CN103502420A

CN103502420A - 生产啤酒麦汁的方法

Info

Publication number: CN103502420A
Application number: CN201280018617.5A
Authority: CN
Inventors: A·M·B·弗雷泽里克森; 福山志朗; 绫部圭一
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2012-04-11
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2032-04-11
Also published as: DK2697356T3; WO2012140075A3; US20150017282A1; MX2013011171A; CN103502420B; RU2013150787A; BR112013025259A2; MX357536B; WO2012140075A2; CN109321391A; PL2697356T3; RU2600885C2; EP2697356A2; ZA201307371B; US10800999B2; EP2697356B1

Abstract

本发明涉及生产啤酒麦汁的方法，包括向醪液添加特定的葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶得自草酸青霉。此外，本发明涉及特定葡糖淀粉酶在啤酒麦汁生产中的用途。此外，本发明涉及葡糖淀粉酶与普鲁兰酶的组合在啤酒麦汁生产中的用途。

Description

生产啤酒麦汁的方法

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用的方式合并入本文。

技术领域

本发明大体涉及生产啤酒麦汁的方法。具体地，本发明涉及通过添加特定葡糖淀粉酶来生产啤酒麦汁的方法。

背景技术

在现代糖化工艺中，当糖化麦芽中的酶量较低时，经常将酶作为补充剂加入，或者添加酶补充剂以利用所有的辅料碎谷物。酶也可以应用在酶含量高的良好溶解（well modified）的麦芽的糖化中，以增加提取回收率以及可发酵糖的量。使用的酶包括淀粉酶、葡糖淀粉酶、普鲁兰酶等。

US3379534记载了通过使用淀粉葡糖苷酶来制备低糊精啤酒。

US4536477记载了特别适用于由淀粉制备含葡萄糖的糖汁的热稳定性葡糖淀粉酶。

WO2009/075682记载了使用特定普鲁兰酶来生产啤酒麦汁，其中使用较小量的酶蛋白来实现糖化。

Matthews等人，2001,Journal of Institute of brewing107(3)pp185-194公开了通过使用来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的葡糖淀粉酶在高温下进行糖化，从而制备碳水化合物较低的啤酒。

然而，仍然对啤酒麦汁生产中帮助减少糖化时间并提高糖分布的方法存在需求。

发明内容

本发明的发明人惊讶地发现，通过使用特定的葡糖淀粉酶，可以使用较低的酶量来实现糖化，可以缩短糖化工序的时间并且还可以改善麦汁的糖分布。

因此，在一方面，本发明涉及生产啤酒麦汁的方法，包括向醪液添加在至少65℃温度的糖化条件下有活性的葡糖淀粉酶。

在另一方面，本发明涉及生产啤酒麦汁的方法，包括向醪液添加在麦汁分离过程中仍有活性并在80℃具有至少10%残余活性的葡糖淀粉酶。

在一方面，在pH6.0下，通过使用麦芽糊精作为底物来形成葡萄糖，从而测定残余活性。

因此，在另一方面，本发明涉及生产啤酒麦汁的方法，包括向醪液添加与SEQ ID NO:1所示序列为至少50%相同的葡糖淀粉酶。

在一方面，方法的糖化工序包括在至少65℃孵育至少20分钟的步骤。

在一方面，葡糖淀粉酶在麦汁分离时有活性。

在另一方面，葡糖淀粉酶在煮浆下有活性。

在另一方面，该方法还包括添加普鲁兰酶。

在另一方面，该方法还包括添加蛋白酶。

在另一方面，该方法还包括添加木聚糖酶。

在另一方面，该方法还包括添加脂肪酶。

在另一方面，该方法还包括添加纤维素酶。

在另一方面，该方法还包括添加淀粉酶。

在另一方面，该方法还包括添加β葡聚糖酶。

在一方面，葡糖淀粉酶在糖化开始时引入。

在另一方面，葡糖淀粉酶在糖化过程中引入。

在一方面，葡糖淀粉酶在麦汁分离时引入。

在另一方面，葡糖淀粉酶的添加在65℃～90℃的温度下进行。

在一方面，实施本发明的方法，得到相对于麦汁的总碳水化合物含量，具有高于80%的葡萄糖的麦汁。

在一方面，葡糖淀粉酶的浓度为，相对于每g碎谷物（grist）总重，约0.0005至约200mg的酶蛋白（EP）。

在一方面，醪液由包含发芽谷粒和/或未发芽谷粒的碎谷物组成。

在一方面，葡糖淀粉酶得自青霉菌（Penicillium）。

在另一方面，葡糖淀粉酶得自草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

在一方面，麦汁进一步发酵，得到酒精饮料。

在另一方面，酒精饮料是啤酒。

在一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:1所示序列具有至少50%同一性的葡糖淀粉酶在啤酒麦汁生产中的用途。

具体实施方式

酿造工艺在本领域中公知，并且通常包括麦芽制成（malting）、糖化和发酵的步骤。糖化是将来自磨碎的大麦麦芽和固体辅料淀粉转化成可发酵和不可发酵的糖，以产生具有理想组成的麦汁的工序。传统的糖化涉及将磨碎的大麦麦芽、辅料与水在设定温度以设定体积进行混合，以继续在麦芽制成工序中开始的生化变化。糖化工序在一段时间内于不同温度进行，以活化负责蛋白质和碳水化合物的降解的内源酶。迄今为止，糖化带来的最重要的变化是将淀粉分子转化成可发酵的糖。在传统糖化工序中负责淀粉转化的主要酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡聚糖酶。α-淀粉酶通过将淀粉分子分成很多可受到β-淀粉酶攻击的较短链而非常迅速地还原不可溶淀粉和可溶淀粉。所产生的二糖是麦芽糖。除在糖化过程中形成的麦芽糖之外，还产生短的支链葡萄糖寡聚物。短的支链葡萄糖寡聚物是不可发酵的糖，增加成品啤酒的味道以及卡路里量。在麦芽制成后，当所有淀粉都已分解时，必须将液体提取物（麦汁）与固体（麦糟）分离。麦汁分离很重要，因为固体包含大量的蛋白质、溶解不好的淀粉、脂肪材料、硅酸盐和多酚（丹宁）。在麦汁分离之前，醪液温度可以提高至约75～78℃（165～173°F）（称为煮浆）。在从麦糟分离麦汁后，麦汁可以用酿酒酵母发酵以生成啤酒。在收集第一麦汁之后留在麦糟中的提取物也可以通过在分离结块上方加热水将其洗出。这个工序称为洗糟。热水流经麦糟并溶解剩余的提取物。稀释的麦汁称为第二麦汁，其提取物从第一麦汁的原始密度降低至1～2%。在添加酒花后，将麦汁煮沸。这样，许多物质包括数种蛋白会变性，并将发生多酚的沉淀。在冷却并去除沉淀后，对成品啤酒麦汁（a）充气并添加酵母。在主要发酵（通常持续5～10天）后，将大多数酵母除去并将所谓的生啤（b）储存在低温下，通常在0～5℃储存1～12周。在此期间，剩余的酵母会与多酚一起沉淀。为去除剩余的过量多酚，进行过滤。此时可在装瓶之前将熟啤（c）碳化。二氧化碳不仅有利于可感知到的“充实度”或“实体感”，并作为风味增强剂，其还用作发泡能力的增强剂并在延长产品货架期中起着重要作用。关于常规酿造工艺的其他信息可以在Research and Teaching Institute ofBrewing,Berlin(VLB)（1999年第二版修订版，ISBN3-921690-39-0）的Wolfgang Kunze的“Technology Brewing and Malting”中找到。

