
[0247] 9. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-8, em que um passo de cozimento a jato é levado a cabo antes da liquefação no passo a).
[0248] 10. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-9, em que a sacarificação e a fermentação são levadas a cabo sequencialmente ou simultaneamente.
[0249] 11. O processo de qualquer um dos parágrafos 1- 10, em que a sacarificação é levada a cabo a uma temperatura de 20-75 graus centígrados, preferencialmente de 40-70 graus centígrados, tal como em torno de 80 graus centígrados, e a um pH entre 4 e 5.
[0250] 12. O processo de qualquer um dos parágrafos 1- 11, em que a fermentação ou a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) são levadas a cabo a uma temperatura de 25 graus centígrados a 40 graus centígrados, tal como de 28 graus centígrados a 35 graus centígrados, tal como de 30 graus centígrados a 34 graus centígrados, preferencialmente em torno de cerca de 32 graus centígrados, tal como por exemplo durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 98 horas.
[0251] 13. O processo de qualquer um dos parágrafos 1-12, em que o produto de fermentação é recuperado após a fermentação, tal como por destilação.
[0252] 14. O processo de qualquer um dos parágrafos 1- 13, em que o produto de fermentação é um álcool, preferencialmente etanol, especialmente etanol combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.
[0253] 15. O processo de qualquer um dos parágrafos 1- 15, em que o material de partida contendo amido é grãos integrais.
[0254] 16. O processo de qualquer um dos parágrafos 1- 16, em que o material contendo amido é derivado de milho, trigo, cevada, centeio, sorgo, sagu, mandioca, tapioca, milho-zaburro, arroz ou batata.
[0255] 17. O processo de qualquer um dos parágrafos 1- 17, em que o organismo fermentador é levedura, preferencialmente uma estirpe de Saccharomyces, especialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae.
[0256] 18. O processo de qualquer um dos parágrafos 1- 18, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase bacteriana, em que a alfa- amilase bacteriana é derivada do gênero Bacillus, tal como uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 1 aqui, em particular uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus truncada, preferencialmente tendo de 485-495 aminoácidos, tal como em torno de 491 aminoácidos.
[0257] 19. O processo de qualquer parágrafo 18, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus é aquela mostrada como SEQ ID NO: 1 aqui ou tendo identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60 por cento, pelo menos 70 por cento, pelo menos 80 por cento, pelo menos 90 por cento, pelo menos 95 por cento, pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento.
[0258] 20. O processo do parágrafo 18 ou 19, sendo que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: - I181ss+G182ss; - I181ss+G182ss-HN193F; preferencialmente - I181ssH-G182ss+E129V+K177LH-R179E; - I181ss+G182ss+N193F+E129V+K177L+R179E; - I181ss+G182ss+N193F+V59A+Q89R+E129V+177L+R179E+H208Y+K220P +N224L+Q254S -I181ss+G182ss+N193F +V59A Q89R+ E129V+ K177L÷ R179E+ Q254S+IVI284V; e – -I181ss+G182ss+N193F+E129V+K177LH- R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 1 para numeração).
[0259] 21. O processo de qualquer um dos parágrafos 18 a 21, em que a variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60 por cento, pelo menos 70 por cento, pelo menos 80 por cento, pelo menos 90 por cento, pelo menos 95 por cento, pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, mas menos do que 100 por cento.
[0260] 22. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que uma protease está presente e/ou é adicionada durante o passo de liquefação (a).
[0261] 23. Uso de uma triacilglicerol lipase em um passo de liquefação do processo de produção de produtos de fermentação para aumento do amido enzimaticamente acessível, por exemplo, por redução da retrogradação do amido.
[0262] 24. Uso do parágrafo 23 em que a triacilglicerídeo lipase tem: (i) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, tal como uma estirpe de Rhizomucor miehei; (ii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento,
preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus oryzae; (iii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 98 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Moesziomyces, tal como uma estirpe de Moesziomyces antarcticus; ou (iii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos
98 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Thermomyces, tal como uma estirpe de Thermomyces lanuginosus.
[0263] A divulgação descrita e reivindicada aqui não é para estar limitada no escopo pelas modalidades específicas divulgadas aqui, uma vez que estas modalidades se destinam como ilustrações dos vários aspectos da divulgação. Quaisquer modalidades equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta divulgação. De fato, várias modificações da divulgação adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes aos peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a residir dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá. Várias referências são citadas aqui, as divulgações das quais são incorporadas por referência em suas totalidades. A presente divulgação é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da divulgação. Materiais & Métodos
[0264] Alfa-Amilase 369 (AA369): Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações: I181* + G182* + N193F + V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V truncada até 491 aminoácidos (SEQ ID NO: 1 aqui).
