KR20240060703A - 사료 첨가제 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

사료 첨가제 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20240060703A
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마리옹 베르나르도
마이클 페리
샤를로테 호르스만스 풀센
알렉산더 베켈레-이트바렉
커스티 깁스
퀀스 게르다 작서
제프리 마이슈
아담 로젠탈
멜라니 브레넌
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인터내셔널 엔＆에이치 덴마크 에이피에스
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Abstract

특히, 복합생균제(DFM) 및 다른 물질을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물뿐만 아니라 대상체 성능 및 균형잡힌 장내 미생물의 유지를 개선시키기 위해 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

Description

사료 첨가제 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2021년 9월 27일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/248,657호, 2021년 9월 27일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/248,668호 및 2022년 8월 11일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/397,189호에 대해 우선권을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문에 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
기술분야
본 명세서에서, 특히, 괴사성 장염 및/또는 콕시듐증의 치료 및 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 및 예방하는 방법 및 조성물이 제공된다.
괴사성 장염(necrotic enteritis: NE)으로 인해 전 세계 가금 산업에 연간 대략 60억 달러의 비용이 소요되는 것으로 추정된다(Poultry Federation, 2019). NE는 전 세계 육계의 40%에 영향을 미치며, 조류(bird)당 대략 $0.050 내지 0.063 USD의 비용이 든다. 10 내지 25%의 사망률과 관련된 급성 임상 질환으로부터 조류 성장 성능(체중 증가 및 사료요구율(feed conversion ratio))을 방해하고 낮은 사망률(0.5 내지 2%)을 야기하는 보다 만성적인 무증상(sub-clinical) 감염까지의 상이한 수준의 NE 중증도가 있다.
항생제 내성은, 특히 대규모 농업 및 육류 생산과 관련하여 2019년 WHO가 선정한 전세계 인류 건강을 위협하는 상위 10개 목록에 포함되어 있다. 미국 식품의약국(FDA)에 따르면, 판매되는 항생제의 80%가 가축에 사용된다. 다수의 국가에서, 가축 생산에서 항생제 사용 금지가 이미 실행되었고, 다른 곳에서는 업계가 성장 촉진용 항생제(antibiotic growth promoter: AGP)를 사용하는 것을 중단하도록 소비자가 압박을 가하고 있다. 성장 촉진용 항생제 사용의 갑작스러운 중단으로 축산업은 큰 압박을 받고 있다.
가금류 시스템에서 항생제를 전세계적으로 제거하려는 경향은 영양사와 수의사에게 계속해서 상당한 어려움을 만들어 내고 있다. NE 및 콕시듐증은 항생제 생산 감소의 상위 두 가지 우려사항이다. 항생제 방어선이 없으면, 장 건강 관련 질환(임상 및 무증상 둘 다)에 대한 동물의 감수성이 증가된다. 이는 불량한 동물 수행으로 이어진다. 세계의 많은 지역에서 AGP가 10년 넘게 무료로 제공되고 있음에도 불구하고(예를 들어, E.U), 가축 생산자는 일관되고 신뢰할 수 있는 항생제 대체품의 부족으로 인해 계속 좌절하고 있다.
가축 생산에서 AGP를 대체하기 위한 현재의 사료 첨가제, 예컨대, 산성화제, 미네랄, 프리바이오틱스, 복합생균제(direct fed microbial: DFM; 프로바이오틱스로도 불림), 뉴클레오타이드 및 식물 추출물(Liu et al., 2018, Animal Nutrition, 4: 113-125))은 모두 항생제(대략 95%)보다 훨씬 더 낮은 효능(50% 미만)을 나타낸다. 따라서, 항생제 내성 증가와 관련된 부정적인 영향을 수반하지 않고 가축의 건강과 성능을 유지할 수 있는 항생제에 대한 대안을 찾아야 하는 충족되지 않은 커다란 필요성이 있다.
본 명세서에 개시된 주제는 이러한 요구를 해결하고 추가의 이점도 제공한다.
특히, 복합생균제(DFM) 및 다른 물질을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물뿐만 아니라 대상체 성능 및 건강하고/하거나 균형잡힌 장내 미생물의 유지를 개선시키기 위해 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
따라서, 일부 양상에서, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 포함하는 복합생균제(DFM)를 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 사료 첨가제 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 삼투 조절자를 더 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 적어도 1종의 에센셜 오일을 더 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제(phytase) 및 아밀라제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 더 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 효소는 캡슐화되거나, 과립형이거나, 냉동 건조된다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 삼투 조절자는 베타인을 포함한다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 에센셜 오일은 신남알데하이드(cinnamaldehyde), 카바콜(carvacol) 및/또는 티몰(thymol)을 포함한다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 적어도 1종의 추가적인 DFM을 더 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트 및/또는 B 비타민 중 하나 이상을 더 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어진다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, B 비타민은 비타민 B1, B6 및/또는 B12 중 하나 이상이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 조성물의 적어도 하나의 성분은 워터라인(water line) 전달용으로 제형화된다.
다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 조성물을 포함하는 동물 사료 또는 프리믹스(premix)가 본 명세서에 제공된다.
추가 양상에서, 유효량의 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 조성물 또는 임의의 동물 사료 또는 프리믹스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 괴사성 장염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 괴사성 장염을 치료 또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가금 또는 돼지이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 가금은 육계 또는 산란계 또는 칠면조이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 돼지는 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 괴사성 장염 장 병변을 감소시키거나 예방한다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 유효량의 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 조성물 또는 본 명세서에 개시된 임의의 동물 사료 또는 프리믹스가 투여된 적이 없는 대상체에 비해서, 추가로 대상체의 사료요구율을 감소시키거나, 사료효율(feed efficiency)을 증가시키거나, 사망률을 감소시키거나, 최종 도살 체중(final slaughter weight)을 증가시키거나, 체중 증가를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 대상체는 임상 또는 무증상 괴사성 장염을 갖는다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB)의 발현을 감소시킨다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 워터라인에 의해 투여된다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 투여는 대상체에 대한 항생제의 공동 투여 없이 수행된다.
또한 추가 양상에서, 유효량의 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 조성물 또는 임의의 동물 사료 또는 프리믹스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 콕시듐증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 콕시듐증을 치료 또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가금이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 가금은 육계 또는 산란계이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 대상체의 사료요구율을 감소시키거나, 사료효율을 증가시키거나, 사망률을 감소시키거나, 최종 도살 체중을 증가시키거나, 체중 증가를 증가시킨다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1가지 이상의 장내 아이메리아(Eimeria) 종을 감소시킨다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물의 적어도 하나의 성분은 워터라인에 의해 투여된다.
다른 양상에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스(C. perfringens) 세포와 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민 및/또는 비피도박테리움 애니멀리스(B. animalis) 또는 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus) 중 하나 또는 둘 다의 분비체 중 하나 이상을 접촉시키는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 퍼프린젠스에서 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB) 발현을 감소시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, B 비타민은 비타민 B1, B6 및/또는 B12 중 하나 이상이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 비피도박테리움 애니멀리스는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04이고/이거나, 락토바실러스 아시도필루스는 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금의 장에 위치된다. 일부 실시형태에서, 가금은 닭, 메추라기, 오리, 거위, 에뮤(emu), 오스트리케(ostriche), 꿩 또는 칠면조이다. 일부 실시형태에서, 닭은 육계 또는 산란계이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 삼투 조절자 및/또는 적어도 1종의 에센셜 오일 중 하나 이상을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼투 조절자는 베타인을 포함한다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 에센셜 오일은 신남알데하이드, 카바콜 및/또는 티몰을 포함한다.
추가 양상에서, 유효량의 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 조성물 또는 본 명세서에 개시된 임의의 동물 사료 또는 프리믹스를 투여하는 단계를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB) 발현의 감소를 필요로 하는 대상체의 클로스트리듐 퍼프린젠스의 괴사성 장염 B-유사 독소 발현을 감소시키는 방법이 본 명세서에 제공되되, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 대상체의 장에 위치된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가금 또는 돼지이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 가금은 육계 또는 산란계 또는 칠면조이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 돼지는 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지이다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 괴사성 장염 장 병변을 감소시키거나 예방한다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 유효량의 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 조성물 또는 본 명세서에 개시된 임의의 동물 사료 또는 프리믹스 조성물이 투여된 적이 없는 대상체에 비해서, 추가로 대상체의 사료요구율을 감소시키거나, 사료효율을 증가시키거나, 사망률을 감소시키거나, 최종 도살 체중을 증가시키거나, 체중 증가를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 대상체는 임상 또는 무증상 괴사성 장염을 갖는다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 워터라인에 의해 투여된다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 일부 실시형태에서, 상기 투여는 대상체에 대한 항생제의 공동 투여 없이 수행된다.
본 명세서에 기술된 양상 및 실시형태 각각은 실시형태 또는 양상의 맥락으로부터 명시적으로 또는 명백하게 제외되지 않는 한, 함께 사용될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 다양한 특허, 특허 출원 및 기타 유형의 간행물(예를 들어, 저널 기사, 전자 데이터베이스 항목 등)이 참조된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 기타 간행물의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
도 1a는 연구 처리당 조류의 평균 최종 도살 체중(D42)을 나타내는 상자 그림을 도시한다. 각 점은 처리 내의 반복 펜(replicate pen)을 나타낸다. 유의도는 시험감염 대조군(Challenged control: CC)과 비교할 때 P<0.05로 결정된다. 도 1b는 연구 처리당 조류의 평균 사료요구율(FCR)(D42)을 나타내는 상자 그림을 도시한다. 각 점은 처리 내의 반복 펜을 나타낸다. 유의도는 시험감염 대조군(CC)과 비교할 때 P<0.05로 결정된다.
도 2a는 D21에 처리에 따라 0 내지 4 점수 시스템에 기반한 개별 조류 괴사성 장염 병변 점수를 도시한다. 처리당 24마리의 조류를 평가하였다. NE 병변이 가장 적은 처리에는 베타인, EO 및 DFM만이 포함된다. 도 2b는 D28에 처리에 따른 조류의 평균 체중을 나타내는 상자 그림을 도시한다. 각 점은 처리 내의 반복 펜을 나타낸다. 유의도는 시험감염 대조군(CC)과 비교할 때 P<0.05로 결정된다. 도 2c는 처리(D35)당 조류의 평균 최종 도살 체중을 나타내는 상자 그림을 도시한다. 각 점은 처리 내의 반복 펜을 나타낸다. 유의도는 시험감염 대조군(CC)과 비교할 때 P<0.05로 결정된다. 도 2d는 장 투과성을 결정하는 방법으로서 처리 전반에 걸쳐 평균 혈청 FITC-덱스트란 수준(㎍/㎖)을 나타내는 상자 그림을 도시한다. 각 반복 펜으로부터의 1마리 조류를 평가하여, 처리당 8마리의 조류를 제공하였다. 각 점은 조류를 나타낸다. 유의도는 시험감염 대조군(CC)과 비교할 때 P<0.05로 결정된다. 도 2e는 처리(D42)당 조류의 평균 사료요구율(FCR)을 나타내는 상자 그림을 도시한다. 각 점은 처리 내의 반복 펜을 나타낸다. 유의도는 시험감염 대조군(CC)과 비교할 때 P<0.05로 결정된다.
도 3a는 qPCR을 이용하여 결정되고 연구 D21에 Log10 CFU/장 면봉으로 표현된 클로스트리듐 퍼프린젠스의 계산을 도시한다. 도 3b는 연구 D21에 수집된 장 면봉에서의 netB 유전자의 발현을 도시하며, 회장 면봉당 log10 유전자 복제수로서 표현된다.
도 4는 실시예 4에 기재된 클로스트리듐 퍼프린젠스 저해 분석의 셋업을 나타내는 격자를 도시한다.
도 5는 Bl-04 및 에센셜 오일에 의한 클로스트리듐 퍼프린젠스의 저해 백분율을 나타내는 일련의 막대 그래프를 도시한다.
도 6는 NCFM 및 에센셜 오일에 의한 클로스트리듐 퍼프린젠스의 저해 백분율을 나타내는 일련의 막대 그래프를 도시한다.
도 7a는 10개 클러스터로 조직화된 최소 M9 배지에서 혐기성으로 성장된 개개 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포로부터의 마커 유전자 발현(로그 전환 값의 z-점수)의 히트맵이다. 도 7b는 아르기닌 생합성에서 최종 단계의 개략도를 도시한다. 도 7c는 BHI 단독, 또는 아스파르테이트, 오르니틴 또는 아르기닌의 존재하의 BHI에서 성장된 클로스트리듐 퍼프린젠스 배양물에 의해 성장 배지에 분비된 NetB 독소의 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 7d는 BHI 단독(명(light)) 또는 BHI에 아스파르테이트(암(dark))를 더한 것 중 하나에서 성장된 클로스트리듐 퍼프린젠스 배양물의 단세포 클러스터링을 나타내는 UMI 플롯을 도시한다. 도 7e는 인간 상피 HT-29 세포에서 아스파르테이트, 오르니틴 또는 아르기닌 유무와 상관없이 성장된 클로스트리듐 퍼프린젠스 배양물로부터의 조건화된 배지의 세포독성을 도시한다.
도 8은, 비보충 성장 배지(BHI)에서 성장시켰을 때 검출된 세포외 독소와 비교하여, 인산암모늄, 아세트산나트륨 또는 B 비타민(비타민 B1, B6 및 B12)을 클로스트리듐 퍼프린젠스의 배양물에 첨가하였을 때의 NetB 독소 생산을 검출하는 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 9a는 (상단) BHI 단독(명), BHI에 2.5%의 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스의 분비체를 더한 것 중 하나에서 성장시킨 클로스트리듐 퍼프린젠스의 단세포 클로스터링을 나타내는 UMI 플롯, (중간) 또는 BHI에 5%의 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스(암)의 분비체를 더한 것 및 (하단) BHI 단독, BHI에 2.5%의 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스의 분비체를 더한 것 또는 BHI에 5%의 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스의 분비체를 더한 것에서 성장시킨 netB 유전자의 상보적 클로스트리듐 퍼프린젠스 단세포 발현을 도시한다. 도 9b는 (상단) BHI 단독(명) 또는 BHI에 락토바실러스 아시도필루스 분비체를 더한 것(암)에서 성장시킨 클로스트리듐 퍼프린젠스 배양물의 단세포 클러스터링을 나타내는 UMI 플롯 및 (하단) BHI 또는 BHI에 락토바실러스 아시도필루스 분비체를 더한 것에서 성장시킨 netB 유전자의 상보적 클로스트리듐 퍼프린젠스 단세포 발현을 도시한다. 도 9c는 BHI 단독 또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 분비체 또는 락토바실러스 아시도필루스 분비체의 존재하에 BHI에서 성장된 클로스트리듐 퍼프린젠스 배양물에 의해 성장 배지에 분비된 NetB 독소의 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 9d는 인간 상피 HT-29 세포에서 분비체 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스, 락토바실러스 아시도필루스 또는 분비체 둘 다의 조합 유무와 상관없이 성장된 클로스트리듐 퍼프린젠스 배양물로부터의 조건화된 배지의 세포독성을 도시한다.
클로스트리듐 퍼프린젠스는 1961년에 처음 기재된 가금의 장 질환인 조류 괴사성 장염(NE)의 주요 원인 제제이다. 닭에서 NE는 급성 또는 만성 장독소혈증으로 나타난다. 급성 질환은 장벽에서 광범위한 괴사 병변의 발생으로 인해 상당한 수준의 사망률을 초래하는 반면, 만성 질환은 생산성 및 복지의 상당한 손실을 야기한다. 상기 질환으로 인해 가금 산업에 연간 수십억 달러의 피해가 발생되는 것으로 추정된다.
클로스트리듐 퍼프린젠스는 통상적으로 가금의 위장에서 발견된다. 클로스트리듐 퍼프린젠스는 그램-양성, 막대형, 아포 형성, 산소 내성 혐기성 생물이다. 클로스트리듐 퍼프린젠스는 4가지의 의심되는 주요 독소(알파, 베타, 엡실론 및 이오타)의 생성을 기준으로 5가지 독소 유형(A, B, C, D 및 E)으로 분류된다. 야생형 A는 닭의 장으로부터 지속적으로 회수되지만, 다른 유형은 덜 일반적이다.
NE에 대한 초기 연구는 질환에 관련된 주요 발병인자가 박테리아에 의해 분비되었다는 것을 시사하였고, 이는 알파-독소로 불리는 포스포리파제 C 효소가 발병에 관련된 주요 독소였다는 제안으로 이어졌다. 그러나 최근의 연구는, 알파 독소가 없는 돌연변이체 균주가 일반적으로 질환에서 알파 독소의 역할에 의문을 제기하는 NE를 야기할 수 있기 때문에, 알파 독소가 필수 발병인자가 아닌 것으로 보인다는 것을 나타냈다. 후속 연구에서, 신규한 기공 형성 독소인 NetB가 이 질환의 발병에 중요한 역할을 한다는 것이 제안되었다.
콕시듐증은 NE 발병의 가장 큰 원인이 되는 인자로 남아있다. 그렇게 할 수 있는 가금 생산자는 전형적으로 NE 발병을 피하기 위해 콕시듐증 통제 프로그램을 사용한다. 생산자들은 구균 백신 접종의 일관성 결여로 인해 계속 좌절감을 느끼고 있으며, 생산자들은 내성 발생을 피하기 위해 이온 운반체/화학적 프로그램을 순환시켜야 한다. 따라서, NE 통제를 위해 개발된 임의의 용액은 시험관내 및 생체내 항-아이메리아 효과(병변 점수화)에 대해 평가되는 NE의 소인으로서 콕시듐증의 원인 기생충인 아이메리아를 이용한 모델에서 평가되어야 한다.
본 출원의 발명자들은 놀랍게도 특정 활성제가 조합하여 사용될 때, 조류종에서 NE의 원인 제제인 클로스트리듐 퍼프린젠스의 감염 생물학을 직접 방해하고/하거나 숙주 및/또는 이의 내인성 장 미생물을 간접적으로 방해하여 클로스트리듐 퍼프린젠스의 감염 생물학을 조절한다는 것을 발견하였다. 본 발명은 시험감염 기간 동안 장 내의 클로스트리듐 퍼프린젠스 수준을 감소시키고, 정족수감지(quorum sensing)를 감소시키며, 따라서 독소 발현을 감소시키고(구체적으로는, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포에 의해 생성된 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB)의 양을 감소시키고), 조류가 (식이 또는 콕시듐증 노출을 통해) NE에 걸리기 쉬운 경향이 있거나, NE로 시험감염될 때 NE 장 병변의 발생을 감소시킨다. 더 나아가, 개시된 발명은 국소 장 염증을 감소시키고 NE 시험감염 기간 동안 장 완전성을 지원/유지하여, 후속적으로 NE 사망률의 감소, 및 NE 시험감염의 존재하에서 조류 성능(체중 증가 및/또는 사료요구율)의 개선으로 이어진다. 본 발명은 또한 양성 장내미생물군을 지원한다.