在糖化过程中形成的短的支链葡萄糖寡聚物可以通过添加外源酶（除麦芽之外加入的酶）而进一步水解。脱支酶例如普鲁兰酶和异淀粉酶在淀粉降解过程中水解分支的α-1-6糖苷键，从而促成β-淀粉酶和葡糖淀粉酶的更高的水解量，得到更多量的麦芽糖和葡萄糖以及更少的不可发酵糊精。

在一方面，本发明提供一种方法来生产低碳水化合物含量（低碳）的啤酒。典型的麦汁由淀粉来源的碳水化合物的混合物组成，碳水化合物根据其是否可被酿酒酵母转化成乙醇而被分类为可发酵或不可发酵。在传统糖化中，可发酵的碳水化合物通过麦芽α-淀粉酶和β-淀粉酶对谷粒淀粉的水解而形成。淀粉是葡萄糖残基经α-1,4键或α-1,6键连接的葡萄糖聚合物。在糖化循环中，淀粉首先溶解，然后部分淀粉分子水解成不可发酵的糊精以及低分子量的糖例如葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖（这些可以被啤酒酵母发酵成乙醇）。不可发酵的或极限糊精部分由所有聚合度（DP）比麦芽三糖高的糖组成。麦汁的组成可以根据起始材料、糖化循环和其他变量而变化。典型麦汁的碳水化合物组成由65～80%的可发酵糖和20～35%不可发酵的极限糊精组成。在发酵过程中，可发酵的部分转化成乙醇，达到终浓度3～6%w/w。极限糊精不转化成乙醇，并留存在最终的啤酒中，增加饮品的碳水化合物含量。在“低碳水化合物”啤酒或超发酵啤酒的生产中，已尝试获得更多部分的醇和更少量的残余糊精。葡糖淀粉酶经常用在酿造中，以降低极限糊精的含量。然而，由于葡糖淀粉酶在水解α-1,4键方面更有效，并且在水解α-1,6键方面有困难，它们通常以极高的浓度进行使用。

在一方面，本发明提供一种适用于生产不可发酵糖较少的麦汁的方法。在另一方面，本发明涉及一种生产富含葡萄糖的麦汁的方法。在另一方面，本发明涉及一种用于生产麦芽糖耗尽的麦汁的方法。该方法应用了明确选择的葡糖淀粉酶的活性。

发明人惊讶地发现，相比于通常用在酿造中的葡糖淀粉酶，使用在高得多的温度下有活性的葡糖淀粉酶可以提供许多优势。例如，通过应用在麦汁分离时有活性的葡糖淀粉酶，发明人发现，他们不仅可以从传统的糖化作用步骤中受益，并且还可以从余下的麦汁分离过程中受益。由此，降低了达到相同RDF（真正发酵度）的葡糖淀粉酶的用量。或者，使用本发明的方法，甚至可以得到更高RDF值并且/或者可以降低60～64℃下的糖化作用时间。发明人还发现，拥有在较高温度下有活性的葡糖淀粉酶，可以实现其中淀粉具有较高糊化温度（例如，玉米、水稻和高粱）的辅料的糖化。由于葡糖淀粉酶在淀粉糊化时有活性，将确保对这些辅料的高水平的淀粉水解。发明人还发现，通过添加普鲁兰酶，并在辅料淀粉糊化并且普鲁兰酶和葡糖淀粉酶有活性的糖化过程中采用保持步骤，将会进一步提高效率。

定义

在本公开中，使用本领域普通技术人员通常理解的多个术语。但是，一些术语在使用时具有特定的含义，这些含义如下所限定。

本文所使用的术语“碎谷物”理解为作为啤酒生产基础的含有淀粉或糖的材料，例如，大麦麦芽和辅料。通常，碎谷物不包含任何添加的水。

术语“麦芽”理解为任何发芽的谷类谷粒，特别是大麦。

术语“辅料”理解为，不是大麦麦芽的部分碎谷物。辅料可以是任何富含淀粉的植物材料，例如，未发芽的谷粒，例如但不限于大麦、玉米、稻、高粱、和小麦，还包括易于发酵的糖和/或糖汁。一些辅料的淀粉具有相对较低的糊化温度，这使得它们可以与麦芽一起糖化，而其他辅料例如稻、玉米和高粱具有较高的糊化温度，这些辅料通常分开蒸煮并在添加到醪液之前用α-淀粉酶溶解。

术语“醪液”理解为包含淀粉的浆料，包括碎的大麦麦芽、碎的未发芽谷粒、其他含淀粉材料或其组合，浸在水中以制备麦汁。

术语“麦汁”理解为，在糖化过程中，在提取碎谷物后的未发酵液体流出物。

术语“麦糟”理解为，提取碎谷物和分离麦汁后沥干的固体残留物。

术语“啤酒”在此理解为发酵的麦汁，即从大麦麦芽及任选的辅料和酒花酿造而来的酒精饮料。本文所使用的术语“啤酒”意在至少涵盖从由未发芽谷物类制备的醪液以及所有由发芽谷物类制备的醪液以及所有由发芽和未发芽谷物的混合物制备的醪液制备而来的啤酒。术语“啤酒”还涵盖用辅料制备的啤酒以及用所有可能的醇物质制备的啤酒。

术语“淀粉糊化”理解为，淀粉在水的存在下进行加热时所经历的不可逆的有序-无序转变。可以采用技术差示扫描量热法（DSC）来研究淀粉糊化的逐步过程，描述淀粉糊化的起始温度和峰值温度（T_o&T_p）。术语“起始糊化温度（T_o）”理解为开始糊化的温度。术语“峰值糊化温度（T_p）”理解为吸热峰的温度。术语“结尾糊化温度（T_c）”理解为糊化终止的温度。

序列同一性：两个氨基酸序列之间的相关度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包（EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite（欧洲分子生物学开放软件包）,Rice等人,2000,Trends in Genetics16:276-277）（优选5.0.0或更新版本）的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法（Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453），来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是，空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，使用EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版本）替换矩阵。Needle标记的“最长同一性”的输出（使用-nobrief选项得到的）被用作同一性百分比并计算如下：