[0265] Protease PfuS: Protease de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 2)
[0266] TG lipase Rm: Triacilglicerol lipase de Rhizomucor miehei (SEQ ID NO: 3 aqui).
[0267] TG lipase Ao: Triacilglicerol lipase de Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 4 aqui).
[0268] TG lipase 1 Ma: Triacilglicerol lipase de Moesziomyces antarcticus (SEQ ID NO: 5 aqui).
[0269] TG lipase 2 Ma: Triacilglicerol lipase de Moesziomyces antarcticus (SEQ ID NO: 6 aqui).
[0270] TG lipase 1 Tl: Triacilglicerol lipase de Thermomyces lanuginosus (SEQ ID NO: 7 aqui).
[0271] TG lipase 2 Tl: Triacilglicerol lipase de Thermomyces lanuginosus (SEQ ID NO: 8 aqui).
[0272] Glucoamilase SA (GSA): Combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada como SEQ ID NO: 34 em WO99/28448 ou SEQ ID NO: 13 aqui, glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/69289 ou SEQ ID NO: 14 aqui e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada em SEQ ID NO: 15 aqui tendo as seguintes substituições G128D + D143N (a razão de atividades em AGU:AGU:FAU-F é cerca de 20:5:1).
[0273] Levedura: ETHANOL RED™ disponível a partir da Red Star/Lesaffre, EUA. Determinação de Td por Calorimetria Diferencial de Varrimento.
[0274] A termoestabilidade das lipases C listadas na tabela em baixo foi determinada a pH 5,0 por Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) usando um Calorímetro Diferencial de Varrimento VP-Capillary (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, EUA) a uma concentração de proteína de aproximadamente 0,5 mg/mL. A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi tomada como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento das soluções de enzima no tampão a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hr. As soluções de amostra e referência (aproximadamente 0,2 mL) foram carregadas no calorímetro (referência:
tampão sem enzima) a partir de condições de armazenamento a 10 °C e termicamente pré-equilibradas durante 20 minutos a 20 °C antes do varrimento por DSC de 20 °C a 100 °C. As temperaturas de desnaturação (Td) foram determinadas a uma precisão de aproximadamente +/- 1 °C. As Tds obtidas sob estas condições para TG lipases são mostradas na tabela em baixo.
Td @ pH 5 Taxa de varrimento em TG lipase: (graus C) DSC exp (graus C/Hr) TG lipase Rm (SEQ ID NO: 3) 65 200 TG lipase Ao (SEQ ID NO: 4) 86 90 TG lipase 1 Ma (SEQ ID NO: 5) 90 90 TG lipase 2 Ma (SEQ ID NO: 6) 65 90 TG lipase 1 Tl (SEQ ID NO: 7) 73 90
EXEMPLOS Exemplo 1 - O Uso de Triacilglicerídeo Lipase na Liquefação Aumenta o Rendimento de Etanol
[0275] Este exemplo demonstra que a presença de triacilglicerídeo lipases durante o passo de liquefação de um processo de produção de produtos de fermentação aumenta os rendimentos de etanol da fermentação, por exemplo, por aumento do amido enzimaticamente acessível. Substrato
[0276] Grãos integrais de milho comprados pela Novozymes foram moídos até uma farinha fina. Após a trituração, a farinha foi medida como sendo aproximadamente 85% de sólidos secos. Enzimas
[0277] As enzimas usadas em este exemplo são mostradas na tabela em baixo. Enzima Dose (ug/g de sólidos secos) TG lipase Rm (SEQ ID NO: 3) 100, 500 TG lipase Ao (SEQ ID NO: 4) 100, 500 TG lipase 1 Ma (SEQ ID NO: 5) 100, 500 TG lipase 2 Ma (SEQ ID NO: 6) 100, 500 TG lipase 1 TI (SEQ ID NO: 7) 100, 500 Procedimento de Liquefação
