CN107002108A - 葡萄糖糖浆的改进的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从液化淀粉制备葡萄糖糖浆的方法，并且涉及在其中有用的组合物。

Description

葡萄糖糖浆的改进的生产
序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及用于从液化淀粉生产包含高％DX葡萄糖糖浆的方法，并且涉及包含其中使用的酶的组合物。
本发明的背景
淀粉通常由约80％支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉是分支多糖，其中直链α-1,4D-葡萄糖残基由α-1,6糖苷键连接。支链淀粉被水解1,4-α-糖苷键以产生支链和直链寡糖的α-淀粉酶部分地降解。
α-淀粉酶在商业上用于各种用途，如在淀粉加工(例如，液化)的初始阶段中。支链淀粉由α-淀粉酶的延长降解导致所谓的α-极限糊精的形成，α-极限糊精不易被α-淀粉酶进一步水解。α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)构成一组催化淀粉和其他直链和支链1,4-葡糖苷寡-和多糖水解的酶。
支链寡糖可以被去分支酶水解为直链寡糖。剩余的支链寡糖可以被葡糖淀粉酶解聚为D-葡萄糖，将直链寡糖水解为D-葡萄糖。
可攻击支链淀粉的去分支酶被分成两类：分别是异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)和普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶不能攻击普鲁兰的特性以及通过它们对于α-极限糊精的有限作用而与普鲁兰酶相区别。
本领域众所周知在淀粉转化过程中添加异淀粉酶或普鲁兰酶。普鲁兰酶是具有普鲁兰6-葡聚糖-水解酶活性(EC 3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化普鲁兰中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。通常，普鲁兰酶与α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶组合使用。
葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的一种酶。
在商业上，葡糖淀粉酶被用于将已通过α-淀粉酶和例如，普鲁兰酶部分地水解的淀粉材料转化成糖浆形式的葡萄糖。
在酶处理前，该淀粉材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式研磨中，整个谷粒被研磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中众所周知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。
在研磨后，典型地将淀粉材料进行液化。在α-淀粉酶的存在下进行液化。在液化过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链和直链的较短单元(麦芽糊精)。
针对葡萄糖糖浆的生产，将液化淀粉材料进行糖化。在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及去分支酶，如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或普鲁兰酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。
针对糖浆生产，所使用的酶组合物应至少包括葡糖淀粉酶和普鲁兰酶，然而，通常α-淀粉酶活性还将存在，例如，当使用黑曲霉葡糖淀粉酶时，来自生产宿主的该黑曲霉α-淀粉酶还将存在于该组合物中。通常，α-淀粉酶的存在是所希望的，因为它增加糖化速度；然而由于潘糖的形成，它还降低糖化产物中的右旋糖百分比(％DX)。潘糖是被葡糖淀粉酶缓慢降解的三糖，并且因此它的形成负面地影响着峰值％DX。
从实用和经济的角度，在糖化反应中技术人员应该优选使用具有干固体(％DS)的高百分比的液化淀粉作为起始材料。不幸的是，在％DS和％DX之间存在着权衡：为了实现具有非常高％DX的糖化产物，技术人员将通常需要从具有相对低％DS的液化淀粉开始。在％DX方面优化产量对于许多目的是重要的：例如，如果所希望的终产物是结晶右旋糖，当DX增加1％，结晶右旋糖的产量可能增加高达3％。甚至出于多个目的，在较低％DX是可接受的情况下，仍然希望的是使用具有更高％DS的液化淀粉来达到那一％DX。
因此，存在用于改进针对液化淀粉糖化技术的需要。
发明概述
本发明提供了组合物和用于产生改进的糖化产物的方法，在该糖化产物中有可能获得较高的葡萄糖百分比/转化率，甚至即使使用具有高干固体含量的液化淀粉来进行该糖化过程。
特别地，本发明提供了一种组合物，该组合物包括葡糖淀粉酶和普鲁兰酶，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率高于6。
本发明进一步提供了用于产生葡萄糖糖浆的方法，该方法包括：
i)提供含有液化淀粉的组合物，并且向所述组合物添加葡糖淀粉酶(AMG)和普鲁兰酶；
ii)使该组合物在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育，并且随后；
iii)向所述组合物中添加α-淀粉酶，并且使该组合物在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育。
另外，本发明提供了用于从液化淀粉产生葡萄糖糖浆的方法，该方法包括使该液化淀粉与根据本发明的组合物相接触。
附图简述
图1示出了在比较研究中作为时间函数的转化率(％DX)，在该研究中液化淀粉使用以下各项经受糖化：(a)用于糖化的常规酶共混物包括葡糖淀粉酶、普鲁兰酶、和α-淀粉酶；(b)根据本发明的组合物，包括葡糖淀粉酶(0.25AGU/gDS)、普鲁兰酶(2.25NPUN(X)/gDS)、且不含α-淀粉酶；以及(c)根据本发明的组合物，包括葡糖淀粉酶(0.25AGU/gDS)、普鲁兰酶(2.25NPUN(X)/gDS)，在24小时添加α-淀粉酶(0.0225FAU(F)/gDS)。
发明详述
定义
α-淀粉酶：α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链以及支链1,4糖苷键寡糖以及多糖的水解的一组酶。根据本发明所使用的α-淀粉酶可以从真菌或细菌来源获得。出于本发明的目的，可以使用以下段落中所描述的α-淀粉酶测定，将真菌α-淀粉酶活性确定为FAU(A)。可以根据下文段落“Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)(Kilo Novo alpha-amylase Units(KNU))”，将细菌α-淀粉酶的活性确定为KiloNovoα-淀粉酶单位(KNU)。
酸性α-淀粉酶单位(FAU(A))：可按FAU(A)(酸性真菌α-淀粉酶单位)来测量酸性α-淀粉酶活性。1个FAU(A)定义为在下表“第一反应，淀粉降解”中所指定的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质所需的酶量。
酸性α-淀粉酶是一种内-α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，它水解该淀粉分子内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长度的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度跟淀粉的浓度成正比。使用反向比色法将酶活性测定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减小。
根据以下描述确定FAU(A)，即酸性α-淀粉酶活性。该反应的原理是基于两个步骤。在第一步中，该酶酸性α-淀粉酶水解淀粉成不同寡糖。在第二步中，碘与淀粉一起形成蓝色复合物，但不与其降解产产物形成蓝色复合物。因此，颜色的强度与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法在指定分析条件下确定该活性为淀粉浓度的减少。
Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)
可釆用马铃薯淀粉作为底物来确定α-淀粉酶活性。该方法基于溶液中的淀粉通过淀粉酶的分解以及在碘存在下淀粉给出蓝黑色颜色。当酶反应进行时，提取该反应的等分试样并且针对其淀粉含量通过与碘溶液混合来分析。当淀粉分解时，在碘存在下，蓝黑色颜色变淡并且逐渐变成红褐色颜色。将其与有色的玻璃标准品相比较。当该颜色匹配玻璃标准品时，到达终点。
将一个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在如下“KNU”表中定义的标准条件下(即，在37℃+/-0.05℃；0.0003M Ca2+；和pH 5.6下)糊精化5260mg/小时淀粉干物质(Merck可溶性淀粉(Merck Amylum solubile))的酶量。
葡糖淀粉酶(AMG)：术语葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.3)被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。出于本发明的目的，根据以下段落中所述的程序将葡糖淀粉酶活性确定为AGU。
葡糖淀粉酶活性(AGU)：将该葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为酶的量，该酶的量每分钟在0.1M乙酸盐缓冲液中，在37℃孵育温度、4.3的pH、100mM的麦芽糖起始浓度、以及6分钟的反应时间下，水解1微摩尔麦芽糖，从而产生α-D-葡萄糖。该定义适用于0.5-4.0AGU/mL的酶工作范围。
在孵育后，该反应可以使用NaOH来停止，并且使用以下两步显色反应方法测量葡萄糖的量：在由己糖激酶催化的一个反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。反应条件是如下表中所指定的：
普鲁兰酶：术语“普鲁兰酶”意指是具有支链淀粉6-葡聚糖-水解酶活性(EC3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化支链淀粉中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。出于本发明的目的，根据以下段落中所述的程序将普鲁兰酶活性确定为NPUN。
普鲁兰酶活性(NPUN)：该NPUN(诺维信新普鲁兰酶单位(New Pullulanase UnitNovozymes))是在以下程序中所测量的内切普鲁兰酶活性的单位。
1NPUN＝一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为酶量，该酶量在下表“第一反应，普鲁兰降解”中所指定的标准条件下每分钟释放相当于0.35μmol葡萄糖还原端。
在第一反应中，该底物在主要样品和空白样品中同样存在。然而，在pH5.0下进行主要样品的反应，同时在pH 9.6下在空白样品中不存在反应，其中普鲁兰酶或淀粉葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)都不具有酶活性。
在第二反应中，将该pH调整到约9.6，并且将样品中的葡萄糖通过葡糖激酶磷酸化成非还原的D-葡萄糖-6-磷酸盐，其在这个范围具有最佳的活性和稳定性并且在pH 9下对葡萄糖具有特异性(参考高厄德(Goward)，生物化学杂志(Biochem.J.)1986，237，第415-420页)。该步骤取决于主要样品和空白样品中的相同pH，以在二者中去除等量的葡萄糖。
将该第二反应通过包含PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼)的碱性试剂(>pH 11)和铋来停止，铋与还原糖复合以产生在405nm下检测的颜色。所产生的颜色与普鲁兰酶活性成比例。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-端加工、C-端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。根据一些实施例，SEQ ID NO:2的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:3的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:3的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:4的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:5的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:5的氨基酸18至573组成，SEQID NO:6的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:6的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:7的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:7的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:8的成熟多肽基本上由SEQ IDNO:8的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:9的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:9的氨基酸18至576组成，SEQ ID NO:10的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:10的氨基酸18至576组成，SEQ IDNO:11的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:11的氨基酸21至618组成，SEQ ID NO:12的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:12的氨基酸1至559组成，SEQ ID NO:13的成熟多肽基本上由SEQ IDNO:13的氨基酸1至928组成，SEQ ID NO:14的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸1至828组成，SEQ ID NO:15的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:15的氨基酸1至928组成，SEQ IDNO:16的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:16的氨基酸1至928组成，SEQ ID NO:17的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:17的氨基酸1至484组成，SEQ ID NO:18的成熟多肽基本上由SEQ IDNO:18的氨基酸1至583组成，SEQ ID NO:19的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:19的氨基酸22至471组成，SEQ ID NO:20的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:20的氨基酸1至514组成，SEQ IDNO:21的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:21的氨基酸1至483组成，SEQ ID NO:22的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:22的氨基酸1至483组成，SEQ ID NO:23的成熟多肽基本上由SEQ IDNO:23的氨基酸1至483组成，SEQ ID NO:24的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:24的氨基酸1至483组成，SEQ ID NO:25的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:25的氨基酸1至483组成，SEQ IDNO:26的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸21至607组成，和/或SEQ ID NO:27的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:27的氨基酸19至640组成。
在进一步的实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:3的成熟多肽由SEQ ID NO:3的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:4的成熟多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:5的成熟多肽由SEQ ID NO:5的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:6的成熟多肽由SEQ ID NO:6的氨基酸18至573组成，SEQ IDNO:7的成熟多肽由SEQ ID NO:7的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:8的成熟多肽由SEQ IDNO:8的氨基酸18至573组成，SEQ ID NO:9的成熟多肽由SEQ ID NO:9的氨基酸18至576组成，SEQ ID NO:10的成熟多肽由SEQ ID NO:10的氨基酸18至576组成，SEQ ID NO:11的成熟多肽由SEQ ID NO:11的氨基酸21至618组成，SEQ ID NO:12的成熟多肽由SEQ ID NO:12的氨基酸1至559组成，SEQ ID NO:13的成熟多肽由SEQ ID NO:13的氨基酸1至928组成，SEQID NO:14的成熟多肽基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸1至828组成，SEQ ID NO:15的成熟多肽由SEQ ID NO:15的氨基酸1至928组成，SEQ ID NO:16的成熟多肽由SEQ ID NO:16的氨基酸1至928组成，SEQ ID NO:17的成熟多肽由SEQ ID NO:17的氨基酸1至484组成，SEQ IDNO:18的成熟多肽由SEQ ID NO:18的氨基酸1至583组成，SEQ ID NO:19的成熟多肽由SEQID NO:19的氨基酸22至471组成，SEQ ID NO:20的成熟多肽由SEQ ID NO:20的氨基酸1至514组成，SEQ ID NO:21的成熟多肽由SEQ ID NO:21的氨基酸1至483组成，SEQ ID NO:22的成熟多肽由SEQ ID NO:22的氨基酸1至483组成，SEQ ID NO:23的成熟多肽由SEQ ID NO:23的氨基酸1至483组成，SEQ ID NO:24的成熟多肽由SEQ ID NO:24的氨基酸1至483组成，SEQID NO:25的成熟多肽由SEQ ID NO:25的氨基酸1至483组成，SEQ ID NO:26的成熟多肽由SEQ ID NO:26的氨基酸21至607组成，SEQ ID NO:27的成熟多肽由SEQ ID NO:27的氨基酸19至640组成。
成熟多肽序列的预测可以基于SignalP程序(尼耳森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，该程序预测SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸1至17是信号肽。同样，预测SEQ ID NO:11的氨基酸1至20、SEQ ID NO:19的氨基酸1至21、SEQ ID NO:26的氨基酸1至20、以及SEQ ID NO:27的氨基酸1-18是信号肽。
由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、或SEQ ID NO:8的氨基酸19至474(具体地19至471)或者SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸19至471所定义的序列是催化结构域。由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8的氨基酸480至573或者SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸483至576所定义的序列是淀粉结合结构域。
序列一致性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(相同残基x 100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)
聚合度(DP)：DP是指给出的糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数量(n)。DP1的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2是二糖，如麦芽糖和蔗糖。
DS和％DS：如本文所使用的，“DS”是术语“干固体”的缩写。在本发明的上下文中，除非另有说明，将液化淀粉的固体含量(包括淀粉浆料或部分水解的淀粉)提供为干固体的百分比(％DS)。基于重量(w/w％)计算干固体的百分比。
％DX：在本发明的上下文中，右旋糖百分比(％DX)用作糖化过程中或糖化过程完成后获得的右旋糖的量的测量。基于重量(w/w％)计算该右旋糖百分比。
本发明的方面和实施例
本发明的诸位发明人已经出人意料地发现液化淀粉的糖化过程中α-淀粉酶的延迟添加或阶段性添加具有若干益处：维持了α-淀粉酶对糖化速度的积极作用，并且另外，该峰值％DX大大改进。即使当糖化过程中在相对晚的时期添加该α-淀粉酶时，也会观察到该有益效果。另外，诸位发明人已经发现在糖化过程开始添加的酶共混物中普鲁兰酶与葡糖淀粉酶的比率的增加还有助于实现糖化产物中较高的％DX。
在第一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括葡糖淀粉酶和普鲁兰酶，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率高于6，例如高于7，高于8，高于9，或在6-20的范围内，例如在6-19的范围内、在6-18的范围内、在6-17的范围内、在6-16的范围内、在6-15的范围内、在6-14的范围内、在6-13的范围内、在6-12的范围内、在6-11的范围内、在7-20的范围内、在7-19的范围内、在7-18的范围内、在7-17的范围内、在7-16的范围内、在7-15的范围内、在7-14的范围内、在7-13的范围内、在7-12的范围内、在7-11的范围内、在8-20的范围内、在8-19的范围内、在8-18的范围内、在8-17的范围内、在8-16的范围内、在8-15的范围内、在8-14的范围内、在8-13的范围内、在8-12的范围内、在8-11的范围内、在9-20的范围内、在9-19的范围内、在9-18的范围内、在9-17的范围内、在9-16的范围内、在9-15的范围内、在9-14的范围内、在9-13的范围内、在9-12的范围内，或例如在9-11的范围内。
应理解的是在糖化过程中延迟α淀粉酶的添加时，令人希望的是在糖化过程的开始添加的包含葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的组合物不含有或含有至少极少的α-淀粉酶活性：因此，在本发明的一些实施例中，该组合物不包含α-淀粉酶活性。可替代地，如果所述组合物确实包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，例如高于50、高于100、高于200、高于300、高于400、高于500、高于600、高于800、高于1000、高于2000、高于3000、高于4000、或例如高于5000。如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo No-voα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，例如高于50、高于100、高于200、高于300、高于400、高于500、高于600、高于800、高于1000、高于2000、高于3000、高于4000，或例如高于5000。
在一些具体的实施例中，本发明提供了一种组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率高于6，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100，如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
在其他具体的实施例中，本发明提供了一种组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在6-20的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100，如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为KiloNovoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
在进一步具体的实施例中，本发明提供了一种组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在6-20的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500。如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为KiloNovoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500。
在甚至另外具体的实施例中，本发明提供了一种组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率是在7-15的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
本发明的其他具体的实施例提供了一种组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在7-15的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500。如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500。
包括在该组合物中的或用于根据本发明的方法的葡糖淀粉酶可以来源于任何合适的来源，例如，来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌起源的，选自下组，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)，1991,55(4):941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，1996，蛋白质工程(Prot.Eng.)9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，1995，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，1994，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，1996，生物化学(Biochemistry)35:8698-8704)；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，1997，蛋白质工程(Protein Eng.)10:1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，1998，“来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性”(“Purification and properties of the raw-starch-degradingglucoamylases from Corticium rolfsii”)应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利登记号32,153)、和Talaromyces duponti、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。
考虑的真菌葡糖淀粉酶包括瓣环栓菌，披露于WO 2006/069289中。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶来源于密孔菌属的菌株，具体地如WO 2011/066576中所描述的密孔菌属菌株(SEQ ID NO 2、4或6)；或来源于褐褶菌属的菌株，具体地如WO 2011/068803中所描述的褐褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)或黑层孔属的菌株，具体地如WO 2012/064351中所披露的黑层孔属的菌株(SEQ ID NO:2)(所有参考文献通过引用并入本文)或青霉属菌株，具体地是WO 2011/127802(SEQ ID NO:2)或WO2013/036526中所披露的草酸青霉菌。还考虑了以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶展现与上述葡糖淀粉酶的任一种的高一致性，即，与上述酶序列的成熟部分中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、例如100％的一致性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶来源于木霉属的菌株，具体地是如WO 2009/048487、WO 2009/048488、WO 2008/045489、WO 2011/022465、WO 2012/001139中所描述的。
