KR100764528B1 - 글루코아밀라제 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모 균류 글루코아밀라제의 변이체와 관련이 있는데, 그 변이체는 개선된 열 안정성 및/또는 당질 기질을 사용하는데에 증가된 특이활성을 나타낸다.

글루코아밀라제, 돌연변이유발, 글루코아밀라제 변이체, 녹말전환

Description

글루코아밀라제 변이체{GLUCOAMYLASE VARIANTS}

본 발명은 특히 개선된 열 안정성 및/또는 특이활성, 예를 들어 녹말전환, 예를 들면 녹말로부터 포도당의 생산에 적합한 증가된 특이활성을 지닌 모 AMG의 신규한 글루코아밀라제 변이체(돌연변이체)에 관련된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 글루코아밀라제 효소의 변이체와 이런 변이체 효소의 사용에 관련된다.

글루코아밀라제 (1,4-α디글루칸 글루코하이드로라제, EC 3.2.1.3)는 녹말이나 관련 올리고당과 다당류분자의 비환원 말단으로부터 D-포도당을 분해하는 반응을 촉매하는 효소이다. 글루코아밀라제는 상업적으로 가장 중요한 Aspergillus에서 유래된 것 함께 몇 가지의 사상균과 효모에 의하여 생산된다.

상업적으로는 글루코아밀라제 효소는 이미 α-아밀라제에 의해 부분적으로 가수분해된 옥수수 녹말을 포도당으로 전환하는데 사용된다. 포도당은 그후 포도당 이성화효소에 의하여 거의 동량의 포도당과 과당으로 구성된 혼합물로 전환된다. 이 혼합물 또는 과당이 더욱 농축된 혼합물은 전세계적으로 상업화된 고과당 옥수수 시럽으로 보통 사용된다. 이 시럽은 세계에서 효소공정에 의해 생산되는 가장 큰 규모의 생산물이다. 녹말을 과당으로 전환시키는데 관여하는 세 가지 효소는 생산되는 산업 효소중 가장 중요한 효소의 하나이다.

고과당 옥수수 시럽 생산에서 그루코아밀라아베를 상업적으로 사용하는데 존재하는 주요 문제점 중의 하나는 글루코아밀라제의 상대적으로 낮은 열 안정성이다. 글루코아밀라제는 α- 아밀라제나 포도당 이성화효소처럼 열적으로 안정하지 않고 α-아밀라제 또는 포도당 이성화효소보다 낮은 pH에서 가장 활성이 높고 안정하다. 따라서, 글루코아밀라제는 별개의 용기에서 더 낮은 온도와 pH에서 사용하여야 한다.

Aspergillus niger의 글루코아밀라제는 길게 그리고 많이 O-그루코실화된 링커에 의하여 분리된 1개의 촉매활성도메인(aa 1-440)과 녹말부착도메인(aa 509-616)을 가진다(Svensson et al. (1983),Carlsberg Res. Commun. 48, 529-544, 1983 및 (1986), Eur.J.Bioche. 154, 497-502). Aspergillus awamori 변이체X100에서 유래한 글루코아밀라제의 촉매활성도메인은 6개의 보존된 α→α 고리 단편이 바깥쪽 및 안쪽 베럴을 연결하는 (α/α)₆-폴드를 채택하고 있다.(Aleshin et al. (1992), J. biol.Chem. 267, 19291-19298). 1-디옥시노지리마이신(deoxyjirimycin)과 복합체를 이룬 글루코아밀라제의 결정구조 (Harris et al. (1993), Biochemistry, 32, 1618-1626)와 슈도테트라사카라이드 저해제인 아카아르보오즈(acarbose)와 D-글루코 D-하이드로아카르보즈(D-gluco- dihydroacarbose)와 복합체를 이룬 글루코아밀라제의 결정구조 (Aleshin et al. (1996), Biochemistry, 35, 8319-8328)는 , 더 나아가 일반산과 일반염기로 작용하는 글루탐산 179와 400과 각각 양립가능하다. 이 잔기의 촉매반응중의 중심적 역할은 단백질공학을 사용하여 연구된 바 있다(Sterks et al.(1990), Protein Engng. 3, 193-198; Frandsen et al.(1994), Biochemistry, 33, 13808-13816). 4개의 글리코실 잔기 부착도메인인 -1, +1, +2, 및 +3에서의 글루코아밀라제-탄수화물 상호작용은 글루코아밀라제 복합체 구조에서 두드러지고(Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8319-8328), 부착과 촉매반응에 중요한 잔기은 활성분석과 연계된 특정부위 돌연변이를 사용하여 광범위하게 연구되었다(Sierks et al. (1989), Protein Engng 2, 621-625; Sierks et al. (1990), Protein Engng.3, 193-198; Berland et al. (1995), Biochemistry, 34, 10153-10161; Frandsen et al. (1995), Biochemistry, 34, 10162-10169).

열안정성을 증가시키기 위한 Aspergillus niger 글루코아밀라제의 다양한 치환이 기술되었다:

i) α-나선형 글리신의 치환: G137A와 G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499-505); ii) 손상되기 쉬운 Asp-X 펩티드결합의 제거, D257E와 D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582); iii) N182에서 탈아미노화의 방지(Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); iv) 추가적 이황화결합의 조작,A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); v) A435와 A436자리에 프롤린 잔기의 도입 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204). 더 나아가 Clark Ford는 ENZIME ENGINEERING 14지(1997. 10. 17판) 및 Beijing/China지 (1997년 10월 12-17일판, 요약서 번호:Abstract book p.0-61)에 이를 발표하였다. 이 요약서는 열안정성을 개선하기 위한 Aspergillus awamori 글루코아밀라제의 G137A, N20C/A27C,및 S30P위치의 돌연변이를 제시하고 있다.

글루코아밀라제에 관한 추가 정보는 인터넷 홈페이지 (http://www.public.iastate.edu/~pedro/glase/glase.html)에서 찾아볼 수 있다 . Pedro M. Coutinho에 의하여 작성된 "글루코아밀라제 www 페이지" (1997.10.8 마지막 수정)는 Aspergillus 주로부터 유래하는 글루코아미라제를 포함하는 글루코아밀라제에 관한 정보를 개시하고 있다. Aspergillus niger 글루코아밀라제의 화학적인 변이와 특정부위 변이가 열거되어 있다.

본 발명의 목적은 개선된 열안정성 및 /또는, 예를 들어 녹말전환 공정에서의 당화 단계, 사용에 적합한 증가된 특이활성을 가진 개선된 글루코아밀라제 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 본문에 사용된 "열안정성이 개선된 글루코아밀라제 변이체"는 본 발명에서는 대응하는 모 글루코아밀라제보다 높은 T_1/2(반감기)를 가지는 글루코아밀라제 변이체를 의미한다.

T_1/2의 결정(방법1과 방법2)은 하기의 "재료 및 방법"편에 기술되어 있다.

본 발명의 본문에 사용된 "특이활성이 증가된 글루코아밀라제 변이체"는 본 발명에서는 문제의 당류 내의 α-1,4결합에 대한 특이활성이 증가된 글루코아밀라제 변이체를 의미한다. 특이활성은 k_cat 또는 AGU/mg(하기의 "재료 및 방법"편에서 기술된 대로 측정한다)으로 결정된다. 증가된 특이활성은 k_cat 또는 AGU/mg값이 대응 하는 모 글루코아밀라제의 k_cat 또는 AGU/mg값 보다 더 높다는 것을 의미한다.

본발명의 발명자는 모 글루코아밀라제와 비교하여 개선된 열안정성 및 또는 증가된 특이활성을 지닌 여러 모 글루코아밀라제 변이체를 제공하여왔다. 개선된 열안정성은 모 글루코아밀라제의 선택된 위치의 치환에 의하여 얻어진다. 이에 대하여는 후술한다.

명명법

본 명세서와 청구범위에서는 관용적인 1문자 및 3문자 코드가 아미노산 잔기에 대하여 사용된다. 참조의 편의를 위하여, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 이하의 명명법을 사용하여 기술한다:

원래 아미노산: 위치: 치환된 아미노산

이 명명법에 의하면, 예를 들어 30번 위치의 알라닌을 아스파라긴으로 치환한 경우 다음과 같이 나타낸다:

Ala30Asn 또는 A30N

같은 위치에서 알라닌을 결실한 경우 다음과 같이 나타낸다:

Ala30* 또는 A30*

같은 위치에서 라이신같은 다른 아미노산 잔기를 삽입한 경우 다음과 같이 나타낸다.

Ala30AlaLys 또는 A30AK

아미노산 잔기30 내지 33번과 같이 아미노산 잔기의 인접한 연결체의 결실은 (30-33)* 또는 △(A30-N33)과 같이 나타낸다.

다른 글루코아밀라제에 비교하여 특정 위치에 "결실"을 포함하고 그 위치에 삽입이 있는 경우는 다음과 같이 나타낸다:

*36Asp 또는 *36D 라 표시하면, 36번 위치에 아스파르트산이 삽입된 경우이다.

다중돌연변이는 +기호로 분리된다. 예를 들어:

Ala30Asp + Glu34Ser 또는 A30N + E34S 와 같이 표시하면 각각 30번과 34번 위치에서 알라닌과 글루탐산이 아스파라긴과 세린으로 치환된 경우를 나타낸다. 다중돌연변이는 다음과 같이 또한 분리된다, 즉 더하기 부호와 같은 의미:

Ala30Asp/Glu34Ser 또는 A30N/E34S.

하나 이상의 아미노산 잔기가 주어진 위치에 무작위로 삽입된 경우에는 A30N,E 또는 A30N/E, 또는 A30N 또는 A30E 와 같이 표시된다.

더 나아가, 변형에 적합한 위치가 제시된 특정 변이가 없이 그 중에서 확인된 경우, 그 위치에서 존재하는 아미노산 잔기가 다른 어떤 아미노산 잔기로 치환된 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어 30번 위치의 알라닌의 변형이 언급되었으나 특정되지 아니한 경우에는 알라닌은 결실되거나 다른 어떤 아미노산 예를 들어:

R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V 중 어느 하나로 치환된 것으로 이해된다.

도 1은 Aspergillus niger G1의 글루코아밀라제 유전자를 포함하는 플라스미 드 pCAMG91을 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 기초가 되는 연구의 목표는 녹말 전환이나 알콜 발효에 적합한 특성에 기초하여 선택된 균류생체, 특히 Aspergillus 속 균주로부터 얻을 수 있는 특정 글루코아밀라제의 열안정성을 개선하고/또는 특이활성을 증가시키는 것이다.

개선된 열안정성 및/또는 증가된 특이활성을 얻기 위하여 돌연변이를 유발할 위치 및/또는 영역의 결정

분자역학(MD) 가상실험은 단백질내 구조의 아미노산의 운동성을 나타낸다 (McCammon, JA 와 Harvey, SC., (1987), "Dynamics of proteins and nucleic acids", Cambridge University Press). 이런 단백질역학은 종종 결정학 B-인자와 비교된다(Stout, GH 와 Jensen, LH, (1989), "X-ray structure determination", Wiley). 적정 기능잔기의 각기 다른 수소이온결합상태에서의 MD가상실험 운용을 통하여, 잔기의 pH에 따른 운동성이 가상 재현된다. 무작위 돌연변이유발을 위하여, 가장 높은 운동성 또는 유연성을 가지는 부위(여기서 동방성 연동)이 선택된다. 여기서는 단백질의 특정 부위에서 발견되는 높은 운동성은 이들 잔기를 다른 잔기로 치환하여 열적으로 개선될 수 있다고 이해된다. 치환은 잔기의 역학적 행동을 변화시킬 잔기 예를 들어 더 큰 곁사슬 및/또는 가까운 주위의 잔기와 개선된 접촉을 형성할 능력을 가진 잔기에 대하여 행하여진다. Aspergillus niger서 유래한 AMG는 MD가상실험에 사용 되었다(MD가상실험의 수행방법은 후술할 "재료 및 방법" 편에 기술된다.).

개선된 열안정성 및/또는 증가된 특이활성을 얻으려 할 때 돌연변이에 적합한, 분자역학(MD)가상실험에 의하여 발견된 영역은 다음과 같다:

영역:1-18,

영역:19-35,

영역:73-80,

영역:200-212,

영역:234-246,

영역:334-341,

영역:353-374,

영역:407-411,

영역:445-470,

특이활성 증가시키고 및/또는 열안정성을 개선시키기 위한 관심 있는 영역은 활성부위에 근접한 영역이다. α-나선구조의 각각 N-말단 및 C-말단에 위치한 것을 포함하는, 기질부착도메인에 있는 α-나선구조들 사이에 위치한 영역들은, 효소의 활성에 매우 중요하다. 이런 영역은 다음의 영역를 구성한다:

영역:40-62,

영역:93-127,

영역:170-184,

영역:234-246,

영역:287-319,

영역:388-414.

Rhizopus, Talaromyces emerosonii (WO 99/28448에서 개시됨)같은 Talaromyces, 및 Thielavias는 말토스와 말토헵토스를 포함하는 말토덱스트린에 대하여 높은 특이활성을 갖는다. 그러므로, 특히 관심 있는 증가된 특이활성에 관련을 갖는(특이활성을 가져오는) 영역은 :

영역:200-212

영역: 287-300

영역: 305-319

본 발명자는 모 글루코아밀라제의 아미노산 서열상의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 통하여 모 글루코아밀라제의 열안정성을 개선하고/또는 특이활성을 증가시키기는 것이 실제로 가능하다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이런 발견에 기초를 두고 있다.

따라서, 첫 번째 견지에서 본 발명은 후술되는 부위이나 위치에서의 하나 이상의 변이를 포함하는 모 글루코아밀라제의 개선된 변이체와 관련된다.

모 글루코아밀라제

본 발명에 따라 고려된 모 글루코아밀라제는 균류의 글루코아밀라제, 특히 Asperfillus niger나 Aspergillus awamori 글루코아밀라제와 같은 Aspergillus 종으로부터 얻을 수 있는 균류 글루코아밀라제, 또는 그것의 변이체, 상동성 글루코아밀라제, 및 구조적 및/또는 기능적으로 SEQ ID NO: 2와 유사한 그 외의 글루코아밀라제를 포함한다. "Aspergillus niger에서 유래한 글루코아밀라제 G1과 G2는 개 별적이지만 밀접히 연관된 두 mRNA에 의하여 합성된다."(Boel et al. (1984) EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102)에 개시된 Aspergillus niger 유래 글루코아밀라제 G1과 G2이 구체적으로 고려되었다. G2 글루코아밀라제는 SEQ ID NO: 2에 개시된다. G1 글루코아밀라제는 SEQ ID NO: 13에 개시된다. 다른 하나의 고려된 AMG 뼈대는 Talaromyces emersonii,특히 WO 99/28448(Novo Nordisk)에 개시된 Talaromyces emersoonii DSM,이다.

시종 구입 가능한 모 글루코아밀라제

시중 구입 가능한 모 글루코아밀라제는 Novo Nordisk로부터의 AMG, 또한 미국 Genecor Inc., 및 네덜란드의 Gist-Brocades, Delft사의 글루코아밀라제를 포함한다.