[0278] Farinha foi pesada em recipientes Lab-O-Mat. Água da torneira foi adicionada à farinha para fazer uma pasta semifluida a aproximadamente 36% de sólidos secos. O pH da pasta semifluida foi ajustado até pH 5,0 a pH 5,5. Um cocktail de alfa-amilases comercial compreendendo Alfa-Amilase 369 (AA369) e protease Pfu foi adicionado a uma dose relevante para a indústria. Os tratamentos com TG lipase foram adicionados adicionalmente à dose de amilase. As amostras foram liquefeitas no Lab-O-Mat a 85 °C durante 2 horas. Quando a reação estava completa, os recipientes foram colocados em gelo e refrigerados. O material foi armazenado congelado até ao uso. Procedimento de Fermentação
[0279] Os tratamentos de mosto liquefeito foram fermentados a uma escala de 5 g. O pH dos mostos foi ajustado até aproximadamente pH 5,0. Nitrogênio exógeno na forma de ureia foi adicionado, em conjunto com o antibiótico penicilina. O mosto ajustado foi pesado em tubos de 15 mL e água da torneira adicional foi adicionada para levar a % de sólidos secos até aproximadamente 20% ou 32%. Uma mistura comercial de glucoamilase, Glucoamylase SA (GSA), foi adicionada a uma dose relevante para a indústria. Ethanol Red ADY (levedura seca ativada) foi adicionada a um passo de 1 g/L. Os tratamentos fermentaram a 32 °C durante aproximadamente 50+ horas. Análise de HPLC
[0280] As fermentações foram amostradas às ~24 horas ou ~50 horas para examinar os carboidratos solúveis e os ácidos orgânicos. As amostras foram em primeiro lugar acidificadas com H2SO4 a 40% para parar a reação e depois centrifugadas a aproximadamente 3 krpm durante até 5 minutos. O sobrenadante foi depois filtrado através de um filtro de 0,2 um. O filtrado foi depois medido por HPLC usando uma coluna H. Os analitos de interesse foram: DP4, DP3, glucose, frutose, arabinose, ácido láctico, glicerol, ácido acético e etanol. Análise de dados
[0281] Os dados foram analisados usando o software estatístico JMP da SAS. Resultados
[0282] A FIG. 1 é um gráfico ilustrando os resultados do rastreamento primário a 20% de sólidos secos (DS) a um ponto temporal de 24 hr, mostrando que a TG lipase Rm e a TG lipase Ao melhoraram os títulos de etanol em comparação com o tratamento de controle não tendo uma TG lipase.
[0283] A FIG. 2A é um gráfico ilustrando os resultados do rastreamento secundário a 32% de DS a um ponto temporal de 24 hr, mostrando o efeito de TG lipases nos títulos de etanol em comparação com o tratamento de controle.
[0284] A FIG. 2B é um gráfico ilustrando os resultados do rastreamento secundário a 32% de DS a um ponto temporal de 60 hr, mostrando o efeito de TG lipases nos títulos de etanol em comparação com o tratamento de controle.
[0285] O etanol final e a percentagem de aumento de etanol por adição de TG lipase estão resumidos na Tabela 2 em baixo. Tabela 2: Resultados Resumidos de Rendimento de Etanol e Percentagem de Mudança 24 horas 60 horas Aumento Aumento (% (% de de Tratamento p/v) p/v) Etanol Etanol Etanol Etanol (%) (%) Controle de AA369 e Pfu 10,22 0,00 12,57 0,00 Controle de AA369 e PFU mais 100 µg de TG lipase Rm (SEQ ID NO: 3) 10,20 -0,01 12,50 -0,07 Controle de AA369 e PFU mais 500 µg de TG lipase Rm (SEQ ID NO: 3) 10,44 0,22 12,62 0,05
Controle de AA369 e Pfu mais 100 µg de TG lipase Ao (SEQ ID NO: 4) 10,10 -0,11 12,55 -0,02 Controle de AA369 e Pfu mais 500 µg de TG lipase Ao (SEQ ID NO: 4) 10,11 -0,11 12,41 -0,17 Controle de AA369 e Pfu mais 100 µg de TG lipase 1 Ma (SEQ ID NO: 5) 9,99 -0,23 12,46 -0,11 Controle de AA369 e Pfu mais 500 µg de TG lipase 1 Ma (SEQ ID NO: 5) 10,06 -0,16 12,28 -0,29 Controle de AA369 e Pfu mais 100 µg de TG lipase 2 Ma (SEQ ID NO: 6) 9,87 -0,35 12,64 0,07 Controle de AA369 e Pfu mais 500 µg de TG lipase 2 Ma (SEQ ID NO: 6) 10,26 0,04 12,42 -0,15 Controle de AA369 e Pfu mais 100 µg de TG lipase 1 TI (SEQ ID NO: 7) 10,22 0,00 12,61 0,04 Controle de AA369 e Pfu mais 500 µg de TG lipase 1 TI (SEQ ID NO: 7) 9,99 -0,23 12,57 0,00