可商购的葡糖淀粉酶组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSU-PER，SANTMEXTRAL，SPIRIZYMETMPLUS，SPIRIZYMETMFUEL，SPIRIZYMETMB4U，SPIRIZYME ULTRATM，SPIRIZYMEEXCELTM和AMGTME(来自诺维信公司，丹麦)；OPTIDEXTM300，GC480TM和GC147TM(来自杰能科国际公司(Genencor Int.)，美国)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900，G-ZYMETM和G990ZR(来自杜邦-杰能科公司)
根据具体的实施例中，所述葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：黑曲霉葡糖淀粉酶、埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、瓣环栓菌葡糖淀粉酶、密粘褶菌葡糖淀粉酶、里氏木霉葡糖淀粉酶、特异腐质霉葡糖淀粉酶、和烟曲霉葡糖淀粉酶，及其杂交体和变体。
原则上，任何普鲁兰酶可以在本发明的方法中使用。在一个实施例中，该普鲁兰酶是一种来自脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶，例如，US 6,074,854和US 5,817,498中所披露的，或者是衍生自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶，例如，WO 2009/075682中所披露的(SEQ ID4；GENESEQP：AXB71624)。该普鲁兰酶还可以是这些普鲁兰酶的任何杂交体或变体。
可商购的普鲁兰酶包括可以从诺维信公司，巴格斯瓦德，丹麦获得的PromozymeD2、Novozym 26062(诺维信公司)和Optimax L 1000(杜邦-杰能科公司)。
根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该普鲁兰酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)变体氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.5％序列一致性；
其中当相对于“普鲁兰酶活性(NPUN)”的定义如以上所阐述的来测试时，当所述普鲁兰酶包括如在ii)中定义的子序列或如在iii)中定义的变体氨基酸序列时，它优选地具有i)中所定义的各氨基酸(其中它是子序列或变体)的至少80％，例如至少90％的普鲁兰酶活性。
在根据本发明的组合物中，该葡糖淀粉酶可以特别地包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：
i)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)变体氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.5％序列一致性
其中当相对于“葡糖淀粉酶活性(AGU)”的定义如以上所阐述的来测试时，当所述葡糖淀粉酶包括如在ii)中定义的子序列或如在iii)中定义的氨基酸序列时，它优选地具有在i)中所定义的各氨基酸(其中它是子序列或变体)的至少80％，例如至少90％的葡糖淀粉酶活性。
具体地，根据本发明的该组合物可以包括：
i)葡糖淀粉酶，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:12中阐述的氨基酸序列或其成熟多肽，
ii)SEQ ID NO:12中阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列，和
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.5％序列一致性；
其中当相对于“葡糖淀粉酶活性(AGU)”的定义如以上所阐述的来测试时，当所述葡糖淀粉酶是如在ii)中定义的子序列或如在iii)中定义的变体氨基酸序列时，它优选地具有在i)中所定义的各氨基酸(其中它是子序列或变体)的至少80％，例如至少90％的葡糖淀粉酶活性。
与一种普鲁兰酶组合
iv)该普鲁兰酶包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽，
v)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列，和
vi)氨基酸序列，其与iv)和v)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、例如至少99.5％序列一致性；
其中当相对于“普鲁兰酶活性(NPUN)”的定义如以上所阐述的来测试时，当所述普鲁兰酶包括如在v)中定义的子序列或如在vi)中定义的变体氨基酸序列时，它优选地具有iv)中所定义的各氨基酸(其中它是子序列或变体)的至少80％，例如至少90％的普鲁兰酶活性。
在相关实施例中，该葡糖淀粉酶基本上由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。在其他相关的实施例中，该葡糖淀粉酶由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。
在以上权利要求中任一项所述的组合物中，该α-淀粉酶可以包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
当相对于“酸性α-淀粉酶单位(FAU(A))”或“α-淀粉酶活性(KNU)”的定义如以上所阐述而测试时，当以上定义的α-淀粉酶是子序列或变体时，它优选地具有选自SEQ ID NO:1和17-26或其成熟多肽的各α-淀粉酶(其中它是子序列或变体)的至少80％，如至少90％的α-淀粉酶活性。在本上下文中，α-淀粉酶(包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、17-19和26或其成熟多肽)被认为是真菌α-淀粉酶，并且活性如相对于“酸性α-淀粉酶单元(FAU(A))”的以上定义所提供的来进行测试。α-淀粉酶(包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:20-25或其成熟多肽)被认为是细菌α-淀粉酶，并且活性如相对于“Kilo Novoα-淀粉酶单元(KNU)”的以上定义所提供的来进行测试。
在相关实施例中，该α-淀粉酶基本上由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。在其他相关的实施例中，该α-淀粉酶由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。
根据本发明提供的组合物可以是液体或固体组合物。在目前优选的实施例中，它是液体组合物。
本发明的另一方面提供了用于生产葡萄糖糖浆的方法。在根据本发明的方法中，α淀粉酶是在糖化反应开始时添加葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的意义上进行添加的，然而将α-淀粉酶的添加延迟至少直到显著的或相当大部分的液化淀粉已经被糖化。因此，本发明的方法包括，
i)提供含有液化淀粉的组合物，并且向所述组合物添加葡糖淀粉酶(AMG)和普鲁兰酶；
ii)使该组合物在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育，并且随后
iii)向所述组合物中添加α-淀粉酶，并且使该组合物在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育。
本方法的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量可以特别地对应于0.05-0.5AGU/gDS，例如0.05-0.4AGU/gDS、0.05-0.35AGU/gDS、0.05-0.3AGU/gDS、0.075-0.5AGU/gDS、0.075-0.4AGU/gDS、0.075-0.35AGU/gDS、0.075-0.3AGU/gDS、0.075-0.5AGU/gDS、0.1-0.5AGU/gDS、0.1-0.4AGU/gDS、0.1-0.35AGU/gDS、0.1-0.3AGU/gDS、0.125-0.5AGU/gDS、0.125-0.4AGU/gDS、0.125-0.35AGU/gDS、0.125-0.3AGU/gDS、0.15-0.5AGU/gDS、0.15-0.4AGU/gDS、0.15-0.35AGU/gDS、0.15-0.3AGU/gDS、0.175-0.5AGU/gDS、0.175-0.4AGU/gDS、0.175-0.35AGU/gDS、0.175-0.3AGU/gDS、0.2-0.5AGU/gDS、0.2-0.4AGU/gDS、0.2-0.35AGU/gDS、0.2-0.3AGU/gDS、0.24-0.5AGU/gDS、0.24-0.4AGU/gDS、0.24-0.35AGU/gDS，或例如0.24-0.26AGU/gDS。
本方法的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量可以特别地对应于0.05-5NPUN(X)/gDS，例如0.05-4.5NPUN(X)/gDS、0.05-4NPUN(X)/gDS、0.05-3.5NPUN(X)/gDS、0.05-3NPUN(X)/gDS、0.05-2.5NPUN(X)/gDS、0.1-5NPUN(X)/gDS、0.1-4NPUN(X)/gDS、0.1-3.5NPUN(X)/gDS、0.1-3NPUN(X)/gDS、0.1-2.5NPUN(X)/gDS、0.25-5NPUN(X)/gDS、0.25-4.5NPUN(X)/gDS、0.25-4NPUN(X)/gDS、0.25-3.5NPUN(X)/gDS、0.25-3NPUN(X)/gDS、0.5-5NPUN(X)/gDS、0.5-4.5NPUN(X)/gDS、0.5-4NPUN(X)/gDS、0.5-3.5NPUN(X)/gDS、0.05-3NPUN(X)/gDS、0.5-2.5NPUN(X)/gDS、1.0-5NPUN(X)/gDS、1.0-4.5NPUN(X)/gDS、1.0-4NPUN(X)/gDS、1.0-3.5NPUN(X)/gDS、1.0-3NPUN(X)/gDS、1.0-2.5NPUN(X)/gDS、1.5-5NPUN(X)/gDS、1.5-4.5NPUN(X)/gDS、1.5-4NPUN(X)/gDS、1.5-3.5NPUN(X)/gDS、1.5-3NPUN(X)/gDS、1.5-2.5NPUN(X)/gDS、2-5NPUN(X)/gDS、2-4.5NPUN(X)/gDS、2-4NPUN(X)/gDS、2-3.5NPUN(X)/gDS、2-3NPUN(X)/gDS、2-5NPUN(X)/gDS、2-2.5NPUN(X)/gDS、2.25-5NPUN(X)/gDS、2.25-4.5NPUN(X)/gDS、2.25-4NPUN(X)/gDS、2.25-3.5NPUN(X)/gDS、2.25-3NPUN(X)/gDS、2.25-2.5NPUN(X)/gDS，或例如2.50-2.54NPUN(X)/gDS。
根据本发明，在本方法的步骤iii)中添加的α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，该α-淀粉酶的量可以特别地对应于0.0005-0.025FAU(A)/gDS，例如0.0005-0.0225FAU(A)/gDS、0.0005-0.02FAU(A)/gDS、0.0005-0.0175FAU(A)/gDS、0.0005-0.015FAU(A)/gDS、0.0005-0.0125FAU(A)/gDS、0.001-0.025FAU(A)/gDS、0.001-0.0225FAU(A)/gDS、0.001-0.02FAU(A)/gDS、0.001-0.0175FAU(A)/gDS、0.001-0.015FAU(A)/gDS、0.001-0.0125FAU(A)/gDS、0.0025-0.025FAU(A)/gDS、0.0025-0.0225FAU(A)/gDS、0.0025-0.02FAU(A)/gDS、0.0025-0.0175FAU(A)/gDS、0.0025-0.015FAU(A)/gDS、0.0025-0.0125FAU(A)/gDS、0.005-0.025FAU(A)/gDS、0.005-0.0225FAU(A)/gDS、0.005-0.02FAU(A)/gDS、0.005-0.0175FAU(A)/gDS、0.005-0.015FAU(A)/gDS、0.005-0.0125FAU(A)/gDS、0.0075-0.025FAU(A)/gDS、0.0075-0.0225FAU(A)/gDS、0.0075-0.02FAU(A)/gDS、0.0075-0.0175FAU(A)/gDS、0.0075-0.015FAU(A)/gDS、0.0075-0.0125FAU(A)/gDS、0.008-0.025FAU(A)/gDS、0.008-0.0225FAU(A)/gDS、0.008-0.02FAU(A)/gDS、0.008-0.0175FAU(A)/gDS、0.008-0.015FAU(A)/gDS、0.008-0.0125FAU(A)/gDS、0.009-0.01FAU(A)/gDS，或例如0.0095FAU(A)/gDS。
根据本发明，在本方法的步骤iii)中添加的α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，该α-淀粉酶的量可以特别地对应于0.0005-0.025KNU/gDS，例如0.0005-0.0225KNU/gDS、0.0005-0.02KNU/gDS、0.0005-0.0175KNU/gDS、0.0005-0.015KNU/gDS、0.0005-0.0125KNU/gDS、0.001-0.025KNU/gDS、0.001-0.0225KNU/gDS、0.001-0.02KNU/gDS、0.001-0.0175KNU/gDS、0.001-0.015KNU/gDS、0.001-0.0125KNU/gDS、0.0025-0.025KNU/gDS、0.0025-0.0225KNU/gDS、0.0025-0.02KNU/gDS、0.0025-0.0175KNU/gDS、0.0025-0.015KNU/gDS、0.0025-0.0125KNU/gDS、0.005-0.025KNU/gDS、0.005-0.0225KNU/gDS、0.005-0.02KNU/gDS、0.005-0.0175KNU/gDS、0.005-0.015KNU/gDS、0.005-0.0125KNU/gDS、0.0075-0.025KNU/gDS、0.0075-0.0225KNU/gDS、0.0075-0.02KNU/gDS、0.0075-0.0175KNU/gDS、0.0075-0.015KNU/gDS、0.0075-0.0125KNU/gDS、0.008-0.025KNU/gDS、0.008-0.0225KNU/gDS、0.008-0.02KNU/gDS、0.008-0.0175KNU/gDS、0.008-0.015KNU/gDS、0.008-0.0125KNU/gDS、0.009-0.01KNU/gDS，或例如0.0095KNU/gDS。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，其中在该方法的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.05-0.5AGU/gDS，在该方法的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于0.05-5NPUN(X)/gDS，并且在该方法的步骤iii)中添加的真菌α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025(FAU)(A)/gDS，或在该方法的步骤iii)中添加的细菌α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025KNU/gDS。
在又其他的实施例中，本发明提供了一种方法，其中在该方法的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.175-0.3AGU/gDS，在该方法的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于2-4NPUN(X)/gDS，并且在该方法的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0025-0.02(FAU)(A)/gDS，或在该方法的步骤iii)中添加的细菌α-淀粉酶的量对应于0.0025-0.02KNU/gDS。
在进一步的实施例中，本发明涉及一种方法，其中在该方法的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.2-0.3AGU/gDS，在该方法的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于2-3NPUN(X)/gDS，并且在该方法的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.008-0.0125(FAU)(A)/gDS，或在该方法的步骤iii)中添加的细菌α-淀粉酶的量对应于0.008-0.0125KNU/gDS。
当在糖化过程中延迟添加α淀粉酶时，令人希望的是在糖化过程的开始将无或至少极少的α-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶和普鲁兰酶一起增加。因此，在一些实施例中，该方法包括向含有液化淀粉的所述组合物中添加含有葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的配制品，其中如果所述配制品包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是细菌来源的，那么在所述组合物中表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，例如高于50、高于100、高于200、高于300、高于400、高于500、高于600、高于800、高于1000、高于2000、高于3000、高于4000，或例如高于5000。如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，例如高于50、高于100、高于200、高于300、高于400、高于500、高于600、高于800、高于1000、高于2000、高于3000、高于4000，或例如高于5000。
根据一些实施例，在该方法的步骤ii)中添加的葡糖淀粉酶和普鲁兰酶是处于如上述定义的根据本发明的组合物中。
在该方法的步骤ii)中的孵育可以具有从2-35小时，例如从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从18-35小时、从18-30小时、从18-28小时、从18-26小时、从18-24小时、从18-22小时、从18-20小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从22-35小时、从22-30小时、从22-28小时、从22-26小时、从22-24小时的持续时间，或例如24小时的持续时间。
本方法的步骤iii)中的孵育可以具有从2-94小时，例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-94小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-94小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-94小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-94小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-94小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-94小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-94小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-94小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在具体的实施例中，本方法的步骤ii)中的孵育具有从2-35小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-94小时，例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-94小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-94小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-94小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-94小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-94小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-94小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-94小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-94小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在其他具体的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从2-20小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-94小时、例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-94小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-94小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-94小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-94小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-94小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-94小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-94小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-94小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在又其他的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从4-35小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-92小时、例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-92小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-92小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-92小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-92小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-92小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-92小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-92小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-92小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在进一步的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从4-22小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-92小时，例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-92小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-92小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-92小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-92小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-92小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-92小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-92小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-92小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在又进一步的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从10-35小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-86小时，例如从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-86小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-86小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-86小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-86小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-86小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-86小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-86小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-86小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-86小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在甚至另外实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从10-24小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-86小时，例如从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-86小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-86小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-86小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-86小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-86小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-86小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-86小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-86小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-86小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在又另外的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从14-35小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-70小时，例如从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-94小时、从25-