글루코아밀라제 변이체

첫 번째 측면에서는 본 발명은 NO: 2에서 나타낸 아미노산 서열상의 이하의 위치 또는 부위에서의 하나 이상의 돌연변이로 구성된 모 글루코아밀라제의 변이체와 관련이 있다:

영역: 1-18

영역: 19-35,

영역: 40-62,

영역: 73-80,

영역: 93-127,

영역: 170-184,

영역: 200-212

영역: 234-246,

영역: 334-341,

영역: 353-374,

영역: 388-414,

영역: 445-470,

및/또는 SEQ ID NO: 2에서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60% 상동성을 나타내는 상동성 글루코아밀라제 내의 대응하는 위치 또는 영역, 여기에서 다음의 치환은 제외된다: N20C, A27C, S30P, Y48W, Y50F, W52F, R54K/L, D55G/V, G57A, K108R, D112Y, Y116A/W, S119C/W/E/G/Y/P, W120H/F/Y, G121T/A, R122Y, P123G, Q124H, R125K, W170F, N171S, Q172N, T173G, G174C, Y175F, D176N/E, L177H/D, W178R/D, W178R/D, E179Q/D, E180D/W, V181D/A/T, N182A/D/Q/Y/S, G183K, S184H, W212F, R241K, A246C, D293E/Q, A302V, R305K, Y306F, D309N/E, Y312W, W317F, E389D/Q, H391W, A392D, A393P, N395Q, G396S, E400Q/C, Q401E, G407D, E408P, L410F, S411A/G/C/H/D, S460P

한 구체예에서 변이된 부위는 영역:1-18이다. 고려된 구체적으로 바람직한 위치는 하나 이상의:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의: A1V, T2P/Q/R/H/M/E/K, L3N, N9A, A11E/P, I18V를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G,

T2K+S30P+N427M+S44G+V47M,

T2E+T379A+S386K+A393R,

T2Q+A11P+S394R,

T2R+L66V+S394P+Y420F,

T2M+N9A+T390R+D406N+L410R,

T2R+S386R+A393R,

A11P+T2Q+S394R,

A11E+E408R'

I18V+T51S+S56A+V59T+L60A.

한 구체예에서 변이된 영역는 영역: 19-35이다.

바람직한 하위-영역는 하나 이상의: 21-26, 31-35를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의: L19N, N20T, G23A, A24S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N을 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역는 영역: 40-62 이다.

바람직한 하위-영역는 하나 이상의:40-47, 58-62를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 56, 58, 59, 60, 61, 62를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

S40C/A/G,

T43R,

T51S/D,
T53D,

S56A/C,

V59T/A,

L60A를 포함한다.

돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:

T51S+S56A+V59T+L60A+I18V,

V59A+A393R+T490A+PLASD(N-말단 연장)를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 73-80이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의:73,74,75,76,77,78,79,80을 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

S73P/D/T/N/Q/E,

L74I/D,

L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V(I/N/D가 바람직함),

S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V(T/A가 바람직함),

T77V/T,

I78V,

E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V(Q/R/K가 바람직함),

N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V(H/D/E/R/K/T/S/Y가 바람직함),

을 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 93-127 이다. 또 다른 구체예에서 하위-영역은: 영역:93-124이다. 바람직한 하위-영역은 하나 이상의: 93-107, 109-111, 113-115을 포함한다.

고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127을 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

N93T,

P94V,

S95N,

D97S,

L98S/P,

S100T/D,

A102S/*,

P107M/L/A/G/S/T/V/I,

N110T,

V111P,

D112N,

E113M/A,

T114S,

A115Q/A,

Y116F,

S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V, A가 바람직함,

R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V,

G127A. 을 포함한다.

돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:

S119P+G447S,

S119P+Y402F,

S119P+A393R,

S119P+I189T+223F+F227Y+Y402F,

S119P+T416H+Y402F+Y312Q를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역:170-184이다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:

N171R/K//Q/E/W/F/Y,

Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,

T173K/R/S/N/Q,

G174A, S,

Y175N/Q/D/E,

D176L

L177I

E180N/M

V181I/T

N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V.

G183A

S183A

S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K 를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 200-212이다. 바람직한 하위-영역은 영역: 200-211을 포함한다.

고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211을 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, S211P, W212N/A/T를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 234-246 이다.

바람직한 하위-영역은 하나 이상의: 234-240, 242-245를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의:234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

L243A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.

A235S

F237Y/H/N/D.

D238T/S.

S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.

S240G

S242S/P/T/A/Y/H/N/D.

G243S/P/T/A/Y/H/N/D.

K244R,

A246T를 포함한다.

돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의: A246T+T72I를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역:287-319 이다.

바람직한 하위-영역은 하나 이상의:287-292, 294-301, 313-316를 포함한다.

고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

I288L/N/Q,

Y289F,

T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V,

L291I/D/N,

N292D,

D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,

G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V,

L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V,

S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,

S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,

E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V.

V301T/I,

A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, S가 바람직함

V303T/I,

G304A,

R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,

Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.

E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V, Q가 바람직함,

D309L,

T310V/S,

Y311N,

Y312Q/N,

N313T/S/G,

N315Q/E/R,

F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V, Y가 바람직함, 를 포함한다.

돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:

Y312Q+S119P+T416H+Y402F,

Y312Q+S119P+Y402F+T416H+S411V,

Y312Q+T416H

N313G+F318Y 를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 334-341이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.

K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.

Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.

G339S/P/T/A.

S340I/T/N/V/A/D/G.

L341F/L/I/V 를 포함한다.

돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:

S340G+D357S+T360V+S386P를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 353-374이다.

고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

A353D/S,

S356P/N/D,

D357S,

A359S,

T360V,

G361S/P/T/A,

T362R,

S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

S366T,

S368P/T/A,

T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

S371Y/H/N/D,

S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G 를 포함한다.

돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:

S356P+S366T,

D357S+T360V+S371H,

D357S+T360V+S386P+S340G 를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 388-414이다.

바람직한 하위-영역은 하나 이상의: 397-399, 402-406, 412-414를 포함한다.

고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 388, 389, 390, 394, 397, 398, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

T390R,

A393R,

S394P/R,

M398L,

S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V, T/Q/C가 바람직함,

Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V, F가 바람직함,

D403S,

S405T,

D406N,

E408C/R,

A409R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, P가 바람직함,

L410R/I,

S411R/N/Q/E/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V, V가 바람직함,

A412C,

R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V.

D414A를 포함한다.

돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:

A393R+T490+V59A+PLASD(N-말단 연장),

S394R+T2Q+A11P,

Y402F+S411V,

Y402F+S411V+S119P,

Y402F+S411V+S119P+A393R,

Y402F+S411V+S119P+T416A,

E408R+S386N,

E408R+A425T+S465P+T494A,

L410R+A393R,

Y402F+Y312Q+S119P+T416H+S411V+A393R를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 445-470이다.

바람직한 하위-영역은 하나 이상의:445-459, 461-470을 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 461, 162, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:

G447S, G456C/P, S465P를 포함한다.

특정 변이체는 하나 이상의 다음의 치환을 포함한다: A1V, T2E/P/Q/R/H/M, L3P/N, N9A, A11P/E, I18V, L19N, N20T, G23A, A2S/T, D25S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N, S40C, T43R, T51D/S, T53D, S56A/C, V59T/A, L60A, N93T, P94V, S95N, D97S, L98P/S, S100T/D, A102S/*, N110T, V111P, D112N, E113M/A, F202L, A203L, T204K, A115Q/G, Y116F, S119A, G127A, N182E, A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, S211P, W212N/A/T, A246T, Y312Q, N313T/S/G, A353D/S, S356P/N/D, D357S, A359S, T360V, G361S/P/T/A, T362R, S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S366T, S368P/T/A, T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S371Y/H/N/D, S372F/Y/C/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G, T390R, A393R, S394R/P, M398L, S399C/Q/T, Y402F, D403S, S405T, D406N, E408C/R, L410I/R, S411V, A412C, D414A, G447S, S465P

개선된 열안정성

두 번째 측면에서는 본 발명은 특히 40℃ 내지 80℃온도 범위, 바람직하게는 60℃ 내지 80℃온도 범위, 및 바람직하게는 pH4 내지 5에서의 개선된 열 안정성을 가진 모 글루코아밀라제의 변이체와 관계되고, NO: 2에 나타낸 아미노산 서열내 하기 위치 또는 영역

영역: 1-18,

영역: 19-35,

영역: 73-80,

영역: 93-127,

영역: 170-184,

영역: 200-212,

영역: 234-246,

영역: 287-319,

영역: 334-341,
영역: 353-374,

영역: 388-414,

영역: 445-470,

및/또는 다음 치환 N20C, A27C, S30P, A246C 제외한, SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60% 상동성을 보이는 상동성 글루코아밀라제내의 대응하는 위치 또는 영역에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체인 모 글루코아밀라제의 변이체와 관계된다:

기질의 부착이 안정성을 개선할 수도 있으므로, 영역: 93-127, 영역: 170-184, 부위: 305-319 역시 본 발명에 따라 열 안정화를 위하여 고려되었다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 1-18이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의: A1V, T2P/Q/R/H/M/E, N9A, A11E/P를 포함한다. 바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

A1V+L66R+Y042F+N427S+S486G,

T2K+S30P+N427M+S44G+V470M,

T2E+T379A+S386K+A393R,

T2R+S386R+A393R,

A11P+T2Q+S394R,

T2Q+A11P+S394R,

T2R+L66V+S394P+Y402F,

T2M+N9A+T390R+S406N+L410R,

T2R+S386R+A393R,

A11E+E408R을 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 19-35이다. 바람직한 하위-영역은 하나 이상의: 21-26, 31-35를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 : 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의: L19N, N20T, G23A, A24S/T, D25S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N을 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 73-80이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:

S73P/D/T/N/Q/E,

L74I/D,

L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V, I/N/D가 바람직함,

S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, T/A가 바람직함,

T77V/T,

I78V,

E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V, Q/R/K가 바람직함,

N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, H/D/E/R/K/T/S/Y가 바람직함, 을 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 93-127이다. 부가된 구체예에서 변이된 영역은 영역: 93-124이다. 바람직한 하위-영역들은 하나 이상의: 93-107, 109-111, 113-115를 포함한다.

고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127을 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

P107M/L/A/G/S/T/V/I,

S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V, A가 바람직함,

R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

S119P+G447S S119P+A393R을 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 170-184이다. 특정 돌연변이는 하나 이 상의:

N171R/K/Q/E/W/F/Y,

Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,

T173K/R/S/N/Q,

G174A,S,

Y175N/Q/D/E,

D176L,

L177I,

E180N/M,

V182R/C/E/G/H/I/L/K/P/T/W/Y/V,

G183A,

S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 200-212이다. 바람직한 하위-영역은: 200-211을 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의: A203L, S211P를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 234-246이다. 바람직한 하위-영역은 하나 이상의:234-240, 242-245를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 : 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V,

A234S,

F237Y/H/N/D,

D238T/S,

S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V,

S240G,

S242S/P/T/A/Y/H/N/D,

G243S/P/T/A/Y/H/N/D,

K244R,

A246T를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

A246T+T72I를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 287-319이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:287-292, 294-301, 313-316을 포함한다.

부가된 구체예에서 변이된 하위-영역은 영역:305-319이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치들은 하나 이상의 :287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

Y312Q

F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V, Y가 바람직함,를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

N313G+F318Y,

Y302Q+S119P+T416H+Y402F를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 334-341이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치들은 하나 이상의 : 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V,

K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T//W/Y/V,

Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V,

G339S/P/T/A,

S340I/T/N/V/A/D/G,

L341F/L/I/V를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:S304G+D357S+T360V+S386P

를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 353-374이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374를 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

A353D/S,

S356P/N/D,

D357S,

A359S,

T360V,

G361S/P/T/A,

T362R,

S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

S366T,

S368P/T/A,

T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

S371Y/H/N/D,

S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

S356+S366T,

D357S+T360V+S371H,

D357S+T360V+S386P+S340G를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 388-414이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:397-399, 402-406, 412-414를 포함한다.

부가된 구체예에서 변이된 하위-영역은 영역:407-411이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414를 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:

A393R,

S393P/R,

S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V, T/Q/C가 바람직함,

Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V, F가 바람직함,

D403S,

S405T,

D406N,

E408C/R,

Q409A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, P가 바람직함,

L410I/R,

S411V,

A412C,

R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,

D414A를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

A393R+T2R+S386R,

A393R+T490A+V59A+PLASD(N-말단 연장),

S394R+T2Q+A11P,

Y402F+T2R+L66V+S394P,

Y402F+S411V+S119P,

Y402F+S411V,

Y402F+Y312Q+S119P+T416H,

S411V+A393R,

E408R+S386N,

E408R+A425T+S465P+T494A,

L410R+A393R,

S411V+S119P+Y402F+A393R,

S411V+S119P+Y402F+A393R+T416H를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 445-470이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:445-459, 461-470을 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470을 포함한다.

특정 돌연변이는 하나 이상의:

G447S, G456C/P, S465P를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

G447S+S119P,

S465P+ES08R+A425T+T494A를 포함한다.

증가된 특이활성

세번째 측면에서는 본발명은 NO: 2에 나타난 다음의 위치 또는 영역:

영역: 1-18,

영역: 40-62,

영역: 93-127,

영역: 170-184,

영역: 200-212,

영역: 234-246,

영역: 287-319,

영역: 388-414,

및/또는 다음 치환: S411G를 제외한 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60% 상동성을 나타내는 상동성 글루코아밀라제 내의 대응하는 위치 또는 부위에서의 하나 이상의 변이로 구성된 증가된 특이활성을 갖는 모 글루코아밀라제의 변이체와 관련된다.

한 구체예에서 변이된 부위는 부위: 1-18이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19를 포함한다. 특정 돌연변이는: L3N, I18V이다. 바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

I18V+T51S+S56A+V59T+L60A를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 40-62이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:40-47, 58-62를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 56, 58, 59, 60, 61, 62를 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:

S40C, T43R, T51S/D, T53D, S56A/C, V59T, L60A를 포함한다. 바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의: T51S+S56A+V59T+L60A+I18V를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역:93-127이다. 추가적 구체예에서 변이된 하위-영역은 영역:93-124이다. 바람직한 하위-부위는 하나 이상의: 93-107, 109-111, 113-115를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:

N93T, P94V, S95N, D97S, L98S/P, S100T/D, A102S/*, N110T, V111P, D112N, E113M/A, T114S, A115Q/G, Y116F, S119A, G127A를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

S119P+Y402F,

S119P+Y402F+I189T+Y223F+F227Y를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 170-184이다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:

N171R/K/Q/E/W/F/Y,

Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,

T173K/R/S/N/Q,

G174A/S,

Y175N/Q/D/E,

D176L,

L177I,

E180N/M,

V181I/T,

N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V, E가 바람직함,

G183A,

S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역:200-212이다. 바람직한 하위- 영역은: 200-211을 포함한다.

고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, W212N/A/T를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 234-246이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:234-240, 242-245를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245를 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 287-319이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:287-292, 294-301, 313-316을 포함한다.