[0286] A FIG. 3 é um gráfico ilustrando os resultados da incubação de amostras de mosto liquefeito com Alfa-Amilase e Glucoamilase, mostrando um aumento na quantidade de amido enzimaticamente acessível após tratamento com TG lipas para todas as lipases testadas. O efeito do tratamento com lipase é dependente da dose. Algumas doses têm um impacto negativo. A dose eficaz depende do tipo de lipase empregue. Exemplo 2 - Uso de uma Triacilglicerídeo Lipase em SSF para Aumentar o Rendimento de Etanol
[0287] Um mosto de controle foi preparado internamente com uma dose relevante para a indústria de AA369 e protease Pfu usando uma incubadora Lab-O-Mat durante 2 horas a 85 ºC e 36% de DS para simular as condições típicas da indústria. A mistura foi depois congelada antes do uso em SSF. Para SSF, todo o mosto foi preparado com 1000 ppm de ureia e 3 ppm de penicilina para auxiliar com a fermentação da levedura e mitigar potenciais contaminantes. Todos os tratamentos foram doseados com uma combinação de glucoamilases comercial de linha de base (GSA), enquanto os tratamentos com TG lipase foram doseados adicionalmente a 1600 ug/g de DS. A SSF foi realizada à escala de 5 g com 1 g/L de levedura Ethanol Red a 32 °C durante até 60 horas a 32% de DS. No final da fermentação, as amostras foram desativadas com 50 uL de ácido sulfúrico a 40% e depois centrifugadas. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,2 um e depois medido quanto a carboidratos solúveis, álcoois e ácidos orgânicos usando uma coluna H de permuta iônica em HPLC.
[0288] Inesperadamente, como mostrado na Tabela 3 em baixo, somente a TG lipase Rm mostra um aumento de etanol por adição a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), enquanto todos os outros tratamentos viram uma diminuição nos títulos de etanol. A dosagem de TG lipases em este caso está muito acima da dosagem relevante para a indústria.
Resultados: Tabela 3: Percentagem de Aumento de Etanol Após Adição de TG Lipase a SSF Aumento Percentagem (% de de Aumento Tratamento p/v) Etanol de Etanol Etanol (%) Controle de AA369 e Pfu 13,13 0,00 Controle de AA369 e 1,8% PFU mais 1600 µg de TG lipase Rm (SEQ ID NO: 3) 13,36 0,22 Controle de AA369 e Pfu -1,4% mais 1600 µg de TG lipase Ao (SEQ ID NO: 4) 12,94 -0,19 Controle de AA369 e Pfu -3,7% mais 1600 µg de TG lipase 1 Ma (SEQ ID NO: 5) 12,65 -0,48 Controle de AA369 e Pfu -0,3% mais 1600 µg de TG lipase 2 Ma (SEQ ID NO: 6) 13,09 -0,04 Controle de AA369 e Pfu -0,8% mais 1600 µg de TG lipase 1 TI (SEQ ID NO: 7) 13,03 -0,10
Claims (17)
1. Processo para aumento do amido enzimaticamente acessível, por exemplo por redução da retrogradação do amido, e/ou aumento do rendimento de produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, durante um processo de produção de produtos de fermentação, caracterizado por uma triacilglicerol lipase estar presente e/ou ser adicionada antes de ou durante um passo de liquefação e/ou antes de ou durante um passo de sacarificação, um passo de fermentação ou um passo de sacarificação e fermentação simultâneas do processo de produção dos produtos de fermentação.
2. Processo para produção de um produto de fermentação caracterizado por compreender os passos de: (a) liquefação de um material contendo amido usando uma alfa- amilase; (b) sacarificação do material contendo amido liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos para formar açúcares fermentáveis; e (c) fermentação dos açúcares fermentáveis usando um organismo fermentador para produzir o produto de fermentação, em que uma triacilglicerol lipase é adicionada antes do ou durante o passo de liquefação (a) e/ou adicionada antes do ou durante o passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas.