I. 정의
용어 "동물" 및 "대상체"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되고, 비반추 초식동물, 즉, 단위(mono-gastric) 동물을 지칭한다. 단위 동물의 예는 돼지(pig) 및 돼지(swine), 예컨대, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지, 암퇘지; 및 가금을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "가금"은 이들의 알, 이들의 고기 또는 이들의 털에 대해 인간에 의해 유지되는 축화계를 의미한다. 이러한 조류는 가장 전형적으로는 가금상목, 특히 닭, 메추라기, 오리, 기러기류, 에뮤, 오스트리케, 꿩 및 칠면조를 제한 없이 포함하는 순계목의 구성원이다. 추가 실시형태에서, 동물은 닭, 예컨대, 육계 또는 산란계이다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 동물은 인간이 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방하다", "예방하는", "예방" 및 이들의 문법적 변형은, 부분적으로 또는 전적으로, 질환 또는 병태(예컨대, 괴사성 장염) 및/또는 그의 수반되는 증상 중 하나 이상의 발병 또는 재발을 지연시키거나 방지하거나, 동물이 장애 또는 병태를 획득 또는 재획득하는 것을 막거나, 동물이 장애 또는 병태 또는 그의 수반되는 증상 중 하나 이상을 획득 또는 재획득할 위험을 감소시키는 방법을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, 특정 형질, 특성, 특징, 생물학적 과정 또는 현상과 관련하여 "감소시키는"이라는 용어는 특정 형질, 특성, 특징, 생물학적 과정 또는 현상의 감소를 지칭한다. 상기 특질, 특성, 특징, 생물학적 과정, 또는 현상은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 넘게 감소될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "투여하다" 또는 "투여하는"은 급식 또는 위관영양법에 의하는 것과 같이 1종 이상의 미생물 균주, 외인성 사료 효소, 사료 첨가제 및/또는 동물에 대한 균주를 도입하는 작용을 의미한다. 일 실시형태에서, 조성물은 대상체가 마시는 워터라인을 통해 대상체에게 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"은 동물에서 하나 이상의 기질을 개선시키기 위한 물질(예를 들어, 베타인, 복합생균제(DFM) 또는 에센셜 오일(EO))의 양을 의미한다. 동물의 하나 이상의 기질(예컨대, 제한 없이, 임의의 개선된 사료요구율(FCR); 개선된 체중 증가; 개선된 사료효율; 개선된 장내 미생물 상태(즉, 더 건강한("좋은") 박테리아 및/또는 덜 건강에 해로운("나쁜") 박테리아; 및/또는 개선된 도체(carcass) 품질 중 하나 이상의 기질의 개선은 본 명세서에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. 유효량은 물질을 함유하는 사료 및/또는 물에 대한 자유로운 접근을 제공함으로써 동물에게 투여될 수 있다. 따라서, 물질(예를 들어, 베타인, DFM 또는 EO)은 또한 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 일부 실시형태에서, 유효량의 일부 물질(예를 들어, 베타인 또는 EO)은 사료로 또는 사료의 성분으로서 투여될 수 있고, 다른 물질(예를 들어, 1종 이상의 DFM)이 워터라인에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "병원체"는 질환의 임의의 원인 제제를 의미한다. 이러한 원인 제제는 비제한적인 예로서 박테리아, 바이러스, 진균 원인 제제 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "무증상"은 임상 징후가 없음을 의미하며; 증상 및 징후가 분명하거나, 임상 시험 또는 실험실 검사에 의해 검출 가능하게 되기 전의 감염 또는 다른 질환(예를 들어, 괴사성 장염)의 초기 단계 또는 감염 또는 다른 질환(예를 들어, 괴사성 장염)의 매우 경증인 형태를 말한다.
"사료" 및 "식품"은 각각 비-인간 동물 및 인간이 각각 먹고, 섭취하고, 소화시키기 위한 또는 이에 적합한 임의의 천연 또는 인공 식이, 음식 등이나 이러한 음식의 성분을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "식품"은 광의의 개념으로 사용되며, 인간을 위한 식품 및 식료품, 및 비인간 동물을 위한 식품(즉, 사료)을 포괄한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "사료"는 본 명세서에서 "사료물"과 동의어로 사용된다. 사료는 동물의 영양을 위해, 그리고 갓 태어난 동물 또는 어린 동물 및 발육 중인 동물을 포함하는 동물의 정상적 또는 가속화된 성장을 지속하기 위해 사용되는 물질, 액체 또는 고체를 광범위하게 지칭한다. 상기 용어는 동물(예를 들어, 가금의 경우, 예컨대, 메추라기, 오리, 칠면조 및 닭)에 의한 섭취에 적합한 화합물, 제제, 혼합물 또는 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사료 또는 사료 조성물은 기본 사료 조성물 및 1종 이상의 사료 첨가제 또는 사료 첨가제 조성물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "사료 첨가제"는 사료 흡수를 촉진시키거나, 질환을 치료 또는 예방하거나, 대사를 변경하기 위해 추가적인 성분이 있는 기본 사료를 강화할 목적으로 포함시킨 성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 그러나, 사료 첨가제는 동물에 워터라인 전달을 위해 제형화되고, 사료에 직접 첨가되지 않는다. 사료 첨가제는 프리믹스를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사료 첨가제"는 또한 사료에 또는 사료와 함께 투여되는 물에 첨가되는 물질을 지칭한다. 사료 첨가제는 여러 이유로 사료에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 사료의 소화율 향상을 위해, 사료의 영양가를 보충하기 위해, 수용자의 면역 방어를 개선시키기 위해 그리고/또는 사료의 보관 수명을 개선시키기 위함. 일부 실시형태에서, 사료 첨가제는 사료의 영양가를 보충하고/하거나 수용자의 면역 방어를 개선시킨다. 일부 실시형태에서, 사료 첨가제는 인간 투여용이 아니다.
본 명세서에서 지칭되는 "프리믹스"는 미세성분, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 비타민, 미네랄, 화학 보존제, 항생제, 발효 산물, 및 다른 필수 성분 중 하나 이상으로 이루어진 조성물일 수 있다. 프리믹스는 보통 상업적 배급사료에의 배합에 적합한 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "성능"은 동물의 사료효율 및/또는 중량 증가에 의해 그리고/또는 사료요구율에 의해 그리고/또는 사료 내 영양소(예를 들어, 아미노산 소화율 또는 인 소화율) 그리고/또는 사료 내 소화 가능한 에너지 또는 대사 가능한 에너지의 소화율에 의해 그리고/또는 질소 보유에 의해 및/또는 질병의 부정적인 영향을 피하는 동물의 능력에 의해 또는 대상체의 면역 반응에 의해 결정될 수 있다. 성능 특징은 체중; 중량 증가; 질량; 체지방 백분율; 신장; 체지방 분포; 성장; 성장률; 우유 생산; 미네랄 흡수율; 미네랄 배설률, 미네랄 보유율; 뼈 밀도; 뼈 강도; 사료 전환율(FCR); 평균 일일 사료 섭취량(ADFI); 평균 일일 증체량(average daily gain: ADG) 유지율 및/또는 구리, 나트륨, 인, 질소 및 칼슘 중 어느 하나 이상의 분비율; 아미노산 보유율 또는 흡수율; 미네랄화, 뼈 미네랄화 도체 수율 및 도체 품질을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사료효율"은 동물에게 일정 기간 동안 자유롭게 또는 특정량의 음식이 공급될 때 발생하는 동물의 체중 증가량을 지칭한다. "사료효율 증가"란, 사료에서 또는 워터라인 전달을 통한 음용수에서 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물의 사용이 상기 사료 첨가제 조성물이 존재하지 않는 동물 사료에 비해서 사료 섭취 단위당 체중 증가 증대를 초래하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "사료요구율"은 사료 질량을 목적하는 생산량의 증가로 전환시킴에 있어서 대상체의 효율 척도를 지칭하며, 특정 기간 동안 섭식한 사료의 질량을 생산량으로 나눔으로써 계산된다. 예를 들어, 고기(예를 들어, 쇠고기)를 얻기 위해 동물을 사육하는 경우, 생산량은 동물의 증가된 질량일 수 있다. 다른 의도된 목적(예를 들어, 우유 생산)을 위해 동물을 사육하는 경우, 생산량은 다를 것이다. 용어 "사료요구율"은 용어 "사료 전환율" 또는 "사료 전환 효율"과 호환 가능하게 사용될 수 있다. "더 낮은 사료요구율" 또는 "사료요구율 개선"이란, 사료 중 사료 첨가제 조성물의 사용이, 동물의 중량을 특정량만큼 증가시키기 위해 동물에게 공급될 필요가 있는 사료의 양을 사료가 상기 사료 첨가제 조성물을 포함하지 않을 때 동물의 중량을 동일한 양만큼 증가시키는 데 필요한 사료의 양에 비해서 더 적게 하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "미생물(microorganism 또는 microbe)"은 박테리아, 진균(예컨대, 효모), 바이러스, 원생동물 및 기타 미생물 또는 미시적 유기체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "복합생균제"("DFM")는, 충분한 수로 적용될 때 수용자에게 유익을 줄 수 있는 살아있는(생존 가능한) 미생물의 공급원, 즉 프로바이오틱이다. DFM은 박테리아 균주와 같은 하나 이상의 미생물을 포함할 수 있다. DFM의 범주에는 바실러스, 락트산 박테리아 및 효모가 포함된다. 따라서, DFM이라는 용어는 다음 중 하나 이상을 포괄한다: 직접 공급 박테리아, 직접 공급 효모, 직접 공급 효모 및 이들의 조합물. 바실러스는 포자를 형성하는 독특한, 그램-양성 막대균이다. 이들 포자는 매우 안정하며, 열, 수분 및 다양한 pH와 같은 환경 조건을 견딜 수 있다. 이들 포자는 동물에 의해 소화되면 활성 영양 세포로 발아하며, 음식 및 펠릿화된 식이에서 이용될 수 있다. 락트산 박테리아는 일부 병원체에 길항성인 락트산을 생산하는 그램-양성 구균이다. 락트산 박테리아는 다소 열 민감성으로 나타나므로, 이들은 펠렛화된 식이에서 전형적으로 사용되지 않는다. 락트산 박테리아의 유형은 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "프로바이오틱", "프로바이오틱 배양물" 및 "DFM"은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며, 예를 들어, 충분한 수로 섭취되거나 국소적으로 적용될 때, 숙주 유기체에 소화 및/또는 성능 유익과 같은 하나 이상의 입증 가능한 유익(예컨대, 건강 유익 또는 균형잡힌 장내미생물군 유익)을 부여함으로써 숙주 유기체에 유익하게 영향을 미치는 (예를 들어 박테리아 또는 효모를 포함하는) 살아있는 미생물을 정의한다. 프로바이오틱은 하나 이상의 점막 표면에서 미생물 균형을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 점막 표면은 장, 요로, 호흡기 또는 피부일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로바이오틱"은 또한 면역계의 유익한 가지(branch)를 자극하고 동시에 점막 표면, 예를 들어 내장에서 염증 반응을 감소시킬 수 있는 살아있는 미생물을 포함한다. 프로바이오틱 흡수에 대한 하한 또는 상한은 없지만, 1일 용량으로서 적어도 106 내지 1012개, 예를 들어, 적어도 106 내지 1010개, 예를 들어 108 내지 109개의 콜로니 형성 단위(cfu)가 대상체에서 유리한 효과를 달성하는 데 효과적이라는 것을 시사하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CFU"는 "콜로니 형성 단위"를 의미하며, 콜로니가 단일 전구 세포에서 유래된 세포의 집합체를 나타내는 생존 가능한 세포의 척도이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "분비체"는 세포에 의해 생산되고 분비되는 유기 분자 및 무기 구성요소의 총체를 의미한다. 성장 조건이 표시되는 경우, 분비체는 해당 성장 조건하에서 세포에 의해 생산되고 분비된 유기 분자 및 무기 구성요소의 총체이다. 분비체는 세포 상청액 및 이의 상청액의 분획에서 회수될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "삼투 조절자"는 세포의 내부와 세포의 외부 사이의 삼투압의 균형을 맞춤으로써, 고도의 삼투압 환경에서 세포의 생존을 돕는 화합물을 의미한다. 일 실시형태에서, 삼투 조절자는 베타인이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "베타인"은 트라이메틸글리신을 지칭한다. 상기 화합물은 트라이메틸암모니오아세테이트, 1-카복시-N,N,N-트라이메틸메탄아미늄, 분자내 염 및 글리신 베타인으로도 불린다. 이는 하기 화학식을 갖는 자연 발생적 4차 암모늄 유형 화합물이다
.
베타인은 산과 알칼리성 용액을 둘 다 중화시킬 수 있는 친수성 모이어티(COO-) 및 소수성 모이어티(N+)를 포함하는 양극성 구조를 갖는다. 이의 순수한 형태에서, 베타인은 물 및 저급 알코올에서 용이하게 가용성인 백색 결정질 화합물이다. 본 발명에서, 베타인은, 예를 들어, 무수 형태로, 또는 수화물로서 또는 동물 사료 허용 가능 염으로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 베타인이 존재할 때, 이는 자유 양쪽성 이온으로 존재한다. 일 실시형태에서, 베타인이 존재할 때, 이는 무수 베타인으로 존재한다. 일 실시형태에서, 베타인이 존재할 때, 이는 일수화물로서 존재한다. "베타인"은 또한 자연 유래 베타인뿐만 아니라 합성 베타인을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동물 사료 허용 가능 염"은, 수용자에게 투여 시, 직접적으로 또는 간접적으로, 본 명세서에 기재된 화합물 또는 화합물의 유도체를 제공할 수 있는 임의의 비독성 염을 의미한다. 허용 가능한 염을 형성하기 위해 통상적으로 사용되는 산은 무기산, 예컨대, 이황화수소, 염산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 황산 및 인산뿐만 아니라 유기산, 예컨대, 파라-톨루엔설폰산, 살리실산, 타르타르산, 바이타르타르산, 아스코르브산, 말레산, 베실산, 퓨마르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 포름산, 글루탐산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 락트산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 카본산, 석신산, 시트르산, 벤조산 및 아세트산 및 관련된 무기 및 유기산을 포함한다. 따라서, 이러한 동물 사료 허용 가능 염은 설페이트, 파이로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 포스페이트, 모노하이드로전포스페이트, 다이하이드로전포스페이트, 메타포스페이트, 파이로포스페이트, 염화물, 브로민화물, 아이오딘화물, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 아이소뷰티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 퓨마레이트, 말레에이트, 뷰틴-1,4-다이오에이트, 헥신-1,6-다이오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 다이나이트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 설포네이트, 자일렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐뷰티레이트, 시트레이트, 락테이트, [베타]-하이드록시뷰티레이트, 글리콜레이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등의 염을 포함한다. 바람직한 동물 사료 허용 가능 산 부가 염은 무기산, 예컨대, 염산 및 브로민화수소산에 의해 형성된 것, 및 유기산, 예컨대, 말레산에 의해 형성된 것을 포함한다. 사료 허용 가능 염을 형성하기 위한 적합한 양이온은 특히 암모늄, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 양이온을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "에센셜 오일"은 오일이 유래된 식물로부터 증류 또는 추출될 수 있거나, 합성에 의해 제조될 수 있고, 해당 식물의 특징적 향에 기여하는 모든 화합물의 세트를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[H. McGee, On Food and Cooking, Charles Scribner's Sons, p. 154-157 (1984)] 참조. 에센셜 오일의 비제한적 예는 티몰 및 신남알데하이드를 포함한다.
용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 중합체를 나타낸다. "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산 잔기의 중합체 서열을 포함한다. IUPAC-IUB 생화학 명명 연합 위원회(Joint Commission on Biochemical Nomenclature: JCBN)와 부합하여 정의되는 아미노산에 대한 한 글자 및 세 글자 기호가 본 개시내용 전체적으로 사용된다. 한 글자 X는 20개 아미노산 중 임의의 하나를 나타낸다. 또한 폴리펩타이드가 유전자 기호의 축중으로 인해 하나를 초과하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "~로부터 유래된" 및 "~로부터 얻어진"은 해당 유기체 균주에 의해 생산되거나 생산 가능한 단백질뿐만 아니라 이러한 균주에서 단리된 DNA 서열에 의해 암호화되고 이러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생산된 단백질을 지칭한다. 추가적으로, 이 용어는 합성 및/또는 cDNA 유래의 DNA 서열에 의해 암호화되며 해당 단백질을 확인시키는 특징을 갖는 단백질을 나타낸다.
본 명세서에서 특정 범위는 용어 "약"이 선행되는 수치 값으로 제시된다. 본 명세서에서 용어 "약"은 뒤에 오는 정확한 수뿐만 아니라 이 용어 뒤에 오는 수에 근사하거나 대략적인 수를 문자 그대로 뒷받침하기 위하여 사용된다. 수가 구체적으로 명시된 수에 근사하거나 대략적인지를 결정하는 데 있어서, 근사하거나 대략적인 명시되지 않은 수는 그것이 제시되는 문맥에서 구체적으로 명시된 수의 실질적 등가물을 제공하는 수일 수 있다. 예를 들어, 수치 값과 관련하여, "약"이라는 용어는 이 용어가 달리 구체적으로 문맥에서 정의되어 있지 않으면, 그 수치 값의 -10% 내지 +10%의 범위를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 단수형 용어는, 문맥에 분명하게 달리 지시되지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다.
또한, 임의의 선택적 요소를 제외하도록 청구범위가 작성될 수 있음에 유의한다. 이와 같이, 이러한 서술은 청구항 요소의 설명과 관련하여 "단독의", "단지" 등과 같은 이러한 배타적인 용어의 사용이나, "부정적" 제한의 사용에 대한 선행적 근거 역할을 하도록 의도된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 어구는, 이 어구 앞에 열거된 성분(들)의 작용 또는 활성에 기여하지 않거나 이를 방해하지 않는 다른 알려진 성분(들)의 총량이 전체 조성물의 30 중량% 미만으로 존재하는 조성물을 지칭함에 또한 유의한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "포함하는"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어 앞의 성분(들)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다는 것을 의미함에 또한 유의한다. "포함하는"이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 의무적이지만, 이 성분(들)을 포함하는 조성물은 다른 비-의무적이거나 선택적인 성분(들)을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "~로 이루어진"이라는 용어는 "~로 이루어진"이라는 용어 앞의 성분(들)을 포함하고 이에 제한됨을 의미함에 유의한다. 따라서, "~로 이루어진"이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 의무적이며, 다른 성분(들)은 조성물에 존재하지 않는다.
본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 제한은, 모든 하한 수치 제한이 본 명세서에 명백하게 기재된 것처럼, 이러한 하한 수치 제한을 포함하려는 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 제한은, 더 큰 모든 수치 제한이 본 명세서에 명백하게 기재된 것처럼, 이러한 더 큰 수치 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는, 더 넓은 수치 범위 내에 있는 더 좁은 모든 수치 범위가 본 명세서에 명백하게 기재된 것처럼, 이러한 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
용어의 다른 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 나타날 수 있다.
II. 조성물
1종 이상의 복합생균제(DFM; 예를 들어, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스 중 하나 이상을 포함하는 DFM) 및/또는 1종 이상의 삼투 조절자(예를 들어, 베타인) 및/또는 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및/또는 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제; 및/또는 1종 이상의 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트 및/또는 B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12)을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
A. 복합생균제(DFM)
일 실시형태에서, DFM은 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 제형에 포함될 수 있고, 액체, 건조 분말 또는 과립으로서 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 제형의 DFM은 단일 혼합물로서 제형화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 제형의 DFM은 별개의 혼합물로서 제형화될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 제형의 DFM의 별개의 혼합물은 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 제형의 DFM의 별개의 혼합물은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, DFM을 포함하는 제1 혼합물이 투여된 후에 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 제형을 포함하는 제2 혼합물이 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 사료 첨가제 제형을 포함하는 제1 혼합물이 투여된 후에 DFM을 포함하는 제2 혼합물이 투여될 수 있다.
건조 분말 또는 과립은 당업자에게 공지된 수단에 의해, 예컨대 상부-분무 유동층 코팅장치에서, 하부 분무 부르스터(Wurster)에서 또는 드럼 제립(예컨대 고전단 제립), 압출, 팬 코팅에 의해 또는 미량성분 혼합장치에서 제조될 수 있다.
다른 실시형태에서, 1종 이상의 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일, 효소, 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 DFM은 코팅될 수 있고, 예를 들어, 캡슐화될 수 있다. 적합하게는, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일, 효소, 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 DFM은 동일한 코팅 내에서 제형화되거나, 동일한 캡슐 내에서 캡슐화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예컨대 DFM이 내생포자를 생산할 수 있는 경우, DFM은 임의의 코팅 없이 제공될 수 있다. 이러한 상황에서, DFM 내생포자는 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일, 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 효소와 간단하게 혼합될 수 있다. 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일, 효소, 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 DFM은 혼합물로서 캡슐화될 수 있거나(즉, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 모두를 포함), 이들은 별개로, 예를 들어, 단일로 캡슐화될 수 있다.
적어도 하나의 DFM은 생존 가능한 박테리아 균주 또는 생존 가능한 효모 또는 생존 가능한 진균 또는 생존 가능한 곰팡이와 같은 적어도 하나의 생존 미생물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, DFM은 적어도 1종의 생존 가능한 박테리아를 포함한다. DFM은 포자 형성 박테리아 균주일 수 있고, 그에 따라 용어 DFM은 포자, 예를 들어 박테리아 포자, 예컨대, 내생포자로 이루어지거나 이를 함유할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 용어 "생존 가능한 미생물"은 내생포자 또는 분생포자(conidia) 같은 미생물 포자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재되는 사료 첨가제 조성물에서의 DFM은 미생물 포자, 예컨대 내생포자 또는 분생포자로 이루어지지 않을 수 있거나 이를 함유하지 않을 수 있다. 미생물은 자연 발생 미생물일 수 있거나 형질전환된 미생물일 수 있다.