고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319를 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:

S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

I288L/N/Q,
Y289F,

T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/P/S/V,

L291I/D/N,

N292D,

D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,

G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V,

L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

S295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,

S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,

E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V,

V301T/I,

A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, S가 바람직함,

V303T/I,

G304A,

R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,

Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V,

E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V, Q가 바람직함,

D309L,

T310V/S,

Y311N,

Y312Q/N, Q가 바람직함,

Y313T/S/G, S가 바람직함,

N315Q/E/R을 포함한다.

한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 388-414이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:397-399, 402-406, 412-414을 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치들은 하나 이상의 :388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414를 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의: M398L, S399C/Q/T, Y402F, D403S, S405T, E408C/R, S411V, A412C, D414A를 포함한다.

바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:

Y402F+S119P,

Y402F+S119P+I189T+Y223F+F227Y를 포함한다.

한 바람직한 구체예에서 변이된 영역은:

부위: 287-300,

부위: 305-319,

및/또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60% 상동성을 나타내는 상동성 글루코아밀라제 내의 대응하는 위치 또는 영역이다.

상동성 (동일성)

상기 모 글루코아밀라제에 대해 언급한 상동성은 첫번째 서열이 두번째 서열로부터 유도됨을 나타내는 두 단백질 서열간의 일치성의 정도로서 결정된다. 상동성은 GCG 프로그램 패키지(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. 및 Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p>443-453)에서 제공되는 GAP같이. 분야에서 알려진 컴퓨터 프로그램의 수단을 통해 적절히 결정된다. 폴리펩티드 서열을 비교하기 위해 다음과 같은 지정: GAP 생성 페널티(creation penalty) 3.0, GAP 연장 페널티(extension penalty) 0.1으로 GAP를 사용하여, 본 발명의 유사 DNA 서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드의 성숙한 부분은 적어도 70%와 같이 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 적어도 99% SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열의 성숙한 부분과 동일성을 나타낸다.

바람직하게는, 모 글루코아밀라제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 또는 그것의 대립유전자 변이체; 또는 글루코아밀라제 활성이 있는 그것의 단편으로 포함한다.

SEQ ID NO: 2의 단편은 이 아미노산 서열의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단으로부터 하나 이상의 결실된 아미노산을 가진 폴리펩티드이다. 예를 들어, AMG G2(SEQ ID NO: 2)는 글루코아밀라제 활성이 있는 Aspergillus niger G1 글루코아밀라제의 한 단편이다(Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5), p. 1097-1102). 대립 유전자 변이체란 같은 염색체 상 자리를 차지하는 유전자의 둘 이상의 택일적 형태중 어느 하나를 의미한다. 대립유전자 변이체는 돌연변이에 의해 자연적으로 생겨나고 집단 내의 다양성의 결과를 낳을 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵할(코드화되는 폴리펩티드상에 변화가 없음)수도 있거나 또는 바뀐 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드화 할 수도 있다. 폴리펩티드의 대립유전자 변이체는 유전자의 대립유전자 변이체에 의하여 코드화되는 폴리펩티드이다.

상동성 모 글루코아밀라제의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실 및/또는 다른 아미노산 잔기에 의한 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 다를 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 변화는 부차적인 종류의, 즉 단백질의 접힘 및/또는 활성에 중대한 영향이 없는 보전적 아미노산의 치환; 작은 결실, 전형적으로 1 내지 30 아미노산; 아미노-말단의 메티오닌 잔기와 같은 작은 아미노-말단 또는 카르복실 말단의 연장, 대략 20 내지 25 잔기 까지의 작은 연결 펩티드; 또는 폴리-히스티딘 반복서열, 항체의 에피톱, 또는 부착 도메인과 같은 전체 전하 또는 그외 다른 기능을 바꾸어 정제를 용이하게하기 위한 작은 연장이다.

또 다른 구체예에서, 분리된 모 글루코아밀라제는 매우 낮은 스트린전시(stringency)조건, 바람직하게는 낮은 스트린전시 조건, 더욱 바람직하게는 중간 스트린전시 조건, 더욱 바람직하게는 중간-높은 스트린전시 조건, 더욱 더 바람직하게는 높은 스트린전시 조건, 가장 바람직하게는 매우 높은 스트린전시 조건하에서, i)SEQ ID NO:1의 cDNA 핵산 서열, ii)SEQ ID NO: 1의 cDNA 서열, iii) i) 또는 ii)의 하위-서열, 또는 iv) i),ii) 또는 iii)의 상보적 가닥과 동일 조건하에서 혼성화하는 핵산 프로브와 혼성화하는 핵산 서열에 의하여 코드화된다(J. Sambrook, E.F. Fritsch, 및 T.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제 2판, Cold Spring Harbor, New York). SEQ ID NO:1의 하위-서열은 적어도 100 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 적어도 200 뉴클레오티드이다. 또한, 그 하위-서열은 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드 단편을 코드화 한다. 모 폴리펩티드는 또한 대립유전자 변이체 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드 단편이다.

SEQ ID NO: 1의 핵산 서열 또는 그것의 하위서열뿐만 아니라 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 그것의 단편은 서로 다른 속 또는 종의 균주로부터 당업계 주지의 방법에 따라 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 밝히고 글로닝하기 위하여 핵산 프로브를 제작하는데 사용될 수 있다. 특히, 이런 프로브는 그 안의 대응하는 유전자를 밝히고 분리하기 위하여 표준적인 서던블롯 방법에 따라 그 관심있는 속 또는 종의 게놈 DNA 또는 cDNA와 혼성화에 사용될 수 있다. 이런 프로브는 전체 서열에 비하여 상당히 짧을 수 있지만 적어도, 바람직하게는 적어도 25, 더 바람직하게는 적어도 35 뉴클레오티드 길이는 되어야 한다. 더 긴 프로브도 또한 사용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 대응하는 유전자를 탐지하기 위하여(예를 들어 ³²P, ³H, ³⁵S,비오틴(biotin), 또는 아비딘(avidin)으로)표지된다.

그러므로, 이런 다른 생물체로부터 마련된 게놈 DNA 또는 cDNA라이브러리는 상기한 프로브에 혼성화되고 글루코아밀라제를 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 찾기 위하여 검색될 수 있다. 이런 다른 생물체으로부터 유래한 게놈 DNA나 다른 DNA는 한천 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동이나 다른 분리기술을 이용하여 분리될 수 있다. 라이브러리에서 유래한 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀루로즈 또는 다른 적합한 운반체 물질에 옮겨져서 고정될 수 있다. 클론이나 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 하위-서열과 상동성 있는 DNA를 동정하기 위하여 운반체 물질이 서던블롯에 사용된다. 본 발명의 목적을 위하여, 혼성화는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1에 나타낸 핵산서열, 그것의 상보적 가닥, 또는 그것의 하위-서열 각각에 매우 낮은 스트린전시 조건 내지 매우 높은 스트린 전시 조건하에서 대응하는 핵산 프로브에 혼성화된다는 것을 가리킨다. 이런 조건 하에서 핵산 프로브가 혼성화된 분자는 X-선 필름을 사용하여 탐지된다.

적어도 100 뉴클레오티드 긴 길이의 프로브를 위하여는 운반체 물질은 최종적으로 적어도 45℃(매우 낮은 스트린전시), 더 바람직하게는 적어도 50℃(낮은 스트린전시), 더 바람직하게는 적어도 55℃(중간 스트린전시), 더 바람직하게는 적어도 60℃(중간-높은 스트린전시),좀더 바람직하게는 적어도 65℃(높은 스트린전시), 및 가장 바람직하게는 적어도 70℃(매우 높은 스트린전시) 각각의 온도에서 2x SSC, 0.2% SDS로 각각 15분씩 세번씩 세척되어야 한다.

약 15뉴클레오티드 내지 70뉴클레오티드 길이의 짧은 프로브를 위하여, 스트린전시 조건은 표준 서던블롯 과정에 따라 Bolton과 Mccarthy에 따른 계산 방법 (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390)을 사용하여 계산된 T_m의 5℃ 내지 10℃이하에서 0.9M NaCl, 0.09M Tris-HCl pH 7.6, 6mM EDTA, 0.5% NP-40, 1x Denhardt's 용액, 1mM 피로인산나트륨, 1mM 제1인산나트륨, 0.1mM ATP, 및 ml당 0.2mg의 효모 RNA의 조성 안에서의 전 혼성화, 혼성화, 및 세척 후-혼성화로서 정의된다.

약 15뉴클레오티드 내지 70뉴클레오티드 길이의 짧은 프로브를 위하여는 운반체 물질은 6x SCC + 0.1% SDS에서 15분간 한번 세척되고 계산된 T_m보다 5℃ 내지 10℃ 낮은 온도에서 6x SCC를 사용하여 각각 15분씩 두번 세척되어야 한다.

본 발명은 또한 (a) 매우 낮은, 낮은, 중간, 중간-높은, 높은, 매우 높은 스트린전시 조건에서 SEQ ID NO:1의 핵산 서열, 또는 그것의 상보 가닥, 또는 그것의 하위-서열과의 혼성화; 및 (b) 그 핵산 서열의 분리에 의하여 만들어진, 분리된 핵산 서열과 관련된다. 그 하위-서열은 바람직하게는 글루코아밀라제 활성이 있는 폴리펩티드 단편을 코드화하는 서열 같은, 적어도 100 뉴클레오티드의 서열이다.

고려된 모 글루코아밀라제은 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 100% SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드 글루코아밀라제 활성의 가지고 있다.

한 바람직한 구체예에서는 이 발명의 변이체는 대략 60 내지 80℃, 바람직 하게는 63 내지 75℃ 온도 간격 내에서, 바람직하게는 pH 4 내지 5, 특히 4.2 내지 4.7에서 말토덱스트린을 기질로 사용하여 개선된 열 안정성 및/또는 증가된 특이활 성을 가진다.

다른 한 바람직한 구체예에서는 이 발명의 변이체는 예를 들어 알콜 발효를 위하여 사용된다.

한 바람직한 구체예에서는 모 글루코아밀라제는 Aspergillus niger G1의 글루코아밀라제(Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5), p. 1097-1102)이다. 모 글루코아밀라제는 절단형의 글루코아밀라제, 예를 들면 AMG G2 글루코아밀라제, 일 수도 있다.

모 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA 서열의 클로닝

모 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA서열은 당업계 주지의 다양한 방법을 사용하여 문제의 글루코아밀라제를 생산하는 어떤 세포나 미생물로부터 분리될 수 있다. 첫째로, 연구될 글루코아밀라제를 생산하는 생물체에서 유래한 염색체 DNA 또는 전령 RNA 를 사용하여 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리가 제작되어야 한다. 그 후, 만약 글루코아밀라제의 아미노산 서열이 알려진 경우는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 합성될 수 있고 문제의 생물체로 부터 마련된 게놈 라이브러리에서 유래한 글루코아밀라제를 코드화하는 클론을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 대안으로, 다른 공지의 글루코아밀라제 유전자에 상동성 있는 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 매우 낮은 스트린전시 부터 매우 높은 스트린전시 까지의 혼성화 및 세척조건을 사용하여 글루코아밀라제를 코드화하는 클론을 동정하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이것은 위에 기술되어 있다.

글루코아밀라제를 코드화하는 클론을 동정하는 또 다른 방법은 게놈 DNA 단 편을 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입하고, 결과물인 게놈 DNA 라이브러리로 글루코아밀라제가 없는 세균에 형질전환 시키고, 그런 뒤에 형질 변환된 세균을 글루코아밀라제의 기질(즉, 말토스)을 포함하는 한천에 도말하고, 그것에 의하여 글루코아밀라제를 발현하는 클론을 동정되도록 두는 것을 포함한다.

대안으로, 그 효소를 코드화하는 DNA 서열은 확립된 표준적 방법, 예를 들어 S.L. Beaucage 및 M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, 에 서술된 포스포로아미디트(phosphoroamidite) 방법 또는 Matthes et al.에 의하여 EMBO J. 3, p. 801-805에 서술된 동 방법에 의해 합성으로 준비될 수 있다. 포스포로아미디트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자동 DNA 합성기에 의하여, 합성되고, 정제되고, 어닐(anneal)되고, 이어지고, 그리고 적합한 벡터에 클론되었다.

마지막으로, DNA서열은 표준적 기술에 따라 합성된, 게놈, 또는 cDNA 기원의 이어진 단편(적합하게는, 전체 DNA 서열의 다양한 부분에 해당하는 단편들)에 의하여 마련된 게놈 기원과 합성된 기원의 혼합, 합성된 기원과 cDNA 기원의 혼합, 또는 게놈 기원과 cDNA 기원의 혼합일 수 있다. DNA서열은 또한 특이적 프라이머,예를 들면 US 4,683,202 또는 R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491에 서술된, 를 사용한 다중효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 마련될 수 있다.

부위특이적 돌연변이 유발

일단 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA 서열이 분리되고, 그리고 돌연변이를 위하여 원하는 부위가 동정되면, 돌연변이를 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입될 수 있다. 이런 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌연변이 부위에 측면을 접한 핵산서열을 포함한다. 한 특정 방법에서는, DNA의 단일가닥으로된 갭(gap), 즉 글루코아밀라제를 코드화하는 서열,이 글루코아밀라제 유전자를 운반하는 벡터안에 만들어진다. 그 다음엔 원하는 돌연변이를 갖는 합성된 뉴클레오티드가 그 단일가닥 DNA의 상동성 부분에 어닐된다. 남은 갭은 그 다음에 DNA 중합효소I (클레노우 단편)으로 채워지고, 그리고 구조체가 T4 리가아제를 사용하여 연결된다. 이 방법의 특이적 예는 Morianga et al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639에 서술되어 있다. US4,760,025는 사소한 변화를 실행함으로써 다중변이를 코드화하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시한다. 그러나, Morinaga 방법에 의하면 다양한 길이의 올리고뉴클레오티드 다수가 도입 될 수 있으므로 어느 한번에도 더욱 많은 수의 다양한 돌연변이도 도입될 수 있다.

돌연변이를 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA서열에 도입하는 또 다른 방법은 Nelson and Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151에 서술되어 있다. 그것은 화학적으로 합성된 DNA 가닥을 PCR의 프라이머 중 하나로 사용하여 원하는 돌연변이를 포함하는 PCR단편의 3-단계 생성과 관련되어 있다. PCR로부터 생성된 단편으로 부터, 돌연변이를 운반하는 DNA 단편이 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의하여 분리될 수 있고, 발현 벡터에 다시 삽입될 수 있다.

더 나아가, Sierks. et al., (1989), Protein Eng., 2, 621-625; Sierks et al., (1990), Protein Eng. vol. 3, 193-198; 또한 Aspergillus niger에서 부위특이적 돌연변이 유발에 대하여 서술한다.

무작위 돌연변이 유발

무작위 돌연변이 유발은 문제를 나타낸 아미노산 서열로 번역되는 유전자의 적어도 세 부분 또는 유전자 전체 내에 편재된 또는 영역-특이적 무작위 돌연변이로서 적합하게 수행된다.

모 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA 서열의 무작위 돌연변이 유발은 통상적으로 당업계에 알려진 어느 한 방법으로 수행된다.