（相同残基×100）/（比对长度-比对中的空位总数）。

麦汁生产

在一方面，在pH6.0下通过使用麦芽糊精作为底物来形成葡萄糖，从而测量残余活性。

在一方面，本发明涉及生产啤酒麦汁的方法。特别地，本发明涉及生产啤酒麦汁的方法，包括向醪液添加与SEQ ID NO:1所示序列至少50%相同的葡糖淀粉酶。

根据一个方面，醪液可以通过研磨包含麦芽和/或辅料的碎谷物而获得。水优选添加至碎谷物，将水预热，以使醪液形成时达到所期望的醪液温度。如果所形成的醪液的温度低于期望的糖化温度，优选供应额外的热量以达到期望的工序温度。优选地，期望的糖化温度在醪液形成后15分钟内达到，或更优选地在10分钟内，例如在9、8、7、6、5、4、3、2分钟或甚至更优选在1分钟内达到，或最优选地，在醪液形成时达到期望的糖化温度。糖化工序的温度曲线可以是来自常规糖化工序的曲线，其中温度被设定为实现麦芽酶对碎谷物干物质的最佳降解。

糖化工序通常在温度方面应用受控的逐步增加，其中各步骤偏好一种酶作用胜过其他酶作用，最终降解蛋白质、细胞壁和淀粉。糖化温度曲线通常在本领域中已知。在本发明中，糖化工序中的糖化作用（淀粉降解）步骤优选在60℃～66℃进行，更优选为61℃～65℃，甚至更优选为62℃～64℃，最优选为63℃～64℃。在本发明的具体实施方式中，糖化作用温度是64℃。

在一方面，本发明涉及生产啤酒麦汁的方法，包括向醪液添加在至少65℃温度的糖化条件下有活性的葡糖淀粉酶。在另一方面，葡糖淀粉酶在至少68℃，例如70℃，例如72℃，例如75℃，例如76℃，例如77℃，例如78℃，例如79℃，例如80℃的糖化条件下有活性。

在一方面，本发明的葡糖淀粉酶在麦汁分离和/或醪液过滤过程中有活性。

在一方面，本发明的糖化工序包括但不限于煮浆步骤。在一方面，煮浆步骤包括但不限于在至少65℃的温度下孵育醪液至少20分钟。在一方面，煮浆步骤包括在至少65℃的温度，例如于至少66℃、至少67℃、至少68℃、至少69℃、至少70℃、至少71℃、至少72℃、至少73℃、至少74℃或至少75℃、至少76℃、至少77℃、至少78℃、至少79℃、至少80℃、至少81℃、至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃下，孵育醪液至少20分钟，例如至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少65分钟、至少70分钟、至少75分钟、至少80分钟、至少85分钟、至少90分钟、至少95分钟、至少100分钟、至少105分钟、至少110分钟、至少115分钟、至少120分钟、至少125分钟、至少130分钟、至少135分钟、至少140分钟、至少145分钟，例如至少150分钟。在具体的实施方式中，煮浆在75℃下进行120分钟。

在一方面，醪液的pH在约4.6至约6.4的范围内。在另一方面，pH在约4.6至6.2的范围内，例如在pH约4.8至约6.0间的范围内，优选在pH约5.0至约6.0间的范围内，更优选在pH约5.0至约5.6的范围内，甚至更优选在pH约5.0至约5.4的范围内。

麦芽优选源于选自玉米、大麦、小麦、黑麦、高粱、小米和大米的一种或多种谷粒。优选地，麦芽是大麦麦芽。碎谷物优选包括0.5%～99%，优选1%～95%，更优选5%～90%，甚至更优选10%～80%的麦芽。

除发芽的谷粒外，碎谷物可以优选包含辅料，如未发芽的玉米，或其他未发芽的谷粒，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大米、买罗高粱、小米和/或高粱，或生淀粉和/或精制淀粉和/或得自植物的含糖材料，其中植物为例如小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、买罗高粱、小米、高粱、马铃薯、甘薯、木薯、木薯粉、西米、香蕉、糖用甜菜和/或甘蔗。就本发明而言，辅料可以从块茎、根、茎、叶、豆荚、麦片和/或全谷粒获得。优选的是从玉米和/或大米获得的辅料，更优选地，辅料是大米淀粉、玉米淀粉和/或粗玉米粉。醪液优选包含1%～60%，优选5%～45%，更优选10%～40%的辅料淀粉。辅料还可以包含易发酵的碳水化合物例如糖或糖汁，并且可以在本发明糖化工序之前、之中或之后加至麦芽醪液中，但是优选在糖化工序之后加入。在形成醪液之前，优选将麦芽和/或辅料磨碎，并最优选干磨或湿磨。在一方面，辅料的糊化温度高，更具体地，对于玉米、稻和高粱，具有较高的起始糊化温度。在一方面，辅料在糖化之前进行糊化。在另一方面，辅料在糖化之前不糊化。

在一方面，醪液包含至少20%的淀粉糊化温度（优选起始糊化温度）为至少65℃的辅料。在另一方面，醪液包含至少25%，例如至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%例如至少65%的淀粉糊化温度（优选起始糊化温度）为至少65℃的辅料。

在一方面，醪液包含相对于总碎谷物为至少10%的未发芽谷粒。在另一方面，醪液包含至少15%，例如至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%，例如至少60%的未发芽谷粒。

在本发明的一方面，辅料包括玉米。在本发明的另一方面，醪液包含至少20%的玉米辅料。在一方面，醪液包含至少25%，例如，至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%，例如至少60%的玉米辅料。

在一方面，玉米辅料在添加至醪液时未糊化。

在本发明的一方面，辅料包括大米。在本发明的另一方面，醪液包含至少20%的大米辅料。在一方面，醪液包含至少25%，例如至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%，例如至少60%的大米辅料。

在一方面，大米辅料在添加至醪液时未糊化。

在一方面，葡糖淀粉酶从外源提供和/或存在于醪液中。在一方面，葡糖淀粉酶在糖化开始时引入。在另一方面，葡糖淀粉酶在糖化过程中引入。在另一方面，葡糖淀粉酶在麦汁分离时引入。

在另一优选实施方式中，向醪液添加其他酶，该酶包括但不限于α淀粉酶、异淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、漆酶、木聚糖酶、脂肪酶、含磷脂肪酶（phospholipolase）、植酸酶、植酸钙镁和酯酶。

在方法的一方面，添加的其他酶包括但不限于普鲁兰酶。

在方法的一方面，添加的其他酶包括但不限于淀粉酶，优选但不限于α淀粉酶。

在方法的一方面，添加的其他酶包括但不限于蛋白酶。

在方法的一方面，添加的其他酶包括但不限于纤维素酶。

在方法的一方面，添加的其他酶包括但不限于木聚糖酶。

在方法的一方面，添加的其他酶包括但不限于脂肪酶。

在方法的一方面，添加的其他酶包括但不限于葡聚糖酶，优选但不限于β葡聚糖酶。

在一方面，实施本发明的方法引起麦汁中增加量的葡萄糖。在一方面，当与在没有这些葡糖淀粉酶时所生产的麦汁相比，葡萄糖增加为至少1%，例如至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%。

在一方面，实施本发明的方法得到当与麦汁中总碳水化合物含量相比时含有至少80%葡萄糖的麦汁。在另一方面，当与麦汁的总碳水化合物含量相比时，麦汁含有至少81%的葡萄糖，例如至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少92.5%、至少93%、至少93.5%、例如至少94%的葡萄糖。