본 명세서에 기재된 DFM은 다음 속 중 하나 이상으로부터의 미생물을 포함할 수 있다: 락토바실러스, 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스, 바실러스, 페디오코커스(Pediococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 류코노스토크(Leuconostoc), 카르노박테리움(Carnobacterium), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스 프로피오니박테리움(Pediococcus Propionibacterium), 비피도박테리움, 클로스트리듐 및 메가스파에라(Megasphaera) 및 이들의 조합. 일부 실시형태에서, DFM은 바실러스 종(Bacillus spp.), 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 변종 토요이(Bacillus cereus var. toyoi), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis), 바실러스 베레젠시스(Bacillus velezensis) 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터 선택된 1종 이상의 박테리아 균주를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "바실러스" 속은, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 렌투스(B.lentus), 바실러스 브레비스(B.brevis), 바실러스 스테아로써모필루스(B.stearothermophilus), 바실러스 알칼로필루스(B. alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 클라우시이(B. clausii), 바실러스 할로두란스(B. halodurans), 바실러스 메가테리움(B. megaterium), 바실러스 코아굴란스(B. coagulans), 바실러스 시르쿨란스(B. circulans), 바실러스 기브소니이(B. gibsonii), 바실러스 푸밀리스 및 바실러스 투링기엔시스(B. thuringiensis)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 바실러스 속은 계속해서 분류학적으로 재편성되고 있는 것으로 인식되고 있다. 따라서, 속은, 현재는 "게오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)"로 명명되는 바실러스 스테아로써모필루스, 또는 현재 "파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)"인 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa)와 같은 유기체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 재분류된 종을 포함하는 것으로 의도된다. 스트레스가 많은 환경 조건 하에서 내성 내생포자의 생산은 바실러스 속의 규정적 특징으로 간주되지만, 이 특성은 최근 명명된 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 암피바실러스(Amphibacillus), 아네우리니바실러스(Aneurinibacillus), 아녹시바실러스(Anoxybacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 필로바실러스(Filobacillus), 그라실리바실러스(Gracilibacillus), 할로바실러스(Halobacillus), 파에니바실러스(Paenibacillus), 살리바실러스(Salibacillus), 써모바실러스(Thermobacillus), 우레이바실러스(Ureibacillus), 및 비르기바실러스(Virgibacillus)에도 적용된다.
또 다른 양상에서, DFM은 다음 락토코커스 종과 추가로 조합될 수 있다: 락토코커스 크레모리스(Lactococcus cremoris) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 이들의 조합. DFM은 또한 다음의 락토바실러스 종을 포함할 수 있다: 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 비피더스(Lactobacillus bifidus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파르시미니스(Lactobacillus farciminis), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스 델브레욱키이(Lactobacillus delbreuckii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 파르시미니스, 락토바실러스 람노수스, 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) 및 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 및 이들의 임의의 조합. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "락토바실러스" 속은 당업자에게 알려진 바와 같은 "락토바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 락토바실러스 속은 계속해서 분류학적으로 재편성되고 있는 것으로 인식되고 있다. 예를 들어, 2020년 3월 현재, 락토바실러스는 표현형적, 생태학적 및 유전형적으로 매우 다양한 261종을 포함하였다. 전체 게놈 서열분석 및 비교 게놈학의 최근의 발전을 고려하여, 락토바실러스 속은 최근에 25개의 별개의 속으로 나누어졌고, 이전에 지정된 락토바실러스 종에 속하는 균주는 새로운 종 및/또는 속으로 이전되었다(문헌[Zheng et al., 2020, Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,70:2782-2858; Pot et al., Trends in Food Science & Technology 94 (2019) 105-113; 및 Koutsoumanis et al., 2020, EFSA Journal, 18(7):6174]을 참조하며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 본 개시내용의 목적을 위해, 락토바실러스 종의 이전의 분류가 계속해서 사용될 것이다. 그러나, 일부 실시형태에서 락토바실러스 아길리스(Lactobacillus agilis)는 리기락토바실러스 아길리스(Ligilactobacillus agilis)로도 분류된다. 다른 실시형태에서, 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)는 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius)로도 분류된다. 추가 실시형태에서, 락토바실러스 류테리는 리모시락토바실러스 류테리(Limosilactobacillus reuteri)로도 분류된다.
또 다른 양상에서, DFM은 다음 비피도박테리아 종과 추가로 조합될 수 있다: 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스, 비피도박테리움 비피디움(Bifidobacterium bifidium), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 애니멀리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 카테눌라툼(Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatum), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 및 비피도박테리움 안굴라툼(Bifidobacterium angulatum), 및 이들의 임의의 조합.
다음 종의 박테리아가 언급될 수 있다: 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 베레젠시스, 바실러스 푸밀리스, 엔테로코커스, 엔테로코커스 종, 및 페디오코커스 종, 락토바실러스 종, 비피도박테리움 종, 락토바실러스 아시도필루스, 페디오코크서스 아시딜락티시(Pediococsus acidilactici), 락토코커스 락티스, 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 바실러스 서브틸리스, 프로피오니박테리움 토에니이(Propionibacterium thoenii), 락토바실러스 파르시미니스, 락토바실러스 람노수스, 메가스파에라 엘스데니이(Megasphaera elsdenii), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 티로뷰티리쿰(Clostridium tyrobutyricum), 비피도박테리움 애니멀리스 아종 애니멀리스(Bifidobacterium animalis ssp. animalis), 락토바실러스 루테리, 바실러스 세레우스, 락토바실러스 살리바리우스 아종 살리바리우스(Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius), 프로피오니박테리아 종(Propionibacteria spp) 및 이들의 조합.
하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 본 명세서에 기재된 복합생균제는 동일한 유형(속, 종 및 균주)일 수 있거나, 속, 종 및/또는 균주의 혼합물을 포함할 수 있다. 대안적으로, DFM은 WO2012110778에 개시된 생성물 또는 이러한 생성물에 함유된 미생물 중 하나 이상과 조합될 수 있으며, 다음과 같이 요약될 수 있다: 바실러스 서브틸리스 균주 2084(수탁 번호 NRRLB-50013), 바실러스 서브틸리스 균주 LSSAO1(수탁 번호 NRRL B-50104), 및 바실러스 서브틸리스 균주 15A-P4(ATCC 수탁 번호 PTA-6507)(Enviva Pro®제(과거에는 Avicorr®로 알려져 있음)); 바실러스 서브틸리스 균주 C3102(Calsporin®에서 유래됨); 바실러스 서브틸리스 균주 PB6(Clostat®제); 바실러스 푸밀리스(8G-134); 엔테로코커스 NCIMB 10415(SF68)(Cylactin®제); 바실러스 서브틸리스 균주 C3102(Gallipro® 및 GalliproMax®제); 바실러스 리케니포르미스(Gallipro®Tect®제); 엔테로코커스 및 페디오코커스(Poultry star®제); 락토바실러스, 비피도박테리움 및/또는 엔테로코커스(Protexin®제); 바실러스 서브틸리스 균주 QST 713(Proflora®제); 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 CECT-5940(Ecobiol® 및 Ecobiol® Plus에서 유래됨); 엔테로코커스 파에슘(Enterococcus faecium) SF68(Fortiflora®제); 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리케니포르미스(BioPlus2B®제); 락트산 박테리아 7 엔테로코커스 파에시움(Lactiferm®제); Baymix® Grobig BS제의 바실러스 서브틸리스 균주 QST 713; LACTILLUS™의 락토바실러스 균주; 바실러스 균주(CSI®제); 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)(Yea-Sacc®제); 바실러스 서브틸리스(바실러스 베레젠시스 NRRL B-67259)(Correlink™제); 엔테로코커스(Biomin IMB52®제); 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 엔테로코커스, 비피도박테리움 아니말리스 아종 아니말리스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 살리바리우스 아종 살리바리우스(Biomin C5®제); 락토바실러스 파르시미니스(Biacton®제); 엔테로코커스(Oralin E1707®제); 엔테로코커스(2개 균주), 락토코커스 락티스 DSM 1103(Probios-pioneer PDFM®제); 락토바실러스 람노수스 및 락토바실러스 파르시미니스(Sorbiflore®제); 바실러스 서브틸리스(Animavit®제); 엔테로코커스(Bonvital®제); 사카로마이세스 세레비시아에(Levucell SB 20®제); 사카로마이세스 세레비시아에(Levucell SC 0 및 SC10® ME에서 유래됨); 페디오코커스 아시딜락티(Bactocell에서 유래됨); 사카로마이세스 세레비시아에(ActiSaf®(과거에는 BioSaf®)에서 유래됨); 사카로마이세스 세레비시아에NCYC Sc47(Actisaf® SC47에서 유래됨); 클로스트리듐 부티리쿰(Miya-Gold®제); 엔테로코커스(Fecinor 및 Fecinor Plus®제); 사카로마이세스 세레비시아에NCYC R-625(InteSwine®제); 사카로마이세스 세레비시아에(BioSprint®제); 엔테로코커스 및 락토바실러스 람노수스(Provita®제); 바실러스 서브틸리스 및 아스페르길루스 오리자에(PepSoyGen-C®제); 바실러스 세레우스(Toyocerin®제); 바실러스 세레우스 변종 토요이(Bacillus cereus var. toyoi)NCIMB 40112/CNCM I-1012(TOYOCERIN®제), 또는 다른 DFM, 예컨대 바실러스 리케니포르미스 및 바실러스 서브틸리스(BioPlus® YC에서 유래됨) 및 바실러스 서브틸리스(GalliPro®제).
Danisco A/S. Enviva® PRO로부터 상업적으로 입수 가능한 Enviva® PRO와 조합될 수 있는 DFM은 바실러스 균주 2084 수탁번호 NRRL B-50013, 바실러스 균주 LSSAO1 수탁번호 NRRL B-50104 및 바실러스 균주 15A-P4 ATCC 수탁번호 PTA-6507의 조합물이다(본 명세서에 참조에 의해 원용된 US 7,754,469 B에 교시된 바와 같음). 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 DFM은 일반적으로 안전한 것으로 인식되고(GRAS), 바람직하게는 GRAS 승인된 미생물을 포함한다. 당업자는 식품 및/또는 농업 산업에서 사용되고 일반적으로 동물 소비에 적합한 것으로 간주되는 본 명세서에 기재된 속의 특정 미생물 종 및/또는 균주를 쉽게 알 것이다.
다른 실시형태에서, DFM은 락토바실러스 류테리 균주 S1, 락토바실러스 류테리 균주 S2, 락토바실러스 류테리 균주 S3, 락토바실러스 류테리 균주 A2, 락토바실러스 갈리나룸(L. gallinarum) 균주 H1, 락토바실러스 살리바리우스 균주 H2 및/또는 락토바실러스 아길리스 균주 H3 중 하나 이상과 조합될 수 있으며, 이들은 2019년 7월 24일자로 네덜란드 위트레흐트 3584 CT 웁살라란 8에 소재한 곰팡이 다양성 연구소(Westerdijk Fungal Biodiversity Institute: WFDB)에 기탁되었고 각각 수탁번호 CBS 145921, CBS 145922, CBS 145923, CBS 145924, CBS145918, CBS145919 및 CBS 145920이 주어졌다. 기탁은 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁 인정에 관한 부다페스트 조약(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)의 조항 하에 이루어졌다(또한 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 국제 특허 출원 공개 WO2021034660 참조).
일부 실시형태에서, DFM은 내열성인 것이, 즉 열안정한 것이 중요하다. 이는 특히 사료가 펠릿화될 때 그러하다. 따라서, 또 다른 실시형태에서, DFM은, 예를 들어, 바실러스 종을 포함한 내열성 박테리아와 같은 내열성 미생물일 수 있다.
다른 양상에서, DFM은 바실러스, 예를 들어 바실러스 종과 같은 포자 생성 박테리아를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 바실러스는 성장 조건이 불리할 때 내생포자를 형성할 수 있고, 열, pH, 습기 및 살균제에 매우 내성이다.
본 명세서에 기재된 DFM은 병원성 미생물(예컨대, 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및/또는 에스케리키아 콜라이 및/또는 살모넬라 종 및/또는 캄필로박터 종)의 장내 확립을 감소시키거나 방지할 수 있다. 다시 말해, DFM은 항병원성일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항병원성"은 DFM이 병원체의 효과(부정적 효과)에 대항하는 것을 의미한다.
상기 기재된 바와 같이, DFM은 임의의 적합한 DFM일 수 있다. 예를 들어, DFM으로서의 미생물의 적합성을 결정하기 위해 다음 검정 "DFM ASSAY"가 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 DFM 검정은 US2009/0280090에 더 자세히 설명되어 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본 명세서에 교시된 "DFM ASSAY"에 따라 저해성 균주(또는 항병원성 DFM)로 선택된 DFM은, 본 개시에 따라, 즉, 본 개시에 따른 사료 첨가제 조성물에 사용하기에 적합한 DFM이다. 튜브는 각각 대표적 클러스터로부터의 대표적 병원체(예컨대, 박테리아)와 함께 씨드접종되었다. 호기적으로 또는 혐기적으로 성장시킨 잠재적 DFM으로부터의 상청액을 시딩된 튜브에 첨가하고(상청액이 첨가되지 않은 대조군은 제외함), 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 대조군 및 상청액 처리된 튜브의 광학 밀도(OD)를 각 병원체에 대해 측정했다. 이어서, 대조군(임의의 상청액을 함유하지 않음)과 비교하여 낮은 OD를 생성한 (잠재적 DFM) 균주의 콜로니는 저해성 균주(또는 항병원성 DFM)로 분류될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 DFM 검정은 US2009/0280090에 더 자세히 설명되어 있다. 일부 실시형태에서, 이 DFM 검정에 사용되는 대표적인 병원체는 다음 중 하나(또는 그 초과)일 수 있다: 클로스트리듐, 예컨대, 클로스트리듐 퍼프린젠스 및/또는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 및/또는 이콜라이(E. coli) 및/또는 살모넬라 종(Salmonella spp) 및/또는 캄필로박터 종(Campylobacter spp). 하나의 바람직한 실시형태에서, 검정은 클로스트리듐 퍼프린젠스 및/또는 클로스트리듐 디피실 및/또는 이콜라이 중 하나 이상, 바람직하게는 클로스트리듐 퍼프린젠스 및/또는 클로스트리듐 디피실레, 더욱 바람직하게는 클로스트리듐 퍼프린젠스로 수행된다.
DFM은 배양물(들) 및 담체(들)(사용되는 경우)로 준비될 수 있고, 리본(ribbon) 또는 패들(paddle) 믹서에 첨가되어 약 15분 동안 혼합될 수 있지만, 타이밍(timing)은 늘리거나 줄일 수 있다. 성분들은 배양물과 담체의 균일한 혼합물이 생성되도록 배합된다. 최종 생성물은 바람직하게는 건조한 유동성있는 분말이다. 이어서, 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 DFM(들)이 (바람직하게는 본 명세서에 기재된 효소와 동시에) 동물 사료 또는 사료 프리믹스에 첨가되거나, 동물의 물에 첨가되거나, 당업계에 공지된 다른 방식으로 투여될 수 있다. DFM 혼합물 중의 개개 균주의 포함은 1% 내지 99%, 및, 바람직하게는 25% 내지 75%의 다양한 비율일 수 있다. 동물 사료 중의 DFM의 적합한 용량은 약 1×103 CFU/사료(g) 내지 약 1×1010 CFU/사료(g), 적합하게는 약 1×104 CFU/사료(g) 내지 약 1×108 CFU/사료(g), 적합하게는 약 7.5×104 CFU/사료(g) 내지 약 1×107 CFU/사료(g)의 범위일 수 있다. 다른 양상에서, DFM은 사료물에 약 1×103 초과의 CFU/사료(g), 적합하게는 약 1×104 초과의 CFU/사료(g), 적합하게는 약 5×104 초과의 CFU/사료(g), 또는 적합하게는 약 1×105 초과의 CFU/사료(g)로 투여될 수 있다.
DFM은 사료 첨가제 조성물에 약 1×103 CFU/조성물(g) 내지 약 1×1013 CFU/조성물(g), 예컨대, 1×105 CFU/조성물(g) 내지 약 1×1013 CFU/조성물(g), 예컨대, 약 1×106 CFU/조성물(g) 내지 약 1×1012 CFU/조성물(g), 예컨대, 약 3.75×107 CFU/조성물(g) 내지 약 1×1011 CFU/조성물(g)로 투여될 수 있다. 또 다른 양상에서, DFM은 사료 첨가제 조성물에 약 1×105 초과의 CFU/조성물(g), 예컨대, 약 1×106 초과의 CFU/조성물(g), 예컨대, 약 3.75×107 초과의 CFU/조성물(g)로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, DFM은 사료 첨가제 조성물에 약 2×105 초과의 CFU/조성물(g), 예컨대, 약 2×106 초과의 CFU/조성물(g), 적합하게는 약 3.75×107 초과의 CFU/조성물(g)로 투여된다.
일부 실시형태에서, DFM은 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04 및/또는 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM이다. 이러한 박테리아 균주는 DuPont Nutrition Biosciences ApS(Langebrogade 1, DK-1411 Copenhagen K, 덴마크)가 부다페스트 조약에 따라 Leibniz-Institut Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, 독일)에 기탁하였으며, 다음과 같은 등록번호로 기록되었다: 2021년 3월 15일자로 기탁된 균주 NCFM(DSM33840); 및 2020년 5월 19일자로 기탁된 균주 Bl-04(DSM33525). 이러한 박테리아 균주는 DuPont Nutrition Biosciences ApS로부터 상업적으로 입수 가능하다.
추가적으로, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 DFM의 분비체 또는 이의 분획(예컨대, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04 및/또는 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM의 분비체)은 본 명세서에 개시된 임의의 조성물 또는 방법에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 DFM에 대한 분비체는 당업계에 알려진 임의의 표준 수단을 통해 얻을 수 있고, 배양된 세포 상청액, 변형된 상청액, 상청액 분획, 부분적으로 정제된 분비체 및 세포의 분비체 분획을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
B. 에센셜 오일
에센셜 오일은 이들의 유래된 식물의 특징적 냄새를 갖는 농축 휘발성 오일이다. 전형적으로, 에센셜 오일은 식물의 증류에 의해 얻어지며, 성분 화합물의 혼합물을 포함한다. 에센셜 오일의 이러한 성분 화합물은 아네톨, 베타-이오논, 캡사이신, 카바크롤, 신남알데하이드, 시트랄, 크레졸, 유게놀, 과이어콜, 리모넨, 티몰, 탄닌 및 바닐린을 포함한다.
본 명세서에 개시된 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 1000 ㎏의 동물 사료당 적어도 1 g의 신남알데하이드, 1000 ㎏의 동물 사료당 적어도 2 g의 신남알데하이드, 1000 ㎏의 동물 사료당 적어도 3 g의 신남알데하이드, 1000 ㎏의 동물 사료당 적어도 4 g의 신남알데하이드, 1000 ㎏의 동물 사료당 적어도 5 g의 신남알데하이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 1 ㎏의 동물 사료당 적어도 1 ㎎의 신남알데하이드, 1 ㎏의 동물 사료당 적어도 2 ㎎의 신남알데하이드, 1 ㎏의 동물 사료당 적어도 3 ㎎의 신남알데하이드, 1 ㎏의 동물 사료당 적어도 4 ㎎의 신남알데하이드, 1 ㎏의 동물 사료당 적어도 5 ㎎의 신남알데하이드를 포함할 수 있다.
