CN105722989A - 发酵中的海藻糖酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用海藻糖酶改善发酵产物包括乙醇的收率，改善酵母健康状态，尤其是减小发酵结束DP2水平的方法。

Description

发酵中的海藻糖酶

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年10月28日提交的美国临时申请序列号61/896,601的优先权权益，该临时申请全文以引用的方式并入本文。

发明背景

在燃料乙醇生产中，在发酵结束(EOF)时，相当大百分比-约50％-的“DP2峰”(DP-聚合度-等同于二糖)为海藻糖，海藻糖被认为是酵母为了同渗容摩稳定(例如，为了防止高乙醇、高葡萄糖等的细胞环境的干燥)而内部合成。此外，这些海藻糖水平可随着发酵温度而增加，经过测量高达EOFDP2水平的60％-70％。因为海藻糖形成与葡萄糖利用处于直接竞争关系，所以这种损失的碳将导致小于乙醇生产的理论收率。然而，为了增强的发酵有益效果而除去海藻糖可导致负面的发酵性能，因为已知海藻糖防止应力。但是，有参考文献提出，细胞外海藻糖的水解可用于直接的乙醇生产以及酵母生长(Basu等人，BiochemBoiphys.Acta1760,134-160(2006))。海藻糖降低EOF“残余糖”水平，同时增加乙醇收率的潜在用途受到工业关注。

一分子海藻糖通过海藻糖酶水解成两分子葡萄糖。海藻糖酶(α,α-海藻糖-1-C-葡萄糖水解酶，EC3.2.1.28)已报告来自许多生物包括原核生物、植物和动物。虽然不知道海藻糖存在于哺乳动物中，但是发现海藻糖酶存在于肾刷状缘膜和肠绒毛膜中。通过海藻糖酶的海藻糖水解是各种生物的重要生理过程，诸如真菌孢子萌发、昆虫飞行和恢复静止细胞的生长。已对至少两种类型的海藻糖酶进行表征，基于它们的最佳pH；酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶。还提出，中性海藻糖酶主要在胞质中，然而酸性海藻糖酶通常是细胞外分泌的(ParrouJL等人，FEMSYeastRes.(2005)5:503-11)。

因此，在工业中存在对发展包括除了其它方面外改善乙醇收率、减少DP2峰且改善发酵过程的海藻糖酶的方法和包含海藻糖酶的组合物的需要。

发明内容

本发明提供提高从液化液生产乙醇的方法，该方法包括：用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵液化液；以及在发酵结束时除去乙醇和其它期望的发酵产物，其中经海藻糖酶处理的发酵相比于未经海藻糖酶处理的发酵产生增加的乙醇。在另一方面中，本发明提供降低发酵产物中DP2的最终浓度的方法，该方法包括：用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵液化液；以及在发酵结束时回收期望的发酵产物，其中DP2浓度相比于未经海藻糖酶处理的发酵减少。在另一个方面中，葡糖淀粉酶为DISTILLASESSF。在另一方面中，海藻糖酶来自真核生物或丝状真菌诸如木霉属。在另一方面中，海藻糖酶是酸性海藻糖酶或中性海藻糖酶。在另一方面中，海藻糖酶以约0.1μg/gDS至约1000μg/gDS的液化液的浓度，优选地以约0.25μg/gDS至约100μg/gDS的液化液的浓度，更优选地以约0.5μg/gDS至约10μg/gDS的液化液的浓度添加。

本发明还提供提高从液化液生产乙醇的方法，该方法包括：用葡糖淀粉酶、发酵生物和发酵稳定的海藻糖酶发酵液化液；以及在发酵结束时除去乙醇和其它期望的发酵产物，其中经海藻糖酶处理的发酵相比于未经海藻糖酶处理的发酵产生增加的乙醇。

本发明还提供改善发酵反应的方法，该方法包括添加海藻糖酶，其中海藻糖酶提供改善的特征，诸如发酵期间较健康的酵母细胞、改善的乙醇产率或延长的乙醇生产。海藻糖酶可在发酵开始或发酵期间添加。

本发明还提供改善发酵反应中乙醇生产的方法，该方法包括在整个发酵反应中保持海藻糖水平低于阈值水平，其中阈值水平低于发酵开始时海藻糖浓度的两倍(％wt/v)。本发明还提供改善发酵反应中乙醇生产的方法，该方法包括将海藻糖酶添加到发酵反应中，从而在整个发酵反应中保持海藻糖水平低于阈值水平，其中阈值水平低于未将海藻糖酶添加到过程中时在发酵期间将存在的海藻糖浓度的一半(％wt/v)。

本发明还提供如上文所公开的方法，该方法还包括附加酶，该附加酶选自：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、普鲁兰酶、还原酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。

本发明还提供用于通过除去海藻糖来改善在包含液化液和回糟(backset)的发酵反应中乙醇生产的方法，包括使用海藻糖酶，其中海藻糖水平低于发酵反应的0.01％w/v。本发明还提供一种用于通过从包含回糟的液化中除去海藻糖来改善发酵反应中乙醇生产的方法，包括通过用海藻糖酶处理来除去回糟中的海藻糖，其中海藻糖水平低于回糟的0.05％w/v。