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在甚至另外实施例中，本方法的步骤ii)中的孵育具有从14-26小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-70小时，例如从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-94小时、从25-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在其他实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从18-35小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-78小时，例如从2-74小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-78小时、从4-74小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-76小时、从10-74小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-78小时、从14-74小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-78小时、从20-74小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-78小时、从24-76小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-78小时、从30-74小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-76小时、从40-74小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-78小时、从50-74小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在另外的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从18-28小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-78小时，例如从2-74小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-78小时、从4-74小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-76小时、从10-74小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-78小时、从14-74小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-78小时、从20-74小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-78小时、从24-76小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-78小时、从30-74小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-76小时、从40-74小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-78小时、从50-74小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在甚至另外的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从20-35小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-76小时，例如从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-76小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-76小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-76小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-76小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-76小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-76小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-76小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-76小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-76小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在又进一步的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从20-30小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-76小时，例如从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-76小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-76小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-76小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-76小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-76小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-76小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-76小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-76小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-76小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
在甚至另外的实施例中，本方法的步骤ii)中的所述孵育具有从22-35小时的持续时间，并且本方法的步骤iii)中的所述孵育具有从2-74小时，例如从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-74小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-74小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-74小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-74小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-94小时、从25-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-74小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-94小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-74小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-94小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-74小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
可以允许进行权利要求14的步骤iii)中的孵育直到该组合物中葡萄糖(％DX)的量达到对应于95％(w/w)或更高，例如95.5％(w/w)或更高、95.75％(w/w)或更高、96％(w/w)或更高、96.25％(w/w)或更高、或例如96.75％(w/w)或更高的水平。
在一些实施例中，从向该含有液化淀粉的组合物中添加所述葡糖淀粉酶(AMG)和所述的普鲁兰酶直到该淀粉水解/糖化中止的过程的持续时间是从24-96小时，例如从24-72小时、从24-64小时、从24-48小时、从24-36小时、从24-32小时、从32-96小时、从32-72小时、从32-64小时、从32-48小时、从32-36小时、从36-96小时、从36-72小时、从36-64小时、从36-48小时、从48-96小时、例如从48-72小时、从48-64小时、从56-96小时、例如从56-72小时、或例如从56-64小时，
在根据本发明的方法中，该淀粉水解/糖化可以具体发生在3.5-5.0范围内的pH(如在4.0-4.5范围内的pH)下、和在59℃-70℃范围内的温度(如在59℃-65℃范围内或如在59℃-62℃范围内)下。
针对根据本发明的糖化方法，该用作底物的液化淀粉可以是淀粉浆料或部分地水解的淀粉(液化物或麦芽糊精)。具体地而言，该淀粉浆料或部分水解的淀粉可以具有在5-42范围内的右旋糖当量(DE)，如在5-30范围内、在8-18范围内或如在9-14范围内。
该淀粉可以来自任何来源，具体地是来自玉米、小麦或木薯。该淀粉浆料或部分水解的淀粉可以具有来自存在的液化过程的剩余的α-淀粉酶活性，或者可以将其失活，如通过将pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，来失活该液化的α-淀粉酶。
所述的淀粉浆料或部分水解的淀粉的电导率可以具体地是在0-500mi-croS/cm/cm范围内。根据一些实施例，该钙含量对应于0-200ppm游离钙。
在根据本发明的方法中，该淀粉水解/糖化可以具体发生在3.5-5.0范围内的pH(如在4.0-4.7范围内的pH)下、和在58℃-70℃范围内的温度(如在58℃-65℃范围内、在59℃-65℃范围内或如在59℃-62℃范围内)下。
作为起始材料提供的包括液化淀粉的组合物；即，包括提供于本方法的步骤i)中的液化淀粉的组合物可以包含从25％-45％干固体(％DS)，例如从25％-40％DS、从30％-38％DS、从32％-38％DS、或例如从34％-36％DS。
在根据本发明的方法中有用的真菌α-淀粉酶包括来源于曲霉属的菌株的α-淀粉酶，诸如米曲霉、黑曲霉和白曲霉α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶是一种真菌淀粉样(Fungamyl-like)α-淀粉酶，该α-淀粉酶来源于米曲霉菌株。根据本发明，术语“真菌淀粉样α-淀粉酶”指与WO 96/23874中SEQID NO:10中示出的氨基酸序列的成熟部分呈现高一致性的α-淀粉酶，即呈现多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％、多于99％或甚至100％的一致性。
另一种优选的酸性α-淀粉酶来源于黑曲霉菌株。在一个优选实施例中，酸性真菌α-淀粉酶是来自在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且在WO 89/01969(实例3)中进行描述的黑曲霉的α-淀粉酶。
其他考虑到的野生型α-淀粉酶包括那些来源于根毛霉属和多孔菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(通过引用并入的WO 2004/055178)或大型多孔菌(Meripilusgiganteus)的菌株。
在一个优选实施例中，α-淀粉酶是来源于白曲霉并且是由金子(Kaneko)等人，1996，发酵与生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.)81:292-298：“编码来自白曲霉的酸稳定的α-淀粉酶的一种基因的核苷酸序列的分子克隆和测定(Molecular-cloning anddetermination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stablealpha-amylase from Aspergillus kawachii)”所披露；并且进一步被披露为EMBL：#AB008370。
真菌α-淀粉酶还可以是包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施例中，该野生型α-淀粉酶来源于一种白曲霉菌株。
在进一步的实施例中，该α淀粉酶是真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选的实例包括WO 2005/003311或美国申请公开案号2005/0054071(诺维信公司)或美国申请号60/638,614(诺维信公司)(特此通过引用结合)中所披露的α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包括α-淀粉酶催化结构域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，例如淀粉结合域和任选的接头。
考虑的杂合α-淀粉酶的具体实例包括披露于美国申请号60/638,614中的实例的表1至5中的那些，包括具有催化结构域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolf-sii)SBD的真菌淀粉酶变体(US 60/638,614中的SEQ ID NO:100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO:101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(将其在美国申请号11/316,535的表5中披露为氨基酸序列SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合)或作为WO 2006/069290的表5中的V039、以及具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(美国申请号60/638,614中的SEQ ID NO:102)。其他确切考虑的杂合α-淀粉酶是列于美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(通过引用结合在此)中的实例4中的表3、4、5和6中的任何α-淀粉酶。
考虑的杂合α-淀粉酶的其他具体实例包括披露于美国专利申请号2005/0054071中的那些，包括披露于15页表3中的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
根据本发明所述的方法中有用的细菌α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属的菌株的α-淀粉酶，如地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌。
还考虑了呈现出与以上提及的α-淀粉酶的高一致性，即，与成熟酶序列具有多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％、多于99％、或甚至100％一致性的α-淀粉酶。
含有α-淀粉酶的优选的商用组合物包括MYCOLASETM(DSM)、BANTM、TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETMX、LIQUOZYMETMSC、和SANTMSUPER、SANTMEXTRA L(诺维信公司)以及CLARASETML-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETMFRED、SPEZYMETMAA、SPEZYMETMα、SPEZYMETMDELTAAA、GC358、GC980、SPEZYMETMCL、和SPEZYMETM RSL(杜邦-杰能科公司)、FUELZYMETM(来自范恩尼姆公司(Verenium Corp)，美国)。
如必要，这些α淀粉酶还可以按如以上所阐述的非常低的量被包括在根据本发明的组合物中。
在根据本发明的方法中有用的葡糖淀粉酶和普鲁兰酶包括相对于根据本发明的组合物的如以上披露的那些。
因此，在本发明的具体的实施例中，该α淀粉酶选自黑曲霉、土曲霉、或微小根毛酶α淀粉酶，该葡糖淀粉酶选自黑曲霉、烟曲霉、埃默森篮状菌、瓣环栓菌、里氏木霉、特异腐质霉、和密粘褶菌葡糖淀粉酶，并且该普鲁兰酶选自脱支芽孢杆菌或嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶。
具体地，该葡糖淀粉酶可以包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:2-12和27中阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)变体氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
在相关实施例中，该葡糖淀粉酶基本上由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。在其他相关实施例中，该葡糖淀粉酶由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。
在根据本发明的方法中使用的α-淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)变体氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
在相关实施例中，该α-淀粉酶基本上由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。在其他相关的实施例中，该α-淀粉酶由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。
在具体实施例中，包括或由iii)中所定义的氨基酸序列组成的α-淀粉酶是一种α-淀粉酶的变体，该变体包括或由SEQ ID NO:20中定义的氨基酸序列或其成熟多肽组成，其中已做出以下突变：I181*/G182*/N193F(使用SEQ ID NO:20中的氨基酸编号)。
根据其他实施例，包括或由iii)中所定义的氨基酸序列组成的α-淀粉酶是一种α-淀粉酶的变体，该变体包括或由SEQ ID NO:23中定义的氨基酸序列或其成熟多肽组成，其中已做出以下突变：H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQ ID NO:21中的氨基酸编号)。
在甚至另外实施例中，包括或由iii)中所定义的氨基酸序列组成的α-淀粉酶是一种α-淀粉酶的变体，该变体包括或由SEQ ID NO:23中定义的氨基酸序列或其成熟多肽组成，其中已做出以下突变：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用SEQ ID NO:21中的编号)。
在根据本发明的方法中使用的普鲁兰酶可以包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)变体氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
在相关实施例中，该普鲁兰酶基本上由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。在其他相关实施例中，该普鲁兰酶由如上项目i)-iii)中任一项所阐述的氨基酸序列组成。
本发明范围内是多个实施例，其中该葡糖淀粉酶包括或由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成：
i)SEQ ID NO:12中阐述的氨基酸序列或其成熟多肽，
ii)SEQ ID NO:12中阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列，和
iii)变体氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.5％序列一致性；
其中该普鲁兰酶包括或由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成：
iv)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
v)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列，和
vi)变体氨基酸序列，其与iv)和v)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.5％序列一致性；并且
其中该α-淀粉酶包括或由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成：
vii)SEQ ID NO:18中阐述的氨基酸序列或其成熟多肽，
viii)SEQ ID NO:18中阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列，和
iv)变体氨基酸序列，其与vii)和viii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.5％序列一致性。
当相对于“葡糖淀粉酶活性(AGU)”的定义如以上所阐述的来测试时，当所述葡糖淀粉酶是如上述所定义的子序列或变体氨基酸序列时，它优选地具有各氨基酸(其中它是子序列或变体)的至少80％，例如至少90％的葡糖淀粉酶活性。
当相对于“普鲁兰酶活性(NPUN)”的定义如以上所阐述的来测试时，当所述普鲁兰酶是如上述所定义的子序列或变体氨基酸序列时，它优选地具有各氨基酸(其中它是子序列或变体)的至少80％，例如至少90％的普鲁兰酶活性。
当相对于“酸性α-淀粉酶单位(FAU(A))”或“α-淀粉酶活性(KNU)”的定义如以上所阐述而测试时，当以上定义的α-淀粉酶是子序列或变体时，它优选地具有选自SEQ ID NO:1和17-26或其成熟多肽的各α-淀粉酶(其中它是子序列或变体)的至少80％，如至少90％的α-淀粉酶活性。在本上下文中，α-淀粉酶(包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、17-19和26或其成熟多肽)被认为是真菌α-淀粉酶，并且活性如相对于“酸性α-淀粉酶单元(FAU(A))”的以上定义所提供的来进行测试。α-淀粉酶(包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:20-25或其成熟多肽)被认为是细菌α-淀粉酶，并且活性如相对于“α-淀粉酶活性(KNU)”的以上定义所提供的来进行测试。
在进一步的方面，本发明提供了用于从液化淀粉生产葡萄糖糖浆的方法。该方法包括使液化淀粉与在上文描述的根据本发明的组合物相接触。
该液化淀粉可以具体地包含从25％-45％干固体(％DS)(w/w％)，例如从25％-40％DS(w/w％)、从30％-38％DS、从32％-38％DS，或例如从34％-36％DS。
在进一步的实施例中，该方法包括使液化淀粉在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育。
项目
1.含有葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率高于6，例如高于7，高于8，高于9，或在6-20的范围内，例如在6-19的范围内、在6-18的范围内、在6-17的范围内、在6-16的范围内、在6-15的范围内、在6-14的范围内、在6-13的范围内、在6-12的范围内、在6-11的范围内、在7-20的范围内、在7-19的范围内、在7-18的范围内、在7-17的范围内、在7-16的范围内、在7-15的范围内、在7-14的范围内、在7-13的范围内、在7-12的范围内、在7-11的范围内、在8-20的范围内、在8-19的范围内、在8-18的范围内、在8-17的范围内、在8-16的范围内、在8-15的范围内、在8-14的范围内、在8-13的范围内、在8-12的范围内、在8-11的范围内、在9-20的范围内、在9-19的范围内、在9-18的范围内、在9-17的范围内、在9-16的范围内、在9-15的范围内、在9-14的范围内、在9-13的范围内、在9-12的范围内，或例如在9-11的范围内。
2.根据项目1所述的组合物，其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，例如高于50、高于100、高于200、高于300、高于400、高于500、高于600、高于800、高于1000、高于2000、高于3000、高于4000、或例如高于5000，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，例如高于50、高于100、高于200、高于300、高于400、高于500、高于600、高于800、高于1000、高于2000、高于3000、高于4000、或例如高于5000。
3.根据项目1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率高于6，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
4.根据项目1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在6-20的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
5.根据项目1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在6-20的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500。
6.根据项目1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在7-15的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
7.根据项目1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在7-15的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
8.根据以上项目中任一项所述的组合物，其中所述葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：黑曲霉葡糖淀粉酶、埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、瓣环栓菌葡糖淀粉酶、密粘褶菌葡糖淀粉酶、里氏木霉葡糖淀粉酶、特异腐质酶葡糖淀粉酶、和烟曲霉葡糖淀粉酶，及其杂交体和变体。
9.根据以上项目中任一项所述的组合物，其中所述普鲁兰酶选自下组，该组由以下各项组成：脱支芽孢杆菌普鲁兰酶、嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶，及其杂交体和变体。
10.根据以上项目中任一项所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列；
ii)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
11.根据以上项目中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列；
ii)是SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
12.根据以上项目中任一项所述的组合物，其中该普鲁兰酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列；
ii)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
13.根据以上项目中任一项所述的组合物，所述组合物是液体或固体组合物。
14.一种用于生产葡萄糖糖浆的方法，该方法包括，
i)提供含有液化淀粉的组合物，并且向所述组合物添加葡糖淀粉酶(AMG)和普鲁兰酶；
ii)使该组合物在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育，并且随后
iii)向所述组合物中添加α-淀粉酶，并且使该组合物在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育。
15.根据项目14所述的方法，其中项目14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.05-0.5AGU/gDS，例如0.05-0.4AGU/gDS、0.05-0.35AGU/gDS、0.05-0.3AGU/gDS、0.075-0.5AGU/gDS、0.075-0.4AGU/gDS、0.075-0.35AGU/gDS、0.075-0.3AGU/gDS、0.075-0.5AGU/gDS、0.1-0.5AGU/gDS、0.1-0.4AGU/gDS、0.1-0.35AGU/gDS、0.1-0.3AGU/gDS、0.125-0.5AGU/gDS、0.125-0.4AGU/gDS、0.125-0.35AGU/gDS、0.125-0.3AGU/gDS、0.15-0.5AGU/gDS、0.15-0.4AGU/gDS、0.15-0.35AGU/gDS、0.15-0.3AGU/gDS、0.175-0.5AGU/gDS、0.175-0.4AGU/gDS、0.175-0.35AGU/gDS、0.175-0.3AGU/gDS、0.2-0.5AGU/gDS、0.2-0.4AGU/gDS、0.2-0.35AGU/gDS、0.2-0.3AGU/gDS、0.24-0.5AGU/gDS、0.24-0.4AGU/gDS、0.24-0.35AGU/gDS，或例如0.24-0.26AGU/gDS。