육계의 경우, 본 명세서에 개시된 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 1000 ㎏의 동물 사료당 6 g 미만의 신남알데하이드; 예를 들어, 5.9 g 미만의 신남알데하이드를 포함할 수 있다. 돼지의 경우, 동물 사료는 1000 ㎏의 동물 사료당 18 g 미만의 신남알데하이드, 예컨대, 1000 ㎏의 동물 사료당 17 g 미만의 신남알데하이드, 1000 ㎏의 동물 사료당 16 g의 미만의 신남알데하이드, 1000 ㎏의 동물 사료당 15 g의 미만의 신남알데하이드, 1000 ㎏의 동물 사료당 14 g 미만의 신남알데하이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물이 티몰을 포함하는 경우, 동물 사료는 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 1 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 2 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 3 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 4 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 5 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 6 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 7 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 8 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 9 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 10 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 11 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 12 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 13 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 14 g의 티몰, 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 적어도 15 g의 티몰을 포함할 수 있다. 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 1000 ㎏의 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물당 50 g 미만의 티몰을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 성분 (i), (ii) 및 카바콜의 적어도 0.00001중량%를 포함할 수 있다. 적합하게는, 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 적어도 0.00005 중량%; 적어도 0.00010 중량%; 적어도 0.00020 중량%; 적어도 0.00025 중량%; 적어도 0.00050 중량%; 적어도 0.00100 중량%; 적어도 0.00200 중량%의 성분 (i), (ii) 및 카바콜을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 동물 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 적어도 0.0001 중량%의 사료 효소를 포함할 수 있다. 적합하게는, 동물 사료는 적어도 0.0005 중량%; 적어도 0.0010 중량%; 적어도 0.0020 중량%; 적어도 0.0025 중량%; 적어도 0.0050 중량%; 적어도 0.0100 중량%의 사료 효소를 포함할 수 있다. 동물 사료는 적어도 0.001 중량%의 동물 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 적합하게는, 동물 사료는 적어도 0.005 중량%; 적어도 0.010 중량%; 적어도 0.020 중량%; 적어도 0.100 중량%; 적어도 0.200 중량%; 적어도 0.250 중량%; 적어도 0.500 중량%의 동물 사료 첨가제 또는 사료 첨가제 조성물을 포함할 수 있다.
C. 효소
일 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 1종의 효소(예를 들어, 피타제)를 추가로 함유하는, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일, 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 DFM-함유 사료 또는 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 방법에 따라 사용하기 위한 적합한 효소는 글루코아밀라제, 자일라나제, 아밀라제, 피타제, 베타-글루카나제 및 프로테아제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
1. 글루코아밀라제
글루코아밀라제(1,4-알파-D-글루칸 글루코하이드롤라제, EC 3.2.1.3)는 전분 또는 관련된 올리고- 및 다당류 분자의 비환원 말단에서 D-글루코스의 방출을 촉매하는 효소이다. 글루코아밀라제는 여러 사상성 진균 및 효모에 의해 생산된다.
일 실시형태에서, 1종 이상의 글루코아밀라제를 포함하는, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일 및/또는 DFM 사료 또는 사료 첨가제 조성물이 본 명세서에 제공된다. 글루코아밀라제는 임의의 상업적으로 입수 가능한 글루코아밀라제일 수 있다. 적합하게는, 글루코아밀라제는 1,4-알파-D-글루칸 글루코하이드롤라제(EC 3.2.1.3)일 수 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 E.C. 효소 분류는 본 명세서에 포함된 문헌[Enzyme Nomenclature -Recommendations (1992) of the nomenclature committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - ISBN 0-12-226164-3]에 제공된 분류와 관련된다.
글루코아밀라제는 상업적 적용분야에서 여러 해 동안 성공적으로 사용되었다. 추가적으로, 열 안정성 및 비활성(specific activity)을 향상시키기 위해 다양한 돌연변이가 진균 글루코아밀라제, 예를 들어, 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)　글루코아밀라제(TrGA)에 도입되었다. 예를 들어, WO 2008/045489; WO 2009/048487; WO 2009/048488; 및 미국 특허 제8,058,033호 참조. 글루코아밀라제 활성은 아래의 실시예 부문에 기재된 것을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 수단을 이용하여 평가될 수 있다.
글루코아밀라제는 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 미생물 또는 식물로부터 유래될 수 있다. 글루코아밀라제, 예를 들어, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) G1 또는 G2 글루코아밀라제(Boel et al., 1984, EMBO J. 3(5): 1097-1102), 또는 이들의 변이체, 예컨대, WO 92/00381, WO 00/04136 및 WO 01/04273에 개시된 것(Novozymes, Denmark제); WO 84/02921에 개시되어 있는 아스페르길루스 아와모리(A. awamori) 글루코아밀라제, 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 글루코아밀라제(Hata et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55(4): 941-949), 또는 이들의 변이체 또는 단편은 아스페르길루스(Aspergillus) 글루코아밀라제로 이루어진 군으로부터 선택된 진균 또는 박테리아 유래될 수 있다. 다른 아스페르길루스 글루코아밀라제 변이체는 향상된 열 안정성을 갖는 변이체를 포함한다: G137A 및 G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505); D257E 및 D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582); N182(Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); 이황화결합, A246C(Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704; 및 A435 및 S436번 위치에 Pro 잔기의 도입(Li et al., 1997, Protein Eng. 10: 1199-1204.
다른 글루코아밀라제는 아델리아 롤프씨(Athelia rolfsii)(이전에 나타난 코티슘 롤프시(Corticium rolfsi)) 글루코아밀라제(미국 특허 제4,727,026호 및 문헌[Nagasaka et al., 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 323-330] 참조), 특히 탈라로미세스 듀폰티(Talaromyces duponti), 탈라로미세스 이멀소니(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448), 탈라로미세스 레이세타누스(Talaromyces leycettanus)(미국 특허 Re. 32,153) 및 탈라로미세스 써모필루스(Talaromyces thermophilus)(미국 특허 제4,587,215호)로부터 유래된, 탈라로미세스(Talaromyces) 글루코아밀라제를 포함한다.
박테리아 글루코아밀라제는 클로스트리듐, 특히, 모두 WO 2006/069289에 개시되어 있는 클로스트리듐 써모아밀롤리티쿰(C. thermoamylolyticum)(EP 135138) 및 클로스트리듐 써모하이드로설푸리쿰(C. thermohydrosulfuricum)(WO86/01831), 트라메테스 싱굴라타(Trametes cingulata), 파키키토스포라 파피라세아(Pachykytospora papyracea) 및 류코팍실러스 기간테우스(Leucopaxillus giganteus); 또는 WO2007/124285 또는 PCT/US2007/066618에 개시된 페니오포라 루포마르기나타(Peniophora rufomarginata); 또는 이들의 혼합물로부터 유래된 글루코아밀라제를 포함한다. 혼성 글루코아밀라제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 혼성 글루코아밀라제의 예는 WO 2005/045018에 개시되어 있다. 구체적인 예는 실시예 1의 표 1 및 표 4에 개시되는 혼성 글루코아밀라제를 포함한다(이 혼성체는 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
글루코아밀라제는 임의의 위에 언급한 글루코아밀라제와 높은 정도의 서열 동일성, 즉, 위에 언급한 성숙 효소 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 심지어 100% 동일성을 가질 수 있다.
상업적으로 입수 가능한 글루코아밀라제 조성물은 AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL 및 AMG™ E(덴마크 소재의 Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480™ 및 GC147™(미국 소재의 Genencor Int.제); AMIGASE™ 및 AMIGASE™ PLUS(DSM제); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ 및 G990 ZR(Genencor Int.제)을 포함한다.
2. 자일라나제
자일라나제는, 선형 다당류 β-1,4-자일란을 자일로스로 분해하여 식물 세포벽의 주요 구성 요소 중 하나인 헤미셀룰로스를 분해하는 효소 부류에 부여된 명칭이다. 자일라나제, 예를 들어, 엔도-β-자일라나제(EC 3.2.1.8)는 자일란 골격 사슬을 가수분해한다. 일 실시형태에서, 1종 이상의 자일라나제를 포함하는, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일 및/또는 DFM-함유 사료 또는 사료 첨가제 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 1종 이상의 자일라나제를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 자일라나제는 상업적으로 입수 가능한 자일라나제일 수 있다. 적합하게는, 자일라나제는 엔도-1,4-P-d-자일라나제(E.G. 3.2.1.8로 분류됨) 또는 1,4β-자일로시다제(E.G. 3.2.1.37로 분류됨)일 수 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 EC 효소 분류는 본 명세서에 포함된 문헌[Enzyme Nomenclature-Recommendations (1992) of the nomenclature committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - ISBN 0-12-226164-3]에 제공된 분류와 관련된다.
또 다른 실시형태에서, 자일라나제는 바실러스, 트리코더마, 테리노마이세스(Therinomyces), 아스페르길루스 및 페니실리움(Penicillium)으로부터의 자일라나제일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 자일라나제는 Axtra XAP® 또는 Avizyme 1502®(둘 모두 Danisco A/S에서 상업적으로 입수 가능한 제품임)의 자일라나제일 수 있다. 일 실시형태에서, 자일라나제는 둘 이상의 자일라나제의 혼합물일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 자일라나제는 엔도-1,4-β-자일라나제 또는 1,4-β-자일로시다제이다. 또 다른 실시형태에서, 자일라나제는 바실러스, 트리코더마(Trichoderma), 써모마이세스(Thermomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium) 및　후미콜라(Humicola)로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체로부터 유래된다. 또 다른 실시형태에서, 자일라나제는 자일라나제 중 하나 이상 또는 표 1에 열거된 상업적 제품 중 하나 이상일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 자일라나제를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 조성물은 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 350, 350 내지 400, 400 내지 450, 450 내지 500, 500 내지 550, 550 내지 600, 600 내지 650, 650 내지 700, 700 내지 750 및 750 초과의 자일라나제 단위/조성물(g)을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 500 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2500, 2500 내지 3000, 3000 내지 3500, 3500 내지 4000, 4000 내지 4500, 4500 내지 5000, 5000 내지 5500, 5500 내지 6000, 6000 내지 6500, 6500 내지 7000, 7000 내지 7500, 7500 내지 8000 및 8000 초과의 자일라나제 단위/조성물(g)을 포함한다.
1개의 자일라나제 단위(XU)는 pH 5.3 및 50℃에서 분당 귀리-스펠트-자일란(oat-spelt-xylan) 기질로부터 (디니트로살리실산(DNS) 검정-환원당 방법에 의한 자일로스로서) 0.5 μ㏖의 환원당 당량을 방출하는 효소의 양임을 이해할 것이다(문헌[Bailey, et al., Journal of Biotechnology, Volume 23, (3), May 1992, 257-270]).
3. 아밀라제
아밀라제는 전분을 말토스와 같은 짧은 사슬 올리고당으로 가수분해할 수 있는 효소 부류이다. 이어서 글루코스 모이어티는 원래 전분 분자에서보다 말토스에서 모노글리세라이드 또는 글리코실모노글리세라이드로 더 쉽게 이동할 수 있다. 용어 아밀라제는 α-아밀라제(E.G. 3.2.1.1), G4-형성 아밀라제(E.G. 3.2.1.60), β-아밀라제(E.G. 3.2.1.2) 및 γ-아밀라제(E.C. 3.2.1.3)를 포함한다. 아밀라제는 박테리아 또는 진균 유래이거나, 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체일 수 있다. 다른 실시형태에서, 1종 이상의 아밀라제를 포함하는, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일 및/또는 DFM-함유 사료 또는 사료 첨가제 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일 실시형태에서, 아밀라제는 둘 이상의 아밀라제의 혼합물일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 아밀라제는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터의 아밀라제, 예를 들어 α-아밀라제, 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 아밀라제, 예를 들어, α-아밀라제일 수 있다. 일 실시형태에서, α-아밀라제는 Axtra XAP® 또는 Avizyme 1502®(둘 모두 Danisco A/S에서 상업적으로 입수 가능한 제품임)의 α-아밀라제일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 아밀라제는 펩신 내성 α-아밀라제, 예컨대 펩신 내성 트리코더마(예컨대, 트리코더마 리세이) 알파 아밀라제일 수 있다. 적절한 펩신 내성 α-아밀라제는 UK 출원 번호 101 1513.7(본 명세서에 참고로 포함됨) 및 PCT/IB2011/053018(본 명세서에 참고로 포함됨)에 교시되어 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 아밀라제는 표 2에 열거된 하나 이상의 상업적 제품 중 하나 이상의 아밀라제일 수 있다.
1개의 아밀라제 단위(AU)는 pH 6.5 및 37℃에서 분당 수불용성 가교 전분 중합체 기질로부터 1 m㏖의 글루코시드 결합을 방출하는 효소의 양임을 이해할 것이다(이는 본 명세서에서 1 AU를 결정하기 위한 검정으로 지칭될 수 있다).
일 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 아밀라제를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 조성물은 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 350, 350 내지 400, 400 내지 450, 450 내지 500, 500 내지 550, 550 내지 600, 600 내지 650, 650 내지 700, 700 내지 750, 및 750 초과의 아밀라제 단위/조성물(g)을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 500 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2500, 2500 내지 3000, 3000 내지 3500, 3500 내지 4000, 4000 내지 4500, 4500 내지 5000, 5000 내지 5500, 5500 내지 6000, 6000 내지 6500, 6500 내지 7000, 7000 내지 7500, 7500 내지 8000, 8000 내지 8500, 8500 내지 9000, 9000 내지 9500, 9500 내지 10000, 10000 내지 11000, 11000 내지 12000, 12000 내지 13000, 13000 내지 14000, 14000 내지 15000 및 15000 초과의 아밀라제 단위/조성물(g)을 포함한다.
4. 프로테아제
본 명세서에서 사용되는 용어 프로테아제는 펩티다제 또는 프로테이나제와 동의어이다. 프로테아제는 서브틸리신(E.G. 3.4.21.62) 또는 바실로리신(E.G. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제(E.G. 3.4.21.x) 또는 케라티나제(E.G. 3.4.X.X)일 수 있다. 일 실시형태에서, 프로테아제는 서브틸리신이다. 적합한 프로테아제에는 동물, 식물 또는 미생물 유래의 프로테아제가 포함된다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 또한 적합하다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 예를 들어, 알칼리성 미생물 프로테아제 또는 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 다른 실시형태에서, 1종 이상의 프로테아제를 포함하는 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일 및/또는 DFM-함유 사료 또는 사료 첨가제 조성물이 본 명세서에 제공된다.
알칼리성 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히, 바실러스 종으로부터 유래된 것, 예를 들어, 서브틸리신 Novo, 서브틸리신 Carlsberg, 서브틸리신 309(예를 들어, 미국 특허 제6,287,841호), 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168(예를 들어, WO 89/06279)이다. 트립신 유사 프로테아제의 예는 트립신(예를 들어, 돼지 또는 소 유래의 트립신) 및 푸사리움 프로테아제(예를 들어, WO 89/06270 및 WO 94/25583 참조)이다. 유용한 프로테아제의 예에는 또한 WO 92/19729 및 WO 98/20115에 기재된 변이체가 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다.
다른 실시형태에서, 프로테아제는 표 3에 열거된 하나 이상의 상업적 제품 중 하나 이상의 프로테아제일 수 있다.
일 실시형태에서, 프로테아제는 서브틸리신, 바실로리신, 알킨 세린 프로테아제, 케라티나제, 및 노카르디옵시스(Nocardiopsis) 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된다.
1 프로테아제 단위(PU)는 pH 7.5(40 mM Na2PO4/락트산 완충액) 및 40℃에서 1분 내에 기질(0.6% 카제인 용액)로부터 1 마이크로그램의 페놀 화합물(티로신 등가물로 표현됨)을 유리시키는 효소의 양임을 이해할 것이다. 이는 1 PU를 결정하기 위한 검정으로 지칭될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 프로테아제를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 자일라나제 및 프로테아제를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 아밀라제 및 프로테아제를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 자일라나제, 아밀라제 및 프로테아제를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 조성물은 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 350, 350 내지 400, 400 내지 450, 450 내지 500, 500 내지 550, 550 내지 600, 600 내지 650, 650 내지 700, 700 내지 750 및 750 초과의 프로테아제 단위/조성물(g)을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 500 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2500, 2500 내지 3000, 3000 내지 3500, 3500 내지 4000, 4000 내지 4500, 4500 내지 5000, 5000 내지 5500, 5500 내지 6000, 6000 내지 6500, 6500 내지 7000, 7000 내지 7500, 7500 내지 8000, 8000 내지 8500, 8500 내지 9000, 9000 내지 9500, 9500 내지 10000, 10000 내지 11000, 11000 내지 12000, 12000 내지 13000, 13000 내지 14000, 14000 내지 15000 및 15000 이상의 프로테아제 단위/조성물(g)을 포함한다.
5. 피타제
다른 실시형태에서, 1종 이상의 피타제를 포함하는, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 에센셜 오일 및/또는 DFM-함유 사료 또는 사료 첨가제 조성물이 본 명세서에 제공된다. 본 발명에서 사용하기 위한 피타제는 6-피타제(E.C. 3.1.3.26으로 분류됨) 또는 3-피타제(E.C. 3.1.3.8로 분류됨)로 분류될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 피타제는 아래의 표 4의 하나 이상의 상업적 제품 중 하나 이상의 피타제일 수 있다.
일 실시형태에서, 피타제는, 예를 들어, WO2006/038062(본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 및 WO2006/038128(본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 개시된 바와 같이, 예를 들어, 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 일부 실시형태에서, 시트로박터 프레운디 NCIMB 41247 및 이의 변종, WO 2004/085638에 개시된 바와 같이 시트로박터 브라키(Citrobacter braakii) YH-15, WO2006/037328(본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 개시된 바와 같이 시트로박터 브라키　ATCC 51113뿐만 아니라, 예를 들어, WO2007/112739(본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 및 WO2011/117396(본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 개시된 바와 같이, 이의 변이체, 시트로박터 아말로나티쿠스(Citrobacter amalonaticus), 일부 실시형태에서, WO2006037327(본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 개시된 바와 같이 시트로박터 아말로나티쿠스 ATCC 25405 또는 시트로박터 아말로나티쿠스 ATCC 25407, 시트로박터 길렌니(Citrobacter gillenii), 일부 실시형태에서, WO2006037327 (본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 개시된 바와 같이 시트로박터 길렌니 DSM 13694, 또는　시트로박터 인터메디우스(Citrobacter intermedius), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 시트로박터 무르리니아(Citrobacter murliniae), 시트로박터 로덴티움(Citrobacter rodentium), 시트로박터 세드라키(Citrobacter sedlakii), 시트로박터 워크만니(Citrobacter werkmanii), 시트로박터 영가(Citrobacter youngae), 시트로박터 종 폴리펩타이드 또는 이의 변이체로부터 유래된, 시트로박터 피타제이다.
일부 실시형태에서, 피타제는　명칭 Phyzyme XP™ Danisco A/S 하에 시판되는 이콜라이 피타제이다. 대안적으로, 피타제는 부티아욱셀라(Buttiauxella) 피타제, 예를 들어, 부티아욱셀라 아그레스티스(Buttiauxella agrestis) 피타제, 예를 들어, WO 2006/043178, WO 2008/097619, WO2009/129489, WO2008/092901, PCT/US2009/41011 또는 PCT/IB2010/051804에 교시되어 있는 피타제 효소일 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 대안적으로, 피타제는 조작된, 견고한 높은 Tm 계통군 피타제 폴리펩타이드, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2020/106796에 개시되어 있는 피타제일 수 있다.
일 실시형태에서, 피타제는 하프니아(Hafnia)로부터의, 예를 들어, 하프니아 알베이(Hafnia alvei)로부터의 피타제, 예컨대, US2008263688에 교시된 피타제 효소(들)일 수 있으며, 이 참고문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일 실시형태에서,　피타제는　아스퍼질러스, 예를 들어, 아스퍼질러스 오리자에로부터 유래된 피타제일 수 있다. 일 실시형태에서, 피타제는　페니실리움, 예를 들어, 페니실리움 푸니쿨로섬(Penicillium funiculosum)로부터의 피타제일 수 있다.