在一方面，醪液和/或麦汁不包含添加的葡萄糖糖汁。

在另一方面，实施本发明的方法引起65℃～90℃温度时额外的葡萄糖形成。在一方面，当与在没有这些葡糖淀粉酶时所生产的麦汁相比，在65℃～90℃温度形成的额外葡萄糖为至少1%，例如至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%。

在一方面，实施本发明的方法引起麦汁中降低浓度的麦芽糖。在一方面，当与在没有这些葡糖淀粉酶时所生产的麦汁相比，麦芽糖的浓度降低至少0.5%，例如至少1%，例如至少2%、至少3%、至少4%、至少5%。

在一方面，实施本发明的方法引起麦汁中增加浓度的葡萄糖和降低浓度的麦芽糖。在一方面，当与在没有这些葡糖淀粉酶时所生产的麦汁相比，葡萄糖的浓度增加至少1%，例如至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%，麦芽糖的浓度降低至少0.5%，例如至少1%，例如至少2%、至少3%、至少4%，至少5%。

在一方面，本发明的方法引起缩短的糖化时间。在一方面，与没有这些葡糖淀粉酶时进行的方法相比，该方法引起糖化时间降低至少5分钟，例如至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟，更优选降低至少30分钟。

在一方面，本发明的方法引起低于120分钟的糖化时间。在另一方面，糖化时间低于110分钟，例如低于100分钟，例如低于90分钟、低于80分钟、低于70分钟、低于60分钟、低于50分钟，例如低于40分钟。

在一方面，本发明的方法引起较少的糖化作用时间，即温度为60℃～66℃的糖化过程的时间。在一方面，该时间少于60分钟。在另一方面，时间少于58分钟，例如少于56分钟、少于54分钟、少于52分钟、少于50分钟、少于48分钟、少于46分钟、少于44分钟、少于42分钟、少于40分钟、少于38分钟、少于36分钟、少于34分钟、少于32分钟、少于30分钟、少于28分钟、少于26分钟、少于24分钟、少于22分钟，例如少于20分钟。

在另一方面，本发明的方法引起减少的酶量，特别是葡糖淀粉酶的用量。在一方面，当与现有技术中使用葡糖淀粉酶的方法相比，葡糖淀粉酶用量降低至少10%，例如至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%，例如至少75%。

在糖化过程中，从碎谷物中提取的淀粉逐渐水解成可发酵的糖和更小的糊精。优选地，在提取麦汁之前，醪液是对碘试验为阴性的淀粉。

从醪液获得麦汁通常包括从麦糟中滤出麦汁，麦糟即不溶性谷粒和碎谷物的谷壳材料形成部分。可使热水流通过麦糟，以从碎谷物中冲洗或喷洗出任何残余的提取物。任选地，在本发明的工序中应用热稳定性纤维素酶会引起β-葡聚糖含量的有效下降，以促进麦汁滤出，由此确保循环时间减少且提取回收率高。优选地，提取回收率为至少80%，优选至少81%，更优选至少82%，甚至更优选至少83%，例如至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%，最优选至少91%。

在从碎谷物麦糟中分离麦汁后，可以按原样使用麦汁或将其脱水以提供浓缩的和/或干缩的麦汁。浓缩的和/或干缩的麦汁可以用作酿酒提取物，例如麦芽提取物调味剂，用于非酒精的麦芽饮料、麦芽醋、早餐麦片，用于糖果等。在优选实施方式中，将麦汁发酵，以生产酒精饮料，优选为啤酒，例如，爱尔啤酒、强麦啤酒、比特酒、司陶特啤酒、波特啤酒、拉格啤酒、Export啤酒、麦汁酒、青稞酒、发泡酒、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或淡啤酒。麦汁的发酵可以包括向麦汁中投入含有新鲜酵母（即为先前未用于本发明的酵母）的酵母浆，或者酵母可以是循环利用的酵母。应用的酵母可以是适于啤酒酿造的任何酵母，特别是选自酵母属（Saccharomyces spp.）的酵母，例如酿酒酵母（S.cerevisiae）和葡萄汁酵母（S.uvarum），包括这些生物体的天然或人工产生的变体。用于麦汁发酵以产生啤酒的方法为本领域技术人员所熟知。

本发明的方法可以包括向发酵的麦汁添加二氧化硅水凝胶，以增加啤酒的胶体稳定性。这些方法还可以包括向发酵的麦汁中加入硅藻土并过滤以使啤酒鲜亮。在一个方面，本发明提供由麦汁生产的啤酒，例如通过发酵麦汁生产啤酒而产生的啤酒。啤酒可以是任何类型的啤酒，例如，爱尔啤酒、强麦啤酒、司陶特啤酒、波特啤酒、拉格啤酒、比特酒、Export啤酒、青稞酒、发泡酒、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或淡啤酒。

在一方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列为至少50%相同的氨基酸序列的葡糖淀粉酶在麦汁生产工序中的用途。

在一方面，本发明涉及通过使用本发明方法而生产的麦汁。

在另一方面，本发明涉及使用本发明方法制备的麦汁而得到的啤酒及其生产方法。

酶

应用于本发明中的酶应该根据它们在本发明工序的操作温度下保持充分活性的能力以及它们在醪液的适度酸性pH方案下保持充分活性的能力来进行选择，并且应该以有效量加入。酶可以得自任何来源，优选来自植物或藻类，更优选来自微生物，例如来自于细菌或真菌。

葡糖淀粉酶（EC3.2.1.3）

葡糖淀粉酶（葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，EC3.2.1.3）是催化末端（1->4）-连接的α-D-葡萄糖残基相继从链的非还原端水解同时释出β-D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶也有其他名称，例如4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶；例如，淀粉葡糖苷酶，例如1,4-α-葡糖苷外酶，例如γ-淀粉酶；例如溶酶体α-葡糖苷酶等。

葡糖淀粉酶可以从微生物或植物获得。出于本发明的目的，本文中与给定来源结合使用的术语“得自”应该是指，由核苷酸序列编码的多肽是由该来源或已插入有该来源的核苷酸序列的株系所产生的。在优选的方面，得自给定来源的多肽是分泌到细胞外的。