위와 관련하여, 본 발명의 더 나아간 측면은 그 안에서 변이체가 모 글루코아밀라제에 비하여 상대적으로 증가된 열안정성을 나타내는 글루코아밀라제 변이체를 생성하는 방법과 관련이 있는 데, 그 방법은:

(a) 모 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA 서열을 무작위 돌여변이를 유발하는 단계,

(b) (a)단계에서 얻어진 돌연변이된 DNA 서열을 숙주세포내로 발현하는 단계, 및

(c) 모 글루코아밀라제에 비하여 상대적으로 변화된 특성을 갖는 글루코아밀라제 변이체를 발현하는 숙주세포를 선별하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 방법의 (a) 단계는 바람직하게는 이 안의 작업 실시예에서 기술된 바와 같이 혼입된 프라이머를 사용하여 수행된다(아래 참조).

예를 들어, 무작위 돌연변이 유발은 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발물질을 사용하거나, 적합한 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 또는 DNA서열을 PCR에 의하여 생성되는 돌연변이 유발의 대상으로 함으로써 수행된다. 더 나아가, 무작위 돌연변이 유발은 이런 돌연변이 유발물질의 어떤 조합을 사용하여 수행된다. 돌연변이 유발 물질은 예를들면 전이, 전환, 역위, 교차, 결실, 및/또는 삽입을 유발할 수 있는 물질이다.

본 목적에 적합한 물리적 화학적 돌연변이 유발 물질의 예는 자외선(UV), 조사 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸 히드록실아민, 질산, 에틸 메탄 설포네이트 (EMS), 아황산 나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이와 같은 물질이 사용될 때에는 돌연변이 유발은 전형적으로 돌연변이 유발하고자 하는, 선택한 돌연변이 유발 물질 존재 하에서 돌연변이 유발이 일어나기 적합한 조건에서 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 항온처리하고, 원하는 성질을 가진 돌연변이된 DNA를 선별함으로써 수행된다.

올리고뉴클레오티드를 사용하여 돌연변이 유발이 수행될 때, 하나의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 합성하는 동안 바뀌어야 할 위치에서 세개의 비-모 뉴클레오티드로 혼입되거나 섞여진다. 혼입 또는 섞임은, 그것을 수행하여, 원하지 아니하는 아미노산에 대한 코돈은 회피되도록 수행된다. 혼입 되거나 섞인 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 PCR, LCR, 또는 적합하다고 여겨지는 어떤 DNA 중합효소 및 리가아제를 사용하여, 어떠한 공지된 기술에 의하여도 글루코아밀라제 효소를 코드화하는 DNA 속으로 삽입될 수 있다.

바람직하게는, 혼입은 야생형과 돌연변이의 비율이 미리 정의된 "일정한 무작위 혼입"을 사용하여 수행된다. 더 나아가서, 혼입은 어떤 뉴클레오티드의 도입이 우위가 되는, 그리고 그것에 의하여 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 도입되 는 것이 우위가 되는 방향으로 나아간다. 혼입은 예를 들어 각 위치에서 90%의 야생형과 10%의 돌연변이가 도입되도록 만들어진다. 혼입 계획의 선택에서 덧붙여 고려할 점은 단백질-구조적 뿐아니라 유전적 제약이다. 혼입 계획은 특히 종결 코돈의 삽입이 회피되는 것을 확실이 하는, DOPE 프로그램을 사용하여 만들어져야 한다.

PCR에 의하여 생성되는 돌연변이 유발이 사용될 때에는, 모 글루코아밀라제를 코드화하는 화학적으로 처리 또는 비처리 유전자가 뉴클레오티드의 잘못된 삽입을 증가시키는 조건 하에서 PCR이 수행된다 (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15).

E.coli, S. cereviseae, 또는 어떤 다른 미생물의 돌연변이 균주도 모 글리코실라제를 내포하는 플라스미드를 돌연변이 균주내로 형질전환하고, 그 돌연변이 균주를 그 플라스미드와 함께 성장시켜, 그리고 그 변이된 플라스미드를 그 돌연변이 균주으로부터 분리함으로써 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA의 무작위 돌연변이 유발에 사용될 수 있다. 변이된 플라스미드는 그 다음에 발현을 위한 생물체내로 형질전환된다.

돌연변이 유발될 DNA 서열은 편리하게도 모 글루코아밀라제를 발현하는 생물체로부터 마련된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리안에 존재한다. 대안으로는, 그 DNA 서열은 플라스미드나 박테리오파지와 같은 적합한 벡터상에 존재하는데, 이와같은 벡터는 그러지 아니하면 돌연변이 유발 물질에 노출되므로 함께 가온 방치된다. 돌연변이 유발될 DNA 서열은 또한 숙주세포의 유전체에 삽입되어 있거나 그 세 포안에 정착된 벡터로 존재하면서 숙주세포 안에 존재한다. 마지막으로 돌연변이 유발될 DNA 서열은 유리된 형태로 존재한다. 무작위 돌연변이 유발의 대상이 될 DNA는 바람직하게는 cDNA 또는 게놈DNA라는 것이 이해될 것이다.

어떤 경우에 있어서는 발현 단계 b) 또는 선별 단계 c)를 수행하기 전에 돌연변이된 DNA 서열을 증폭하는 것이 편리하다. 이와같은 증폭은 당업계에 알려진 방법, 현재에 바람직한 방법은 모 효소의 DNA 또는 아미노산 서열을 바탕으로 마련된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 생성된 증폭에 따라 수행된다.

함께 항온처리 또는 돌연변이 유발물질에의 노출에 이어서, 돌연변이된 DNA는 발현이 이루어지는 것을 허용하는 조건하에서, DNA서열을 운반하고 있는 적합한 숙주 세포를 배양하는 것에 의하여 발현된다. 이 목적에 사용되는 숙주세포는 선택적으로 벡터안에 존재하는, 돌연변이된 DNA 서열이 형질전환된, 또는 돌연변이유발 처리 과정동안 모효소를 코드화하는 DNA 서열을 운반한 숙주세포이다. 적합한 숙주 세포의 예는 다음과 같다: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans 또는 Strepetomyces murinus와 같은 그람 양성 세균; 및 E.coli같은 그람 음성 세균.

돌연변이된 DNA서열은 더 나아가 변이된 DNA서열의 발현을 용인하는 기능을 코드화하는 DNA서열로 구성된다.

편재된 무작위 돌연변이 유발

무작위 돌연변이 유발은 문제의 모 글루코아밀라제의 한 부분에 유리하게 편재된다. 이것은, 예를 들어, 그 효소의 어떤 영역이 그 효소의 주어진 특성에 특히 중요함이 동정된 때, 그리고 변형에 의해 개선된 특성을 갖는 변이의 결과가 예상될때에 유리하다. 이와 같은 영역은 정상적으로는 모 효소의 4차구조가 밝혀지고 그 효소의 기능과 관련이 된 때에 동정된다.

편재된, 또는 영역-특이적, 무작위 돌연변이유발은 위에 기술된 바와 같은 PCR에 의하여 생성된 돌연변이 유발 기술 또는 당업계에 알려진 적합한 다른 기술을 사용하여 편리하게 수행된다. 대안으로, 변형될 DNA서열의 부분을 코드화하는 DNA서열은 분리되고, 예를 들어, 적합한 벡터 안으로의 삽입에 의하여, 그리고 전기한 부분은 그다음에 위에 논의된 돌연변이 유발 방법 중 어느 하나를 사용하여 돌연변이 유발의 대상으로 한다.

이 발명의 변이체를 만들기 위한 대안적 방법은 WO 95/22625 (Affymax Technologies N.V.) 또는 WO 96/00343 (Novo Nordisk A/S)에 서술된 바와 같은 유전자 혼합법(gene shuffling)을 포함한다.

글루코아밀라제 변이체의 발현

본 발명에 따르면, 전기한 방법, 또는 당업계에서 알려진 대안의 방법 중의 하나에 의하여 생산된 변이체를 코드화하는 DNA서열은, 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 부착 부위, 번역 개시 신호, 및 선택적으로, 억제 유전자나 다양한 활성인자 유전자를 코드화하는 조절 서열을 전형적으로 포함하는 발현벡터를 사용하여 효소의 형태로 발현될 수 있다.

발현벡터

본 발명의 글루코아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA서열을 운반하는 재조합 발현벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정의 대상이 되는 벡터 중 어느 하나이고, 벡터의 선택은 종종 그 벡터가 도입될 숙주세포에 의존된다. 벡터는 숙주세포에 도입될 때 숙주세포 유전체에 삽입되어 그 벡터가 삽입된 염색체와 함께 복제되는 벡터이다. 적합한 발현벡터의 예는 pMT838을 포함한다.

프로모터

벡터안에서, DNA서열은 적합한 프로모터 서열과, 작동가능하도록 연결되어야 한다. 프로모터는 선택적 숙주 내에서 번역 활성을 나타내는 DNA 서열중의 하나이고 숙주세포에 대하여 상동적인, 또는 상이적인 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유래한다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA서열의 전사를 이끌어내기 위한 적합한 프로모터의 예, 특히 세균에서의 예는 E.coli의 lac 오페론의 프로모터, Streptomyces coelicolor 의 agarase 유전자 dagA 프로모터, Bacillus licheniformis a-amylase 유전자 (amyL) 의 프로모터, Bacillus strearothermophilus 의 말토스합성 아밀라제 유전자 (amyM)의 프로모터, Bacillus amyloliquefaciens a-아밀라제 (amyQ)의 프로모터, Bacillus subtilis xylA와 xlyB 유전자의 프로모터 등이다. 균류 숙주에서의 전사를 위하여는, 유용한 예는 A. oryzae TAKA 아밀라제, S. cerevisiae 에서 유래한 TPI (트리오스 포스페이트 이성 화효소)프로모터(Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, p.419-434), Rhizomucor miehei 아스파르트 프로티나제, A. niger의 중성 a-아밀라제, A. niger의 산에 안정한 a-아밀라제, A. niger의 글루코아밀라제, Rhizomucor miehei 리파제, A. oryzae의 알칼리 프로테아제, A. oryzae 의 트리오스 포스페이트 이성화효소, 또는 A. nidulans 아세트아미다제 등을 코드화하는 유전자에서 유래한 프로모터이다.

발현벡터

본 발명의 발현벡터는 또한 적합한 전사 종결인자로 구성되어 있고, 진핵세포에서는 다중 아데닐화 서열이 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA서열과 조작가능하도록 연결되어 있다. 종결과 폴리아데닐화 서열은 적합하게 프로모터와 동일한 기원에서 유래한다.

벡터는 더 나아가 벡터가 문제의 숙주 세포에서 복제하는 것을 가능하게 하는 DNA 서열로 구성되어 있다. 이와 같은 서열의 예는 플라스미드인 pUS19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제 개시점이다.

벡터는 또한 B. subtilis 또는 B. licheniformis의 dal 유전자, 또는 엠피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제내성을 지니는 유전자와 같은 선택마커, 즉 숙주세포의 결함을 보충하는 산물의 유전자, 로 구성되어 있다. 더 나아가, 벡터는 amdS, argB, niaD, 및 하이그로마이신(hygromycin) 내성을 일으키는 마커인 sC와 같은 Aspergillus 선택마커로 구성되어 있거나, 또는 WO 91/17243에 기술된 바와 같이, 공-형질전환에 의 하여 선택성이 획득된다.

본 발명의, 글루코아밀라제 변이체, 프로모터, 종결인자, 및 다른 인자들 각각을 코드화하는 DNA제작물을 연결하고, 이를 복제에 필수적인 정보를 포함하는 적합한 벡터에 삽입하는데 사용되는 방법은 당업계에서 숙련된 자에게 주지되어 있다 (참고., 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2판, Cold Spring Harbor, 1989).

숙주세포

위에 정의한 바대로 DNA 구조체 또는 본 발명의 발현벡터로 이루어져 있는 본 발명의 세포는 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 재조합의 생산에, 숙주세포로서 유리하게 사용된다. 세포는 DNA 구조체(하나 또는 그이상의 복제본)을 숙주세포 염새체 안으로 삽입함에 의하여, 변이체를 코드화하는 본발명의 DNA 구조체와 함께 형질전환된다. 이 삽입은 DNA서열이 세포내에서 안정하게 유지될 가능성이 높다는 잇점이 있는것으로 일반적으로 생각되고 있다. DNA 구조체들의 숙주 염색체 안으로의 삽입은 편리한 방법, 예를 들면 상동적 또는 상이적 재조합 방법, 에 따라 수행된다. 대안으로는, 세포는 다른 종류의 숙주세포와 관련하여 위에 기술된 바와 같이 발현벡터를 사용하여 형질전환된다.

본 발명의 세포는 포유류나 곤충과 같은 고등 생물의 세포가 되기도 하지만, 바람직하게는 미생물 세포, 예를들면 세균 또는 곰팡이 (효모 포함) 세포이다.

적합한 세균의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, 또는 Streptomyces lividans, 또는 Streptomyces murinus과 같은 그람 양성 세균, 또는 E. coli 같은 그람 음성 세균이다. 박테리아의 형질전환은 원형질체 형질전환에 의해, 또는 수용(competent) 세포를 사용함에 의하여 그 자체로 알려진 바대로 달성된다.

효모 생물체는 예를 들어 Saccharomyces cerevisiae 같은 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces의 종으로 부터 호의적으로 선택된다.

숙주세포는 또한 사상균, 예를 들어 Aspergillus의 종, 가장 바람직하게는 Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus niger에 속하는 균주, 또는 Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (완전한 상태에서는 Gribberella zeae라 명명하고, 이전에는 Gibberella roseum f. sp. cerealis), 또는 Fusarium sulphureum (완전한 상태에서는 Gibberella puricaris라고 명명하고, Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, 및 Fusarium roseum var. graminearum과 동의어), Fusarium cerealis (Fusarium cokkwellnse와 동의어), 또는 Fusarium venenatum의 균주와 같은 Fusarium의 균주이다.

발명의 한 바람직한 구체예에서는 숙주세포는 프로테아제가 결핍되거나 또는 결손된 균주이다.

이것은 예를 들어 "alp"라 명명되는 유전자가 결실된 염기성 프로테아제를 갖는, 프로테아제 결핍 균주인 Aspergillus oryzae Jal 125이 된다. 이 균주는 WO97/35956 (Novo Nordica)에 서술되어 있다.

사상균 세포는 원형질체 제작과 그 자체로 알려진 방법에 따라, 세포벽의 재생산이 후속되는 원형질체의 형질전환과 관련된 과정에 의하여 형질전환된다. Aspergillus를 숙주 미생물로 사용하는 것은 EP 238 023 (Novo Nordisk A/S)에 기술되어 있고, 그 내용은 참고문헌으로써 여기에 삽입되어 있다.

글루코아밀라제 변이체의 제작방법

좀더 나아간 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 글루코아밀라제의 변이체를 생산하는 방법과 관련이 있는데, 그 방법은 그 변이체를 생산하는데 도움이 되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것과 그 변이체를 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수하는 것으로 구성되어 있다.