일부 실시형태에서, 피타제는 약 200 FTU/㎏ 내지 약 1000 FTU/㎏ 사료 범위의 사료 또는 사료-첨가제 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 약 300 FTU/㎏ 사료 내지 약 750 FTU/㎏ 사료. 일부 실시형태에서, 약 400 FTU/㎏ 사료 내지 약 500 FTU/㎏ 사료. 일 실시형태에서, 피타제는　약 200 FTU 초과/사료(㎏), 적합하게는 약 300 FTU 초과/사료(㎏), 적합하게는 약 400 FTU 초과/사료(㎏)로 사료물에 존재한다. 일 실시형태에서, 피타제는 약 1000 FTU 미만/사료(㎏), 적합하게는 약 750 FTU 미만/사료(㎏)로 사료물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 피타제는 약 40 FTU/g 내지 약 40,000 FTU/조성물(g); 약 80 FTU/조성물(g) 내지 약 20,000 FTU/조성물(g); 약 100 FTU/조성물(g) 내지 약 10,000 FTU/조성물(g); 및 약 200 FTU/조성물(g) 내지 약 10,000 FTU/조성물(g) 범위의 사료 첨가제 조성물 중에 존재한다. 일 실시형태에서, 피타제는 약 40 FTU 초과/조성물(g), 적합하게는 약 60 FTU 초과/조성물(g), 적합하게는 약 100 FTU 초과/조성물(g), 적합하게는 약 150 FTU 초과/조성물(g), 적합하게는 약 200 FTU 초과/조성물(g)로 사료 첨가제 조성물 중에 존재한다. 일 실시형태에서, 피타제는　약 40,000 FTU 미만/조성물(g), 적합하게는 약 20,000 FTU 미만/조성물(g), 적합하게는 약 15,000 FTU 미만/조성물(g), 적합하게는 약 10,000 FTU 미만/조성물(g)로 사료 첨가제 조성물 중에 존재한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 1 FTU(피타제 단위)가 ISO 2009 피타제 분석 - 피타제 활성을 결정하기 위한 표준 분석에 정의된 반응 조건하에서 1분에 기질로부터 1 μ㏖의 무기 오쏘포스페이트를 방출하는 데 필요한 효소의 양으로서 정의되며, 1 FTU는 국제 표준 ISO/DIS　30024: 1-17, 2009에서 찾을 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 효소는 위의 E.C. 분류를 이용하여 분류되고, E.C. 분류는 1 FTU를 결정하기 위해 본 명세서의 분석 교시에서 시험될 때 해당 활성을 갖는 효소를 표시한다.
D. 사료 및 사료 첨가제 제형
단독으로 또는 적어도 1종의 복합생균제, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰), 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 적어도 1종의 다른 효소와 조합된 효소는 동물 사료 또는 프리믹스에서 사용을 위해 캡슐화될 수 있다. 또한, 단독으로 또는 적어도 1종의 복합생균제, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰), 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 적어도 1종의 프로테아제, 아밀라제, 자일라나제, 베타-글루코시다제 및/또는 피타제와 조합된 효소는, 캡슐화되든 캡슐화되지 않든, 과립 형태일 수 있다.
동물 사료는 가금, 돼지, 반추, 수산 및 애완 동물용 식물 물질, 예컨대 옥수수, 밀, 수수, 대두, 유채, 해바라기 또는 임의의 이러한 식물 물질의 혼합물 또는 식물 단백질원을 포함할 수 있다. 용어 "동물 사료", "사료물" 및 "마초"는 호환 가능하게 사용되며, a) 곡물, 예컨대 소형 낟알(예컨대, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 이의 조합) 및/또는 대형 낟알, 예컨대 옥수수 또는 수수; b) 곡물로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐식, 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS)(특히 옥수수계 가용분 함유 증류 건조 낟알(cDDGS), 밀겨, 거친 밀가루, 밀 쇼트(shorts), 쌀겨, 쌀 왕겨, 귀리 왕겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프; c) 대두, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두, 누에콩, 면실, 유채, 어류 음식, 건조 혈장 단백질, 고기 및 뼈 음식, 감자 단백질, 유장, 코프라, 참깨와 같은 공급원에서 얻어진 단백질; d) 식물 및 동물 공급원에서 얻어진 오일 및 지방; 및/또는 e) 미네랄 및 비타민을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사료 물질을 포함할 수 있다.
사료, 예컨대, 기능성 사료로서 또는 이의 제조에서 사용될 때, 본 발명의 효소 또는 사료 첨가제 조성물은 영양적으로 허용 가능한 담체, 영양적으로 허용 가능한 희석제, 영양적으로 허용 가능한 부형제, 영양적으로 허용 가능한 아쥬반트, 영양적으로 활성 성분 중 하나 이상과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 수크로스, 락토스, 소르비톨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 염화나트륨, 황산나트륨, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 소르브산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 아세트산칼륨, 시트르산칼륨, 포름산칼륨, 아세트산칼륨, 소르브산칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산마그네슘, 시트르산마그네슘, 포름산마그네슘, 소르브산마그네슘, 메타중아황산나트륨, 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성분이 언급될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 효소 또는 사료 첨가제 조성물은 사료 성분과 혼합되어 사료물을 형성한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "사료 성분"은 사료물의 전부 또는 일부를 의미한다. 사료물의 일부는 사료물의 하나의 구성성분 또는 사료물의 하나 초과의 구성성분, 예를 들어, 2종 또는 3종 또는 4종 이상의 구성성분을 의미할 수 있다. 일 실시형태에서, 용어 "사료 성분"은 프리믹스 또는 프리믹스 구성성분을 포괄한다.
바람직하게는, 사료는 마초, 또는 이의 프리믹스, 화합물 사료, 또는 이의 프리믹스일 수 있다. 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물은 화합물 사료, 화합물 사료 성분 또는 화합물 사료의 프리믹스 또는 마초, 마초 성분, 또는 마초의 프리믹스와 혼합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "마초"는 동물(그 스스로를 위해 채집하는 동물이 아님)에 제공되는 임의의 식품을 의미한다. 마초는 절단된 식물을 포괄한다. 또한, 마초에는 저장 목초, 압축 및 펠릿화 사료, 오일 및 혼합 배급사료, 그리고 또한 싹튼 낟알 및 콩류가 포함된다.
마초는 옥수수(maize), 알팔파(Lucerne), 보리, 버어즈풋트 트레포일(birdsfoot trefoil), 브라시카스(brassicas), 차우 모엘리에(Chau moellier), 케일, 평지씨(유채), 루터베가(swede), 순무, 토끼풀, 앨사이크(alsike) 토끼풀, 붉은 토끼풀, 지하 토끼풀, 흰 토끼풀, 김의털, 참새귀리, 기장, 귀리, 수수, 대두, 나무(나무-건초용 전지 나무 새싹), 밀 및 콩류로부터 선택되는 하나 이상의 식물로부터 수득될 수 있다.
용어 "화합물 사료"는 음식, 펠릿, 너트, 케이크 또는 크럼블 형태의 상업적 사료를 의미한다. 화합물 사료는 다양한 원료 및 첨가제로부터 배합될 수 있다.
이들 배합물은 표적 동물의 구체적 요건에 따라 제형화된다.
화합물 사료는 모든 일일 요구 영양소를 제공하는 완전 사료, 배급사료(단백질, 에너지)의 일부를 제공하는 농축물 또는 추가 미세영양소, 예컨대 미네랄 및 비타민만을 제공하는 보충물일 수 있다. 화합물 사료에서 이용되는 주요 성분은 사료 낟알이며, 여기에는 옥수수, 밀, 유채 음식, 평지씨 음식, 루핀, 대두, 수수, 귀리 및 보리가 포함된다.
적합하게는 본 명세서에서 언급되는 프리믹스는 미세성분, 예컨대 비타민, 미네랄, 화학 보존제, 항생제, 발효 산물, 및 다른 필수 성분으로 이루어진 조성물일 수 있다. 프리믹스는 보통 상업적 배급사료에의 배합에 적합한 조성물이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "접촉된"은 단독으로 적어도 1종의 복합생균제, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰), 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 적어도 1종의 다른 효소와 조합하여 생성물(예를 들어, 사료)에 대한 효소의 간접 또는 직접 적용을 지칭한다. 이용될 수 있는 적용 방법의 예에는, 비제한적으로 사료 첨가제 조성물을 포함하는 물질 중 제품의 처리, 사료 첨가제 조성물과 제품의 혼합에 의한 직접 적용, 제품 표면 상으로의 사료 첨가제 조성물의 스프레이 또는 사료 첨가제 조성물의 제조물 내로의 제품 침지가 포함된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 바람직하게는 제품(예컨대 사료물)과 혼합된다. 대안적으로, 사료 첨가제 조성물은 사료물의 에멀션 또는 원료 성분에 포함될 수 있다.
또한, 단독으로 또는 적어도 1종의 복합생균제, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰), 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 적어도 1종의 다른 효소와 조합된 효소는 균질화되어 분말을 생성할 수 있다. 대안의 실시형태에서, 단독으로 또는 적어도 1종의 복합생균제, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰), 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 적어도 1종의 다른 효소와 조합된 효소는 (TPT 과립으로 지칭됨) 또는 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO1997/016076 또는 WO1992/012645에 기재된 바와 같이 과립으로 제형화될 수 있다. "TPT"는 열 보호 기술(Thermo Protection Technology)을 의미한다.
또 다른 양상에서, 사료 첨가제 조성물이 과립으로 제형화되는 경우, 과립은 단백질 코어 상에 코팅된 수화된 배리어 염을 포함한다. 이러한 염 코팅의 장점은 개선된 열-관용성, 개선된 저장 안정성 및 다른 경우 효소 상에 유해 효과를 갖는 다른 사료 첨가제에 대한 보호이다. 바람직하게는, 염 코팅을 위해 사용된 염은 20℃에서 0.25 초과의 물 활성 또는 60% 초과의 일정한 습도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 염 코팅은 Na2SO4를 포함한다.
단독으로 또는 적어도 1종의 복합생균제, 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰), 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민(예컨대, 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 및/또는 적어도 1종의 다른 효소와 조합된 효소의 제조 방법은 또한 분말을 펠릿화하는 추가 단계를 포함한다. 분말은 당업계에 공지된 다른 성분과 혼합될 수 있다. 분말, 또는 분말을 포함하는 혼합물은 다이(die)를 통해 밀려나갈 수 있고, 생성 가닥은 다양한 길이의 적합한 펠릿으로 절단된다.
선택적으로, 펠릿화 단계는 펠릿의 형성 전에 증기 처리 또는 컨디셔닝 단계를 포함할 수 있다. 분말을 포함하는 혼합물은 컨디셔너, 예를 들어, 증기 주입을 갖는 혼합기에 배치될 수 있다. 혼합물은 컨디셔너에서 명시된 온도까지, 예컨대 60℃ 내지 100℃로 가열되며, 전형적인 온도는 70℃, 80℃, 85℃, 90℃ 또는 95℃일 것이다. 체류시간은 몇 초 내지 몇 분 및 심지어 몇 시간으로 가변적일 수 있다. 예컨대 5초, 10초, 15초, 30초, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분 및 1시간.
당업자는 상이한 동물이 상이한 사료물을 필요로 하며, 동물이 사육되는 목적에 따라 심지어 동일한 동물도 상이한 사료물을 필요로 할 수 있음을 이해할 것이다. 선택적으로, 사료물은 또한, 추가적인 미네랄, 예컨대 칼슘 및/또는 추가적인 비타민을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 사료물은 옥수수 대두분, 밀 또는 혼합된 곡물 믹스이다.
사료물은 전형적으로 원료가 먼저 적합한 입자 크기로 분쇄된 후, 적절한 첨가제와 혼합되는 사료 밀(mill)에서 제조된다. 이후, 사료물은 곤죽사료 또는 펠릿으로 제조될 수 있는데; 후자는 전형적으로 온도가 목표 수준까지 상승된 후 특정 크기의 펠릿을 제조하도록 사료가 다이를 통과하는 방법을 수반한다. 펠릿은 냉각하게 된다. 후속하여, 액체 첨가제, 예컨대 지방 및 효소가 첨가될 수 있다. 사료물의 제조는 또한 펠릿화 전에 특히 적어도 증기 사용을 포함할 수 있는 적합한 기법에 의한, 압출 또는 팽창을 포함하는 추가 단계를 수반할 수 있다.
사료물은 단위 동물, 예컨대 가금(예를 들어, 구이용, 산란용, 구이용 육종용, 칠면조, 오리, 거위, 고니), 및 멧돼지(모든 연령 범주), 반추동물, 예컨대 소(예컨대 젖소 또는 황소(송아지 포함)), 말, 양, 애완동물(예를 들어, 개, 고양이) 또는 어류(예를 들어, 소화관 비보유 어류, 소화관 보유 어류, 담수 어류, 예컨대 연어, 대구, 송어 및 잉어, 예컨대 코이(koi) 잉어, 염수 어류, 예컨대 씨 바스(sea bass), 및 갑각류, 예컨대, 새우, 홍합 및 조가비)를 위한 사료물일 수 있다.
사료 첨가제 조성물 및/또는 이를 포함하는 사료물은 임의의 적합한 형태로 이용될 수 있다. 사료 첨가제 조성물은 고체 또는 액체 제제 또는 이의 대안물의 형태로 사용될 수 있다. 고체 제제의 예는 습윤 가능, 분말 건조 또는 냉동 건조된 분말, 페이스터, 볼루스, 캡슐, 펠릿, 정제, 분진 및 과립을 포함한다. 액체 제제의 예는 수성, 유기 또는 수성-유기 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 적용에서, 사료 첨가제 조성물은 사료와 혼합되거나 음용수(예를 들어, 우물, 분수, 얕은 우물, 세미-아테시안(semi-artesian) 및 아테시안 우물, 도시용수, 호수 또는 개울로부터 유래된 음용수) 중에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물 중 하나 이상의 성분(예를 들어, 삼투 조절자, 에센셜 오일(들), DFM 또는 사료 효소 중 하나 이상)은 음용수 중에 투여되고, 사료 첨가제 조성물 중 하나 이상의 성분(예를 들어, 삼투 조절자, 에센셜 오일(들), DFM, 또는 사료 효소 중 하나 이상)은 함께 또는 동시에 투여된다. 워터라인 전달이 상정될 때, 사료 첨가제 조성물의 투여는 조성물을 물에 혼합하는 것, 조성물 성분(예를 들어, DFM)을 재수화시키는 것, 수화된 조성물을 투약기구에 첨가하는 것 및 도사트론(dosatron) 또는 다른 펌핑 수단을 통해 워터라인에 이를 투여하는 것 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
사료 허용 가능 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 명세서에 교시된 바와 같은 DFM(예컨대, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 DMF) 및/또는 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및/또는 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제), 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트 아세테이트 및/또는 B 비타민(예컨대 비타민 B1, B6 및/또는 B12) 중 하나 이상을 혼합하고, (선택적으로) 패키징하는 것을 포함하는, 사료 첨가제 조성물.
사료물 및/또는 사료 첨가제 조성물은 적어도 하나의 미네랄 및/또는 적어도 하나의 비타민과 조합될 수 있다. 이렇게 유래된 조성물은 본 명세서에서 프리믹스로 지칭될 수 있다. 사료물은 적어도 0.0001 중량%의 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 적합하게는, 사료물은 적어도 0.0005 중량%; 적어도 0.0010 중량%; 적어도 0.0020 중량%; 적어도 0.0025 중량%; 적어도 0.0050 중량%; 적어도 0.0100 중량%; 적어도 0.020 중량%; 적어도 0.100중량% 적어도 0.200 중량%; 적어도 0.250 중량%; 적어도 0.500중량%의 사료 첨가제를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 식품 또는 사료 첨가제 조성물은 적어도 하나의 생리적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 생리적으로 허용 가능한 담체는 바람직하게는 말토덱스트린, 석회석(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, Na2SO4, 활석, PVA 및 이의 혼합물 중 적어도 1종으로부터 선택된다. 추가 실시형태에서, 식품 또는 사료 첨가제는 금속 이온 킬레이터를 추가로 포함할 수 있다. 금속 이온 킬레이터는 EDTA 또는 시트르산으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 식품 또는 사료 첨가제 조성물은 1종 이상의 효소(예컨대, 프로테아제, 피타제, 자일라나제, 글루코아밀라제 또는 아밀라제)를 적어도 0.0001 g/㎏, 0.001 g/㎏, 적어도 0.01 g/㎏, 적어도 0.1 g/㎏, 적어도 1 g/㎏, 적어도 5 g/㎏, 적어도 7.5 g/㎏, 적어도 10.0 g/㎏, 적어도 15.0 g/㎏, 적어도 20.0 g/㎏, 적어도 25.0 g/㎏의 수준으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 사료 또는 사료 첨가제는, 사료 또는 사료 물질에 첨가될 때, 사료 물질은 1 내지 500 ㎎/㎏, 1 내지 100 ㎎/㎏, 2 내지 50 ㎎/㎏ 또는 2 내지 10 ㎎/㎏의 범위의 1종 이상의 효소를 포함하는 수준으로, 1종 이상의 효소(예컨대, 프로테아제, 피타제, 자일라나제, 글루코아밀라제 또는 아밀라제)를 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 식품 또는 사료 물질은 사료 또는 식품 물질 1 ㎏ 당 적어도 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 20000, 30000, 50000, 100000, 500000, 1000000 또는 2000000 단위의 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, a-1,2-푸코시다제 활성의 1개 단위는 표준 분석 조건 하에 분당 1몰 기질의 방출을 촉매할 수 있는 효소의 양으로 정의될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 효소를 포함하는 제형은 제형이 활성 효소를 포함한다는 것을 보장하기 위해 임의의 적합한 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 제형은 액체, 건조 분말 또는 과립일 수 있다. 바람직하게는, 사료 첨가제 조성물은 사료 펠릿 상으로 또는 사료 펠릿에 첨가하기 적합한 고체 형태이다.
건조 분말 또는 과립은 당업자에게 공지된 수단, 예컨대 고전단 과립화, 드럼 과립화, 압출, 구형화, 유동층 응집, 유동층 스프레이 건조에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 사료 첨가제 조성물은 WO2007/044968(TPT 과립으로 지칭됨) 또는 WO1997/016076 또는 WO1992/012645(각각은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 건조 분말 또는 과립으로 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 동물 사료는 코어; 활성 제제; 및 적어도 하나의 코팅을 포함하는 사료 조성물을 위한 과립으로 제형화될 수 있고, 과립의 활성 제제는 a) 사료 펠릿화 공정, b) 증기-가열 사료 전처리 공정, c) 저장, d) 펠릿화되지 않은 혼합물 중의 성분으로 저장, 및 e) 미량 미네랄, 유기산, 환원당, 비타민, 콜린 클로라이드, 및 산성 또는 염기성 사료 기재 혼합물 또는 사료 프리믹스를 생성하는 화합물로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 사료 기재 혼합물 또는 사료 프리믹스 중 성분으로 저장 중 하나 이상으로부터 선택되는 조건 후 적어도 50% 활성, 적어도 60% 활성, 적어도 70% 활성, 적어도 80% 활성을 보전한다.
과립에 대해 적어도 하나의 코팅은 과립의 적어도 55% w/w를 구성하는 수분 수화 물질을 포함할 수 있고/있거나; 적어도 하나의 코팅은 2개의 코팅을 포함할 수 있다. 2개의 코팅은 수분 수화 코팅 및 수분 배리어 코팅일 수 있다. 일부 실시형태에서, 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 60% w/w일 수 있고 수분 배리어 코팅은 과립의 2% 내지 15% w/w일 수 있다. 수분 수화 코팅은 무기 염, 수크로스, 전분 및 말토덱스트린으로부터 선택될 수 있고, 수분 배리어 코팅은 중합체, 고무, 유장 및 전분으로부터 선택될 수 있다.
사료 첨가제 조성물은 코어; 활성 제제로서, 과립의 활성 제제가 저장 후 및 과립이 하나의 성분인 증기-가열 펠릿화 공정 후 적어도 80% 활성을 보전하는 활성 제제; 수분 배리어 코팅; 및 과립의 적어도 25% w/w인 수분 수화 코팅으로서, 과립이 증기-가열 펠릿화 공정 전 0.5 미만의 수분 활성을 가지는 수분 수화 코팅을 포함하는 동물 사료용 과립으로 제형화될 수 있다.
과립은 중합체 및 고무로부터 선택되는 수분 배리어 코팅을 가질 수 있고 수분 수화 물질은 무기 염일 수 있다. 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 45% w/w일 수 있고 수분 배리어 코팅은 과립의 2% 내지 10% w/w일 수 있다.
과립은 최대 수 분 동안 85℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있는 증기-가열 펠릿화 공정을 사용해서 제조될 수 있다.
대안적으로, 조성물은 소비에 적합한 액체 제형이며, 바람직하게는 이러한 소비 액체는 완충액, 염, 소르비톨 및/또는 글리세롤 중 하나 이상을 함유한다.