16.根据项目14-15中任一项所述的方法，其中项目14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于0.05-5NPUN(X)/gDS，例如0.05-4.5NPUN(X)/gDS、0.05-4NPUN(X)/gDS、0.05-3.5NPUN(X)/gDS、0.05-3NPUN(X)/gDS、0.05-2.5NPUN(X)/gDS、0.1-5NPUN(X)/gDS、0.1-4NPUN(X)/gDS、0.1-3.5NPUN(X)/gDS、0.1-3NPUN(X)/gDS、0.1-2.5NPUN(X)/gDS、0.25-5NPUN(X)/gDS、0.25-4.5NPUN(X)/gDS、0.25-4NPUN(X)/gDS、0.25-3.5NPUN(X)/gDS、0.25-3NPUN(X)/gDS、0.5-5NPUN(X)/gDS、0.5-4.5NPUN(X)/gDS、0.5-4NPUN(X)/gDS、0.5-3.5NPUN(X)/gDS、0.05-3NPUN(X)/gDS、0.5-2.5NPUN(X)/gDS、1.0-5NPUN(X)/gDS、1.0-4.5NPUN(X)/gDS、1.0-4NPUN(X)/gDS、1.0-3.5NPUN(X)/gDS、1.0-3NPUN(X)/gDS、1.0-2.5NPUN(X)/gDS、1.5-5NPUN(X)/gDS、1.5-4.5NPUN(X)/gDS、1.5-4NPUN(X)/gDS、1.5-3.5NPUN(X)/gDS、1.5-3NPUN(X)/gDS、1.5-2.5NPUN(X)/gDS、2-5NPUN(X)/gDS、2-4.5NPUN(X)/gDS、2-4NPUN(X)/gDS、2-3.5NPUN(X)/gDS、2-3NPUN(X)/gDS、2-5NPUN(X)/gDS、2-2.5NPUN(X)/gDS、2.25-5NPUN(X)/gDS、2.25-4.5NPUN(X)/gDS、2.25-4NPUN(X)/gDS、2.25-3.5NPUN(X)/gDS、2.25-3NPUN(X)/gDS、2.25-2.5NPUN(X)/gDS，或例如2.50-2.54NPUN(X)/gDS。
17.根据项目14-16中任一项所述的方法，其中在项目14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025(FAU)(A)/gDS，例如0.0005-0.0225(FAU)(A)/gDS、0.0005-0.02(FAU)(A)/gDS、0.0005-0.0175(FAU)(A)/gDS、0.0005-0.015(FAU)(A)/gDS、0.0005-0.0125(FAU)(A)/gDS、0.001-0.025(FAU)(A)/gDS、0.001-0.0225(FAU)(A)/gDS、0.001-0.02(FAU)(A)/gDS、0.001-0.0175(FAU)(A)/gDS、0.001-0.015(FAU)(A)/gDS、0.001-0.0125(FAU)(A)/gDS、0.0025-0.025(FAU)(A)/gDS、0.0025-0.0225(FAU)(A)/gDS、0.0025-0.02(FAU)(A)/gDS、0.0025-0.0175(FAU)(A)/gDS、0.0025-0.015(FAU)(A)/gDS、0.0025-0.0125(FAU)(A)/gDS、0.005-0.025(FAU)(A)/gDS、0.005-0.0225(FAU)(A)/gDS、0.005-0.02(FAU)(A)/gDS、0.005-0.0175(FAU)(A)/gDS、0.005-0.015(FAU)(A)/gDS、0.005-0.0125(FAU)(A)/gDS、0.0075-0.025(FAU)(A)/gDS、0.0075-0.0225(FAU)(A)/gDS、0.0075-0.02FAU(A)/gDS、0.0075-0.0175FAU(A)/gDS、0.0075-0.015FAU(A)/gDS、0.0075-0.0125FAU(A)/gDS、0.008-0.025(FAU)(A)/gDS、0.008-0.0225(FAU)(A)/gDS、0.008-0.02(FAU)(A)/gDS、0.008-0.0175(FAU)(A)/gDS、0.008-0.015(FAU)(A)/gDS、0.008-0.0125(FAU)(A)/gDS、0.009-0.0125(FAU)(A)/gDS，或例如0.01FAU(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，在项目14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025KNU/gDS，例如0.0005-0.0225KNU/gDS、0.0005-0.02KNU/gDS、0.0005-0.0175KNU/gDS、0.0005-0.015KNU/gDS、0.0005-0.0125KNU/gDS、0.001-0.025KNU/gDS、0.001-0.0225KNU/gDS、0.001-0.02KNU/gDS、0.001-0.0175KNU/gDS、0.001-0.015KNU/gDS、0.001-0.0125KNU/gDS、0.0025-0.025KNU/gDS、0.0025-0.0225KNU/gDS、0.0025-0.02KNU/gDS、0.0025-0.0175KNU/gDS、0.0025-0.015KNU/gDS、0.0025-0.0125KNU/gDS、0.005-0.025KNU/gDS、0.005-0.0225KNU/gDS、0.005-0.02KNU/gDS、0.005-0.0175KNU/gDS、0.005-0.015KNU/gDS、0.005-0.0125KNU/gDS、0.0075-0.025KNU/gDS、0.0075-0.0225KNU/gDS、0.0075-0.02KNU/gDS、0.0075-0.0175KNU/gDS、0.0075-0.015KNU/gDS、0.0075-0.0125KNU/gDS、0.008-0.025KNU/gDS、0.008-0.0225KNU/gDS、0.008-0.02KNU/gDS、0.008-0.0175KNU/gDS、0.008-0.015KNU/gDS、0.008-0.0125KNU/gDS、0.009-0.01KNU/gDS，或例如0.0095KNU/gDS。
18.根据项目14-17中任一项所述的方法，其中在项目14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.05-0.5AGU/gDS，在项目14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于0.05-5NPUN(X)/gDS，并且如果该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在项目14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025(FAU)(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025KNU/gDS。
19.根据项目14-17中任一项所述的方法，其中在项目14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶对应于0.125-0.35AGU/gDS，在项目14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于1.5-3.5NPUN(X)/gDS，并且如果该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在项目14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0025-0.02(FAU)(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.0025-0.02KNU/gDS。
20.根据项目14-17中任一项所述的方法，其中在项目14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶对应于0.175-0.3AGU/gDS，在项目14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于2-4NPUN(X)/gDS，并且如果该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在项目14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0075-0.0175FAU(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.0075-0.0175KNU/gDS。
21.根据项目14-17中任一项所述的方法，其中在项目14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.2-0.3AGU/gDS，在项目14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于2-3NPUN(X)/gDS，并且如果该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在项目14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.008-0.0125(FAU)(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.008-0.0125KNU/gDS。
22.根据项目14-21中任一项所述的方法，该方法包括向含有液化淀粉的所述组合物中添加含有葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的配制品，其中如果所述配制品包括具有α-淀粉酶活性的多肽，其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么在所述组合物中表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，例如高于50、高于100、高于200、高于300、高于400、高于500、高于600、高于800、高于1000、高于2000、高于3000、高于4000、或例如高于5000，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，例如高于50、高于100、高于200、高于300、高于400、高于500、高于600、高于800、高于1000、高于2000、高于3000、高于4000、或例如高于5000。
23.根据项目14-21中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中添加的葡糖淀粉酶和普鲁兰酶处于如在项目1-13中任一项所定义的组合物中。
24.根据项目14-23中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从2-35小时，例如从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从18-35小时、从18-30小时、从18-28小时、从18-26小时、从18-24小时、从18-22小时、从18-20小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从22-35小时、从22-30小时、从22-28小时、从22-26小时、从22-24小时的持续时间，或例如24小时的持续时间。
25.根据项目14-24中任一项所述的方法，其中项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-94小时，例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-94小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-94小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-94小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-94小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-94小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-94小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-94小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-94小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
26.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从2-35小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-94小时、例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-94小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-94小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-94小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-94小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-94小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-94小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-94小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-94小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
27.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从2-20小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-94小时、例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-94小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-94小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-94小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-94小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-94小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-94小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-94小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-94小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
28.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从4-35小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-92小时、例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-92小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-92小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-92小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-92小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-92小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-92小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-92小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-92小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
29.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从4-22小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-92小时，例如从2-90小时、从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-92小时、从4-90小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-92小时、从10-90小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-92小时、从14-90小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-92小时、从20-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小孩、从20-22小时、从24-92小时、从24-90小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-92小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-92小时、从40-90小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-92小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
30.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从10-35小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-86小时，例如从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-86小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-86小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-86小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-86小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-86小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小孩、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-86小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-86小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-86小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-86小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
31.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从10-24小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-86小时，例如从2-80小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-86小时、从4-80小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-86小时、从10-80小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-86小时、从14-80小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-86小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-86小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小孩、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-86小时、从24-80小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-86小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-86小时、从40-80小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-86小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
32.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从14-35小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-70小时、例如从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-94小时、从25-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
33.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从14-26小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-70小时、例如从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-94小时、从25-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
34.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从18-35小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-78小时、例如从2-74小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-78小时、从4-74小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-76小时、从10-74小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-78小时、从14-74小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-78小时、从20-74小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-78小时、从24-76小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-78小时、从30-74小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-76小时、从40-74小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-78小时、从50-74小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
35.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从18-28小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-78小时、例如从2-74小时、从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-78小时、从4-74小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-76小时、从10-74小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-78小时、从14-74小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-78小时、从20-74小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-78小时、从24-76小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-78小时、从30-74小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-76小时、从40-74小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-78小时、从50-74小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
36.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从20-35小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-76小时、例如从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-76小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-76小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-76小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-76小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-76小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-76小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-76小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-76小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-76小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
37.根据项目14-22中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从20-30小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-76小时、例如从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-76小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-76小时、从10-70小时、从10-60、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-76小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-76小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-76小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-76小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-76小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-76小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-76小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-94小时、从60-90小时、从60-80小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