숙주세포를 배양하는데 사용된 배지는 문제의 숙주세포를 성장시키고 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 발현을 얻는데 적합한 통상적 배지중의 하나이다. 적합한 배지는 상업적 공급자로부터 이용가능하거나 또는 공지된 방법에 따라서 마련될 수 있다(예를 들어 American Type Culture Collection 의 카탈로그에 기술된 바에 따라).

숙주세포로부터 분비된 글루코아밀라제 변이체는 세포를 원심분리 또는 여과를 통하여 배지로부터 분리하는 것과, 그리고 배지에서 단백질을 포함하는 구성물을 황산 암모늄과 같은 염을 이용하여 침전시키는 것을 포함하는 주지된 과정에 따라 배지로부터 편리하게 회수되며, 이 과정은 이온교환수지, 친화성 크로마토그래피, 또는 이와 유사한 과정과 같은 크로마토그래피 과정의 사용으로 이행된다.

녹말 전환

본 발명은 포도당 생산과 그와 유사한 것을 녹말로부터 생산함에 본발명의 글루코아밀라제 변이체를 사용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 방법은 a-아밀라제의 존재하의 전구체 녹말의 부분적 가수분해와 그리고 그 다음으로 글루코아밀라제 존재하의 a-(1→4) 및 a-(1→6) 글루코시딕 결합의 절단을 통한 녹말 또는 연관된 올리고당과 다당 분자의 비환원말단으로부터 D-포도당의 방출물의 더 나아간 가수분해 단계를 포함한다.

a-아밀라제를 이용한 전구체 녹말의 부분적 가수분해는 녹말 분자의 내부의 a-(1→4)-결합의 가수분해를 통한 첫 분해를 제공한다. 상업적 응용에서는, a-아밀라제를 사용한 첫 가수분해는 약 105℃의 온도에서 수행된다. 통상적으로 30% 내지 40% 고체의 매우 높은 녹말 농도가 처리된다. 첫 가수분해는 통상적으로 이런 상승된 동도에서 5분간 수행된다. 부분적으로 가수분해된 녹말은 두번째 용기로 옮겨지고 10 내지 15의 덱스트로스 평형체(D.E.)를 만들기 위해 85℃내지 98℃의 온도에서 대략 1 내지 2시간동안 항온처리될 수 있다.

글루코아밀라제 존재 하에서의 녹말 또는 연관된 올리고당과 다당 분자의 비환원 말단으로부터의 D-포도당의 분출물의 더 나아간 가수분해의 단계는 보통 30℃와 62℃사이의 낮아진 온도하에서 분리된 용기에서 수행된다. 바람직하게는 기질 용액의 온도는 55℃와 60℃사이로 떨어진다. 용액의 pH는 약 5.5 내지 6.5으로부터 3과 5.5 사이 범위로 떨어진다. 바람직하게는, 용액의 pH는 4 내지 4.5이다. 글루코아밀라제가 용액에 첨가되고 24 내지 72 시간동안, 바람직하게는 36 내지 48 시간동안 반응이 수행된다.

본 발명의 내열성 글루코아밀라제 변이체를 사용하여 회분식 당화공정보다 더 높은 온도에서 당화공정들이 수행된다. 본 발명에 따르면 당화과정은 60℃이상내지 80℃ 범위의 온도들, 바람직하게는 63℃ 내지 75℃ 수행될 수 있다. 이것은 전통적 회분식 과정 (상기한 바대로) 및 연속식 당화과정 양자 모두에 적용한다.

실제적으로, 하나 이상의 막에 의하여 분리된 과정들을 포함하는 연속 당화 과정들은 막을 통한 합당한 높은 유입을 유지할 수 있기 위하여 또는 세균의 오염을 최소화하기 위하여, 60℃이상의 온도에서 수행되어야 한다. 그러므로, 본 발명의 내열성 변이들은 공업적인 당화 공정에서 받아들일 수 있는 시간의 기간내에, 낮은 비용 및/또는 더 낮은 효소 단백질의 양으로도 대규모 연속 당화 공정들을 수행할 수 있는 가능성을 제공한다. 본 발명에 따르면, 당화시간은 더 단축될 수 있다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체(예를 들어 AMG 변이체)의 활성은 전통적으로 사용되는 30℃ 내지 60℃사이의 온도에서보다 60℃ 내지 80℃ 사이의 범위에서 일반적으로 충분히 더 높다. 그러므로, 글루코아밀라제가 작동하는 온도를 높임으로써 당화 과정은 더 짧은 시간의 기간동안 수행된다.

더 나아가, 열안정성을 개선함으로써 T_1/2(반감기, 재료 및 방법 편에 정의된 대로)는 개선될 수 있다. 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 열 안정성이 개선되어서, 당화 과정동안 불활성화된 글루코아밀라제와 교체하기 위하여 소량의 글루코아밀라제가 첨가되면 된다. 본 발명에 따르면 당화과정동안 더 많은 글루코아밀라 제가 활성이 유지된다. 더욱 더 나아가, 63℃이상의 온도에서 당화과정이 수행되는 동안 미생물에 의한 오염의 위험 또한 줄어든다.

글루코밀라제, 아밀라제 및 풀루란나제를 이용한 전형적인 당화 시도로부터의 포도당 수율은 95.5% 내지 96.5% 이다. 나머지 탄수화물들은 1%의 말토스, 1.5 내지 2%의 이소말토스, 및 1 내지 1.5%의 가수가 더 높은 올리고당들로 구성되어 있다. 이당류들은, 포도당 농도가 높고 건조 고체의 수위가 높은 때의 글루코아밀라제는 역반응산물을 형성하는 경향이 있기 때문에, 생산된다.

액화된 후 용액내 존재하는 당류들 및 당화과정에서 생성된 당류들로의 증가된 특이활성을 갖는 글루코아밀라제는 사용될 수 있는 것보다 줄어든 효소 용량 또는 더 짧아진 과정 시간 때문에 잇점이 있다. 일반적으로, 글루코아밀라제는 더 짧은 사슬 당류에 비해 더 긴 당류로 구성된 기질들에 선호성을 가지고 예를 들어 말토헵토스에 대한 특이활성이 따라서 말토스에 대하여 보다 6배 더 높다. 말토스와 같은 짧은 사슬 당류에 대한 증가된 특이활성(올리고당에 대한 활성의 감소 없는)은 따라서 또한 더 낮은 효소 용량 및/또는 더 짧은 과정 시간의 사용을 가능하게 한다.

더 나아가, 더 높은 포도당 수율은, 감소된 분량의 효소 단백질이 사용되므로, 증가된 α-1,4 가수분해 활성(만약 α-1,6 활성이 변하지 아니하거나 또는 줄어든다면)을 갖는 글루코아밀라제 변이체를 이용하여 얻어 질 수 있고 α-1,6 역반응 산물은 따라서 줄어든다(더 적은 양의 이소말토스).

특이활성은 37℃ 또는 60℃에서, "재료 및 방법" 편에서 기술된 방법을 사용 하여 측정된다.

그 안에 본 발명의 글루코아밀라제 변이체들이 사용되는 당화과정의 실시예는 JP 3-224493; JP 1-191693; JP 62-272987; EP452,238, 와 WO 99/27124 (모든 참고문헌은 참고문헌으로서 여기 삽입되어 있다)에 기술된 과정들을 포함한다.

본 발명의 더 나아간 측면은 다음의 단계들로 구성된, 액화된 녹말용액의 당화하는 방법과 관련이 있다.

(i) 그 단계동안 하나 이상의 효소 당화기간들이 일어나는 당화 단계, 그리고 그 다음 단계로서

(ii) 하나 이상의 높은 온도의 막분리 단계

상기 효소 당화는 본 발명의 내열성 글루코아밀라제 변이체를 사용하여 수행된다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체(들)은 본 발명의 과정에서는 오직 4개이상의 포도당 잔기 분자내의 α-(1→6)-글리코시딕 결합만 가수분해하는 효소와 조합하여 사용된다. 선호적으로는, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 풀루란나제 또는 이소아밀라제와 조합하여 사용될 수 있다. 탈분지를 위한 이소아밀라제와 풀루란나제의 사용, 그 효소들의 분자적 특성, 및 효소들의 글루코아밀라아재와의 잠재적 사용은 G.M.A. van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142에 설명되어 있다.

더 나아간 측면에서는 본 발명은 녹말 전환 과정에서의 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 사용과 관련이 있다.

더 나아가, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 연속 당화 단계들을 포함하여 연속 녹말 전환 과정에 사용된다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 또한 고정화된 형태로 사용될 수 있다. 이것은 말토스 시럽과 같은 특화된 시럽들을 생산 하는데, 및 더 나아가 과당 시럽의 생산과 관련된 올리고당의 추출 찌꺼기 흐름에 적합하고 자주 사용된다.

본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 또한 연료 또는 음료로서의 에탄올을 생산하는 과정에 사용되거나 또는 시트르산, 아스코르브산, 라이신, 글루탐산과 같은 유기 화합물들을 생산하기 위한 발효공정에 사용된다.

재료 및 방법

재료:

효소들:

AMG G1: Boel etal. (1984), EMBO J. 3 (5), 1097-1102, 및 SEQ ID NO: 13 에 개시된 Aspergillus niger 글루코아밀라제 G1, Novo Nordisk로부터 이용가능

AMG G2: SEQ ID NO: 2에 나타난 절단된 Aspergillus niger의 글루코아밀라제, G1 Novo Nordisk로부터 이용가능

용액들:

완충액: 0.05M 아세트산나트륨 ( 1L milli-Q 물에 6.8g ), pH 4.5

정지용액: 0.4M NaOH

GOD-perid, 124036, Boehringer Mannheim

기질들:

말토스: 29mM ( 100ml 50mM 아세트산 나트륨에 1g의 말토스, pH4.5) (Sigma)

말토헵토스: 10mM, 115mg/10ml (Sigma)

숙주 세포:

A. oryzae JaL 125: Institute for Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-chome Yodogawa-ku, Osaka, Japan으로부터 이용가능하고, A. oryzae pyrG 유전자를 마커로 사용하여 1단계 유전자 교환방법(G. May에 의하여 "Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi" (1992), p.1-25. Eds. J. R. Kinghorn 및 G. Turner; Blackie Academic and Professional에 서술됨)에 의하여 결실된 "alp"(Murakami K et al., (1991), Agric. Biol. Chem. 55, p. 2807-2811에 서술됨)라 칭하는 알칼리성 프로테아제 유전자를 가진 Aspergillus oryzae IFO 4177. JaL 125 균주는 더 나아가 WO 97/35956 (Novo Nordisk)에 개시되었다.

미생물들:

균주: Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATaleu2-△2 ura3-52 his4-539 pep4-△1[cir+]

플라스미드들 :

pCAMG91: 도1 참조. Aspergillus niger G1 글루코아밀라제 (AMG G1)을 포함하는 플라스미드. pCAMG91의 제조는 Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (7) p.1581-1585에 개시되어 있다.

pMT838: 절단된 Aspergillus niger 글루코아밀라제 G2(SEQ ID NO: 2)를 코드화하는 플라스미드

pJSO026 (S. cerevisiae 발현 플라스미드) (J.S.Okkels, (1996) " pYES벡터내의 URA3-프로모터의 결실은 S. cerevisae에서 균류 리파제의 발현 수준을 증가시킨다." Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, Anuals of the New York Academy of Sciences의 vol. 782) 더 구체적으로, 발현 플라스미드 pJSO37는 pYES 2.0의 유도가능 GAL1프로모터를 Saccharomyces cerevisiae로부터 유래한 항시-발현성 TPI프로모터(트리오스 포스페이트 이성화효소)(Albert 및 Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1, 419-434)로 교체함과 URA3 프로모터의 일부분을 결실함에 의하여 pYES2.0로부터 유도되었다.

방법:

Saccharomyces cerevisiae YNG 318의 형질전환

DNA단편들 및 열린 벡터들은 혼합되어 표준 방법들에 의하여 효모인 Saccharomyces cerevisae YNG318로 형질전환된다.

특이활성을 k _cat (sec. ^-1 )로서 결정함

750 마이크로L 기질(1% 말토스, 50mM 아세트산나트륨, pH4.3)은 5분동안 37℃ 또는 60℃와 같은 선택된 온도에서 항온처리된다.

아세트산나트륨에 희석된 50 마이크로L 효소가 첨가된다. 100 마이크로L의 분할량들이 0, 3, 6, 9 및 12분 후에 취하여져서 반응을 정지하기 위하여 100 마이크로L 0.4M 수산화나트륨에 옮겨진다. 빈칸도 포함된다.

20 마이크로L은 마이크로 적정 평판들로 옮겨지고 200 마이크로L의 GOD-Perid 용액이 첨가된다. 실온에서 30분 항온처리한 후 650nm에서의 흡광도가 측정된다.

포도당이 표준으로 사용되고 특이활성은 k_cat(sec.^-1)로서 계산된다.

AGU 활성의 결정 및 AGU / mg로 표현

1 노보 아밀로글루코시다제 유니트(Novo Amyloglucosiase Unit)(AGU)는 1분에 37℃ 및 pH 4.3에서 1 마이크로몰의 말토스를 가수분해하는 효소의 분량으로 정의된다. 분석 방법의 자세한 서술(AEL-SM-0131)은 Nove Nordisk로부터 요구하여 이용가능하다.

활성은 Boehringer Mannheim에서 유래한 GOD-kit, 124036.를 사용한 후에 변형된 방법에 의하여 AGU/mg으로 결정된다. Standard: AMG-standard, batch 7-1195, 195 AGU/mg.

375 마이크로L의 기질 (50mM아세트산나트륨 안의 1% 말토스, pH4.3)은 37℃에서 5분동안 항온처리된다. 아세트산나트륨에 희석된 25마이크로L의 효소가 첨가된다. 이 반응은 10분 경과후 100 마이크로L의 0.25M의 NaOH를 첨가함으로써 정지된다. 20마이크로L는 96정 마이크로적정평판으로 옮겨지고 200 마이크로L GOD-Perid 용액이 첨가된다. 실온에서 30분 경과 후, 650nm에서의 흡광도가 측정되고 특이활성이 AMG-표준에 따른 AGU/mg으로 계산된다.

AMG로된 특이활성은 그다음엔 단백질 농도(mg/ml)로 유추한 활성(AGU/ml)으 로 부터 계산된다.

Aspergillus oryzae 의 형질전환 (일반 과정)

100ml의 YPD (Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory)는 A. oryzae의 포자로 접종되고, 약 24시간 동안 진탕 배양된다. 균사는 미라글로스(miracloth)를 통하여 여과에 의하여 수집되고 200ml의 0.6M MgSO₄로 세척한다. 균사는 15ml의 1.2M MgSO_4, 10mM NaH₂PO₄ , pH 5.8안에서 현탁시킨다. 그 현탁액은 얼음위에서 냉각되고 1ml의 120mg의 Novozyme^TM234을 포함하는 완충액이 첨가 된다. 5분 경과 후, 1ml의 12mg/ml의 BSA (Sigma H 형)가 첨가되고 현미경 아래에서 조사한 표본 안에 많은 수의 원형질체가 관찰될 때까지 1.5 내지 2.5시간동안 37℃에서 온화하게 교반하면서 항온처리가 이어진다.