本发明的葡糖淀粉酶可以是真菌来源。例如，葡糖淀粉酶可以得自酵母，例如假丝酵母属（Candida）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、毕赤酵母属（Pichia）、酵母属（Saccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）或耶氏酵母属（Yarrowia）。优选地，葡糖淀粉酶可以得自丝状真菌，例如支顶孢属（Acremonium）、伞菌属（Agaricus）、链格孢属（Alternaria）、曲霉属（Aspergillus）、短梗霉属（Aureobasidium）、葡萄座腔菌属（Botryospaeria）、拟蜡菌属（Ceriporiopsis）、毛喙壳属（Chaetomidium）、金孢属（Chrysosporium）、麦角属（Claviceps）、旋孢腔菌属（Cochliobolus）、鬼伞属（Coprinopsis）、乳白蚁属（Coptotermes）、棒囊壳属（Corynascus）、隐丛赤壳属（Cryphonectria）、隐球菌属（Cryptococcus）、色二孢属（Diplodia）、黑耳属（Exidia）、线黑粉酵母属（Filibasidium）、镰孢属（Fusarium）、赤霉属（Gibberella）、全鞭毛虫属（Holomastigotoides）、腐质霉属（Humicola）、耙齿菌属（Irpex）、香菇属（Lentinula）、小球腔菌属（Leptospaeria）、梨孢菌属（Magnaporthe）、Melanocarpus属、亚灰树花菌属（Meripilus）、毛霉属（Mucor）、毁丝霉属（Myceliophthora）、新考玛脂霉属（Neocallimastix）、脉孢菌属（Neurospora）、拟青霉属（Paecilomyces）、青霉属（Penicillium）、平革菌属（Phanerochaete）、瘤胃壶菌属（Piromyces）、Poitrasia属、假黑盘菌属（Pseudoplectania）、假披发虫属（Pseudotrichonympha）、根毛霉属（Rhizomucor）、裂褶菌属（Schizophyllum）、节格孢属（Scytalidium）、篮状菌属（Talaromyces）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、梭孢壳属（Thielavia）、弯颈霉属（Tolypocladium）、木霉属（Trichoderma）、长毛盘菌属（Trichophaea）、轮枝孢属（Verticillium）、小包脚菇属（Volvariella）、或炭角菌属（Xylaria）的具有葡糖淀粉酶活性的多肽。

在另一优选方面，葡糖淀粉酶得自解纤维枝顶孢（Acremoniumcellulolyticus）、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）、泡盛曲霉（Aspergillusawamori）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、臭曲霉（Aspergillus foetidus）、日本曲霉（Aspergillus japonicus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉、米曲霉（Aspergillus oryzae）、嗜角质金孢子菌（Chrysosporiumkeratinophilum）、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌（Chrysosporium tropicum）、Chrysosporium merdarium、Chrysosporiuminops、租金孢子菌（Chrysosporium pannicola）、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢（Fusariumbactridioides）、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、尖镰孢（Fusarium culmorum）、禾谷镰孢（Fusarium graminearum）、禾赤镰孢（Fusarium graminum）、异孢镰孢（Fusarium heterosporum）、合欢木镰孢（Fusarium negundi）、尖孢镰孢（Fusarium oxysporum）、网状镰孢（Fusarium reticulatum）、粉红镰孢（Fusarium roseum）、接骨木镰孢（Fusarium sambucinum）、肤色镰孢（Fusarium sarcochroum）、拟分枝孢镰孢（Fusarium sporotrichioides）、硫色镰孢（Fusarium sulphureum）、圆镰孢（Fusarium torulosum）、拟丝孢镰孢（Fusarium trichothecioides）、镶片镰孢（Fusarium venenatum）、灰腐质霉（Humicola grisea）、特异腐质霉（Humicola insolens）、柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa）、白耙齿菌（Irpex lacteus）、米赫毛霉（Mucor miehei）、嗜热毁丝菌（Myceliophthora thermophila）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、绳状青霉（Penicillium funiculosum）、产紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、托姆青霉（Penicillium thomii）、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、无色梭孢壳（Thielavia achromatica）、Thielavia albomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢壳（Thielavia australeinsis）、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳（Thielavia microspora）、卵孢梭孢壳（Thielavia ovispora）、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳（Thielavia spededonium）、毛梭孢壳（Thielavia setosa）、耐热梭孢壳（Thielavia subthermophila）、太瑞斯梭孢壳（Thielavia terrestris）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、康宁木霉（Trichoderma koningii）、长梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）、里氏木霉（Trichoderma reesei）或绿色木霉（Trichoderma viride）。

在更优选的方面，葡糖淀粉酶得自草酸青霉。在最优选的方面，葡糖淀粉酶是具有葡糖淀粉酶活性的草酸青霉多肽，例如包含SEQ IDNO:1的多肽。

应当理解的是，就前文所述的物种而言，本发明涵盖完美和不完美的状态，以及分类学上的其他等同物，例如无性型，不管它们已知的种名是什么。本领域技术人员将很容易地识别出合适的等同物的身份。

公众可以在若干保藏机构容易地获取这些物种的菌株，这些机构为诸如美国典型培养物保藏中心（ATCC）、德意志微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）、真菌菌种保藏中心（CBS）和农业研究服务专利培养物保藏中心北方区域研究中心（NRRL）。

此外，这些多肽可以使用领域内已知的技术，例如使用编码多肽的多核苷酸作为探针，从其他来源，包括从自然界（例如，土壤、堆肥、水等）分离的微生物中鉴定并获得。用于从天然生境分离微生物的技术为本领域内公知。随后，多核苷酸可以通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够通过使用本领域普通技术人员熟知的技术来分离或克隆多核苷酸（参见，例如，Sambrook等人（1989）Molecular cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor,NY）。

在一方面，葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列为至少50%相同的氨基酸序列，例如至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者甚至至少99%相同。

在优选的实施方式中，葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO:1氨基酸序列的差别不超过100个氨基酸，优选不超过80个氨基酸，更优选不超过50个氨基酸，更优选不超过30个氨基酸，甚至更优选不超过20个氨基酸，最优选不超过10个氨基酸的氨基酸序列。

在一方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列为至少50%相同，例如至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者甚至至少99%相同的氨基酸序列的葡糖淀粉酶在麦汁生产工序中的用途。

在一方面，葡糖淀粉酶的最适温度为至少65℃。在另一方面，最适温度为至少66℃，例如为至少67℃，例如至少68℃，至少69℃、至少70℃、至少71℃、至少72℃、至少73℃、至少74℃、至少75℃、至少76℃、至少77℃、至少78℃、至少79℃，例如至少80℃，该最适温度通过酶在32～85℃、pH5.0～6.0下孵育1小时的过程中释放出葡萄糖的能力而确定。在一方面，孵育pH为6.0。在另一方面，pH为5.8。在一方面，pH为5.6。在另一方面，pH为5.4。在一方面，pH为5.2。在另一方面，pH为5.0。

在一个实施方式中，葡糖淀粉酶的最适温度为约65～75℃，如实施例No:1中所描述的，通过酶在32～85℃、pH6.0下孵育1小时的过程中释出葡萄糖的能力来确定最适温度。

在一个实施方式中，葡糖淀粉酶的残余活性为至少10%，例如至少11%，例如12%，例如13%，例如14%，例如15%，例如16%，例如17%，例如18%，例如19%，例如20%，例如至少21%，例如22%，例如23%，例如24%，例如25%，例如26%，例如27%，例如28%，例如29%，例如30%，例如31%，例如32%，残余活性如实施例No:1中所描述的，通过酶在pH6.0下释出葡萄糖的能力而加以确定，其中释放葡萄糖的能力通过使用麦芽糊精作为底物以形成葡萄糖来测量。

在一方面，葡糖淀粉酶以相对于每克总碎谷物为约0.0005至约200mg酶蛋白的浓度添加，优选为相对于每克碎谷物总重为约0.001至约100mg酶蛋白（EP），更优选为约0.01至约50mg酶蛋白（EP），甚至更优选为约0.05至约2.0mg酶蛋白（EP）。