38.根据项目14-25中任一项所述的方法，其中项目14的步骤ii)中的所述孵育具有从22-35小时的持续时间，并且项目14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-74小时，例如从2-70小时、从2-60小时、从2-55小时、从2-50小时、从2-45小时、从2-40小时、从2-35小时、从2-30小时、从2-28小时、从2-26小时、从2-24小时、从2-22小时、从2-20小时、从2-18小时、从2-16小时、从2-14小时、从2-12小时、从2-10小时、从2-8小时、从4-74小时、从4-70小时、从4-60小时、从4-55小时、从4-50小时、从4-45小时、从4-40小时、从4-35小时、从4-30小时、从4-28小时、从4-26小时、从4-24小时、从4-22小时、从4-20小时、从4-18小时、从4-16小时、从4-14小时、从4-12小时、从4-10小时、从4-8小时、从10-74小时、从10-70小时、从10-60小时、从10-55小时、从10-50小时、从10-45小时、从10-40小时、从10-35小时、从10-30小时、从10-28小时、从10-26小时、从10-24小时、从10-22小时、从10-20小时、从10-18小时、从10-16小时、从10-14小时、从10-12小时、从14-74小时、从14-70小时、从14-60小时、从14-55小时、从14-50小时、从14-45小时、从14-40小时、从14-35小时、从14-30小时、从14-28小时、从14-26小时、从14-24小时、从14-22小时、从14-20小时、从14-18小时、从14-16小时、从20-74小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从25-94小时、从25-90小时、从20-80小时、从20-70小时、从20-60小时、从20-55小时、从20-50小时、从20-45小时、从20-40小时、从20-35小时、从20-30小时、从20-28小时、从20-26小时、从20-24小时、从20-22小时、从24-74小时、从24-70小时、从24-60小时、从24-55小时、从24-50小时、从24-45小时、从24-40小时、从24-35小时、从24-30小时、从24-28小时、从24-26小时、从30-94小时、从30-90小时、从30-80小时、从30-70小时、从30-60小时、从30-55小时、从30-50小时、从30-45小时、从30-40小时、从30-35小时、从40-74小时、从40-70小时、从40-60小时、从40-55小时、从40-50小时、从40-45小时、从50-94小时、从50-90小时、从50-80小时、从50-70小时、从50-60小时、从60-74小时的持续时间，或例如从60-70小时的持续时间。
39.根据项目14-38中任一项所述的方法，其中允许进行项目14的步骤iii)中的孵育直到所述组合物中葡萄糖(％DX)的量达到对应于95％(w/w)或更高、例如95.5％(w/w)或更高、95.75％(w/w)或更高、96％(w/w)或更高、96.25％(w/w)或更高、或例如96.75％(w/w)或更高的水平。
40.根据项目14-39中任一项所述的方法，其中从向该含有液化淀粉的组合物中添加所述葡糖淀粉酶(AMG)和所述的普鲁兰酶直到该淀粉水解/糖化中止的过程的持续时间是从24-96小时，例如从24-72小时、从24-64小时、从24-48小时、从24-36小时、从24-32小时、从32-96小时、从32-72小时、从32-64小时、从32-48小时、从32-36小时、从36-96小时、从36-72小时、从36-64小时、从36-48小时、从48-96小时、例如从48-72小时、从48-64小时、从56-96小时、例如从56-72小时，或例如从56-64小时，
41.根据项目14-40中任一项所述的方法，其中该淀粉水解/糖化发生在3.5-5.0范围内的pH(例如在4.0-4.5范围内的pH)下，以及在59℃-70℃范围内的温度(例如在59℃-65℃范围内，或例如在59℃-62℃范围内)下。
42.根据项目14-41中任一项所述的方法，其中在项目14的步骤i)中提供的该含有液化淀粉的组合物含有从25％-45％干固体(％DS)，例如从25％-40％DS、从28％-38％DS、从30％-38％DS、或例如从33％-36％DS。
43.根据项目14-42中任一项所述的方法，其中该α淀粉酶选自地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、黑曲霉、土曲霉、或微小根毛酶α淀粉酶，该葡糖淀粉酶选自黑曲霉、烟曲霉、埃默森篮状菌、瓣环栓菌、里氏木霉、特异腐质霉、和密粘褶菌葡糖淀粉酶，并且该普鲁兰酶选自脱支芽孢杆菌、或嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶。
44.根据项目14-43中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
iv)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列；
v)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列的子序列；
vi)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
45.根据项目14-44中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
iv)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列；
v)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列的子序列；
vi)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
46.根据项目14-45中任一项所述的方法，其中该普鲁兰酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
iv)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列；
v)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列的子序列；
vi)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，如至少99.5％序列一致性。
47.一种从液化淀粉生产葡萄糖糖浆的方法，该方法包括使该液化淀粉与根据项目1-13中任一项所述的组合物相接触。
48.根据项目47所述的方法，其中所述液化淀粉含有从25％-45％的干固体(％DS)，例如从25％-40％DS、从30％-38％DS、从32％-38％DS、或例如从34％-36％DS。
49.根据项目47-48中任一项所述的方法，所述方法包括使该液化淀粉在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育。
通过以下实例对本发明进行进一步描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实例
实例1
将来自玉米淀粉液化的麦芽糊精粉末溶解于水中，同时加热使浆料处于34.2％干固体。使用显示1.39221的折射指数度量来测量浆料的固体含量。使用1M盐酸溶液将浆料调节至pH为4.3。将该浆料的18克等分试样添加到具有隔膜帽闭合的18个玻璃反应闪烁管中，并且将其插入加热器中加热至61℃的温度。每个管给出基于下表的酶加料量，并且将另外的水添加到各管中以达到33％的目标干固体。在不同的时间点(36小时和48小时)从各管中经由针通过隔膜取1.5mL样品，并且在105℃下失活5分钟。将1mL的各失活样品用4mL去离子水进行稀释。使用HPLC方法DP1-4评估稀释的样品，用于测量右旋糖纯度(％DP1或％DX、％DP2、％DP3和％DP4+)。
来自表1的结果示出了NPUN/AGU比率越高，右旋糖百分比越高。
表1示出了0.25AGU/gDS的恒定AGU剂量，在该共混物中，当NPUN与AGU的比率(NPUN/AGU)从10.1增加至30.2，观察到在峰值处％DX的增加(96.7％至97.0％DX)。具有NPUN/AGU是9或更高的新创建的共混物示出了优于商业产品的0.7％至1％DX的提高。当NPUN/g DS剂量在共混物中保持为恒定时，通过改变AGU/gDS剂量，没有观察到更高的％DX，仅反应速度受到了影响。在具有NPUN/AGU>9的共混物中的％DX的益处不仅仅归因于形成在36小时显示较低的2.1％-2.2％DP2的AMG(JGA98)的低级异麦芽糖的使用，而且还归因于在36小时较低的％DP3和DP4+。
表1.右旋糖含量
实例2
将来自玉米淀粉液化的麦芽糊精粉末溶解于水中，同时加热使浆料淀粉浆料处于37.8％干固体。使用示出1.39964的折射指数度量来测量浆料的固体含量。使用1M盐酸溶液将浆料调节至pH为4.3。将该浆料的18克等分试样添加到具有隔膜帽闭合的18个玻璃反应闪烁管中，并且将其插入加热器中加热至61℃的温度。每个管给出基于下表的酶加料量，并且将另外的水添加到各管中以达到30％、33％、或36％的目标干固体。在不同时间点从各管中经由针通过隔膜取1.5mL样品，并且在105℃下失活5分钟。将1mL的各失活样品用4mL去离子水进行稀释。使用HPLC方法DP1-4评估稀释的样品，用于测量右旋糖纯度(％DP1或％DX)。
表2示出了在三种不同的固体中，在48小时的右旋糖纯度。在所有经测试的固体中，新的酶共混物示出了优于商业酶共混物0.8％-0.9％DX的提高。该结构显示用新的酶共混物在相同的固体上，可以实现较高的DX(0.8％-0.9％DX增加)。还可以在更高的固体上实现相似的右旋糖纯度。例如，使用96.5％DX的％DX的新的酶共混物，可以实现36％DS来替代使用Dextrozyme DX 2X的30％DS。
表2.右旋糖纯度
实例3
评估由酶共混物与延迟加料的真菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:15)的糖化，以观察α-淀粉酶的延迟加料是如何影响DX和糖化速度的。
材料与方法
使用吉尔森(Gilson)液体处理器进行糖化测试，其中经由利可来耐高温淀粉酶(Liquozyme Supra)制备36％DS的DE11麦芽糖糊精，将pH调节至4.3，并且在60℃下进行糖化。在糖化之前，通过加热处理将麦芽糖糊精中的任何残余α-淀粉酶活性失活。在不同的时间点，通过HPLC分析浆料的DX(葡萄糖)、DP2、DP3和DP4+的比率。
将最初的酶加料量示出在表1中。“基准物”是用于糖化的常规酶共混物，含有葡糖淀粉酶、普鲁兰酶、和α-淀粉酶，后者具有葡糖淀粉酶的副活性(副活性)。“AMG+Pul”是葡糖淀粉酶(无α-淀粉酶副活性)和普鲁兰酶的共混物。该样品体积由于α-淀粉酶掺入仅增加了0.2％，因此在DS中的变化是可以忽略的。
用AMG+Pul共混物孵育24h后，将经纯化的α-淀粉酶(SEQ ID NO:15)以0.01FAU(A)/gDS加料，并且与基准酶作比较。将酶的加料量和给药时间示出在表1中。
表3.酶加料量
结果
来自两个实验的DX曲线(图1)和汇总表(表2)示出了相比AMG+Pul共混物，α-淀粉酶在24h的掺入提高了糖化速度，并且显著增加了峰值DX。当相比在48h(由许多植物利用的糖化阶段)时，由该掺入引起的DX的增加高达0.4％-0.6％。
表4.与基准物相比，掺入AA的AMG+Pul共混物的峰值DX、峰值时间、和在48h的DX
结论
上述呈现的结果证实了将α-淀粉酶延迟加料至葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的共混物可以进一步增加DX和糖化速度两者。
实例4
将来自玉米淀粉液化的麦芽糊精粉末溶解于水中，同时加热使浆料淀粉浆料处于37.2％干固体。使用示出1.3982的折射指数度量来测量浆料的固体含量。使用1M盐酸溶液将浆料调节至pH为4.3。将该浆料的18克等分试样添加到具有隔膜帽闭合的18个玻璃反应闪烁管中，并且将其插入加热器中加热至61℃的温度。每个管给出基于下表的酶加料量，并且将另外的水添加到各管中以达到36％的目标干固体。在不同时间点从各管中经由针通过隔膜取1.5mL样品，并且在105℃下失活5分钟。将1mL的各失活样品用4mL去离子水进行稀释。使用HPLC方法DP1-4评估稀释的样品，用于测量右旋糖纯度(％DP1或％DX)。
表5示出了在不同小时处的浆料的右旋糖纯度。这些结果示出了当NPUN/KNUT高于60时，细菌α淀粉酶的添加对速度和％DX具有积极的效应。
使用吉尔森(Gilson)液体处理器进行糖化测试，其中经由利可来耐高温淀粉酶(Liquozyme Supra)制备36％DS的DE11麦芽糖糊精，将pH调节至4.3，并且在60℃下进行糖化。在糖化之前，通过加热处理将麦芽糖糊精中的任何残余α-淀粉酶活性失活。
最初，将不含有α-淀粉酶副活性的葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:12)和普鲁兰酶(SEQID NO:13)的共混物(AMG+Pul共混物)针对葡糖淀粉酶添加为0.194AGU/gDS，并且针对普鲁兰酶添加为2.25NPUN/gDS。同时，由通过酶添加导致的稀释，麦芽糖糊精浆料的DS变成33％。在孵育的不同时期(0-24h)后，将经纯化的α-淀粉酶(SEQ ID NO:18)加料至15μg/gDS(对应于0.01FAU(A)/gDS)，并且与无α-淀粉酶加料(“无AA添加”)的对照相比较。该样品体积由于α-淀粉酶掺入仅增加了0.2％，因此在DS中的变化是可以忽略的。从用AMG+Pul共混物孵育开始36h后，取出0.75ml整分试样，并且通过HPLC分析浆料的DX(葡萄糖)、DP2、DP3和DP4+的比率。将α-淀粉酶加料的时间和在36h的DX示出在表6中。
表6.α-淀粉酶(SEQ ID NO:18)加料的时间以及在36h生成的DX
在相同的实验批次中，替代在0h和24h在SEQ ID NO:18中阐述的α淀粉酶，掺入另一种纯化自土曲霉(SEQ ID NO:26的成熟多肽)的经纯化的真菌α-淀粉酶AM4279至15μg/gDS。将α-淀粉酶加料的时间和在36h的DX示出在表7中。
表7.α-淀粉酶(SEQ ID NO:26的成熟多肽)加料的时间和在36h生成的DX。
在相同的实验批次中，针对葡糖淀粉酶，将另一种AMG+Pul与代替SEQ ID NO:12中阐述的葡糖淀粉酶的来自黑曲霉(SEQ ID NO:27的成熟多肽)的葡糖淀粉酶共混物最初加料至0.18AGU/gDS，同时将普鲁兰酶的加料量保持为2.25NPUN/gDS。将α-淀粉酶(SEQ IDNO:18)加料的时间和在36h的DX示出在表8中。
表8.α-淀粉酶(SEQ ID NO:18)加料的时间以及在36h生成的DX
在此描述并且要求保护的本发明不局限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面预期处于本发明的范围之内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，对于本领域普通技术人员而言本发明的不同修改将从前述描述变得清楚。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在发生冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 葡萄糖糖浆的改进的生产
<130> 12997-WO-PCT
<160> 27
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 616
<212> PRT
<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）
<400> 1
Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr
1 5 10 15
Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala
20 25 30
Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr
35 40 45
Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val
50 55 60
Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly
85 90 95
Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp
100 105 110
Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp
130 135 140
Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg
145 150 155 160
Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp
165 170 175
Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln
180 185 190
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser
195 200 205
Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser
225 230 235 240
Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe
245 250 255
Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro
260 265 270
Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile
275 280 285
Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly
290 295 300
Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys
305 310 315 320
Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp
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Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys
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Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser
355 360 365
Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe
370 375 380
Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu
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<211> 573
<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌（Gloeophyllum sepiarium）
<400> 2
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<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌（Gloeophyllym sepiarium）
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<212> PRT
<213> 密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）
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<211> 573
<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌（Gloeophyllum sepiarium）
<400> 5
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<211> 573
<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌（Gloeophyllum sepiarium）
<400> 6
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Thr Val Leu
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<210> 7
<211> 573
<212> PRT
<213> 粘褶菌属的物种（Gloeophyllum sp）
<400> 7
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<210> 8
<211> 573
<212> PRT
<213> 密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）
<400> 8
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Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Val Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 9
<211> 576
<212> PRT
<213> 密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）
<400> 9
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Leu Gly Thr Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser
85 90 95
Leu Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr
180 185 190
Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser
355 360 365
Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ser Pro
420 425 430
Val Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly
485 490 495
Glu Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser
500 505 510
Pro Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser
515 520 525
Ile Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile
530 535 540
Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser
545 550 555 560
Ile Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570 575
<210> 10
<211> 576
<212> PRT
<213> 密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）
<400> 10
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Leu Gly Thr Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser
85 90 95
Leu Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr
180 185 190
Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser
355 360 365
Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro
420 425 430
Val Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly
485 490 495
Glu Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser
500 505 510
Pro Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser
515 520 525
Ile Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile
530 535 540
Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser
545 550 555 560
Ile Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570 575
<210> 11
<211> 618
<212> PRT
<213> 埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）
<400> 11
Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro
1 5 10 15
Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu
35 40 45
Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly
50 55 60
Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe
85 90 95
Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser
100 105 110
Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser
115 120 125
Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe
130 135 140
Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala
165 170 175
Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser
180 185 190
Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu
195 200 205
Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu
210 215 220
Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn
225 230 235 240
Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp
245 250 255
Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly
260 265 270
Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala
275 280 285
Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu
290 295 300
Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile
305 310 315 320
Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro
325 330 335
Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala
340 345 350
Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly
355 360 365
Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr
370 375 380
Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn
385 390 395 400
Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile
405 410 415
Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser
420 425 430
Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr
435 440 445
Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala
450 455 460
Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala
465 470 475 480
Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro
485 490 495
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr
500 505 510
Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser
515 520 525
Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu Gly Asn
530 535 540
Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn
545 550 555 560
Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser
565 570 575
Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp
580 585 590
Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln
595 600 605
Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln
610 615
<210> 12
<211> 559
<212> PRT
<213> 密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）
<400> 12
Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile
50 55 60
Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Pro Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Thr
165 170 175
Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser Ile
340 345 350
Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro Val
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly Glu
465 470 475 480
Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser Pro
485 490 495
Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile
500 505 510
Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg
515 520 525
Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile
530 535 540
Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
<210> 13
<211> 928
<212> PRT
<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）
<400> 13
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Arg Pro Ala Gly
1 5 10 15
Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly
20 25 30
Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Val Ala
35 40 45
Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg
50 55 60
Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp Leu
65 70 75 80
Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile Phe
85 90 95
Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn
100 105 110
Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro
115 120 125
Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr
130 135 140
Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly
145 150 155 160
Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly
165 170 175
Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val
180 185 190
Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr
195 200 205
Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro
210 215 220
Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr
225 230 235 240
Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn
245 250 255
Pro Asn Ala Asp Leu Gln Val Glu Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val
260 265 270
Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile
275 280 285
Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val Leu
290 295 300
Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln
325 330 335
Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Ile
340 345 350
Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn
355 360 365
Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly
370 375 380
Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn
385 390 395 400
Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly
405 410 415
Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val
420 425 430
Ile Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly
435 440 445
Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys
450 455 460
Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly
465 470 475 480
Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp
485 490 495
Glu Thr Asp Pro Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr
500 505 510
Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Arg
515 520 525
Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile
530 535 540
Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile
545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp
565 570 575
Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala
580 585 590
Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
595 600 605
Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu
610 615 620
Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile
625 630 635 640
Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
645 650 655
Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met
660 665 670
Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
675 680 685
Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690 695 700
Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr
705 710 715 720
Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr
725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
755 760 765
Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys
770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
820 825 830
Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn
835 840 845
Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly
850 855 860
Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn
865 870 875 880
Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
900 905 910
Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
915 920 925
<210> 14
<211> 828
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杂合普鲁兰酶
<400> 14
Asp Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ser
1 5 10 15
Asn Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn
20 25 30
Gly Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Lys Asp Asp Phe Gly Val
35 40 45
Lys Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asp Thr Gln Val Gly Leu Ile
50 55 60
Val Arg Thr Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Ser Asp Asp Leu His
65 70 75 80
Ile Asp Leu Thr Lys Gly His Glu Ile Trp Ile Val Gln Gly Asp Pro
85 90 95
Asn Ile Tyr Tyr Asn Leu Ser Asp Ala Gln Ala Ala Ala Thr Pro Lys
100 105 110
Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu
115 120 125
Thr Asn Pro Met Thr Leu Ser Asp Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val Thr
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Thr Ala Ala Thr Asn Ala
145 150 155 160
Asn Ser Ala Ser Ser Ser Glu Gln Thr Asp Leu Val Gln Leu Thr Leu
165 170 175
Ala Ser Ala Pro Asp Val Ser His Thr Ile Gln Val Gly Ala Ala Gly
180 185 190
Tyr Glu Ala Val Asn Leu Ile Pro Arg Asn Val Leu Asp Ser Ser Gln
195 200 205
Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Thr His Lys Ala
210 215 220
Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu
225 230 235 240
Leu Tyr Asn Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Thr Val Pro Met Thr
245 250 255
Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu
260 265 270
Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr
275 280 285
Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly
290 295 300
Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp
305 310 315 320
Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met
325 330 335
Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys
340 345 350
Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Gly
355 360 365
Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val
370 375 380
Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Phe Ala Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro
385 390 395 400
Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu
405 410 415
Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Thr Ala Arg Ile Lys Glu Phe
420 425 430
Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met
435 440 445
Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp
450 455 460
Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr
465 470 475 480
Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ser Glu Arg Pro Met
485 490 495
Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr
500 505 510
His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp
515 520 525
Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile
530 535 540
Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Glu
545 550 555 560
Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val
565 570 575
Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser
580 585 590
Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile
595 600 605
Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly
610 615 620
Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp
625 630 635 640
Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys
645 650 655
Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser Gln Gly Val Pro
660 665 670
Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp
675 680 685
Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg
690 695 700
Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His
705 710 715 720
Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile
725 730 735
Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr
740 745 750
Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val
755 760 765
Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly
770 775 780
Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu
785 790 795 800
Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile
805 810 815
Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
820 825
<210> 15
<211> 928
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杂合普鲁兰酶
<400> 15
Ala Ser Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ala Asn
1 5 10 15
Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn Gly
20 25 30
Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Thr Asp Glu Phe Gly Val Thr
35 40 45
Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asn Thr Gln Val Gly Leu Ile Val
50 55 60
Arg Lys Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Pro Asp Asp Leu His Ile
65 70 75 80
Asp Leu Ser Lys Gly His Glu Val Trp Ile Asn Gln Gly Asp Pro Thr
85 90 95
Ile Tyr Tyr Asn Leu Asn Asp Ala Glu Ala Ala Ala Val Pro Ala Val
100 105 110
Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu Ser
115 120 125
Ser Pro Met Thr Leu Thr Asp Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Asp
130 135 140
Glu Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Val Ser Ala Glu Ser Ala Asn
145 150 155 160
Pro Val Thr Ala Val Leu Val Gly Asp Phe Gln Gln Ala Leu Gly Ala
165 170 175
Ser Gly Asn Trp Ser Pro Asp Asp Asp His Thr Lys Leu Ser Lys Ile
180 185 190
Asn Ser Asn Leu Tyr Gln Phe Thr Gly Thr Leu Pro Ala Gly Thr Tyr
195 200 205
Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asp His Ser Trp Ser Ala Ser Tyr Pro Asn
210 215 220
Asn Asn Val Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Phe
225 230 235 240
Thr Tyr Ile Pro Ser Thr His Gln Val Phe Asp Ser Ile Asn Asn Pro
245 250 255
Asp Gln Thr Phe Pro Ser Ser Ser Ala Gly Thr Gln Ser Asp Leu Val
260 265 270
Gln Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Asp Ile Thr His Asp Leu Gln Val
275 280 285
Val Ala Asp Gly Tyr Lys Gly Gly Lys Ile Leu Pro Arg Asn Val Leu
290 295 300
Asn Leu Pro Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp
325 330 335
Val Gln Leu Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln
340 345 350
Leu Glu Met Gln Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro
355 360 365
Gly Asn Leu Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly
370 375 380
Lys Thr Gln Thr Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn
385 390 395 400
Ala Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly
405 410 415
Trp Lys Glu Asp His Gln Gln Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val
420 425 430
Ile Tyr Glu Val His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly
435 440 445
Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys
450 455 460
Gly Pro Asp Gly Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly
465 470 475 480
Ile Asn Ala Val Gln Leu Gln Pro Ile Glu Glu Phe Ala Ser Ile Asp
485 490 495
Glu Thr Gln Pro Asn Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr
500 505 510
Asn Val Pro Glu Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg
515 520 525
Ile Thr Glu Phe Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile His Lys Asp Arg Ile
530 535 540
Ala Ile Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ser Thr Leu Ile
545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Gln Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp
565 570 575
Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Val Gly Asn Glu Phe Ala Thr
580 585 590
Glu His Pro Met Ala Arg Lys Phe Val Leu Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
595 600 605
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610 615 620
Leu Gly Lys Asn Thr Met Ala Glu Ala Ser Lys Glu Leu His Ala Ile
625 630 635 640
Asn Pro Gly Ile Val Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
645 650 655
Gly Ile Thr Gly Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Val Gln Lys Gly Leu
660 665 670
Gly Ile Gly Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
675 680 685
Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690 695 700
Thr Asp Ala Ile Lys Arg Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr
705 710 715 720
Ser Ser Pro Ser Glu Thr Ile Asn Tyr Val Ser Cys His Asp Asn Tyr
725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
755 760 765
Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys
770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
820 825 830
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835 840 845
Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly
850 855 860
Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn
865 870 875 880
Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
900 905 910
Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
915 920 925
<210> 16
<211> 928
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杂合普鲁兰酶
<400> 16
Ala Ser Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ala Asn
1 5 10 15
Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn Gly
20 25 30
Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Thr Asp Glu Phe Gly Val Thr
35 40 45
Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asn Thr Gln Val Gly Leu Ile Val
50 55 60
Arg Lys Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Pro Asp Asp Leu His Ile
65 70 75 80
Asp Leu Ser Lys Gly His Glu Val Trp Ile Asn Gln Gly Asp Pro Thr
85 90 95
Ile Tyr Tyr Asn Leu Asn Asp Ala Glu Ala Ala Ala Val Pro Ala Val
100 105 110
Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu Ser
115 120 125
Ser Pro Met Thr Leu Thr Asp Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Asp
130 135 140
Glu Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Val Ser Ala Glu Ser Ala Asn
145 150 155 160
Pro Val Thr Ala Val Leu Val Gly Asp Phe Gln Gln Ala Leu Gly Ala
165 170 175
Ser Gly Asn Trp Ser Pro Asp Asp Asp His Thr Lys Leu Ser Lys Ile
180 185 190
Asn Ser Asn Leu Tyr Gln Phe Thr Gly Thr Leu Pro Ala Gly Thr Tyr
195 200 205
Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asp His Ser Trp Ser Ala Ser Tyr Pro Asn
210 215 220
Asn Asn Val Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Phe
225 230 235 240
Thr Tyr Ile Pro Ser Thr His Gln Val Phe Asp Ser Ile Asn Asn Pro
245 250 255
Asp Gln Thr Phe Pro Ser Ser Ser Ala Gly Thr Gln Ser Asp Leu Val
260 265 270
Gln Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Asp Ile Thr His Asp Leu Gln Val
275 280 285
Val Ala Asp Gly Tyr Lys Gly Gly Lys Ile Leu Pro Arg Asn Val Leu
290 295 300
Asn Leu Pro Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp
325 330 335
Val Gln Leu Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln
340 345 350
Leu Glu Met Gln Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro
355 360 365
Gly Asn Leu Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly
370 375 380
Lys Thr Gln Thr Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn
385 390 395 400
Ala Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly
405 410 415
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420 425 430
Ile Tyr Glu Val His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly
435 440 445
Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys
450 455 460
Gly Pro Asp Gly Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly
465 470 475 480
Ile Asn Ala Val Gln Leu Gln Pro Ile Glu Glu Phe Ala Ser Ile Asp
485 490 495
Glu Thr Gln Pro Asn Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr
500 505 510
Asn Val Pro Glu Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg
515 520 525
Ile Thr Glu Phe Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile His Lys Asp Arg Ile
530 535 540
Ala Ile Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile
545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp
565 570 575
Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala
580 585 590
Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
595 600 605
Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu
610 615 620
Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile
625 630 635 640
Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
645 650 655
Ala Leu Pro Glu Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met
660 665 670
Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
675 680 685
Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690 695 700
Thr Asp Ala Ile Lys Arg Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr
705 710 715 720
Ser Ser Pro Ser Glu Thr Ile Asn Tyr Val Ser Cys His Asp Asn Tyr
725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
755 760 765
Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys
770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
820 825 830
Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn
835 840 845
Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly
850 855 860
Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn
865 870 875 880
Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
900 905 910
Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
915 920 925
<210> 17
<211> 484
<212> PRT
<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）
<400> 17
Leu Ser Ala Ala Glu Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asp Thr
20 25 30
Gly Asp Gln Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asn His
35 40 45
Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro
50 55 60
Ile Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His
65 70 75 80
Gly Tyr Trp Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr
85 90 95
Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met
100 105 110
Tyr Leu Met Val Asp Val Val Pro Asn His Met Gly Tyr Ala Gly Asn
115 120 125
Gly Asn Asp Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser
130 135 140
Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met
145 150 155 160
Val Gln Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu
165 170 175
Asn Thr Thr Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala
180 185 190
Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val
195 200 205
Leu Glu Val Glu Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Gln Glu Ala Ala Gly
210 215 220
Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Asp Asn Gly Asn Pro Ala Leu Asp Cys
225 230 235 240
Pro Tyr Gln Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp
245 250 255
Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu
260 265 270
Tyr Asn Met Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu
275 280 285
Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser Tyr
290 295 300
Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ser
325 330 335
Gly Gly Lys Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr
340 345 350
Asp Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile
355 360 365
Arg Lys Leu Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn
370 375 380
Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Arg Lys Gly Thr
385 390 395 400
Ser Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly
405 410 415
Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr
420 425 430
Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser
435 440 445
Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Arg Val Leu Leu
450 455 460
Pro Ala Ser Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg
465 470 475 480
Leu Tyr Val Glu
<210> 18
<211> 583
<212> PRT
<213> 微小根毛酶（Rhizomucor pusillus）
<400> 18
Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp
35 40 45
Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro
50 55 60
Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala
100 105 110
Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Asp
115 120 125
Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asn Gln
130 135 140
Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp
145 150 155 160
Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly
165 170 175
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys
180 185 190
His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val
195 200 205
Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro
210 215 220
Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser
245 250 255
Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu
260 265 270
Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln
275 280 285
Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly
290 295 300
Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly
305 310 315 320
Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp
325 330 335
Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg
340 345 350
Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn
355 360 365
Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr
370 375 380
Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe
385 390 395 400
Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr
405 410 415
Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro
420 425 430
Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro
435 440 445
Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala
450 455 460
Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr
465 470 475 480
Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu
485 490 495
Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr
500 505 510
Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro
515 520 525
Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr
530 535 540
Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp
545 550 555 560
Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala
565 570 575
Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
580
<210> 19
<211> 471
<212> PRT
<213> 微小根毛酶（Rhizomucor pusillus）
<400> 19
Met Lys Phe Ser Ile Ser Leu Ser Ala Ala Ile Val Leu Phe Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Ser Leu Ala Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly Lys
20 25 30
Arg Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn
50 55 60
Leu Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu
65 70 75 80
Asp Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile
85 90 95
Pro Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe
100 105 110
Tyr Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu
115 120 125
Ile Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val
130 135 140
Ala Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Gly Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp
165 170 175
Gln Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile
180 185 190
Asp Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser
195 200 205
Gly Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val
210 215 220
Lys His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Val Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly
245 250 255
Pro Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr
260 265 270
Ala Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile
275 280 285
Ser Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val
290 295 300
Leu Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser
305 310 315 320
Gln Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu
325 330 335
Gly Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser
340 345 350
Gly Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr
355 360 365
Asp Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val
370 375 380
Arg Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp
385 390 395 400
Asn Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn
405 410 415
Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys
420 425 430
Phe Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr
435 440 445
Thr Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu
450 455 460
Pro Ala Ile Phe Thr Ser Ala
465 470
<210> 20
<211> 514
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus）
<400> 20
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr
485 490 495
Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
500 505 510
Ala Trp
<210> 21
<211> 483
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）
<400> 21
Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu
20 25 30
Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 22
<211> 483
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
<400> 22
Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp
1 5 10 15
Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp
20 25 30
Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser
35 40 45
Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu
50 55 60
Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu
65 70 75 80
Leu Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr
85 90 95
Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp
100 105 110
Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg
130 135 140
Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly
145 150 155 160
Ala Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg
165 170 175
Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Lys
<210> 23
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组α-淀粉酶缀合物
<400> 23
Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu
20 25 30
Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 24
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芽孢杆菌杂合α-淀粉酶（Bacillus hybrid alpha-amylase）
<400> 24
Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu
20 25 30
Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Ala
35 40 45
Ile Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Phe Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Val Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 25
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芽孢杆菌杂合α-淀粉酶变体
<400> 25
Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu
20 25 30
Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Ala
35 40 45
Ile Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe Trp Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Leu
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Thr Trp Asp Trp Pro Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Tyr Asp Tyr Asp Tyr Pro Asp Val
195 200 205
Val Ala Glu Ile Thr Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 26