현탁액은 마이크로클로스(microcloth)를 통하여 여과되고, 여과물은 살균된 시험관안으로 옮겨지고, 그리고 5ml의 0.6M 솔비톨, 100mM Tris-HCl, pH7.0로 뒤덮여 진다. 원심분리가 1000g에서 15분간 수행되고 원형질체는 MgSO₄완화액의 상층으로부터 수집된다. 2부피의 STC (1.2M 솔비톨, 10mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM CaCl₂)가 원형질체 현탁액에 첨가되고 혼합액은 1000g에서 5분간 원심분리된다. 원형질체 응집체(pellet)는 3ml의 STC로 다시 현탁되고 다시 응집된다. 이 과정은 반복된다. 마지막으로, 원형질체는 0.2-1ml의 STC안에 다시 현탁된다.

100㎕의 원형질체 현탁액은 10㎕의 STC에, 5-25㎍의 p3SR2 ( Hynes et al., Mol. and Cel. Biol. Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Aug. 1983에 기술된 A. nidulans amdS 유전자를 포함하는 플라스미드)와 함께 혼합된다. 그 혼합액은 0.2ml의 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10mM CaCl₂에 방치되고 그리고 10ml의 Tris-HCl, pH7.5가 첨가되고 주의깊게 혼합되고(두번) 그리고 마지막으로 0.85ml의 같은 용액이 첨가되고 주의깊게 혼합된다. 그 혼합액은 실온에서 25분동안 방치되고, 2,500g에서 15분간 돌리고, 그리고 응집체는 2ml의 1.2M 솔비톨에 재현탁된다. 한번 더 침전시킨후 원형질체들은 백그라운드 성장을 저해하기 위하여 1.0M 수크로스, pH 7.0, 질소원으로 10mM 아세트아미드, 및 20mM CsCl를 함유한 최소평판(Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56)에 도말한다. 4 내지 7일간 37℃에서 배양한 후 포자들은 선택되고, 멸균수에 현탁되고 하나의 콜로니로 퍼진다. 이 과정은 반복되며 두번째 재분리 후의 콜로니의 포자들은 정의된 형질전환체로서 보관된다.

유가식 발효

유가식 발효가 말토덱스트로스를 탄소원으로하고, 요소를 질소원으로하고, 효모추출물을 포함하는 배지에서 수행된다. 유가식 발효는 A. oryzae의 문제되는 숙주세포의 진탕 플라스크 배양액을 3.5%의 탄소원과 0.5%의 질소원으로 구성된 배지에 접종함으로써 수행된다. pH5.0 및 34℃에서 24시간동안 배양한 후 부가적 탄소 및 질소원의 연속적 공급이 시작된다. 탄소원이 제한인자로 유지되고 산소공급이 충분함이 보장된다. 유가식 배양은 4일간 지속되며, 그 후에 효소들은 원심분리, 한외여과, 청정 여과 및 무균여과로 회수된다.

정제

배양 육즙은 여과되고 1.7M AMS의 농도로 황산암모늄(AMS)가 첨가되고 pH는 pH5로 맞추어 진다. 침전된 물질은 원심분리로 제거되고 글루코아밀라제 활성을 포함하는 용액은 미리 1.7M AMS, 20mM 아세트산나트륨, pH5로 평형화된 Toyo Pearl Butyl 컬럼에 적용한다. 부착되지 않은 물질들은 평형완충액으로 세척된다. 부착된 단백질은 컬럼부피의 10배 이상의 1.7 내지 0M AMS 선형구배를 사용하여 10mM 아세트산나트륨, pH 4.5로 용출한다. 글루코아밀라제를 포함하는 분획들은 수집되고 20mM 아세트산 나트륨, pH4.5에 대하여 투석된다. 그 용액은 그 다음에는 미리 10mM Piperazin, Sigma, pH5.5로 평형화된 Q 세파로스 컬럼에 적용된다. 부착되지 않은 물질들은 평형완충액으로 세척된다. 부착된 단백질은 컬럼부피의 10배 이상의 0 내지 0.3M 염화나트륨 선형구배를 사용하여 10mM Piperazin, pH5.5로 용출한다. 글루코아밀라제를 포함하는 분획)들은 수집되고 그 순수도는 SDS-PAGE를 이용하여 확인된다.

T _1/2 (반감기) 방법 I

변이체들의 열 안정성은 다음 방법을 사용하여 T_1/2로서 결정된다: 950 마이크로리터의 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH4.3) (NaOAc)가 5분간 68℃ 또는 70℃에서 5분간 항온처리된다. 50마이크로리터의 완충액(4AGU/ml) 안의 효소가 첨가된다. 2x40마이크로리터의 표본들이 0, 5, 10, 20, 30 및 40분 각각에 취하여지고 얼음위에서 냉각된다. 가온방치 이전(0분)에 측정된 활성(AGU/ml)은 대조군(100%)으로 사용된다. 안정성의 기울기(퍼세트로서)가 가온방치시간에 대한 함수로 측정된다. 남 은 글루코아밀라제 활성의 %가 각기 다른 시간에서 결정된다. T_1/2은 그 때까지의 남은 활성의 %가 50%로 줄어든 경우의 시간의 간격이다.

T _1/2 (반감기) 방법 II

T_1/2는 문제의 효소를 pH4.5에서 문제의 온도(예를 들어 70℃)에서 30% 포도당, 50mM 아세트산나트륨에 항온처리함으로써 측정된다. 표본들은 주어진 시간 간격별에서 취하여지고 얼음위에서 냉각되고 잔류된 효소 활성은 pNPG 방법(아래 서술한 대로)에 의하여 측정된다.

%잔류 글루코아밀라제 활성은 다른 시간들에서 결정된다. T_1/2은 그 때까지의 남은 활성의 %가 50%로 줄어든 경우의 시간의 간격이다.

잔류된 효소 활성(pNPG 방법)

pNPG 시약:

0.2g의 pNPG (p-니트로페닐글루코피라노시드)는 0.1M 아세테이트 완충액(pH4.3)에 용해되어 100ml로 만들어진다.

보레이트 용액:

3.8g의 Na₂B₄O₇ 10H₂O 는 Milli-Q 물에 용해되어 100ml로 만들어 진다.

25 마이크로L의 표본들은 50마이크로L의 기질이 첨가되고 2시간동안 50℃에서 항온처리된다. 광학밀도는 405nm에서 측정되고 잔류 활성은 계산된다.

pAMGY 의 제조

pAMGY벡터는 이하와 같이 제조된다: pJSO026의 리파제 유전자는 AMG유전자로 교체되었는데, 그것은 순방향 프라이머인; FG2: 5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3'과 역방향 프라이머인; RG2: 5'-CTC AAA CGA CTCACC AGC CTC TAG AGT-3'과 함께 주형 플라스미드로 AMG유전자를 포함하는 pLAC103를 사용한 PCR 증폭되었다. pJSO026은 XbaI과 SmaI에 의하여 37℃에서 2시간동안 절단되었고 PCR 증폭물은 클레노우 단편의 사용과 XbaI에 의한 절단에 의하여 평활말단화 되었다. 벡터 단편과 PCR 증폭물은 연결된 후 전기 형질전환에 의하여 E.coli 안으로 형질전환되었다. 결과의 벡터는 pAMGY로 명시된다.

pLaC 103의 제작

A. niger의 AMGII cDNA 클론은 AMG의 GII형태의 S. cerevisiae에서의 발현을 목적으로 하는 pLaC103의 기원으로 사용된다. 제조는 아래 개략적으로 서술된 몇몇단계로 이루어진다.

pT7-212 (EP37856/ 미국 특허 번호. 5162498)은 XbaI으로 절단되고 클레노우 DNA 중합효소 및 dNTP로 평활말단화된다. EcoRI으로 절단된 후 결과물인 벡터 단편은 한천 전기영동겔로부터 정제되고 2.05kb 길이의 pBoel53의 EcoRI-EcoRV 단편과 연결되어 그것에 의하여 결과적 플라스미드인 pG2x안의 AMG를 코드화하는 단편의 EcoRI말단에 XbaI부위를 재생산한다.

AMG cds의 상류 DNA를 제거하기 위하여, 및 적합한 제한효소 인식부위를 갖는 AMG를 코드화하는 DNA를 만들기 위하여 다음의 구조체가 만들어졌다:

p53의 930bp EcoRI-PstI 단편은 분리되었고 AluI 절단의 대상이되고, 결과적 771bp Alu-PstI 단편은 평활말단 EcoRI 부위를 갖는(위 참조) pBR322에 연결되었고 PstI으로 절단되었다. 결과적 플라스미드 pBR-AMG'에서, EcoRI 부위는 AMG cds의 개시 코돈으로부터 단 34bp에서 재생산된다.

pBR-AMG'로부터 775bp EcoRI-PstI 단편은 분리되고 pT7-212의 XbaI-EcoRI벡터 단편을 포함하는 연결반응에 의하여 pG2x에서 유래한 1151bp의 PstI-XbaI 단편과 연결된다.

결과적인 플라스미드 pT7GII는 탈인산가수분해효소 존재하에서 BamHI절단을 받고 인산가수분해효소의 불활성화 후에 부분적 SphI절단이 수행된다. 이 반응으로부터 2489bp SphI-BamHI 단편은 AMGII cds에 연결된 S.c.TPI 프로모터를 애워싸게 된다.

위 단편은 pT7GII의 1052bp BamHI단편과 함께 탈인산가수분해효소 처리된 pMT743(EP37856/US 5162498)의 벡터단편에 연결되는데 이 pMT743은 SphI-BamHI절단의 결과물이다. 결과적 플라스미드는 pLaC103이다.

열안정성 AMG 변이체의 선별

라이브러리는 아래에 기술된 내열성 여과지 분석에의해 검색되었다.

열안적성에 대한 여과지 분석법

효모 라이브러리가 30℃에서 최소한 72시간동안 100 ㎍/ml암피실린을 포함하는 SCFura 한천평판 위의 아세트산셀룰로스(OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, 독일)- 니트로셀룰로스 여과지(Protran-Ba 85, Schleicher & Scchuell, Dassel, 독일)의 샌드위치 평판에 도말된다. 콜로니들은 메탄올로 1분간 활성화된 PVDF 여과 지(Immobilon-P, Millipore, Bedford) 또는 Protran여과지(활성화 없이)로 레플리카(replica)되고, 그다음에 바로 0.1M NaAc에서 세척되고, 그다음엔 실온에서 2시간동안 가온방치된다. 콜로니들은 PVDF/Protran 여과지로부터 수도물로 세척된다. 각 여과샌드위치들과 PVDF/Protran 여과지들은 검색후에 여과지들 상의 양성 변이체를 위치짓기 위하여 가온방치 이전에 바늘을 이용하여 특정적으로 표지된다. 부착된 변이체와 함께있는 PVDF 여과지들은 0.1M NaAc, pH4.5가 담겨 있는 용기에 옮겨지고 47℃에서 또는 대안으로 Protran 여과지의 경우에는 67-69℃에서 항온처리된다. 아세트산셀룰로스 샌드위치와 SC ura-한천 평판위의 니트로셀룰로스 여과지는 사용시까지 실온에 보관된다. 항온처리후에, 잔류활성은 5%말토스, 1% 한천, 50mM NaAc, pH4.5를 포함하는 평판위에서 탐지된다. PVDF여과지와 함께 분석 평판은 여과지샌드위치와 같은 방법으로 표지되고, 2시간동안 50℃에서 방치된다. PVDF여과지를 제거한후 분석평판은 포도당 GOD-Perid( Boehringer Mannheim GmbH, 독일)로 염색된다. 잔류 활성이 있는 변이체들은 분석평판에서 하얀 배경에 짙은 녹색의 점으로 탐지된다. 개선된 변이체들은 보관 평판에 위치된다. 개선된 변이체는 처음 선별과 같은 조건하에서 두번 재선별된다.

DOPE 프로그램을 사용한 무작위 돌연변이 유발을 위한 일반적 방법

무작위 돌연변이 유발은 하기의 단계에 의하여 수행된다:

1. 모 효소에서 관심있는 변형을 위한 영역을 선택한다,

2. 선택된 영역에서 돌연변이 부위와 변이되지 않는 부위를 결정한다,

3. 예를 들어, 원하는 안정성 및/또는 제작되어야하는 변이의 수행의 관점에 서, 어떤 종류들의 돌연변이들이 수행되어야 하는지 결정한다,

4. 구조적으로 합당한 변이체를 선택한다.

5. 단계 3에서 선택된 잔기들을 단계 4를 고려하여 조정한다.

6. 뉴클레오티드 분포를 적합한 DOPE알고리즘을 사용하여 분석한다.

7. 필요하다면, 원하는 잔기들을 유전자 코드 리얼리즘(realism)에 맞춘다, 예를 들어 정지 코드의 도입을 피하기 위하여; 예를 들어 유전코드로부터의 제약들을 계산한다, 숙련된 자들은 어떤 코돈 조합들은 실제로는 사용될 수 없고 적응시킬 필요가 있다는 것을 인지할 것이다.

8. 프라이머를 제작한다,

9. 무작위 돌연변이를 프라이머를 사용하여 수행한다.

10. 결과적 검색을 통하여 개선된 특성을 갖는 글루코아밀라제 변이체를 선택한다.

Dope 알고리즘

단계 6에서 사용할 적합한 도프 알고리즘은 당업계에서 주지되어 있다. 이와 같은 알고리즘의 하나는 Tomandl, D. et al., 1997, J. of Computer-Aided Molecular Design 11:29-38에 서술되어있다. 또다른 알고리즘은 DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svecdsen, A, 및 Kretzschmar, T(1998) Nucleic Acids Research 26:697-702) 이다.

분자 가상실험을 사용하여 온도활성에 중요한 영역을 추출하는 방법

관심있는 효소, 여기서는 AMG,의 X-선 구조 및/또는 모델-구성 구조는 분자 역학 가상실험의 대상이 된다. 분자역학가상실험은 CHARMM(Molecular simulations(MSI)에서 유래) 또는 다른 적합한 프로그램, 예를 들어 DISCOVER (MSI로부터)을 사용하여 만들어진다. 역학은 진공상태, 또는 결정수를 포함하여, 또는 적합한 물에 넣어 문제되는 효소와 함께, 예를 들어 구형 또는 상자, 수행된다. 가상실험은 300 피코초 (ps) 이상, 예를들면 300 내지 1200ps 동안에 이루어진다. 등방성 진동은 구조들의 CA 탄소에 대하여 추출되고 구조들간의 비교가 수행된다. 등방성 진동을 얻는 방법의 더 자세한 것은 CHARMM manusl(MSI로부터 이용가능)에서 찾을 수 있다. 분자역학 가상실험은 전하를 띨 수 있는 아미노산위의 표준 전하들 사용하여 수행될 수 있다. 이런 조건은 약 7의 중간 pH와 유사하다. 더 낮은 pH를 분석하기 위하여, 보통의 적정가능한 아미노산 잔기들의 바뀐 pKa들을 얻기 위하여 pH2 내지 10 이내에서; Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr 및 His 분자의 적정이 행하여질 수 있다. 또한 Ser, Thr, 및 Cys도 적정가능하지만 여기서는 고려하지 않는다. 여기에서는 pH 때문에 바뀐 전하들 높은 pH에서는 모든 Arg, Lys은 음전하로, 모든 Asp, Glu는 전하가 없는 걱으로 서술되었다.