在一方面，添加的葡糖淀粉酶的浓度低于每克总碎谷物0.4mg酶蛋白（EP）。在另一方面，葡糖淀粉酶的浓度低于每克总碎谷物0.35mg酶蛋白（EP），例如低于0.3mg酶蛋白（EP），例如低于0.25mg酶蛋白（EP），例如低于0.2mg酶蛋白（EP），例如低于0.15mg酶蛋白（EP）。

普鲁兰酶（EC3.2.1.41）

普鲁兰酶（EC3.2.1.41）催化普鲁兰多糖、支链淀粉和糖原中以及支链淀粉和糖原的α-和β-极限糊精中的（1->6）-α-D-糖苷键的水解。这些酶原来是EC3.2.1.69。它们又称为α-糊精内切-1,6-α-葡糖苷酶或支链淀粉6-葡聚糖水解酶或脱支酶或极限糊精酶或普鲁兰多糖6-葡聚糖水解酶。

根据本发明的普鲁兰酶优选为来自例如火球菌属（Pyrococcus）或芽孢杆菌属（Bacillus）例如嗜酸普鲁兰芽胞杆菌（Bacillusacidopullulyticus）的普鲁兰酶，例如在Kelly等人,1994,FEMS Microbiol.Letters115:97-106中记载的那种，或者是可从Novozymes A/S以Promozyme400L得到的普鲁兰酶。普鲁兰酶也可来自长野芽孢杆菌（Bacillus naganoencis）或Bacillus deramificans，例如得自Bacillusderamificans（US专利5,736,375）。普鲁兰酶也可以是来自例如芽孢杆菌菌株的工程化普鲁兰酶。

其他普鲁兰酶可以源自PCT/DK91/00219中记载的沃氏火球菌（Pyrococcus woesei），或者普鲁兰酶可以源自PCT/DK92/00079中记载的闪烁杆菌属（Fervidobacterium sp.）Ven5，或者普鲁兰酶可以源自PCT/DK95/00097中记载的速生热球菌（Thermococcus celer），或者普鲁兰酶可以源自PCT/DK95/00211中记载的Pyrodictium abyssei，或者普鲁兰酶可以源自PCT/DK95/00095中记载的费尔维多菌（Fervidobacterium pennavorans），或者普鲁兰酶可以源自PCT/DK95/00098中记载的Desulforococcus mucosus。

最优选地，普鲁兰酶得自嗜酸普鲁兰芽胞杆菌。用于本发明工序和/或组合物中的优选普鲁兰酶是具有与在WO2009075682公开的普鲁兰酶3的序列为至少50%相同，例如至少55%，例如至少60%，例如至少65%，例如至少66%，例如至少70%，例如至少75%，例如至少80%，例如至少85%，例如至少86%，例如至少87%，例如至少88%，例如至少89%，例如至少90%，例如至少91%，例如至少92%，例如至少93%，例如至少94%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%或者甚至100%相同的氨基酸序列的普鲁兰酶。

普鲁兰酶可以以本领域技术人员熟知的有效量进行添加。在一方面，普鲁兰酶以0.1～3PUN/g DM，例如0.2～2.9，例如0.3～2.8，例如0.3～2.7，例如0.3～2.6，例如0.3～2.5，例如0.3～2.4，例如0.3～2.3，例如0.3～2.2，例如0.3～2.1，例如0.3～2.0，例如0.3～1.9，例如0.3～1.8，例如0.3～1.7，例如0.3～1.6的用量添加，最优选地，普鲁兰酶以例如0.3～1.5，优选0.4～1.4，更优选0.5～1.3，更优选0.6～1.2，更优选0.7～1.1，更优选0.8～1.0，更优选0.9～1.0的用量添加。在本发明的具体实施方式中，酶以0.3PUN/g DM，例如0.4PUN/g DM，例如0.5PUN/g DM添加，在本发明的特别优选的实施方式中，酶用量不大于1PUN/g DM。

一个普鲁兰酶单位（PUN）是在标准条件下（即，在40℃和pH5.0下30分钟反应时间之后；并用0.2%普鲁兰多糖作为底物）水解普鲁兰多糖，每分钟释放还原力相当于1umol葡萄糖的还原性碳水化合物的酶量。普鲁兰酶活性是通过在以下条件检测增加的还原糖容量（Somogyi-Nelson反应）而测量的：底物：0.2%普鲁兰多糖，pH5.0，反应20时间30分钟。样品用分光光度计在OD520nm分析。

在一方面，本发明的方法同时包含葡糖淀粉酶和普鲁兰酶。

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）

用在本发明的方法和/或组合物中的特定α-淀粉酶可以是芽孢杆菌α-淀粉酶。公知的芽孢杆菌α-淀粉酶包括源自地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）和嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）菌株的α-淀粉酶。在本发明的一方面，考虑的芽孢杆菌α-淀粉酶是WO99/19467第3页第18行至第6页第27行中所定义的α-淀粉酶。优选地，α-淀粉酶与WO99/19467中具有突变I181*+G182*+N193F的公开为SEQ ID NO：3的氨基酸序列所示氨基酸序列具有至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，优选至少85%，更优选至少90%，优选至少91%，优选至少92%，优选至少93%，优选至少94%，更优选至少95%，优选至少96%，优选至少97%，更优选至少98%，最优选至少99%的同一性。同时考虑的是Novozymes A/S的淀粉酶SC。用于本发明工序中的另一特定α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉酶，例如源自曲霉属菌种的α-淀粉酶，优选来自于黑曲霉的菌株。特别考虑的是表现出与WO2002/038787中示为SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有高度同一性的真菌α-淀粉酶，即为至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%或者甚至至少90%的同一性。

添加的α-淀粉酶的量取决于多种参数，并为本领域技术人员普遍知晓。在一方面，醪液中的α-淀粉酶活性为0.1～1.0KNU/g，更优选为0.2～0.4KNU/g，最优选为0.25～0.35KNU/g干重谷物。一千克Novoα淀粉酶单位（KNU）等于1000NU。一个KNU定义为在标准条件下（即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；pH5.6）将5.26g淀粉干物质（MerckAmylum solubile）糊精化的酶量。

异淀粉酶（E.C.3.2.1.68）

应用于本发明工序和/或组合物的另一种酶可以是可替代的脱支酶，例如异淀粉酶（E.C.3.2.1.68）。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-糖苷分支键，并且可以通过异淀粉酶不能作用于普鲁兰多糖以及对α-极限糊精的有限作用而区别于普鲁兰酶。异淀粉酶可以以本领域技术人员公知的有效量加入。