<211> 607
<212> PRT
<213> 土曲霉（Aspergillus terreus）
<400> 26
Met Lys Trp Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val Ile Gly Gln
1 5 10 15
Ala Thr His Ala Leu Thr Pro Ala Glu Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr
20 25 30
Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala
35 40 45
Ala Cys Asp Thr Ser Asp Arg Val Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly
50 55 60
Ile Ile Asn Gln Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile
65 70 75 80
Trp Ile Thr Pro Val Thr Gly Gln Phe Tyr Glu Asn Thr Gly Asp Gly
85 90 95
Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Asp Leu Asn Tyr
100 105 110
Asn Tyr Gly Thr Ala Gln Asp Leu Lys Asn Leu Ala Asn Ala Leu His
115 120 125
Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly
130 135 140
Tyr Asp Gly Ala Gly Asn Thr Val Asp Tyr Ser Val Phe Asn Pro Phe
145 150 155 160
Ser Ser Ser Ser Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Ser Asn Tyr Asp
165 170 175
Asn Gln Thr Asn Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Thr Thr Val Ser
180 185 190
Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ser Thr Ala Val Arg Asn Ile Trp Tyr
195 200 205
Asp Trp Val Ala Asp Leu Val Ala Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg
210 215 220
Val Asp Thr Val Lys His Val Glu Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn
225 230 235 240
Ser Ala Ala Gly Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Tyr Ser Gly Asp Pro
245 250 255
Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Tyr Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr
260 265 270
Pro Ile Tyr Tyr Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser
275 280 285
Ile Ser Asp Leu Tyr Asn Met Ile Ser Ser Val Ala Ser Ser Cys Lys
290 295 300
Asp Pro Thr Leu Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg
305 310 315 320
Phe Ala Ser Tyr Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Ile Thr
325 330 335
Phe Ile Phe Leu Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Gln Glu
340 345 350
Gln His Tyr Ser Gly Gly Ser Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp
355 360 365
Leu Ser Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Thr Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr
370 375 380
Thr Asn Gln Ile Arg Ser Leu Ala Ile Ser Lys Asp Ala Gly Tyr Val
385 390 395 400
Gln Ala Lys Asn Asn Pro Phe Tyr Ser Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met
405 410 415
Arg Lys Gly Thr Thr Ala Gly Ala Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn
420 425 430
Lys Gly Ala Ser Gly Ser Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Thr Gly
435 440 445
Tyr Ser Ala Gly Ala Thr Leu Val Glu Thr Tyr Thr Cys Thr Thr Val
450 455 460
Thr Val Asp Ser Ser Gly Asn Leu Pro Val Pro Met Thr Ser Gly Leu
465 470 475 480
Pro Arg Val Phe Val Pro Ser Ser Trp Val Asn Gly Ser Ala Leu Cys
485 490 495
Asn Thr Glu Cys Thr Ala Ala Thr Ser Ile Ser Val Leu Phe Glu Glu
500 505 510
Leu Val Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Ser Gly Ser Ile
515 520 525
Ser Gln Leu Gly Ser Trp Asn Thr Ala Ser Ala Val Ala Leu Ser Ala
530 535 540
Ser Gln Tyr Thr Ser Ser Asn Pro Glu Trp Tyr Val Ser Val Thr Leu
545 550 555 560
Pro Val Gly Thr Ser Phe Gln Tyr Lys Phe Ile Lys Lys Gly Ser Asp
565 570 575
Gly Ser Val Val Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro
580 585 590
Ala Gly Cys Glu Gly Ala Thr Val Thr Val Ala Asp Thr Trp Arg
595 600 605
<210> 27
<211> 640
<212> PRT
<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）
<400> 27
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly
1 5 10 15
Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser
20 25 30
Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala
35 40 45
Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser
50 55 60
Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser
65 70 75 80
Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr
85 90 95
Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val
100 105 110
Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu
115 120 125
Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp
130 135 140
Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile
145 150 155 160
Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr
165 170 175
Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln
180 185 190
Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser
195 200 205
Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser
210 215 220
Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln
225 230 235 240
Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe
245 250 255
Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
260 265 270
Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp
275 280 285
Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu
290 295 300
Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser
305 310 315 320
Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr
325 330 335
Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr
355 360 365
Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr
370 375 380
Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala
385 390 395 400
Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala
405 410 415
Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu
420 425 430
Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr
435 440 445
Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr
450 455 460
Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly
465 470 475 480
Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr
485 490 495
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr
500 505 510
Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr
515 520 525
Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp
530 535 540
Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser
545 550 555 560
Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser
565 570 575
Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr
580 585 590
Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser
595 600 605
Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val
610 615 620
Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
625 630 635 640

Claims (48)

1.一种组合物，该组合物包括一种葡糖淀粉酶和一种普鲁兰酶，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率高于6。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中如果所述组合物包括一种具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率高于6，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在6-20的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在6-20的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500。
6.根据权利要求1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在7-15的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100，并且其中如果具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于100。
7.根据权利要求1或2所述的组合物，其中表示为NPUN/g的普鲁兰酶活性与表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性的比率在7-15的范围内，并且其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500，并且其中如果具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于500。
8.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中所述葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：黑曲霉葡糖淀粉酶、埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、瓣环栓菌葡糖淀粉酶、密粘褶菌葡糖淀粉酶、里氏木霉葡糖淀粉酶、特异腐质酶葡糖淀粉酶、和烟曲霉葡糖淀粉酶，及其杂交体和变体。
9.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中所述普鲁兰酶选自下组，该组由以下各项组成：脱支芽孢杆菌普鲁兰酶、嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶，及其杂交体和变体。
10.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％序列一致性。
11.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％序列一致性。
12.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该普鲁兰酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％序列一致性。
13.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物是液体或固体组合物。
14.一种用于生产葡萄糖糖浆的方法，该方法包括，
i)提供含有液化淀粉的组合物，并且向所述组合物添加葡糖淀粉酶(AMG)和普鲁兰酶；
ii)使该组合物在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育，并且随后
iii)向所述组合物中添加α-淀粉酶，并且使该组合物在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在权利要求14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.05-0.5AGU/gDS。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于0.05-5NPUN(X)/gDS。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中如果所述α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在权利要求14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025(FAU)(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025KNU/gDS。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.05-0.5AGU/gDS，在权利要求14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于0.05-5NPUN(X)/gDS，并且如果该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在权利要求14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025(FAU)(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.0005-0.025KNU/gDS。
19.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.125-0.35AGU/gDS，在权利要求14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于1.5-3.5NPUN(X)/gDS，并且如果该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在权利要求14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0025-0.02(FAU)(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.0025-0.02KNU/gDS。
20.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.175-0.3AGU/gDS，在权利要求14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于2-4NPUN(X)/gDS，并且如果该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在权利要求14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.0075-0.0175FAU(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.0075-0.0175KNU/gDS。
21.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤i)中添加的葡糖淀粉酶的量对应于0.2-0.3AGU/gDS，在权利要求14的步骤i)中添加的普鲁兰酶的量对应于2-3NPUN(X)/gDS，并且如果该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，在权利要求14的步骤iii)中添加的α-淀粉酶的量对应于0.008-0.0125(FAU)(A)/gDS，并且如果所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，添加的α-淀粉酶的量对应于0.008-0.0125KNU/gDS。
22.根据权利要求14-21中任一项所述的方法，该方法包括向含有液化淀粉的所述组合物中添加含有葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的一种配制品，其中如果所述配制品包括具有α-淀粉酶活性的多肽，其中如果所述组合物包括具有α-淀粉酶活性的多肽，并且该多肽是真菌来源的，那么在所述组合物中表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为真菌α-淀粉酶单位FAU(A)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29，并且其中如果该具有α-淀粉酶活性的多肽是细菌来源的，那么表示为AGU/g的葡糖淀粉酶活性与表示为Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)/g的α-淀粉酶活性的比率高于29。
23.根据权利要求14-21中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中添加的葡糖淀粉酶和普鲁兰酶处于如在权利要求1-13中任一项所定义的组合物中。
24.根据权利要求14-23中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从2-35小时的持续时间。
25.根据权利要求14-24中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-94小时的持续时间。
26.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从2-35小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-94小时的持续时间。
27.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从2-20小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-94小时的持续时间。
28.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从4-35小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-92小时的持续时间。
29.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从4-22小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-92小时的持续时间。
30.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从10-35小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-86小时的持续时间。
31.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从10-24小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-86小时的持续时间。
32.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从14-35小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-70小时的持续时间。
33.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从14-26小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-70小时的持续时间。
34.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从18-35小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-78小时的持续时间。
35.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从18-28小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-78小时的持续时间。
36.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从20-35小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-76小时的持续时间。
37.根据权利要求14-22中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从20-30小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-76小时的持续时间。
38.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤ii)中的所述孵育具有从22-35小时的持续时间，并且在权利要求14的步骤iii)中的所述孵育具有从2-74小时的持续时间。
39.根据权利要求14-38中任一项所述的方法，其中允许进行权利要求14的步骤iii)中的孵育直到在所述组合物中葡萄糖(％DX)的量达到对应于95％(w/w)或更高的水平。
40.根据权利要求14-39中任一项所述的方法，其中从向该含有液化淀粉的组合物中添加所述葡糖淀粉酶(AMG)和所述普鲁兰酶直到该淀粉水解/糖化终止的过程的持续时间是从24-96小时。
41.根据权利要求14-40中任一项所述的方法，其中该淀粉水解/糖化发生在3.5-5.0范围内的pH下，例如在4.0-4.5范围内的pH下，以及在59℃-70℃范围内的温度下，例如在59℃-65℃范围内、或例如在59℃-62℃范围内的温度下。
42.根据权利要求14-41中任一项所述的方法，其中在权利要求14的步骤i)中提供的该含有液化淀粉的组合物含有从25％-45％干固体(％DS)，例如从25％-40％DS、从30％-38％DS、从32％-38％DS、或例如从34％-36％DS。
43.根据权利要求14-42中任一项所述的方法，其中该α淀粉酶选自黑曲霉、土曲霉、或微小根毛酶α淀粉酶，该葡糖淀粉酶选自黑曲霉、烟曲霉、埃默森篮状菌、瓣环栓菌、里氏木霉、特异腐质霉、和密粘褶菌葡糖淀粉酶，并且该普鲁兰酶选自脱支芽孢杆菌、或嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶。
44.根据权利要求14-43中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:2-12和27中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％序列一致性。
45.根据权利要求14-44中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:1和17-26中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％序列一致性。
46.根据权利要求14-45中任一项所述的方法，其中该普鲁兰酶包括/基本上由/由选自下组的氨基酸序列组成，该组由以下各项组成
i)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列或其成熟多肽；
ii)SEQ ID NO:13-16中任一项阐述的氨基酸序列的子序列或其所述成熟多肽的子序列；
iii)氨基酸序列，其与i)和ii)中阐述的氨基酸序列中任一项具有至少70％序列一致性。
47.一种从液化淀粉生产葡萄糖糖浆的方法，该方法包括使该液化淀粉与根据权利要求1-13中任一项所述的组合物相接触。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述液化淀粉含有从25％-45％干固体(％DS)，例如从25％-40％DS、从30％-38％DS、从32％-38％DS、或例如从34％-36％DS根据权利要求47-48中任一项所述的方法，所述方法包括使该液化淀粉在允许淀粉水解/糖化的条件下经受孵育。
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