또한, 사료 첨가제 조성물은 적용에 의해, 예컨대 담체 기재, 예컨대 분쇄 밀 상으로 효소(들)의 스프레이에 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 사료 첨가제 조성물은 프리믹스로 제형화될 수 있다. 단지 예로서, 프리믹스는 1종 이상의 사료 성분, 예컨대 1종 이상의 미네랄 및/또는 1종 이상의 비타민을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 적어도 1종의 DFM 및/또는 효소, 예컨대, 프로테아제, 아밀라제, 자일라나제, 베타-글루코시다제 및/또는 피타제는 말토덱스트린, 석회석(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, Na2SO4, 활석, PVA, 소르비톨, 벤조에이트, 소르베이트, 글리세롤, 수크로스, 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판 디올, 글루코스, 파라벤, 염화나트륨, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 칼슘, 메타바이설파이트, 포르메이트 및 이의 혼합물 중 적어도 하나로부터 선택되는 적어도 하나의 생리적으로 허용 가능한 담체와 제형화된다.
약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어, 광산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염을 사용할 수 있다. 사료 첨가제 및/또는 워터라인 조성물 중 약제학적으로 허용 가능한 담체는 추가로 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자에 의한 섭취를 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있도록 한다. 일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에 직접 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 인간 대상체에 대한 투여를 위해 채택된다.
III. 방법
A. 괴사성 장염을 치료 또는 예방하기 위한 방법
본 개시내용은 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 복합생균제(DFM)를 함유하는 사료, 사료 첨가제 조성물 또는 프리믹스의 유효량을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 괴사성 장염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 그러나, 일부 실시형태에서, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 DFM은 워터라인을 통해 음용수 중에서 대상체에게 전달될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 복합생균제(DFM)를 함유하는 사료, 사료 첨가제 조성물 또는 프리믹스를 함유하는 물의 유효량을 (예를 들어, 워터라인 전달을 통해) 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 괴사성 장염을 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다. 사료, 사료 첨가제 조성물 또는 프리믹스는 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량이 투여된 적이 없는 대상체에 존재하는 괴사성 장염의 발생률에 비해 괴사성 장염의 발생률 감소(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
일 실시형태에서, 괴사성 장염의 치료 또는 예방은 대상체에서 장 병변을 예방 또는 감소시키는 것을 포함한다. 구체적으로는, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량이 투여된 적이 없는 대상체에 존재하는 괴사성 장염의 발생률에 비해 장 병변의 감소(즉, 수의 감소 및/또는 중증도의 감소)(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 괴사성 장염의 치료 또는 예방은 대상체에서 사료요구율(FCR)을 감소시키는 것을 포함한다. 구체적으로는, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량이 투여된 적이 없는 대상체의 FCR에 비해서, FCR의 감소(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 괴사성 장염의 치료 또는 예방은 대상체 또는 대상체 그룹에서 사망률을 감소시키는 것을 포함한다. 구체적으로는, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량이 투여된 적이 없는 대상체 또는 대상체 그룹의 사망률에 비해서, 사망률의 감소(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 괴사성 장염의 치료 또는 예방은 대상체의 사료효율 증가를 포함한다. 구체적으로는, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량이 투여된 적이 없는 대상체의 사료효율에 비해서, 사료효율의 증가(예컨대, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1100%, 1200%, 1300%, 1400%, 1500%, 1600%, 1700%, 1800%, 1900%, 2000%, 2100%, 2200%, 2300%, 2400%, 2500% 중 어느 것만큼의 증가, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 괴사성 장염의 치료 또는 예방은 대상체의 최종 도살 체중 또는 급식의 최종 단계(들)에 들어가는 대상체 체중의 증가를 포함한다. 구체적으로는, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계는, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량이 투여된 적이 없는 대상체의 최종 도살 체중에 비해서, 최종 도살 체중의 증가(예컨대, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1100%, 1200%, 1300%, 1400%, 1500%, 1600%, 1700%, 1800%, 1900%, 2000%, 2100%, 2200%, 2300%, 2400%, 2500% 중 어느 것만큼의 증가, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 괴사성 장염의 치료 또는 예방은 대상체의 체중 증가의 증가를 포함한다. 구체적으로는, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량이 투여된 적이 없는 대상체의 체중 증가에 비해서, 체중 증가의 증가(예컨대, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1100%, 1200%, 1300%, 1400%, 1500%, 1600%, 1700%, 1800%, 1900%, 2000%, 2100%, 2200%, 2300%, 2400%, 2500% 중 어느 것만큼의 증가, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 괴사성 장염의 치료 또는 예방은 대상체의 클로스트리듐 퍼프린젠스 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB)의 발현 감소를 포함한다. NetB는 클로스트리듐 퍼프린젠스 독소유형 A 균주에 의해 생산되며, C형 균주에 의해서는 더 적은 정도로 생산된다(Kaldhusdal et al. (1999) FEMS Immunol Med Microbiol vol 24: 337-343). 단백질은 이의 활성 형태에서 322개의 아미노산 길이이며, 추정 분자량이 36.5 kDa이다. 독성의 분자 기초는 아직 거의 이해되지 않고 있지만, 여러 연구는 NetB가 막에 기공을 형성할 수 있고 작은 기공-형성 독소 계열의 여러 다른 관련 구성원과 아미노산 서열 유사성(클로스트리듐 퍼프린젠스로부터의 베타 독소로부터의 베타 독소와 38% 동일성, 클로스트리듐 퍼프린젠스 델타 독소와 40% 동일성, 및 스타필로코커스 아우레우스의 알파 독소와 31% 동일성)을 공유하기 때문에 작은 β-기공-형성 독소(β-PFT)의 새로운 구성원이라는 것을 시사한다(Keyburn et al. (2008) PLoS Pathog vol 4: e26; Manich et al. (2008) PLoS One vol 3: e3764). 처음에는 동일한 박테리아에 의해 생산된 알파 독소가 NE를 유발하는 주요 발병인자라고 가정하였지만, 알파 독소 돌연변이체를 이용한 실험은 이 균주가 여전히 독성이 있고 질환을 유발할 수 있다는 것을 나타냈다(Keyburn et al. (2006)　Infect Immun vol 74: 6496-6500). 대조적으로, netB 돌연변이체는 NE를 유발할 수 없었던 반면, 야생형 및 보완된 돌연변이체는 NE를 유발할 수 있었다(Keyburn et al. (2008)　PLoS Pathog　vol 4: e26; Manich et al. (2008)　PLoS One　vol 3: e3764). 그러나, 일부 경우에, netB 유전자가 없는　클로스트리듐 퍼프린젠스 균주조차도 여전히 독성을 나타낼 수 있다고 보고된 바와 같이, NetB가 NE를 유발하는 주요 발병인자인지의 여부는 여전히 불안정하다(Cooper & Songer (2009)　Vet Microbiol vol 142: 323-328). 또한, 알파 독소 및 다른 항원, 예컨대, 가상의 아연 메탈로프로테아제 및 파이루베이트-페레독신 산화환원효소를 이용한 면역화 연구는 NE가 발생되는 것으로부터 닭을 적절하게 보호하는 것으로 확인되었다(Cooper et al. (2009)　Vet Microbiol　vol 133: 92-97; Zekarias et al. (2008) Clin Vaccine Immunol vol 15: 805-816; Kulkarni et al. (2010)　Clin Vaccine Immunol　vol 17: 205-214; Kulkarni et al. (2007)　Clin Vaccine Immunol　vol 14: 1070-1077).
일부 실시형태에서, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량이 투여된 적이 없는 대상체의 NetB 발현에 비해서, NetB 발현의 감소(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계 또는 칠면조) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
B. 콕시듐증의 치료 또는 예방을 위한 방법
콕시듐증은 아이메리아속의 세포내 원생동물 기생충에 의한 감염에 의해 야기되는 축화계의 장 질환이다. 콕시듐증은 축화계의 가장 경제적으로 파괴적인 기생충 질환이다. 항콕시듐제 및 콕시듐증으로 인한 손실로 인해 가금 업계는 매년 수억 달러의 비용이 드는 것으로 추정된다. 이 질환은 감염된 대변과의 접촉 또는 감염된 조직의 섭취에 의해 한 동물에서 다른 동물로 퍼진다. 중증의 경우, 출혈이 있을 수 있는 설사가 주된 증상이다. 콕시듐에 감염된 대부분의 동물은 무증상이지만, 어리거나 면역손상된 동물은 중증의 증상 및 사망을 겪을 수 있다.
본 개시내용은 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 복합생균제(DFM)를 함유하는 사료, 사료 첨가제 조성물, 또는 프리믹스의 유효량을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 콕시듐증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 사료, 사료 첨가제 조성물 또는 프리믹스는 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 대상체 또는 대상체 그룹에게 투여하는 것은 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체)를 포함하는 DFM을 함유하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 유효량을 투여한 적이 없는 대상체 또는 대상체 그룹에 존재하는 콕시듐증의 발생률에 비해서 콕시듐증의 발병 또는 발생률 감소(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함)를 초래한다. 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 추가적으로 삼투 조절자(예를 들어, 베타인), 1종 이상의 에센셜 오일(예를 들어, 신남알데하이드 및/또는 티몰) 및 1종 이상의 효소(예를 들어, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제 및 아밀라제) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대상체는 가금(예를 들어, 산란계 또는 육계) 또는 돼지(예를 들어, 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지)일 수 있다.
C. 클로스트리듐 퍼프린젠스에서 NetB 독소 발현을 감소시키기 위한 방법
또한 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트 아세테이트, B 비타민 및/또는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체 중 하나 이상을 접촉시킴으로써, 클로스트리듐 퍼프린젠스의 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB) 발현을 감소시키는 방법이 본 명세서에 제공된다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 아스파르트산, 또는 이의 이온 형태 아스파르테이트를 접촉시키는 것은 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다. 아스파르트산은 단백질의 생합성에서 사용되는 α-아미노산이다. 미생물에서, 아스파르테이트는 메티오닌, 트레오닌, 아이소류신, 리신, 아스파라긴 및 아르기닌을 포함하는 여러 아미노산에 대한 전구체이다. 아스파르테이트가 이의 다른 아미노산으로 전환되는 것은 아스파르테이트가 이의 "세미알데하이드"인 O2CCH(NH2)CH2CHO로 환원되는 것으로 시작된다. 아스파라긴은 아미노기 전이를 통해 아스파르테이트로부터 유도된다. 아르기닌 생합성에서의 아스파르테이트의 역할은 도 7b에 나타낸다. 따라서, 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 아스파르트산, 또는 이의 이온 형태 아스파르테이트를 접촉시키는 것은 아스파르트산과 접촉되지 않은 세포에서의 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현에 비해서 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함). 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 추가로 삼투 조절자(예컨대, 베타인) 또는 에센셜 오일(예컨대, 티몰 또는 신남알데하이드)과 접촉된다. 추가 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금(예를 들어, 닭, 예컨대, 육계 또는 산란계)의 장에 위치된다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 오르니틴을 접촉시키는 것은 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다. 오르니틴은 아르기닌 생합성에서 어떤 역할을 하는 비 단백질 생성 아미노산이다(도 7b). 따라서, 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 오르니틴을 접촉시키는 것은 오르니틴과 접촉되지 않은 세포에서의 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현에 비해서 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함). 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 추가로 삼투 조절자(예컨대, 베타인) 또는 에센셜 오일(예컨대, 티몰 또는 신남알데하이드)과 접촉된다. 추가 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금(예를 들어, 닭, 예컨대, 육계 또는 산란계)의 장에 위치된다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 아르기닌을 접촉시키는 것은 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다. 아르기닌은 단백질의 생합성에서 사용되는 α-아미노산이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 아르기닌을 접촉시키는 것은 아르기닌과 접촉되지 않은 세포에서의 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현에 비해서 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함). 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 추가로 삼투 조절자(예컨대, 베타인) 또는 에센셜 오일(예컨대, 티몰 또는 신남알데하이드)과 접촉된다. 추가 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금(예를 들어, 닭, 예컨대, 육계 또는 산란계)의 장에 위치된다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 포스페이트의 공급원을 접촉시키는 것은 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다. 포스페이트 또는 오쏘포스페이트 이온[PO4]3-은 3개의 양성자 H+의 제거에 의해 인산으로부터 유도된다. 1 또는 2개의 양성자의 제거는 인산2수소 이온[H2PO4]- 및 인산소수 이온[HPO4]2- 이온을 각각 제공한다. 이러한 명칭은 또한, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 암모늄 인산2수소 및 인산삼나트륨과 같은 해당 음이온의 염에 대해 사용된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 포스페이트의 공급원을 접촉시키는 것은 포스페이트의 공급원과 접촉되지 않은 세포에서의 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현에 비해서 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함). 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 추가로 삼투 조절자(예컨대, 베타인) 또는 에센셜 오일(예컨대, 티몰 또는 신남알데하이드)과 접촉된다. 추가 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금(예를 들어, 닭, 예컨대, 육계 또는 산란계)의 장에 위치된다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 아세테이트를 접촉시키는 것은 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다. 아세테이트는 아세트산과 염기(예를 들어, 알칼리성, 토류, 금속성, 비금속성 또는 라디칼 염기)의 조합에 의해 형성된 염이다. 일부 미생물에서, 파이루베이트는 효소 파이루베이트 탈수소효소에 의해 아세틸-코엔자임 A(아세틸-CoA)로 전환된다. 이어서, 이런 아세틸-CoA는 기질-수준 인산화에 의해 ATP를 생성하면서, 아세테이트로 전환된다. 아세테이트 형성은 2개의 효소를 필요로 한다: 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 및 아세테이트 키나제. 따라서, 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 아세테이트를 접촉시키는 것은 아세테이트와 접촉되지 않은 세포에서의 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현에 비해서 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함). 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 추가로 삼투 조절자(예컨대, 베타인) 또는 에센셜 오일(예컨대, 티몰 또는 신남알데하이드)과 접촉된다. 추가 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금(예를 들어, 닭, 예컨대, 육계 또는 산란계)의 장에 위치된다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 하나 이상의 B 비타민을 접촉시키는 것은 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다. B 비타민은 세포 대사에서 중요한 역할을 하는 수용성 비타민의 부류이다. B 비타민의 비제한적 예는 비타민 B1, B6 및/또는 B12를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 하나 이상의 B 비타민을 접촉시키는 것은 하나 이상의 B 비타민과 접촉되지 않은 세포에서의 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현에 비해서 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함). 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 추가로 삼투 조절자(예컨대, 베타인) 또는 에센셜 오일(예컨대, 티몰 또는 신남알데하이드)과 접촉된다. 추가 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금(예를 들어, 닭, 예컨대, 육계 또는 산란계)의 장에 위치된다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체(예를 들어, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04 및/또는 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM)를 접촉시키는 것은 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다. 따라서, 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체를 접촉시키는 것은 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 및/또는 락토바실러스 아시도필루스의 분비체와 접촉되지 않은 세포에서의 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현에 비해서 클로스트리듐 퍼프린젠스 NetB 독소 발현을 감소시킨다(예컨대, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 것만큼의 감소, 이러한 백분율 사이의 모든 값을 포함함). 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 추가로 삼투 조절자(예컨대, 베타인) 또는 에센셜 오일(예컨대, 티몰 또는 신남알데하이드)과 접촉된다. 추가 실시형태에서, 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금(예를 들어, 닭, 예컨대, 육계 또는 산란계)의 장에 위치된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 이해될 수 있으며, 이는 예시로서 제공되고 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 괴사성 장염의 부정적 영향을 감소시키기 위한 베타인, 에센셜 오일 및 DFM의 용도
본 실시예는 베타인, 에센셜 오일 및 DFM을 특정 조합(들)에서 사용할 때, 개선된 병변 점수 및 조류 성능에 의해 입증된 바와 같이 괴사성 장염(NE)의 부정적 영향을 감소시킨다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
간단히 말하면, 40일령 수컷 Cobb 500 육계를 처리당 9개의 반복 펜과 총 7가지의 처리로, 바닥 펜에 두었다. 모든 조류에 3단계에 걸쳐 상업적으로 대표적인 옥수수/대두 식이를 급식하였고, 물은 자유롭게 섭취하였다. 처리군은 다음과 같았다: 비시험감염 대조군(UC), 시험감염 대조군(CC), CC+ BE(베타인; 베타인(1 ㎏/ptt), Enviva® EO(신남알데하이드 및 티몰 에센셜 오일; 100 g/ptt)이 포함됨; CC+ BE+DUAL; CC+BE+NCFM; CC+ 50% BE + DUAL; CC+ 베타인(1 ㎏/ptt)+DUAL. DUAL은 락토바실러스 아시도필루스 NCFM과 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 Bl-04의 DFM 조합물을 지칭한다. BE는 사료를 통해 투여하였지만, DFM은 연구 D1 내지 28일 동안 109 CFU를 받은 조류를 전달하기 위해 격일로 워터라인을 통해 투여하였다. 모든 식이는 750 FTU Axtra® PHY를 함유하였다. 제18일 내지 제20일에 조류를 대략 1×108 CFU/㎖ 클로스트리듐 퍼프린젠스(Cp; netB+ 균주)를 함유하는 1.0 ㎖의 유체 티오글리콜레이트(FTG) 브로스로 경구 위관 영양법을 통해 시험감염시켜 NE를 유발하였다. 대조군 조류에는 18 내지 20일령부터 1일 1회 멸균 FTG로 접종하였다. BWG, FI 및 FCR을 연구의 0, 14, 21, 28 및 42일에 기록하였다. NE 병변 점수를 D28에 수행하였다(0 내지 4).
결과
간략히 말해서, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 결과는 시험한 수준에서 BE 단독이 NE 효과를 감소시키는 데 충분하지 않은 반면, BE+NCFM의 경우 D42 사망률의 유의미한 감소(p<0.05)가 있었다는 것을 입증한다. 조류 병변 점수에 대한 가장 긍정적인 효과는 BE+NCFM 또는 BE+DUAL 조합물에 의해 나타났고, 이에 의해 조류는 1 초과의 병변 점수를 얻지 못한 것에 비해, BE 단독 처리에서는 3마리의 조류가 병변 점수 2를 얻었다. 더 나아가, BE 용량은 50%(각각 500 g 및 50 g의 베타인 및 EO)로 감소되었기 때문에, 더 많은 조류가 1.0 초과의 병변 점수를 기록한 반면, EO의 제거는 보다 중등증 병변에서 용량 반응 증가를 초래하였다.
이러한 결과는 CC에 비해 BE+NCFM 또는 DUAL 및 50% BE+ DUAL의 경우 BW의 유의미한(p<0.05) 개선이 있는 최종 BW(D42)로 해석되었지만, 베타인+DUAL 조합물의 경우 BW의 수치적 개선만 있었다(P>0.05). 따라서, 본 실시예는 NE의 부정적 효과 감소라는 목적하는 결과를 전달하는 활성 물질의 정확한 조합이라는 것을 입증하였다. 이론으로 구속되는 일 없이, 이러한 관찰된 개선은 하기 실시예 3에 따른 연구에서 측정된 바와 같이 생체내 Cp 수준의 감소, 클로스트리듐 증식의 방지, 정족수 감지 및 후속적인 감소된 Net-B 독소 생산을 통해 가능한 것으로 여겨진다.
실시예 2: 모든 활성제가 괴사성 장염의 부정적 효과를 감소시킬 수 있는 것은 아니다
실시예 2는 놀랍게도, 예상되는 항 미생물 활성을 갖는 모든 활성 물질이 조합의 일부로서 사용될 때 NE 발생을 감소시키는 능력을 입증하는 것이 아니라는 것을 입증한다. 글루코스 옥시다제(GOX)는 항-Cp 효과를 갖는 것으로 문헌에 보고되고 있고, 과산화수소 생성을 통해 이의 항미생물 활성으로 인해 통상적으로 사용되는 식품 효소이다.