蛋白酶

合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌蛋白酶和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，以在低于pH7的酸性条件下水解蛋白质的能力为特征的蛋白酶。蛋白酶负责将醪液中的高分子量蛋白的全长降低成低分子量蛋白。低分子量蛋白对于酵母营养是必需的，而高分子量蛋白保证起泡稳定性。因此，技术人员熟知蛋白酶应该以平衡量加入，其同时保证对酵母的足量的游离氨基酸，并留下足够的高分子量蛋白以使泡沫稳定。在一方面，蛋白酶活性通过具有合适FAN产生活性的蛋白水解酶体系来提供，包括内切蛋白酶、外肽酶或其任意组合，优选金属蛋白酶。优选地，蛋白酶与WO9967370中记载的SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少50%同一性，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选至少98%，最优选至少99%或甚至100%的同一性。在另一方面，蛋白酶是可从Novozymes A/S得到的

。蛋白酶可以以0.0001～1000AU/kg DS的量添加，优选为1～100AU/kg DS，最优选为5～25AU/kg干重谷物。蛋白水解活性可以通过使用变性的血红蛋白作为底物而加以确定。在确定蛋白水解活性的Anson-Hemoglobin方法中，使变性血红蛋白消化，并用三氯乙酸（TCA）沉淀未消化的血红蛋白。TCA可溶产物的量通过使用酚试剂而加以确定，其与酪氨酸和色氨酸形成蓝色。一个Anson单位（AU）定义为在标准条件下（即，25℃，pH7.5和10分钟反应时间）以下述初始速率消化血红蛋白的酶量，该初始速率使得每分钟释放的TCA可溶产物的量与酚试剂形成的颜色和一毫当量酪氨酸与酚试剂形成的颜色相同。

纤维素酶（E.C.3.2.1.4）

纤维素酶可以是微生物来源，例如源自丝状真菌（例如，曲霉属、木霉属、腐质霉属、镰孢属）的菌株。纤维素酶的具体实例包括可从特异腐质霉获得且还由WO91/17244图14中氨基酸序列以及WO91/17243中记载的43kD特异腐质霉内切葡聚糖酶所定义的内切葡聚糖酶（内切葡聚糖酶I）。

用于本发明工序的特定纤维素酶可以是内切葡聚糖酶，例如内切-1,4-β-葡聚糖酶。特别考虑的是WO2003/062409中SEQ ID NO：2所示的β-葡聚糖酶和同源序列。可以使用的市售纤维素酶制剂包括

和（可从Novozymes A/S获得）、LAMINEX^TM和

CP（可从Genencor Int.获得）以及

7069W（可从

Germany获得）。β-葡聚糖酶可以以1.0～10000 BGXU/kg DS，优选10～5000BGXU/kg DS，优选50～1000 BGXU/kg DS且最优选100～500 BGXU/kgDS的量加入。

一个β葡聚糖酶单位（BGXU）对应于在标准条件下（在30℃、pH4.40下孵育10分钟）每分钟产生1μm还原性糖所需的酶量。

木聚糖酶

木聚糖酶为领域内已知。在一方面，木聚糖酶活性通过糖基水解酶家族10的木聚糖酶提供。在一方面，木聚糖酶与WO94/21785中记载的木聚糖酶具有至少50%同一性，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选至少98%，最优选至少99%或者甚至100%同一性。在另一方面，木聚糖酶是来自Novozymes A/S的

优选醪液中的木聚糖酶活性是0.02～0.1FXU（S）/g干重谷物，更优选为0.04～0.08FXU（S）/g干重谷物。

木聚糖降解活性可以用FXU（S）单位来表示，在pH6.0下使用雷马-木聚糖（用雷马亮蓝（Remazol Brilliant Blue）R染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖，Fluka）作为底物进行确定。将木聚糖酶样本与雷马-木聚糖底物共孵育。用乙醇沉淀掉未降解的染色底物的背景。保留在上清中的蓝色（用分光光度法在585nm测定）与木聚糖酶活性成比例，然后相对于在标准反应条件下的酶标准品来确定木聚糖酶单位，标准反应条件即为：底物浓度0.45%w/v，酶浓度0.04～0.14FXU（S）/mL，50.0℃和pH6.0，30分钟反应时间。以FXU（S）为单位的木聚糖酶活性相对于Novozymes FXU（S）酶标准品（得自Novozymes）而测量，酶标准品包括单成分木聚糖酶制剂，得自棘孢曲霉的

脂肪酶

脂肪酶为领域内已知。在一个实施方式中，脂肪酶活性通过对甘油三酯和/或半乳糖脂和/或磷脂具有活性的脂肪酶提供。优选地，脂肪酶活性由来自镰孢属（包括尖孢镰孢和异孢镰孢）、曲霉属（包括塔宾曲霉（A.tubigensis））、根霉属（Rhizopus）（包括米根霉（R.oryzae））或嗜热真菌属（Thermomyces）（包括疏棉状嗜热丝孢菌（T.lanuginosus））或其变体的脂肪酶提供。实例是Lipopan X（Lipopan Xtra），疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的变体（具有替换G91A+D96W+E99K+P256V+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F（+274S），其在WO2004099400A2中记载）。在另一方面，脂肪酶是来自尖孢镰孢的脂肪酶/磷脂酶，其在EP869167中记载，可以从Novozymes A/S以F得到。在本发明的特别优选的实施方式中，脂肪酶是Lipozyme

或

该脂肪酶对过滤速度和浑浊降低具有明显较好的作用，并可从Novozymes A/S,Denmark得到。脂肪酶也可以是

其是Lipozyme的变体，可从NovozymesA/S Denmark得到。脂肪酶降解来自大麦的脂类，例如将甘油三酯降解成部分甘油酯和游离脂肪酸。这引起较低的浊度以及大大改善的醪液过滤和麦汁分离特性。优选地，醪液中脂肪酶的活性为0～50LU/g干重谷物，例如0～40LU/g干重谷物，例如0～30LU/g干重谷物，例如0～20LU/g干重谷物。一个脂肪酶单位（LU）是在30.0℃、pH7.0下使用阿拉伯胶作为乳化剂并使用三丁酸甘油酯作为底物，每分钟释放出1μm可滴定丁酸的酶量。

酶可以以酶组合物进行添加。它们可以由一种酶或多于一种的酶或多于一种的酶组合物组成。除酶之外，酶组合物还可以含有至少一种其他物质，例如但不限于缓冲剂、表面活性剂等。酶组合物可以是领域知晓的任何形式，例如，固体、液体、乳液、凝胶或糊状物。这些形式为本领域技术人员已知。在本发明的一个方面，可以添加多于一种的酶组合物，各自包含不同的酶。在本发明的另一方面，可以添加一种含有所有必需酶的酶组合物。在本发明的又一方面，可以添加一种包含一些酶的酶组合物以及至少一种含有一些或所有剩余酶的另一组合物。酶可以同时添加，或者按顺序先后添加，或者甚至作为两种酶的组合，且一种酶分别先后添加。

本发明在以下实施例中进一步说明，这些实施例并不意在以任何方式限制所要求保护的本发明范围。

材料和方法：

葡糖淀粉酶活性：

葡糖淀粉酶活性可以以AGU单位进行测量。

葡糖淀粉酶单位（AGU）定义为在标准条件下（37℃，pH4.3，底物：麦芽糖100mM，缓冲剂：乙酸盐0.1M，反应时间6分钟，如在以下葡糖淀粉酶孵育中列出的）每分钟水解1μm麦芽糖从而生成葡萄糖的酶量。