관심있는 효소의 모델을 만드는 것은 MSI프로그램 패키지의 HOMOLOGY모델을 사용하여 얻을 수 있다. Aspergillus awamori 의 변이체 X100의 결정구조는, 예를 들면 Brookhaven 데이타베이스의 3GLY 및 1DOG에서 찾을 수 있다.

실시예 1

AMG G2 변이체의 제조

특정부위 돌연변이 유발:

AMG G2 (SEQ ID NO:2) 변이체의 제작을 위하여 제조자의 지시에 따라 상업적 키트인, Chameleon 이중가닥, 특정부위 돌연변이 유발 키트가 사용되었다.

문제의 AMG G2효소를 코드화하는 유전자는 AMG G1형태가 포함되어 있는 pCAMG91(도1 참조) 플라스미드의 G2 nt.1362와 G2 nt.1530 사이의 DNA를 결실함에 의하여 마련된 pMT838 상에 위치시킨다.

제조자의 지시에 따라 pMT838의 항암피실린 유전자의 ScaI 부위는 하기의 프라이머를 사용하여 MluI 부위로 전환되었다:

7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3' (SEQ ID NO: 3).

(따라서, 항암피실린 유전자에서 발견되고 절단에 사용된 ScaI 부위는 MluI 부위로 바뀜). 문제의 AMG 유전자를 포함하는 pMT838 벡터는 그 다음에 DNA 중합효소와 올리고 7258 (SEQ ID NO: 3)과 21401(SEQ ID NO: 4)의 주형으로 사용된다.

프라이머 번호. 21401 (SEQ ID NO: 4)은 선별 프라이머로 사용되었다.

21401: 5'p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gta tat acc acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3'

(AMG 유전자에서 발견되는 ScaI부위를 아미노산 서열의 변화없이 전환함).

원하는 돌연변이 (예를 들어, 시스틴 잔기의 도입)는 원하는 돌연변이를 포함하는 적합한 올리고들을 첨가로써 문제의 AMG 유전자에 도입된다.

프라이머 107581은 T12P의 도입을 위하여 사용되었다.

107581: 5'pgc aac gaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3' (SEQ ID NO: 5)

변이체들은 전체 유전자를 서열결정함으로써 입증된다. 플라스미드는 위의 "재료 및 방법" 편에 기술된 방법을 사용하여 A.oryzae내로 형질전환된다. 변이체는 위의 "재료 및 방법" 편에 서술된 것과 같이 발효되고 정제된다.

실시예 2

편재된 무작위, 도프처리된 돌연변이 유발을 사용한, 모 효소에 비하여 개선된 열 안정성을 갖는 A.niger AMG 변이체의 제작

A. niger AMG의 열안정성을 개선시키기 위하여 선-선별된 영역안에 무작위 돌연변이 유발이 수행되었다.

잔기:

영역: L19-G35

영역: A353-V374

DOPE 소프트웨어 (재료 및 방법 참조)는 정지 코돈의 양을 최소화 하는 위의 영역들 안의 각 시사된 변화들 혼입되는 코드를 결정하기 위하여 사용된다(표 1 참조). 아미노산 변화의 시사된 집단을 유추하기 위하여, 뉴클레오티드의 정확한 분포는 코돈의 세 위치들에서 계산된다. 도프된 영역들은 원하는 잔기를 얻을 높은 기회를 갖기 위하여 지적된 위치들에서 특정적으로 도프되지만 아직 다른 가능성들도 허락된다.

첫째열은 돌연변이될 아미노산이고, 두째열은 야생형의 백분율이고, 그리고 세째열은 새로운 아미노산(들)을 정의했다.

L19-G35 에서의 도프

L19 90% N N20 95% T N21 일정 I22 일정 G23 95% A A24 90% S,T D25 93% S,T,R G26 95% A A27 90% S,T W28 ＜80% R,Y V29 일정 S30 93% T,N G31 95% A A32 95% V D33 80% R,K,H S34 90% N G35 일정

프라이머 서열, 야생형 뉴클레오티드 서열, 모 아미노산 서열 및 각 도프된 위치에 대한 뉴클레오티드의 분포와 함께. 결과적인 도프된 올리고뉴클레오티드 가닥은 표2에 센스방향 가닥으로서 나타낸다.

각 도프된 위치에 대한 뉴클레오티드 분포.

1: A10, C90

2: A6, T94

3: A95, C5

4: G95, C5

5: G91, A3, T3, C3

6: G95, A3, C2

7: G3, A95, C2

8: G92, A4, T4

9: A3, T97

10: G95, T5

11: G3, A97

12: G95, A2, C3

13: T5, C95

14: G88, A8, C4

15: G7, A93

16: G4, C96

17: G4, C96

18: G95, A2, C3

순방향 프라이머 (SEQ ID NO: 6):

FAMGII 5'-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GTT ATC 12T A3T AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC ATT GTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC-3'

역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 7):

RAMG1: 5'-GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3'

결과적인 도프된 올리고뉴클레오티드 가닥은 센스방향 가닥으로서 표4에 나타난다: 프라이머 서열, 야생주 뉴클레오티드 서열, 모 아미노산 서열 및 각 도프된 위치에 대한 뉴클레오티드의 분포와 함께.

각 도프된 위치에 대한 뉴클레오티드 분포

1:G91, A3, T3, G3

2:A13, C87

3:A40, T60

4:G3, A3, C94

5:A6, T94

6:G4, A4, T92

7:G2, A96, C2

8:G93, A3.5, C3.5

9:G87, A8, C5

10:A84, C16

11:G93, T7

12:G92, A5, T3

13:A3, C97

14:G3, A97

15:G2, A2, T4, C92

16:G93, A7

17:G93, C7

18:A90, T10

19:G4, A96

20:G95, A5

21:G96, A4

22:G3, C97

23:G2, A1, T95, C2

24:A3, C97

25:G97, A3, C2

26:G2, A96, C2

27:A5, C95

28:A95, T5

29:G2, A98

30:G94, A4, C2

31:G94, A3, T1, C2

32:A4, T96

33:A20, C80

프라이머: FAMGIV (SEQ ID NO: 8)

5'-GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T 1415A 1617C 18CC TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T A16T 2930C ATT 313233 GAT GCC GTG AAG ACT TTC GCC GA-3'

프라이머: RAMGVI (SEQ ID NO: 9)

5'-ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3'

무작위 돌연변이 유발

표2와 표3으로부터 명백한 혼입된 올리고뉴클레오티드들(일반적 용어로 FAMG로 표시된) 및 L19-G35영역에 대한 역방향 프라이머 RAMG와 N-말단(FG2:5'-CAT CCC CAG GAT TAC TCA GCA ATG-3'(SEQ ID NO: 10)과 C-말단(RG2: 5'- CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT (SEQ ID NO: 11)을 커버하는 특정 SEQ ID NO: 2 프라이머가 21염기쌍이 겹치는 중복 연장 방법(Horton et al., Gene, 77 (1989), pp. 61-68)에 의하여 PCR-라이브러리-단편들을 생성하기 위하여 사용되었다. 플라스미드 pAMGY는 중합효소연쇄반응의 주형이다. PCR 단편들은 E.coli/효모 셔틀벡터인 pAMGY에서 상동성 있는 재조합에 의하여 글로닝된다(재료 및 방법 참조).

검색

라이브러리는 위 "재료 및 방법" 편에 기술된 바와 같이 Protran 여과지를 사용하고 67 내지 69℃에서 항온처리함으로써 열안정성 여과지 분석법에서 검색되었다.

실시예 3

DNA올리고들로 혼입된 PCR 혼합에 의한, 모 효소보다 개선된 열안정성을 가진 A. niger AMG 변이체들의 제작

중합효소 연쇄반응(PCR)법은 AMG유전자와 양측인접영역을 포함하는 DNA단편을 마련하기 위하여 사용되었다. 대략 10 ug DNA가 DNA분해효소에 의하여 분해되고, 그리고 2% 아가로스겔이 수행된다. 50-150 bp의 단편들은 겔로부터 정제된다. 대략 1ug의 정제된 단편들은 원하는 돌연변이를 포함하는 5 내지 15몰(molar)배 많은 양의 올리고와 혼합된다. 각각, Hklib1, Hklib2, Hklib3 등의 제작을 위한 올리고들은 다음과 같은 종류이다:

DNA분해효소가 처리된 DNA와 올리고의 혼합에 뉴클레오티드, PCR 완충액 및 Taq/Pwo 중합효소가 첨가된다. PCR 조립반응이, 처음 2분간 94℃, 그다음엔 35 내지 40순환의 다음의 항온처리 시간들: 94℃,30초; 45℃,30초; 72℃,60초; 그 다음 마지막으로 5분간의 72℃를 사용하여 수행되었다. PCR 증폭반응은 1uL의 조립반응물이 주형으로서, 그리고 AMG유전자 양측인접 영역에 어닐하는 프라이머들을 첨가함으로써 수행되었다. 변수들: 처음 2분간 94℃, 그다음엔 다음의 항온처리 시간들로된 35 내지 40 순환: 94℃, 30초; 55℃, 30초; 72℃, 90초; 마지막으로 10분간의 72℃.

결과적 PCR 산물은 1% 아가로스 겔로부터 정제되고, 선형화된 벡터와 혼합되고, 그리고 위에 서술된 대로 컴피턴트 세포에 형질전환된다.

실시예 4

특이활성

AMG G2변이체는 위의 실시예1에 서술된 바와 같이 제작된다. k_cat로 나타난 특이활성은 pH 4.3, 37℃에서, 위 "재료 및 방법" 편에 서술한 바와 같이 말토스와 말토헵토스를 기질로 사용한 표본들에 대하여 계산된다. AGU/mg 으로 표현된 특이활성 또한 위 "재료 및 방법" 편에 서술된 바와 같이 말토스를 기질로 사용하여 pH 4.3, 37℃에서 측정된다.

실시예 5

70 ℃에서 열안정성

실시예1에서 기술된 접근방법을 사용하여 AMG G2 S119P의 변이체가 제조되었다.

열 안정성은 "재료 및 방법" 편에 기술된 바와 같이, 방법I을 사용하여 T_1/2로서, 50mM NaOAc, pH 4.5, 70℃, 0.2AGU/ml에서 30분간 항온처리후의 %잔류 활성으로서 결정되었다. 시험의 결과는 아래 표에 열거되어 있고, 야생형 A. niger AMG G2와 비교되어 있다.

실시예 6

68 ℃에서 열안정성

AMG G2 변이체는, 아래 표의 변이체 no. 1 및 no. 2를 제외하고는, 실시예3에 서술된 접근방법을 사용하여 제작되는데, 그 변이체는 WO 95/22625(Affymax Technology N.V.)에 서술된 바와 같이 혼합함에 의하여 마련된다. 열 안정성은 "재료 및 방법" 편에 서술된 바와 같이 68℃에서 방법 I을 사용하여 T_1/2로서 결정되고 같은 조건하에서의 야생형 A.niger AMG G2와 비교된다. 변이주의 평가는 상층액의 여과후 배양 육즙에 대하여 수행되었다.

실시예 7

68 ℃에서 열안정성

AMG G2 변이체는 실시예3에서 서술된 접근방법을 사용한 혼합함과 양성 변이주를 혼합함으로써 제작되었다. 열안정성은 "재료 및 방법" 편에서 서술된 바와 같 이 68℃에서 방법I을 사용하여 T_1/2로서 결정되고 같은 조건에서의 야생형 A.niger AMG G2에 비교된다. 평가는 상층액의 여과후에 배양 브로스에 대하여 수행된다.

실시예 8

68 ℃에서의 열 안정성

AMG G2 변이체는 실시예3에 서술된 접근방법을 사용하여 제작된다. 열 안정성은 "재료 및 방법" 편에 서술된 바와 같이 68℃에서 방법I을 사용하여 T_1/2로서 결정되었고 같은 조건에서 야생형 A.niger AMG G2와 비교되었다. 변이체의 평가는 상층액의 여과후에 배양 육즙에 대하여 수행되었다.

실시예 9

70 ℃에서 열 안정성

AMG G2 변이체는 실시예1에 서술된 접근방법을 사용하여 제작되었고 반-정제된 표본에 대하여 평가되었다(G-25컬럼 상에서 탈염화로 이어지는 배양 브로스의 여과). 열 안정성은 위의 "재료 및 방법" 편에 기술된 바와 같이, 50mM NaOAc, pH4.5, 70℃에서 방법I을 사용하여 % 잔류 활성으로서 결정된다. 시험의 결과는 아래 표에서 열거되고 야생주 A. niger AMG G2 비교된다.

실시예 10

30% 포도당의 존재하에서 70 ℃에서 열안정성

AMG G2 글루코아밀라제는 실시예3에 서술된 접근방법을 사용하여 제작된다.

열안정성은 "재료 및 방법" 편에 서술한 바와 같이 70℃에서 방법II을 사용하여 T_1/2로서 결정되고 같은 조건에서 야생형 A.niger AMG G2와 비교된다.

실시예 11

AMG 변이체 S119P+Y402F+S411V 및 PLASD (N-말단)+V59A+A393R+T490A,각각의 당화의 수행

양자 모두 개선된 열안정성을 가지는 AMG 변이체 S119P+Y402F+S411V 및 PLASD(N-말단)+V59A+A393R+T490A, 각각의 당화의 수행은 아래에 서술된 바와 같이 70℃에서 시험된다.

참조 효소는 야생형 A.niger AMG G2이다. 당화과정은 하기의 조건하에서 수행된다:

기질 10 DE 말토덱스트로스, 대략 30% DS (w/w)

온도 70℃

최초pH 4.3 (70℃에서)

사용효소량 0.24 AGU/g DS

당화

당화를 위한 기질은 말토덱스트린(일반 옥수수로부터 준비됨)을 끓는 Milli-Q물에 용해하여 건조기질이 대략 30% (w/w)되도록 맞춤으로써 만들어 진다. pH는 4.3으로 맞추어진다. 15g건조 고체에 해당되는 기질의 분할량은 50ml 파란 뚜껑 유리 플라스크에 옮겨지고 교반을 수반하여 수욕에 담겨진다. 효소가 첨가되고, 필요한 경우에는 pH가 다시 맞추어진다. 이 실험은 똑같이 다시 반복 된다. 표본들은 일정시간 간격을 두고 취하여지고 탄수화물 조성을 결정하기 위하여 HPLC상에서 분석된다.