물질 및 방법
본 예에서, 2160일령 수컷 Cobb 500 육계를 8개의 반복 펜/처리(펜당 45마리 조류)로 6개의 처리 펜 중 하나에 할당하였다. 모든 조류에 3단계에 걸쳐 상업적으로 대표적인 옥수수/대두 식이를 급식하였고, 물은 자유롭게 섭취하였다. 모든 식이는 750 FTU Axtra PHY를 함유하였다. 처리군은 다음과 같았다; 비시험감염 대조군(UC), 시험감염 대조군(CC), CC+BEG(베타인(1 ㎏/ptt), Enviva® EO(100 g/ptt, GOX(100 g/ptt)) + NCFM 및 Bl-04(DUAL); CC+BEG+NCFM; CC+BE+DUAL; CC+BE+NCFM. 사료를 통해 BEG 활성 물질을 투여하였고, 연구의 D1 내지 28일 동안 매일 109 CFU를 받은 조류를 전달하기 위해 워터라인을 통해 DFM을 매일 투여하였다. 조류는 제0일에 콕시듐증 백신을 받았고, UC 그룹을 제외한 모든 조류는 제19일, 제20일 및 제21일에 경구 위관 영양법을 통해 108 내지 9 CFU 필드 Cp 균주(Cp4)를 받았다. 이러한 시험감염은 경증의 NE 발병을 초래하였다. NE 병변 점수(0 내지 4) 및 장 투과성 평가(FITC-덱스트란 분석 및 밀착연접 단백질 유전자 발현)를 위해 제21일 및 제28일에 펜당 3마리의 조류를 희생시켰다. 사료 섭취량, 체중 증가 및 FCR을 제14일, 제21일, 제28일 및 제35일에 계산하였다. 사망률을 매일 기록하였다.
결과
D21의 병변 점수는 활성 물질의 모든 조합이 CC와 비교할 때 NE 병변 점수를 감소시켰다는 것을 입증하였지만(도 2a), 그러나, 조합에 1 또는 2개의 DFM 균주가 포함되어 있었는지의 여부와 상관없이, 베타인, EO 및 DFM 조합만을 받은 조류에서 NE 병변 점수의 가장 큰 감소가 관찰되었다. D28에 FITC-DEXTRAN 분석을 사용한 장 투과성의 평가에서도 동일한 결과가 나타났으며(도 2d), 이는 장 완전성이 개선되었다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 D28(도 2b) 및 D35(도 2c)에서의 조류의 체중으로 전환되었다. 예를 들어, BEG+DUAL을 받는 조류는 CC에 비해서 69 그램의 BW를 증가시킨 반면, 동일한 조합에서 GOX를 뺀 것은 D35에 BW를 185 그램으로 증가시켰다. 따라서, BE+ DFM 만을 받는 조류는 가장 높은 BW를 가졌고, CC와 유의미하게 달랐다(P<0.05). 이러한 성능 개선은 D35에 FCR에서 관찰되었다(도 2e); BEG+NCFM의 경우 FCR의 5.18 개선 대 동일한 조합에서 GOX를 뺀 경우에 8.15점.
따라서, 본 실시예는 모든 항미생물 활성 물질이 NE 발병의 동일한 긍정적 영향을 갖는다는 것은 아니라는 것을 입증하였다.
실시예 3: 처리 동물에서 클로스트리듐 퍼프린젠스 및 netB 발현의 감소
본 실시예는 특정 활성 제제가 NE 시험감염 시간 동안 클로스트리듐 퍼프린젠스 및 netB 발현 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
물질 및 방법
간략히 말해서, 1680마리의 수컷 Cobb 500일령 병아리를 처리당 8개의 반복 펜(30마리 조류/펜)으로 7가지 처리 중 하나에 할당하였다. 처리는 다음과 같았다: 비시험감염 대조군(UC), 시험감염 대조군(CC), CC+ BE(베타인(1 ㎏/ptt), Enviva® EO(100 g/ptt)); CC+ BE+3 균주 DFM; CC+BE+DUAL; CC+ BE + NCFM; CC+ BEG(베타인(1 ㎏/ptt), Enviva® EO(100 g/ptt, GOX(100 g/ptt)가 포함됨)+NCFM. DUAL은 락토바실러스 아시도필루스 NCFM과 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 Bl-04의 DFM 조합물을 지칭한다. 사료를 통해 BE 및 BEG 활성 물질을 투여하였고, 연구의 D1 내지 28일 동안 매일 109 CFU를 받은 조류를 전달하기 위해 워터라인을 통해 DFM을 매일 투여하였다. 모든 식이는 750 FTU Axtra® PHY를 함유하였다.
연구 제7일에, UC를 제외한 모든 처리에서 조류는 NE에 걸리기 쉬운 Advent 콕시듐증 백신의 10× 권장 용량을 받았다. D17에 이러한 조류는 사료를 통해 대략 108 CFU 클로스트리듐 퍼프린젠스 현장 단리물을 받았다. 제0일, 제14일, 제21일, 제28일 및 제42일에 조류 성능 매개변수를 측정하였다. NE 병변 점수의 경우 D21에 조류를 희생시켰고, 클로스트리듐 퍼프린젠스 정량화 및 Q-PCR을 통한 netB 발현을 위해 회장 면봉을 수집하였다.
결과
첨가물 보충으로 조류 성능을 수치적으로(P>0.05) 또는 유의미하게(P<0.05) 개선되었다. 미생물 분석은 BE + DUAL 또는 NCFM의 조합물이 클로스트리듐 퍼프린젠스 및 netB 발현 수준을 유의미하게 감소시켰다는 것을 입증한다(도 3a, 도 3b, 도 4A 및 도 4B).
요약하면, 본 실시예는 클로스트리듐 퍼프린젠스 수준을 감소시키고 생성된 미생물 독소의 양을 감소시킴으로써, 결과적으로 장관에 대한 손상이 더 적고, 따라서 조류 성능을 UC와 같은 수준으로 유지한다는 것을 나타냈다.
실시예 4: 클로스트리듐 퍼프린젠스에 대한 프로바이오틱스로부터의 에센셜 오일 CFS를 조합할 때의 상승적 개선
본 실험의 목적은 클로스트리듐 퍼프린젠스(CP)에 대해 프로바이오틱스, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04 및 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM의 제안된 배합 조합물로부터 무세포 상청액(CFS)과의 잠재적 상승 효과 및 Enviva® EO(에센셜 오일)를 평가하는 것이었다.
물질 및 방법
각 프로파이오틱 및 Enviva® EO 에센셜 오일의 증가되는 양의 CFS를 체커보드 방식으로 함께 첨가하고, CP를 접종하고, 밤새 성장시켰다. 이어서, 무처리 대조군(CFS 없음 및 EO 없음)에 대한 저해 백분율을 계산하였다. 간략하게, Bl-04 및 NCFM 균주를 De Man, Rogosa 및 Sharpe 배지(MRS)에서 대략 48시간 동안 37℃에서 혐기적으로 성장시켰다.
8000×g에서 10분 동안 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고 상청액을 0.2 ㎛ aPES 막을 통해 여과시킴으로써 CFS를 채취하였다. 저해 분석을 위해, 96-웰 미량정량판(Corning Costar #3370, 뉴욕 소재의 Corning)의 웰을 130 ㎕ 뇌-심근 침출 배지(BHI)로 채웠다.
Enviva® EO의 17.6 g/ℓ 용액은 멸균수로 이루어졌고, 8.8 g/ℓ의 최종 농도를 위해 BHI에서 50:50으로 희석시켰다. 이어서, BHI에서 2배 희석시켜 4.4, 2.2 및 1.1 g/ℓ의 10× 저장액 농도를 달성하였다. 이어서, 도 4에 나타낸 바와 같이 130 ㎕ BHI를 함유하는 미량정량판의 행 아래에 Bl-04 CFS를 첨가하였다. A 행의 각 웰에, 50 ㎕ CFS를 첨가하였다. B 행에, 45 ㎕를 첨가하였다. G 행에 20 ㎕가 첨가될 때까지 5 ㎕의 감소량으로 상기 공정을 플레이트 아래로 계속하였다. H 행은 CFS를 함유하지 않았다. 이어서, 20 마이크로리터의 10× EO 저장액을 각 열에 첨가하였다. 2열에, 20 ㎕의 1.1 g/ℓ(10×) EO 저장액을 각 웰에 첨가하였다. 3열에, 20 ㎕의 2.2 g/ℓ의 저장액을 첨가하였다. 4열에, 20 ㎕의 4.4 g/ℓ의 저장액을 첨가하였다. 5열에, 20 ㎕의 8.8 g/ℓ의 저장액을 각 웰에 첨가하였다. 1열(EO 없음)에, 20 ㎕ BHI 배지를 첨가하였다. 각 웰의 최종 용적은 MRS에 의해 200 ㎕가 되었다. CFS의 범위가 5 ㎕ 증분으로 5 ㎕에서 35 ㎕까지였던 것을 제외하고, NCFM 균주에 대한 설정은 동일하였다.
BHI 한천 플레이트로부터 클로스트리듐 퍼프린젠스(CP)의 단일 콜로니를 200 ㎕ BHI에 접종시켰고, 0.5 내지 0.8의 OD600으로 3.5시간 동안 성장시켰다. 이것의 2 마이크로리터를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 통기성 막으로 덮고, 37℃에서 약 16 내지 18시간 동안 혐기적으로 접종하였다. 이어서, BioTek Synergy MX 마이크로플레이트 판독기(BioTek Instruments, 버몬트주 위누스키 소재)에서 600 ㎚에서 광학 밀도를 판독하였다. 이어서, CP 증식의 저해는 0개의 CFS/0개의 EO 대조군 웰의 백분율로서 계산하였다.
결과
결과는 2개의 DFM 후보 및 Enviva® EO와 특히 더 높은 EO 농도에서 상승 효과가 있었다는 것을 나타낸다(도 5 및 도 6). 예를 들어, NCFM의 경우, 15 ㎕ CFS가 있는 EO 없음은 CP 저해가 없었다. 그리고, CFS가 없는 0.44 g/ℓ EO는 CP 저해가 없었다. 그러나, 15 ㎕ CFS가 있는 0.44 g/ℓ EO는 91% 저해가 있었다. Bl-04와 NCFM이 둘 다 있는 CFS 및 EO의 다른 농도에서 유사한 상승 효과를 볼 수 있다.
실시예 5: 대사물질의 첨가에 의한 클로스트리듐 퍼프린젠스 netB 독소 발현의 조절
본 실시예는 단일 박테리아 세포에서 유전자 발현을 평가하기 위한 신규한 기법을 사용하여 각각 높은 netB 유전자 발현 및 낮은 netB 유전자 발현을 특징으로 하는 클로스트리듐 퍼프린젠스의 단세포 집단을 확인한다. 높은 netB-발현 세포에서 발현이 감소된 대사 경로의 성분을 암호화하는 유전자를 확인하였고, 이어서, netB 발현에 대한 효과를 확인하기 위해 이러한 높은 netB-발현 세포를 이러한 대사 경로 산물로 보충하였다.
물질 및 방법
프로브 설계 및 라이브러리 생성: 기존 미세유체 단세포 서열분석 플랫폼을 활용하기 위해, DNA 프로브를 이용하여 개개 전사체에 태그를 붙이는 방법을 고안하였다. 이 접근법은 게놈 내의 모든 단백질 암호화 서열에 상보적인 거대 올리고뉴클레오타이드 라이브러리의 생성을 필요로 하였다. UPS2　소프트웨어에 의해 또는 이전에 공개된 올리고뉴클레오타이드 어레이에 기반하여 결정된 바와 같은 고유성(uniqueness)에 기반한 각 ORF로부터 50 bp의 다중 DNA 영역을 선택하였다. 이어서, 이러한 서열은 서열 상보성에 의해 표적 mRNA를 표적화하도록 설계한 ssDNA 프로브의 혼성화 영역으로서 작용하였다. 또한 프로브는 라이브러리 생성을 위한 5' PCR 핸들, 고유 분자 식별자(Unique Molecular Identifier: UMI) 및 10× 게놈 크로뮴 단세포 3' 시스템(10× Genomics Chromium Single Cell 3' system)에 원핵 전사체를 넣기 위한 3' 폴리 아데노신 꼬리(A30)를 포함하였다. 전사체 포획 효율을 향상시키고 임의의 주어진 프로브의 불량한 혼성화 및/또는 불충분한 증폭에 의해 야기되는 노이즈를 감소시키기 위해 각 유전자에 대해 다중 프로브(다른 영역에 대해 상보적)를 설계하였다. 완전한 종 라이브러리는 클로스트리듐 퍼프린젠스에 대한 11,723개의 프로브를 포함하였고, 3189개의 클로스트리듐 퍼프린젠스 유전자를 표적화하였다.
라이브러리를 Twist Biosciences로부터의 서브-펨토몰의 양으로 정렬하였고, scRNA-seq 실험을 위한 충분한 농도(0.25 ㎎ = 10.25 nM/라이브러리 또는 각 프로브에 대해 대략 0.35 pM)를 얻기 위해 회전환 증폭(rolling circle amplification)에 의해 증폭시켰다. 무작위 12 bp UMI 서열 및 폴리-A 꼬리의 첨가에 의해 프로브 라이브러리를 완성하였고, PAGE에 의해 정제하였다. 완성된 라이브러리는 프로브가 균일하게 적용되었다.
미세유체 캡슐화 전에, 박테리아를 1% 파라포름알데하이드에 고정시켰고, 투과시켰다. 투과된 박테리아를 이들의 대응하는 DNA 프로브 라이브러리와 함께 인큐베이션시켰다. 비-혼성화 프로브를 세척하였다. 다음에, 10× 컨트롤러를 통해 박테리아를 실행하여, DNA 프로브를 포획하고 바코드를 부여하였다. 얻어진 라이브러리를 서열분석하였고, 커스텀 스크립트로 전처리하였고, 표준 CellRanger 파이프라인 및 Seurat 분석 패키지로 분석하였다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 : 클로스트리듐 퍼프린젠스 균주 25037-CP01을 0.05% 시스테인-HCL, 및 지시된 경우 0.625 ㎎/㎖ 최종 농도의 오르니틴, 아스파르트산 또는 아르기닌으로 보충한 BHI 배지 내 37℃에서 혐기적으로 성장시켰다. 혐기성 조건은 가스-팩과 혐기성 배양 상자를 사용하여 유지시켰다. 모든 실험 복제물에 대한 산소 지표는 챔버에 산소 오염이 없다는 것을 나타냈다.
HT-29 인간 결장직장 선암종 세포주: HT-29 세포를 ATCC로부터 얻었고, 10% 인증 FBS(완전 배지)를 보충한 McCoy's 5A 배지(1.5 mM L-글루타민; 2200 ㎎/ℓ 탄산수소나트륨)에서 배양시켰다. 세포가 80 내지 90% 합류에 도달될 때까지 5% CO2 및 95% 습도를 함유하는 37℃ 인큐베이터 내 T75 플라스크에서 세포를 배양시켰다. 세포를 0.05% 트립신을 이용하여 세포를 탈착시킴으로써 계대배양시켰고, 원심분리시키고, 10 ㎖의 완전 배지에서 재현탁시켰다. 새로운 플라스크를 1:10로 파종하고, 위와 동일한 조건하에 인큐베이션시키거나, 기재한 바와 같은 실험을 위해 세포를 96 웰 플레이트에 파종하였다.
세포독성 분석: 웨스턴 블롯 분석에서 사용한 클로스트리듐 퍼프린젠스 배양물로부터의 조건화된 배지에 대해 세포독성을 연구하였다. 96 웰 플레이트에서, 2×104개의 HT-29 세포를 각 웰에 파종하였고, 5% CO2 및 95% 습도를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 2일 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 대체하고, 5㎕의 조건화된 클로스트리듐 퍼프린젠스 상청액을 각 웰에 첨가하고, 세포를 5% CO2 및 95% 습도를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, EVOS FLoid 현미경을 이용하여 영상을 획득하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라 세포 증식 분석 키트(BioVision)를 이용하여 세포독성을 측정하였다. 간략히 말해서, 핵염료의 1:50(1:500 최종) 희석액 20 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 플레이트 진탕기 상에서 100 rpm으로, 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 용해시키고, 플레이트 판독기(Tecan)를 이용하여 480/538 ㎚ 형광을 측정하였다.
결과
단세포 전사 분석을 이용하여 진정한 병원체에서 독성 유전자의 이종 발현이 확인될 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 노력을 하였다. 이 목적을 위해, 괴사성 장염의 원인 제제인 클로스트리듐 퍼프린젠스에서 독소 생산을 시험하였다. 괴사성 장염과 관련된 주요 독소인 NetB는 분비된 β-배럴 기공-형성 독소이며, 이는 닭의 병원성을 직접적으로 초래하는 발병인자(REFS)인 것으로 나타났다. 독소가 발현되고 성장 배지에 축적되는 시간인 지수기 후반까지 풍부한 배지(BHI, 물질 및 방법)에서 성장한 클로스트리듐 퍼프린젠스에 대해 단세포 분석을 수행하였다. NetB 독소는 모든 클러스터에서 어느 정도 기본까지 발현되었지만, netB의 차별적 과발현은 하나의 세포 클러스터의 정의적 특징이었고(도 7a, 클러스터 0) - 지수기에서 정지기로 전환하는 동안 여러 다른 OD에 걸쳐 수행된 4개의 생물학적 복제물의 각각의 독립적 분석에서 적어도 0.005의 P-값을 갖는 마커 유전자로서 NetB를 선택하였다(데이터 미제시). 흥미롭게도, 감소된 수준의 NetB를 발현시키는 클러스터의 세포는 아르기닌 합성 유전자(도 7a, 클러스터 2), 추정 파지 유전자(도 7a, 클러스터 4) 및 퓨린 및 피리미딘 합성(도 7a, 클러스터 3)을 포함하는 뚜렷한 생리학적 상태와 관련된 유전자를 차별적으로 과발현시킨다.
아르기닌 합성 유전자를 과발현시키는 세포 및 독소 유전자의 감소된 수준을 발현시키는 클러스터 2에서 아르기닌/오르니틴 역수송체에 대한 유전자의 존재는 독소 생성 집단의 독소 생산 및 크기가 아르기닌 생합성에 관련된 특정 대사물질을 제공함으로써 제어될 수 있는지의 여부에 대한 추측을 촉발시켰다. 이 가설을 시험하기 위해, 배양 배지에 아르기닌-생합성 관련 대사물질인 오르니틴, 아르기닌 및 아스파르트산을 첨가함으로써 배양 배지를 교란시켰고(도 7b), 아스파르트산을 첨가하고, 더 적은 정도로 오르니틴 및 아르기닌을 첨가하는 것은 배지에 분비되는 33 kDa NetB 독소 수준을 낮출 수 있다는 것을 발견하였다(도 7c). 세포외 독소의 감소된 수준을 확인하기 위해, 3종의 대사물질을 첨가하여 성장시킨 배양물에서 단세포 분석을 수행하였다. 아스파르트산의 첨가는 세포 클러스터링의 극적인 이동을 야기하였고, 이 배양물로부터의 단세포 데이터에서 주요 독소 생성 집단의 현저한 감소가 관찰되었다(도 7d). 오르니틴 및 아르기닌의 첨가는 세포에서 작지만 여전히 현저한 이동 및 세포에서 NetB 발현의 약간의 감소를 야기하였다. 이론으로 구속되는 일 없이, 아스파르트산의 첨가에 의해 야기된 큰 이동은 아스파르테이트가 피리미딘 합성 및 아스파르테이트 이화작용을 포함하는 본래의 단세포 데이터에서 다른 차별적으로 발현된 경로의 역할과 관련될 가능성이 있는 아르기닌 생합성에 대한 기여를 넘어서는 효과를 가질 수 있다는 추측을 유도한다(도 7a).
병원성은 NetB 독소를 낮추고 전체 집단에서 독성-발현 세포의 분획을 하향조절하는 대사물질을 첨가함으로써 조절될 수 있다는 가설에 따라, 이어서, 시험관내 조직-배양물 세포독성 연구를 위해 통상적으로 사용하는 세포주인 인간 HT29 포유류 상피 세포를 이용하여 오르니틴 또는 아스파르트산의 존재하에 성장된 세포로부터의 조건화된 배지의 세포독성을 시험하였다(도 7e). 표준 BHI 배지에서 성장시킨 박테리아의 배양물 상청액 5 ㎕를 HT29 세포의 배양물(195 ㎕)에 첨가하는 것은 대략 58%의 세포사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌다. NetB 수준의 감소 및 독성 상태의 세포의 더 적은 분율과 일치되게, 아스파르트산을 받는 박테리아로부터의 5 ㎕의 배양 배지 첨가는 HT29 세포에 대한 독성이 더 적었고, 세포 사멸이 10% 미만이었다. 오르니틴 첨가는 또한 약간 덜 독성이었고, 세포 사멸이 대략 32%였다. 전체적으로, 클로스트리듐 퍼프린젠스에 의한 결과는 독소 생산이 특수화된 세포에 의해 차별적으로 발현될 수 있으며, 다른 세포 상태를 선호하는 성장 조건을 제공함으로써 병원성을 감소시킬 수 있으며, 따라서 클론 박테리아 집단에서 독성 세포의 분율을 감소시킨다는 것을 입증한다.