葡糖淀粉酶孵育：
		底物：	麦芽糖100mM
缓冲剂：	乙酸盐0.1M
		pH：	4.30±0.05
孵育温度	37℃±1
		反应时间：	6分钟
酶工作范围：	0.5～4.0AGU/mL

分析原理通过3个反应步骤进行描述：

步骤1是酶反应：

葡糖淀粉酶，EC3.2.1.3（外切-α-1,4-葡聚糖-葡糖水解酶）水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。在孵育后，用NaOH终止反应。

步骤2和步骤3引起终端反应：

葡萄糖在由己糖激酶催化的反应中由ATP磷酸化。形成的葡糖-6-磷酸通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡糖酸。在同一反应中，等摩尔量的NAD⁺还原为NADH，引起在340nm的吸光度增加。可以使用自动分析系统例如Konelab30分析仪（Thermo Fisher Scientific）。

用作缓冲剂和底物的化学品是至少试剂级别的市售产品。

酶：

使用标准重组技术例如在WO2011/127802中的重组技术来制得Seq ID No:1、Seq ID No:2、Seq ID No:3和Seq ID No:4的葡糖淀粉酶。

实施例

实施例1：葡糖淀粉酶的最适温度

不同序列的葡糖淀粉酶的最适温度通过酶在32～85℃和pH6.0下的孵育过程中所释出葡萄糖的能力而确定。使用4种不同的葡糖淀粉酶，Seq ID No:1、Seq ID No:2、Seq ID No:3、Seq ID No:4。将10μL酶溶液（0.5mg葡糖淀粉酶/mL于10mM NaOAc缓冲剂中，pH6.0，含有0.02%Triton X-100）与190μL底物溶液（10.5%麦芽糊精DE11于50mM NaOAc中）混合。将混合物于32、55、60、65、70、80或85℃孵育1小时。孵育后，对于所有样品将10μL样本与190μL Milli-Q水（×20稀释）混合，但32℃孵育的样本仅稀释×5。样本中葡萄糖浓度（mg/mL）通过酶催化的变旋酶-GOD检定（Wako Autokit Glucose，439-90901）来确定。

将10μL稀释样本转移至96孔板，加入200μL终止试剂并测量505nm的吸光度。应用葡萄糖标准曲线将吸光度转换成mg/mL葡萄糖。结果列表于以下表1中：

表1：在pH6.0下通过使用麦芽糊精作为底物形成葡萄糖（mg/mL）而测量的葡糖淀粉酶的最适温度。

根据该表，显示出，Seq ID No1的葡糖淀粉酶显示出比所测定的其他葡糖淀粉酶（60～65℃）更高的最适温度（70℃）。

实施例2：多种葡糖淀粉酶在麦汁生产中的作用

一式两份进行糖化，并缩小规模以模拟典型的实验室规模糖化布置。将碎玉米和良好溶解的麦芽研磨，粒径为0.2mm。将0.150g碎玉米和0.015g良好溶解的麦芽与添加有100ppm Ca²⁺的660μL水混合。根据以下流程（谷物蒸煮）将此部分在振荡（1200rpm）下孵育：45℃10分钟，以每5分钟5℃升高至80℃，80℃孵育5分钟，以每5分钟5℃升高至90℃，90℃下孵育10分钟。向此溶解的玉米部分添加666.7μL含有60ppm Ca²⁺和0.169g良好溶解麦芽的水。根据表2和表3，将上述不同来源的葡糖淀粉酶添加至醪液，进行和不进行模拟的麦汁分离。

如下进行糖化作用：64℃2小时，以每5分钟5℃升高至75℃，75℃孵育15分钟。孵育通过冷却至20℃而终止或通过将温度升高至78℃而继续并在冷却至20℃之前再孵育2小时（模拟的麦汁分离）。在终止孵育后，将各样本的重量调节至总共2.0g，将样本在14,000rpm下离心5分钟，并通过HPLC对上清（麦汁）分析提取水平和糖分布。结果列于以下表2中。术语“DP1”（聚合度1）表示葡萄糖或果糖，“DP2”表示麦芽糖且DP3表示麦芽三糖。术语“DP4+”或“DP4/4+”表示糊精或者聚合度为4或更高的麦芽低聚糖。

表2：在模拟麦汁分离的糖化结束时得到的麦汁的糖分布（占总量的百分比）

^a包括少量果糖。

根据表2，可以看出，在后接模拟麦汁分离的糖化中，Seq ID No1的葡糖淀粉酶的表现优于其他葡糖淀粉酶。相比于Seq ID No2的葡糖淀粉酶，为达到相同的DP4+水平，只需要一半量的Seq ID No1的葡糖淀粉酶。

表3：在不进行模拟麦汁分离的糖化结束时得到的麦汁的糖分布（占总量的百分比）

^a包含少量果糖。

根据上表3，显示出在不进行模拟麦汁分离时，Seq ID No1的葡糖淀粉酶的表现并不优于Seq ID No2的葡糖淀粉酶。

实施例3：麦汁分离温度和pH对DP1部分的浓度的影响

使用55%麦芽/45%玉米并使用4小时的糖化作用时间来进行实验。Seq ID No1的葡糖淀粉酶以0.3mg EP/总碎谷物（1.44AGU/总碎谷物）的量使用。研究了变化的麦汁分离温度和pH对DP1部分的作用。结果在以下表4中给出：

表4：变化的麦汁分离温度和pH对DP1部分的浓度的影响。

实施例4：葡糖淀粉酶结合普鲁兰酶的作用

一式两份进行糖化实验，并缩小规模以模拟典型的实验室规模糖化布置。将碎玉米和良好溶解的麦芽研磨，粒径为0.2mm。将0.150g碎玉米和0.015g良好溶解的麦芽与添加有100ppm Ca²⁺的660μL水混合。根据以下流程（谷物蒸煮）将此部分在振荡（1200rpm）下孵育：45℃10分钟，以每5分钟5℃升高至80℃，80℃孵育5分钟，以每5分钟5℃升高至90℃，90℃孵育10分钟。向此溶解的玉米部分添加666.7μL含有60ppm Ca²⁺和0.169g良好溶解麦芽的水。

此刻根据表5添加外源供应的酶。

使用的普鲁兰酶具有WO2009075682中公开的序列ID No3。

如下进行糖化作用：64℃2小时，以每5分钟5℃升高至75℃，75℃孵育15分钟。孵育通过冷却至20℃而终止或者通过将温度升高至78℃而继续并从而在冷却至20℃之前再孵育2小时（模拟的麦汁分离）。在终止孵育后，将各样本的重量调节至总共2.0g，将样本在14,000rpm下离心5分钟，并通过HPLC对上清（麦汁）分析提取水平和糖分布。表5.使用葡糖淀粉酶连同和不连同普鲁兰酶处理的醪液的麦汁糖分布。

结果清楚地表明了在糖化中除葡糖淀粉酶外添加普鲁兰酶的益处。