3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a triacilglicerol lipase ser uma triacilglicerol lipase termoestável, preferencialmente tendo um Ponto de Fusão (DSC) de mais do que ou igual a cerca de 60 °C, tal como entre 60 °C e 110 °C, tal como entre 65 °C e 95 °C, tal como entre 70 °C e 90 °C, tal como acima de 70 °C, tal como acima de 72 °C, tal como acima de 80 °C, tal como acima de 85 °C, tal como acima de 90 °C, tal como acima de 92 °C, tal como acima de 94 °C, tal como acima de 96 °C, tal como acima de 98 °C, tal como acima de 100 °C.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 3, caracterizado por a triacilglicerol lipase ter: (i) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, tal como uma estirpe de Rhizomucor miehei; (ii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus oryzae; (iii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 98 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Moesziomyces, tal como uma estirpe de Moesziomyces antarcticus; ou (iii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 98 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Thermomyces, tal como uma estirpe de Thermomyces lanuginosus.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 4, caracterizado por uma alfa-amilase e uma triacilglicerídeo lipase tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 72 graus centígrados, preferencialmente acima de 80 graus centígrados, preferencialmente acima de 82 graus centígrados, especialmente pelo menos 86 graus centígrados, em particular 90 graus centígrados, estarem presentes e/ou serem adicionadas no passo de liquefação (a), passo de sacarificação (b), sacarificação e fermentação simultâneas ou após o passo (a) e antes do passo (b) durante a pré- sacarificação.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 5, caracterizado por a sacarificação e a fermentação serem levadas a cabo sequencialmente ou simultaneamente.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 6, caracterizado por o produto de fermentação ser um álcool, preferencialmente etanol, especialmente etanol combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 7, caracterizado por o material de partida contendo amido ser grãos integrais.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 8, caracterizado por o material contendo amido ser derivado de milho, trigo, cevada, centeio, sorgo, sagu, mandioca, tapioca, milho-zaburro, arroz ou batata.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado por o organismo fermentador ser levedura, preferencialmente uma estirpe de Saccharomyces, especialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado por a alfa-amilase ser uma alfa-amilase bacteriana, em que a alfa-amilase bacteriana é derivada do gênero Bacillus, tal como uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 1 aqui, em particular uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus truncada, preferencialmente tendo de 485-495 aminoácidos, tal como em torno de 491 aminoácidos.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus ser aquela mostrada como
SEQ ID NO: 1 aqui ou tendo identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60 por cento, pelo menos 70 por cento, pelo menos 80 por cento, pelo menos 90 por cento, pelo menos 95 por cento, pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento.
13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizado por a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus ter uma ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: - I181ss + G182ss; - I181ss + G182ss-HN193F; preferencialmente - I181ssH-G182ss + E129V + K177LH- R179E; - I181ss + G182ss + N193F + E129V + K177L + R179E; - I181ss + G182ss + N193F + V59A + Q89R + E129V + 177L + R179E + H208Y + K220P + N224L + Q254S -I181ss + G182ss + N193F + V59A Q89R + E129V + K177L÷ R179E + Q254S + IVI284V; e – -I181ss + G182ss + N193F + E129V + K177LH-R179E + K220P + N224L + S242Q + Q254S (usando SEQ ID NO: 1 para numeração).
14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado por a variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus ter uma identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60 por cento, pelo menos 70 por cento, pelo menos 80 por cento, pelo menos 90 por cento, pelo menos 95 por cento, pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, mas menos do que 100 por cento.
15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por uma protease estar presente e/ou ser adicionada durante o passo de liquefação (a).
16. Uso de uma triacilglicerol lipase em um passo de liquefação do processo de produção de produtos de fermentação, caracterizado por ser para aumento do amido enzimaticamente acessível, por exemplo, por redução da retrogradação do amido.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a triacilglicerídeo lipase ter: (i) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, tal como uma estirpe de Rhizomucor miehei; (ii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus oryzae; (iii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 98 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Moesziomyces, tal como uma estirpe de Moesziomyces antarcticus; ou (iii) pelo menos 60 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, tal como pelo menos 75 por cento, preferencialmente pelo menos 80 por cento, mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, mais preferencialmente pelo menos 91 por cento, mais preferencialmente pelo menos 92 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 por cento, o mais preferencialmente pelo menos 94 por cento e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95 por cento, tal como mesmo pelo menos 98 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, pelo menos 99 por cento, tal como 100 por cento, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Thermomyces, tal como uma estirpe de Thermomyces lanuginosus.
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