실시예 6: 인산암모늄, 아세트산나트륨 또는 B 비타민(비타민 B1, B6 및 B12)의 첨가는 클로스트리듐 퍼프린젠스에 의해 생산된 세포외 NetB 수준을 낮춘다
본 실시예에서, 실시예 5에 기재한 단세포 전사 분석으로부터 얻은 데이터를 사용하여 높은 netB 유전자 발현을 특징으로 하는 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포가 포스페이트, 아세테이트, 또는 B 비타민 대사와 관련된 감소된 발현을 특징으로 하는지를 결정하였다.
물질 및 방법
클로스트리듐 퍼프린젠스의 성장: 클로스트리듐 퍼프린젠스 균주 25037-CP01을 0.05% 시스테인-HCL, 및 지시된 경우 0.625 ㎎/㎖ 최종 농도의 오르니틴, 아스파르트산 또는 다른 첨가제로 보충한 BHI 배지 내 37℃에서 혐기적으로 성장시켰다. 혐기성 조건은 가스-팩과 혐기성 배양 상자를 사용하여 유지시켰다. 모든 실험 복제물에 대한 산소 지표는 챔버에 산소 오염이 없다는 것을 나타냈다.
웨스턴 블롯 분석: 클로스트리듐 퍼프린젠스 배양물로부터 조건화된 배지를 수집하기 위해, 후기 지수 성장(대략 0.7 내지 0.8의 OD)에서 세포 배양물을 4,200×G에서 4분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 이어서, 상청액을 0.2 μM 필터를 통해 여과시켰다. 여과된 조건화 배지를 dH2O 중에 1:10으로 희석시켰고, 5 ㎕ 샘플을 MES SDS 실행 완충제와 함께 10분 동안 95℃에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 동일한 용적으로 로딩하였고, 4 내지 12% Bis Tris 폴리아크릴아마이드 겔에서 실행하였다. PAGE 겔을 제조업자 지침에 따라 Xcell-II 블롯 장치(invitrogen)를 이용하여 메탄올에 사전 침지시킨 invitrolon 45 μM PVDF 막에 옮겼다. 맞춤 다클론성 토끼 항체 및 WesternBreeze 토끼 색소생산성 웨스턴 블롯 키트(Invitrogen)를 이용하여 독소 NetB(33Kd)를 검출하였다. 모든 실험은 여러 독립적인 날에 적어도 생물학적 복제물과 기술적 삼중물을 사용하여 행하였고, 대표 영상을 선택하였다.
결과
NetB 독소를 검출하는 웨스턴 블롯은 비보충 성장 배지(BHI)에서 성장시켰을 때 검출된 세포외 독소에 비해 대사물질 인산암모늄, 아세트산나트륨 또는 B 비타민(비타민 B1, B6 및 B12)을 클로스트리듐 퍼프린젠스의 배양물에 첨가하였을 때 세포외 NetB 독소 수준이 감소되었다는 것을 입증한다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 인산암모늄 밴드는 비보충 BHI 배지에 대한 밴드보다 색이 더 연하다. 또한 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, BHI 밴드는 아세트산Na, 비타민 B1, 비타민 B6 또는 비타민 B12를 첨가한 배지로부터의 밴드보다 색이 더 진하다. 따라서, 이러한 결과에 기반하여, 임의의 대사물질 인산암모늄, 아세트산나트륨, 비타민 B1, 비타민 B6 또는 비타민 B12를 클로스트리듐 퍼프린젠스에 첨가하는 것은 괴사성 장염의 주요 원인 제제인 세포외 NetB 독소를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 복합생균제의 첨가는 클로스트리듐 퍼프린젠스에 의해 생성된 세포외 NetB 수준을 낮춘다
클로스트리듐 퍼프린젠스에 의해 야기된 괴사성 장염(NE)은 항생제 사용을 줄이라는 가중되는 압박에 따라 가금 산업에 다시 위협이 되고 있다. 항생제에 대한 대안은 명백히 일관되지 않은 효과에 대해 알려져 있다. 차세대 해결책을 개발하기 위한 일관성을 개선시키기 위한 수단으로서, 장 건강 문제의 원인과 특징을 완전히 밝혀야 한다.
본 실시예에서, 실시예 5에 기재한 scRNAseq 기술을 사용하여 NetB(다양한 상이한 독소 중 주요 발병인자로서 간주되는 기공-형성 독소)의 생산 및 병원성(또는 NE 유발성) 클로스트리듐 퍼프린젠스 균주의 세포독성에 대한 2개의 복합생균제(DFM) 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM 및 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04 균주의 분비체 효과를 분석하고 판독하였다. NetB 발현 분석을 실시예 5 및 6에서와 같이 수행하였다.
결과
두 균주의 조합된 분비체는 NetB의 생산 및 클로스트리듐 퍼프린젠스의 전반적 세포독성을 감소시켰다. DFM 분비체 둘 다의 존재하에 성장시킨 클로스트리듐 퍼프린젠스로부터의 상청액으로 HT-29 세포를 처리하여 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포독성을 60%까지 감소시켰다(도 9d; p값 <0.05). 클로스트리듐 퍼프린젠스의 생물학 및 병원성 조절에 대한 DFM 분비체 효과를 더 잘 이해하기 위해, 실시예 5에 개시된 신규한 scRNAseq 방법을 사용하여 DFM 분비체의 유무와 상관없이 성장 후 단세포의 전사체를 조사하였다.
클로스트리듐 퍼프린젠스 집단에서 이종 유전자 발현이 나타났으며, netB 독소 유전자는 주로 세포 하위 집단에 의해 발현되었다. 추가로 비피도박테리움 애니멀리스 분비체가 클로스트리듐 퍼프린젠스 집단의 전체 유전자 발현 및 생물학적 구조를 변화시켰고 netB 발현의 8배 감소가 있었다 것이 나타났다(도 9a; p값 < 6×10-7).
클로스트리듐 퍼프린젠스 집단에서 이종 유전자 발현이 나타났으며, netB 독소 유전자는 주로 세포 하위 집단에 의해 발현되었다. 추가로 락토바실러스 아시도필루스 분비체가 클로스트리듐 퍼프린젠스 집단의 전체 유전자 발현 및 생물학적 구조를 변화시켰고 netB 발현의 감소와 관련되었다는 것이 나타났다(도 9b).
NetB 독소를 검출하는 웨스턴 블롯은 세포외 NetB 독소 수준이 비보충 성장 배지(BHI)에서 성장시켰을 때 검출된 추가 세포 독성에 비해서 비피도박테리움 애니멀리스 및 락토바실러스 아시도필루스로부터의 분비체를 클로스트리듐 퍼프린젠스의 배양물에 첨가하였을 때 감소되었다는 것을 입증한다. 도 9c에서 알 수 있는 바와 같이, NetB 독소에 상응하는 밴드는 비보충 BHI 배지에 대한 밴드보다 비피도박테리움 애니멀리스 분비체의 양을 증가시킬 때 색이 더 연하다. 또한 도 9c에서 알 수 있는 바와 같이, BHI 밴드는 증가된 양의 락토바실러스 아시도필루스 분비체를 첨가한 배지로부터의 밴드보다 색이 더 진하다. 따라서, 이러한 결과에 기반하여, 비피도박테리움 애니멀리스 또는 락토바실러스 아시도필루스로부터의 임의의 분비체를 클로스트리듐 퍼프린젠스에 첨가하는 것이 괴사성 장염의 주요 원인 제제인 세포외 NetB 독소를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
병원성은 NetB 독소를 낮추고 전체 집단에서 독성-발현 세포의 분획을 하향조절하는 박테리아 분비체를 첨가함으로써 조절될 수 있다는 가설에 따라, 이어서, 시험관내 조직-배양물 세포독성 연구를 위해 통상적으로 사용하는 세포주인 인간 HT29 포유류 상피 세포를 이용하여 비피도박테리움 애니멀리스 또는 락토바실러스 아시도필루스 분비체의 존재하에 성장된 세포로부터의 조건화된 배지의 세포독성을 시험하였다(도 9d). 표준 BHI 배지에서 성장시킨 박테리아의 배양물 상청액 5 ㎕를 HT29 세포의 배양물(195 ㎕)에 첨가하는 것은 대략 65%의 세포사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌다. NetB 수준의 감소 및 독성 상태의 세포의 더 적은 분율과 일치되게, 비피도박테리움 애니멀리스 또는 락토바실러스 아시도필루스 분비체를 받는 박테리아로부터의 5 ㎕의 배양 배지 첨가는 HT29 세포에 대한 독성이 더 적었고, 세포 사멸이 30% 미만이었다. 비피도박테리움 애니멀리스와 락토바실러스 아시도필루스의 조합물은 또한 약간 덜 독성이었고, 세포 사멸이 대략 44%였다.
전체적으로, 클로스트리듐 퍼프린젠스에 의한 결과는 독소 생산이 특수화된 세포에 의해 차별적으로 발현될 수 있으며, 다른 세포 상태를 선호하는 성장 조건을 제공함으로써 병원성을 감소시킬 수 있으며, 따라서 클론 박테리아 집단에서 독성 세포의 분율을 감소시킨다는 것을 입증한다.
DSMZ DSM33525 20200519 DSMZ DSM33840 20210315 CBS CBS145918 20190724 CBS CBS145919 20190724 CBS CBS145920 20190724 CBS CBS145921 20190724 CBS CBS145922 20190724 CBS CBS145923 20190724 CBS CBS145924 20190724

Claims (48)

  1. 사료 첨가제 조성물로서, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 및/또는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 포함하는 복합생균제(direct fed microbial: DFM)를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진, 사료 첨가제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 삼투 조절자를 더 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진, 사료 첨가제 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 1종의 에센셜 오일을 더 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진, 사료 첨가제 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제, 자일라나제, 베타-글루카나제, 피타제(phytase) 및 아밀라제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 더 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어진, 사료 첨가제 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 효소는 캡슐화되거나, 과립형이거나, 냉동 건조된, 사료 첨가제 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진, 사료 첨가제 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진, 사료 첨가제 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼투 조절자는 베타인을 포함하는, 사료 첨가제 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 에센셜 오일은 신남알데하이드(cinnamaldehyde), 카바콜(carvacol) 및/또는 티몰(thymol)을 포함하는, 사료 첨가제 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 추가적인 DFM을 더 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진, 사료 첨가제 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트 및/또는 B 비타민 중 하나 이상을 더 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어진, 사료 첨가제 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 비타민은 비타민 B1, B6 및/또는 B12 중 하나 이상인, 사료 첨가제 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 적어도 하나의 성분은 워터라인(water line) 전달용으로 제형화된, 사료 첨가제 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 사료 첨가제 조성물을 포함하는, 동물 사료 또는 프리믹스(premix).
  15. 괴사성 장염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 괴사성 장염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 사료 첨가제 조성물 및 제14항의 동물 사료 또는 프리믹스를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 대상체는 가금 또는 돼지인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 가금은 육계 또는 산란계 또는 칠면조인, 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 돼지는 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지인, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 괴사성 장염 장 병변을 감소시키거나 예방하는, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 사료 첨가제 조성물 또는 제14항의 동물 사료 또는 프리믹스가 투여된 적이 없는 대상체에 비해서, 추가로 상기 대상체의 사료요구율(feed conversion ratio)을 감소시키거나, 사료효율(feed efficiency)을 증가시키거나, 사망률을 감소시키거나, 최종 도살 체중(final slaughter weight)을 증가시키거나, 체중 증가를 증가시키는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 대상체는 임상 또는 무증상(subclinical) 괴사성 장염을 갖는, 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB)의 발현을 더 감소시키는, 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사료 첨가제 조성물은 워터라인에 의해 투여되는, 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상체에 대한 항생제의 공동 투여 없이 수행되는, 방법.
  25. 콕시듐증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 콕시듐증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 사료 첨가제 조성물 및 제14항의 동물 사료 또는 프리믹스를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 대상체는 가금인, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 가금은 육계 또는 산란계인, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 사료요구율을 감소시키거나, 사료효율을 증가시키거나, 사망률을 감소시키거나, 최종 도살 체중을 증가시키거나, 체중 증가를 증가시키는, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 1가지 이상의 장내 아이메리아(Eimeria) 종을 감소시키는, 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사료 첨가제 조성물의 적어도 하나의 성분은 워터라인에 의해 투여되는, 방법.
  31. 클로스트리듐 퍼프린젠스에서 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB) 발현을 감소시키는 방법으로서, 클로스트리듐 퍼프린젠스(C. perfringens) 세포와 아스파르트산(아스파르테이트), 오르니틴, 아르기닌, 포스페이트, 아세테이트, B 비타민 및/또는 비피도박테리움 애니멀리스(B. animalis) 또는 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus) 중 하나 또는 둘 다의 분비체 중 하나 이상을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 B 비타민은 비타민 B1, B6 및/또는 B12 중 하나 이상인, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 비피도박테리움 애니멀리스는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스 균주 Bl-04이고/이거나, 락토바실러스 아시도필루스는 락토바실러스 아시도필루스 균주 NCFM인, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 가금의 장에 위치된, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 가금은 닭, 메추라기, 오리, 거위, 에뮤, 오스트리케, 꿩 또는 칠면조인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 닭은 육계 또는 산란계인, 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포와 삼투 조절자 및/또는 적어도 1종의 에센셜 오일 중 하나 이상을 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 삼투 조절자는 베타인을 포함하는, 방법.
  39. 제37항 또는 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 에센셜 오일은 신남알데하이드, 카바콜 및/또는 티몰을 포함하는, 방법.
  40. 클로스트리듐 퍼프린젠스의 괴사성 장염 B-유사 독소(NetB) 발현의 감소를 필요로 하는 대상체의 클로스트리듐 퍼프린젠스의 괴사성 장염 B-유사 독소 발현을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 사료 첨가제 조성물 또는 제14항의 동물 사료 또는 프리믹스를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어지되, 상기 클로스트리듐 퍼프린젠스 세포는 상기 대상체의 장에 위치된, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 대상체는 가금 또는 돼지인, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 가금은 육계 또는 산란계 또는 칠면조인, 방법.
  43. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 돼지는 새끼 돼지, 성장 중인 돼지 또는 암퇘지인, 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 괴사성 장염 장 병변을 감소시키거나 예방하는, 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 사료 첨가제 조성물 또는 제14항의 동물 사료 또는 프리믹스가 투여된 적이 없는 대상체에 비해서, 추가로 상기 대상체의 사료요구율을 감소시키거나, 사료효율을 증가시키거나, 사망률을 감소시키거나, 최종 도살 체중을 증가시키거나, 체중 증가를 증가시키는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 대상체는 임상 또는 무증상 괴사성 장염을 갖는, 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사료 첨가제 조성물은 워터라인에 의해 투여되는, 방법.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상체에 대한 항생제의 공동 투여 없이 수행되는, 방법.
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Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5534046A (en) 1978-09-01 1980-03-10 Cpc International Inc Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production
NO840200L (no) 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
US4536477A (en) 1983-08-17 1985-08-20 Cpc International Inc. Thermostable glucoamylase and method for its production
US4587215A (en) 1984-06-25 1986-05-06 Uop Inc. Highly thermostable amyloglucosidase
US4628031A (en) 1984-09-18 1986-12-09 Michigan Biotechnology Institute Thermostable starch converting enzymes
JPS62126989A (ja) 1985-11-26 1987-06-09 Godo Shiyusei Kk コルテイシウム属担子菌の生産する酵素を用いた澱粉質の無蒸煮糖化法
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
JP2624859B2 (ja) 1988-01-07 1997-06-25 ノボ‐ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素洗剤
US6287841B1 (en) 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
US5162210A (en) 1990-06-29 1992-11-10 Iowa State University Research Foundation Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose
DK13491D0 (da) 1991-01-25 1991-01-25 Novo Nordisk As Anvendelse af et enzymholdigt granulat og fremgangsmaade til fremstilling af et forderstof i tabletform
US5858757A (en) 1991-05-01 1999-01-12 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes and detergent compositions
US5834473A (en) * 1993-04-29 1998-11-10 Cultor, Ltd. Method for treating coccidiosis
DK52393D0 (ko) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
AU7489896A (en) 1995-11-02 1997-05-22 Novo Nordisk A/S Feed enzyme preparations
KR100561826B1 (ko) 1996-11-04 2006-03-16 노보자임스 에이/에스 섭틸라제 변종과 조성물
DE69840512D1 (en) 1997-11-26 2009-03-12 Novozymes As Thermostabile glukoamylase
AU4769999A (en) 1998-07-15 2000-02-07 Novozymes A/S Glucoamylase variants
AU5805700A (en) 1999-07-09 2001-01-30 Novozymes A/S Glucoamylase variant
US7442398B2 (en) 2003-03-25 2008-10-28 Republic Of National Fisheries Research And Development Institute Phytase produced from Citrobacter braakii
ATE457034T1 (de) 2003-10-28 2010-02-15 Novozymes North America Inc Hybridenzyme
AR050895A1 (es) 2004-10-04 2006-11-29 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de fitasa y polinucleotidos que los codifican
GB0422052D0 (en) 2004-10-04 2004-11-03 Dansico As Enzymes
WO2006038128A2 (en) 2004-10-04 2006-04-13 Danisco A/S Citrobacter freundii phytase and homologues
EP2272964A3 (en) 2004-10-04 2011-08-31 Novozymes A/S Polypeptides having phytase activity and polynucleotides encoding same
GB0423139D0 (en) 2004-10-18 2004-11-17 Danisco Enzymes
AU2005319073B2 (en) 2004-12-22 2011-03-17 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
US20100124586A1 (en) 2005-10-12 2010-05-20 Genencor International, Inc. Stable, durable granules with active agents
US7754469B2 (en) 2005-11-30 2010-07-13 Agtech Products, Inc Microorganisms and methods for treating poultry
JP5221516B2 (ja) 2006-04-04 2013-06-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ フィターゼ変異体
EP2010653A4 (en) 2006-04-19 2010-03-03 Novozymes North America Inc POLYPEPTIDES HAVING GLUCOAMYLASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME
EP2061882A2 (en) 2006-10-10 2009-05-27 Danisco US, INC., Genencor Division Glucoamylase variants with altered properties
AU2008209720C1 (en) 2007-01-30 2016-06-16 Novozymes A/S Polypeptides having phytase activty and polynucleotides encoding same
ES2550477T3 (es) 2007-02-07 2015-11-10 Danisco Us Inc. Hidrólisis de almidón utilizando fitasa con una alfa amilasa
MX289945B (es) 2007-03-26 2011-09-05 Novozymes As Fitasa de hafnia.
PL2514818T3 (pl) 2007-10-09 2014-11-28 Danisco Us Inc Odmiany glukoamylazy
ES2527586T3 (es) 2007-11-20 2015-01-27 Danisco Us Inc. Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas
US8021654B2 (en) 2008-03-14 2011-09-20 Danisco A/S Methods of treating pigs with Bacillus strains
US8673609B2 (en) 2008-04-18 2014-03-18 Danisco Us Inc. Buttiauxella sp. phytase variants
EP2553090B1 (en) 2010-03-26 2019-02-27 Novozymes A/S Thermostable phytase variants
GB201102857D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
US20240174993A1 (en) 2018-11-20 2024-05-30 Dupont Nutrition Biosciences Aps ENGINEERED ROBUST HIGH Tm-PHYTASE CLADE POLYPEPTIDES AND FRAGMENTS THEREOF
JP2022532242A (ja) * 2019-05-14 2022-07-13 オルメンデス・ソシエテ・アノニム 活性プロバイオティクス組成物の増強または不活性プロバイオティクス組成物の活性化のためのバチルス・アミロリクエファシエンスおよび／またはバチルス・サブティリスの使用、このようにして得られた組成物、ならびに関連方法
WO2021034660A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Dupont Nutrition Biosciences Aps Compositions for gut health comprising combinations of lactobacillus strains
WO2021046073A1 (en) * 2019-09-05 2021-03-11 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed composition

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