<110> NOVO NORDISK A/S <120> GLUCOAMYLASE VARIANTS <130> 2 <150> DK PA 1998 00937 <151> 1998-07-15 <150> DK PA 1998 01667 <151> 1998-12-17 <160> 81 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1605 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(72) <220> <221> mat_peptide <222> (73)..(1602) <220> <221> CDS <222> (1)..(1602) <400> 1 atg tcg ttc cga tct cta ctc gcc ctg agc ggc ctc gtc tgc aca ggg 48 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly 1 5 10 15 ttg gca aat gtg att tcc aag cgc gcg acc ttg gat tca tgg ttg agc 96 Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser 20 25 30 aac gaa gcg acc gtg gct cgt act gcc atc ctg aat aac atc ggg gcg 144 Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala 35 40 45 gac ggt gct tgg gtg tcg ggc gcg gac tct ggc att gtc gtt gct agt 192 Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser 50 55 60 ccc agc acg gat aac ccg gac tac ttc tac acc tgg act cgc gac tct 240 Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser 65 70 75 80 ggt ctc gtc ctc aag acc ctc gtc gat ctc ttc cga aat gga gat acc 288 Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr 85 90 95 agt ctc ctc tcc acc att gag aac tac atc tcc gcc cag gca att gtc 336 Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val 100 105 110 cag ggt atc agt aac ccc tct ggt gat ctg tcc agc ggc gct ggt ctc 384 Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu 115 120 125 ggt gaa ccc aag ttc aat gtc gat gag act gcc tac act ggt tct tgg 432 Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp 130 135 140 gga cgg ccg cag cga gat ggt ccg gct ctg aga gca act gct atg atc 480 Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile 145 150 155 160 ggc ttc ggg cag tgg ctg ctt gac aat ggc tac acc agc acc gca acg 528 Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr 165 170 175 gac att gtt tgg ccc ctc gtt agg aac gac ctg tcg tat gtg gct caa 576 Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln 180 185 190 tac tgg aac cag aca gga tat gat ctc tgg gaa gaa gtc aat ggc tcg 624 Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser 195 200 205 tct ttc ttt acg att gct gtg caa cac cgc gcc ctt gtc gaa ggt agt 672 Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser 210 215 220 gcc ttc gcg acg gcc gtc ggc tcg tcc tgc tcc tgg tgt gat tct cag 720 Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln 225 230 235 240 gca ccc gaa att ctc tgc tac ctg cag tcc ttc tgg acc ggc agc ttc 768 Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe 245 250 255 att ctg gcc aac ttc gat agc agc cgt tcc ggc aag gac gca aac acc 816 Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr 260 265 270 ctc ctg gga agc atc cac acc ttt gat cct gag gcc gca tgc gac gac 864 Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp 275 280 285 tcc acc ttc cag ccc tgc tcc ccg cgc gcg ctc gcc aac cac aag gag 912 Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu 290 295 300 gtt gta gac tct ttc cgc tca atc tat acc ctc aac gat ggt ctc agt 960 Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser 305 310 315 320 gac agc gag gct gtt gcg gtg ggt cgg tac cct gag gac acg tac tac 1008 Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr 325 330 335 aac ggc aac ccg tgg ttc ctg tgc acc ttg gct gcc gca gag cag ttg 1056 Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu 340 345 350 tac gat gct cta tac cag tgg gac aag cag ggg tcg ttg gag gtc aca 1104 Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr 355 360 365 gat gtg tcg ctg gac ttc ttc aag gca ctg tac agc gat gct gct act 1152 Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr 370 375 380 ggc acc tac tct tcg tcc agt tcg act tat agt agc att gta gat gcc 1200 Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala 385 390 395 400 gtg aag act ttc gcc gat ggc ttc gtc tct att gtg gaa act cac gcc 1248 Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala 405 410 415 gca agc aac ggc tcc atg tcc gag caa tac gac aag tct gat ggc gag 1296 Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu 420 425 430 cag ctt tcc gct cgc gac ctg acc tgg tct tat gct gct ctg ctg acc 1344 Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr 435 440 445 gcc aac aac cgt cgt aac tcc gtc gtg cct gct tct tgg ggc gag acc 1392 Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr 450 455 460 tct gcc agc agc gtg ccc ggc acc tgt gcg gcc aca tct gcc att ggt 1440 Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly 465 470 475 480 acc tac agc agt gtg act gtc acc tcg tgg ccg agt atc gtg gct act 1488 Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr 485 490 495 ggc ggc acc act acg acg gct acc ccc act gga tcc ggc agc gtg acc 1536 Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr 500 505 510 tcg acc agc aag acc acc gcg act gct agc aag acc agc acc acg acc 1584 Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr 515 520 525 cgc tct ggt atg tca ctg tga 1605 Arg Ser Gly Met Ser Leu 530 <210> 2 <211> 534 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 2 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly 1 5 10 15 Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser 20 25 30 Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala 35 40 45 Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser 50 55 60 Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser 65 70 75 80 Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr 85 90 95 Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val 100 105 110 Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu 115 120 125 Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp 130 135 140 Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile 145 150 155 160 Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr 165 170 175 Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln 180 185 190 Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser 195 200 205 Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser 210 215 220 Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln 225 230 235 240 Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe 245 250 255 Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr 260 265 270 Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp 275 280 285 Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu 290 295 300 Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser 305 310 315 320 Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr 325 330 335 Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu 340 345 350 Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr 355 360 365 Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr 370 375 380 Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala 385 390 395 400 Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala 405 410 415 Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu 420 425 430 Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr 435 440 445 Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr 450 455 460 Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly 465 470 475 480 Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr 485 490 495 Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr 500 505 510 Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr 515 520 525 Arg Ser Gly Met Ser Leu 530 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7258 <400> 3 gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac 30 <210> 4 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 21401 <400> 4 ggggatcatg ataggactag ccatattaat gaagggcata taccacgcct tggacctgcg 60 ttatagcc 68 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 107581 <400> 5 gcaacgaagc gcccgtggct cgtac 25 <210> 6 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAMGII <400> 6 cgaagcgacc gtggctcgta ctgccatcnn tantaacatc gngncgnncg ntnctnnngt 60 gnncgncgng nnnnntggca ttgtcgttgc tagtcccagc acggataac 109 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RANGI <400> 7 gatggcagta cgagccacgg tcgcttcg 28 <210> 8 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAMGIV <400> 8 gtgtcgctgg acttcttcaa gnnnnnanac nncnntnctn ntnnanncnc ctacnntann 60 nncagtnncn ngtntantnn cattnnngat gccgtgaaga ctttcgccga 110 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAMGVI <400> 9 cttgaagaag tccagcgaca c 21 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FG2 <400> 10 catccccagg atccttactc agcaatg 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RG2 <400> 11 ctcaaacgac tcaccagcct ctagagt 27 <210> 12 <211> 2602 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> sig_peptide <222> (270)..(323) <220> <221> mat_peptide <222> (342)..(2438) <220> <221> intron <222> (484)..(558) <220> <221> intron <222> (846)..(900) <220> <221> intron <222> (998)..(1058) <220> <221> intron <222> (1697)..(1754) <400> 12 ttcgtcgcct aatgtctcgt ccgttcacaa actgaagagc ttgaagtggc gagatgtctc 60 tgcaggaatt caagctagat gctaagcgat attgcatggc aatatgtgtt gatgcatgtg 120 cttcttcctt cagcttcccc tcgtgcgagt gaggtttggc tataaattga agtggttggt 180 cggggttccg tgaggggctg aagtgcttcc tcccttttag gcgcaactga gagcctgagc 240 ttcatcccca gcatcattac acctcagcaa tgtcgttccg atctctactc gccctgagcg 300 gcctcgtctg cacagggttg gcaaatgtga tttccaagcg cgcgaccttg gattcatggt 360 tgagcaacga agcgaccgtg gctcgtactg ccatcctgaa taacatcggg gcggacggtg 420 cttgggtgtc gggcgcggac tctggcattg tcgttgctag tcccagcacg gataacccgg 480 actgtatgtt tcgagctcag atttagtatg agtgtgtcat tgattgattg atgctgactg 540 gcgtgtcgtt tgttgtagac ttctacacct ggactcgcga ctctggtctc gtcctcaaga 600 ccctcgtcga tctcttccga aatggagata ccagtctcct ctccaccatt gagaactaca 660 tctccgccca ggcaattgtc cagggtatca gtaacccctc tggtgatctg tccagcggcg 720 ctggtctcgg tgaacccaag ttcaatgtcg atgagactgc ctacactggt tcttggggac 780 ggccgcagcg agatggtccg gctctgagag caactgctat gatcggcttc gggcagtggc 840 tgcttgtatg ttctccaccc ccttgcgtct gatctgtgac atatgtagct gactggtcag 900 gacaatggct acaccagcac cgcaacggac attgtttggc ccctcgttag gaacgacctg 960 tcgtatgtgg ctcaatactg gaaccagaca ggatatggtg tgtttgtttt attttaaatt 1020 tccaaagatg cgccagcaga gctaacccgc gatcgcagat ctctgggaag aagtcaatgg 1080 ctcgtctttc tttacgattg ctgtgcaaca ccgcgccctt gtcgaaggta gtgccttcgc 1140 gacggccgtc ggctcgtcct gctcctggtg tgattctcag gcacccgaaa ttctctgcta 1200 cctgcagtcc ttctggaccg gcagcttcat tctggccaac ttcgatagca gccgttccgg 1260 caaggacgca aacaccctcc tgggaagcat ccacaccttt gatcctgagg ccgcatgcga 1320 cgactccacc ttccagccct gctccccgcg cgcgctcgcc aaccacaagg 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Hk3-K352R-sense <400> 64 tgtgtcgctg gacttcttca gagcactgta cagcgatgct g 41 <210> 65 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-A352D-antisense <400> 65 tagcagcatc gctgtacaga tccttgaaga agtccagcga c 41 <210> 66 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-A353S-antisense <400> 66 tagcagcatc gctgtacaga gacttgaaga agtccagcga c 41 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S356P-sense <400> 67 acttcttcaa ggcactgtac ccagatgctg ctactggcac ct 42 <210> 68 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S356N-sense <400> 68 acttcttcaa ggcactgtac aatgatgctg ctactggcac cta 43 <210> 69 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S356X-sense <400> 69 acttcttcaa ggcactgtac gatgatgctg ctactggcac cta 43 <210> 70 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-D357S-antisense <400> 70 gagtaggtgc cagtagcagc agagctgtac agtgccttga aga 43 <210> 71 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-A359S-sense <400> 71 ggcactgtac agcgatgctt ctactggcac ctactcttcg t 41 <210> 72 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-T360V-antisense <400> 72 tggacgaaga gtaggtgcca acagcagcat cgctgtacag t 41 <210> 73 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-G361X-sense <400> 73 tgtacagcga tgctgctact nctacctact cttcgtccag ttc 43 <210> 74 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-T362R-antisense <400> 74 gtcgaactgg acgaagagta tctgccagta gcagcatcgc tg 42 <210> 75 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S364X-sense <400> 75 tgctgctact ggcacctacn nktcgtccag ttcgacttat ag 42 <210> 76 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S365X-sense <400> 76 tgctactggc acctactctn nktccagttc gacttatagt ag 42 <210> 77 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S366T-antisense <400> 77 atgctactat aagtcgaact agtcgaagag taggtgccag ta 42 <210> 78 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S368X-antisense <400> 78 tctacaatgc tactataagt agnactggac gaagagtagg tg 42 <210> 79 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-T369X-sense <400> 79 ctactcttcg tccagttcgn nktatagtag cattgtagat gcc 43 <210> 80 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S371X-antisense <400> 80 ttcacggcat ctacaatgct atnataagtc gaactggacg aag 43 <210> 81 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hk3-S372X-sense <400> 81 cgtccagttc gacttatagt nntattgtag atgccgtgaa gac 43

Claims (28)

1. SEQ ID NO: 2에 나타낸 모 글루코아밀라제 아미노산 서열 내에 다음 돌연변이:

   E408R+A425T+S465P+T494A, E408R+S386N, T2Q+A11P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+D406N+L410R, A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2R+S386R+A393R, Y402F, PLASD(위치 1 바로 앞에 삽입됨)+V59A+A393R+T490A, Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H 중에서 선택되는 돌연변이가 도입된 형태로 구성되는 글루코아밀라제 변이체.
2. 제 1 항에 있어서, 모 글루코아밀라제는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) G1 글루코아밀라제인 것을 특징으로 하는 변이체.
3. 제 1 항에 있어서, 글루코아밀라제는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) G2 글루코아밀라제인 것을 특징으로 하는 변이체.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조체.
5. 제 4 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 재조합 발현벡터.
6. 제 4 항에 따른 DNA 구조체 또는 제 4 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
7. 제 6 항에 있어서, 형질전환된 세포는 미생물인 것을 특징으로 하는 세포.
8. 제 7 항에 있어서, 프로테아제가 결손된 아스퍼질러스 오리자이(Aspergillus oryzae) 또는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)인 것을 특징으로 하는 세포.
9. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체의 존재 하에서 녹말 가수분해물을 당화하는 단계를 포함하는, 녹말 또는 부분적으로 가수분해된 녹말을 덱스트로스를 포함하는 시럽으로 전환하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 글루코아밀라제의 용량은 건조 고체 그램 당 0.05 내지 0.5AUG 범위 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9 항에 있어서, 건조 고체의 무게로 적어도 30%의 녹말 가수분해물의 당화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 9 항에 있어서, 그 과정에 있어서 당화는 풀루란나제 및 이소아밀라제로 구성되는 군으로부터 선택되는 분지 효소의 존재 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 9 항에 있어서, 당화는 pH3 내지 5.5 및 60℃ 내지 80℃의 온도에서 24 내지 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. (i) 하나 이상의 효소적 당화 시기가 발생하는 당화 단계 (여기서 효소적 당화과정은 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하여 수행된다) 및 다음 단계로

    (ii) 하나 이상의 고온 막분리 단계를 포함하는, 액화된 녹말 용액의 당화 방법.
15. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용함으로써 녹말을전환하는 방법.
16. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하는, 연속 공정 녹말전환 방법.
17. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하는, 연속 공정 녹말전환 방법으로서, (i) 하나 이상의 효소적 당화 시기가 발생하는 당화 단계 (여기서 효소적 당화과정은 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하여 수행된다) 및 다음 단계로

    (ii) 하나 이상의 고온 막분리 단계를 포함하는, 액화된 녹말 용액의 당화 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 연속 공정 녹말전환 방법.
18. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하는, 올리고당의 제조방법.
19. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하는, 특수 시럽의 제조방법.
20. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하는, 연료용 에탄올의 제조방법.
21. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하는, 음료의 제조방법.
22. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코아밀라제 변이체를 사용하는, 유기 화합물의 제조를 위한 발효방법.
23. SEQ ID NO: 2에 나타낸 모 글루코아밀라제 아미노산 서열 내에 다음 돌연변이:

    E408R+A425T+S465P+T494A, E408R+S386N, T2Q+A11P+S394R, A11E+E408R, T2M+N9A+T390R+D406N+L410R, A393R, T2R+S386R+A393R, A393R+L410R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2E+T379A+S386K+A393R, A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2R+S386R+A393R, Y402F, PLASD(위치 1 바로 앞에 삽입됨)+V59A+A393R+T490A, Y402F+S411V, S119P+Y402F+S411V, S119P+Y312Q+Y402F+T416H 중에서 선택되는 돌연변이를 만들어서 모 글루코아밀라제의 열 안정성을 개선하는 방법.
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