附图简述

图1-3示出在发酵期间用于各种海藻糖酶浓度和对照的海藻糖的浓度。

图4示出在36℃下具有和不具有海藻糖酶的海藻糖特征图。

图5示出在36℃下具有和不具有海藻糖酶的DP2特征图。

图6示出在36℃下具有和不具有海藻糖酶的最终乙醇产生特征图。

图7和图8示出具有或不具有海藻糖酶的各种发酵的乙醇产生特征图。

图9示出后续发酵中海藻糖的水平。

详细描述

本发明描述了包含海藻糖酶的组合物和包括海藻糖酶的方法。本发明的海藻糖酶可来自原核生物或真核生物，诸如来自真菌，具体地讲来自木霉真菌。海藻糖酶的示例性应用是针对基于淀粉的糖化和发酵。糖化和发酵可同时进行(SSF)。下文详细地描述组合物和方法的这些方面和其它方面。

在描述本发明的组合物和方法的各种方面和实施方案之前，描述以下定义和缩写。

1.定义和缩写

根据此详述，应用以下缩写和定义。除非上下文另外明确地规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物。因此，例如，提及“酶”包括多种此类酶，而提及“剂量”包括提及一种或多种剂量以及本领域技术人员已知的它们的等同物，以此类推。

本文件为了便于阅读而组织成多个节；但是，读者应理解在一节中做出的说明可适用于其它节。这样，用于本公开的不同节的标题不应理解为限制性的。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术性和科学性术语具有与本领域的普通技术人员常常所理解的相同含义。下文提供以下术语。

1.1.缩写和首字母缩写

如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外指明：

ABTS2,2-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸

AE或AEO醇乙氧基化物

AES或AEOS醇乙氧基硫酸盐

AkAA白曲霉(spergilluskawachii)α-淀粉酶

AnGA黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖淀粉酶

AOSα-烯烃磺酸酯

AS烷基硫酸盐

cDNA互补DNA

CMC羧甲基纤维素

DE右旋糖当量

DNA脱氧核糖核酸

DPn具有n个子单元的糖类聚合度

ds或DS干固体

DTMPA二亚乙基三胺五乙酸

EC酶学委员会

EDTA乙二胺四乙酸

EO环氧乙烷(聚合物片段)

EOF发酵结束

GA葡糖淀粉酶

GAU/gds葡糖淀粉酶活性单位/克干固体

HFCS高果糖玉米糖浆

HgGA灰腐质霉(Humicolagrisea)葡糖淀粉酶

IPTG异丙基β-D-硫代半乳糖苷

IRS不溶性残余淀粉

kDa千道尔顿

LAS直链烷基苯磺酸盐

LAT,BLA地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶

MW分子量

MWU修改的伍格母(Wohlgemuth)单位；1.6×10^-5mg/MWU＝活性单位

NCBI国家生物技术信息中心

NOBS壬酰羟苯磺酸盐

NTA次氮基乙酸

OxAmPurastarHPAM5000L(DaniscoUS公司)

PAHBAH对羟基苯甲酸酰肼

PEG聚乙二醇

pI等电点

PI性能指数

ppm百万分之一，例如，μg蛋白质/g干固体

PVA聚(乙烯醇)

PVP聚(乙烯吡咯烷酮)

RCF相对离心/向心力(即，x重力)

RNA核糖核酸

SAS链烷磺酸酯

SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

SSF同时糖化和发酵

SSU/g固体可溶性淀粉单位/克干固体

sp.菌种

TAED四乙酰基乙二胺

Tm解链温度

TrGA里氏木霉(Trichodermareesei)葡糖淀粉酶

w/v重量/体积

w/w重量/重量

v/v体积/体积

wt％重量％

℃摄氏度

H₂O水

dH₂O或DI去离子水

dIH₂O去离子水，Milli-Q过滤

g或gm克

μg微克

mg毫克

kg千克

μL和μl微升

mL和ml毫升

mm毫米

μm微米

M摩尔

mM毫摩尔

μM微摩尔

U单位

sec秒

min(s)分钟

hr(s)小时

DO溶解氧

Ncm牛顿厘米

ETOH乙醇

eq.当量

N当量浓度

MWCO分子量截留量

SSRL斯坦福同步辐射光源

PDB蛋白质数据库

CAZy碳水化合物活性酶数据库

Tris-HCl三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐

HEPES4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸

mS/cm毫西门子/厘米

CV柱体积

DP2二糖

HPLC高效液相色谱法

HPAEC-PAD具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法

IC离子色谱法

RID示差折射率检测器

Da道尔顿(分子量)，当提及kDa为千道尔顿时

1.2.定义

术语“海藻糖酶”是指将一个海藻糖分子催化生成两个葡萄糖分子(α-D葡萄糖和β-D葡萄糖)的酶。海藻糖酶(α,α-海藻糖-1-C-葡萄糖水解酶，EC3.2.1.28)。

术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指尤其能够催化降解淀粉的酶。α-淀粉酶是裂解淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。一般来讲，α-淀粉酶(EC3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式裂解淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键产生含有三个或更多个(1-4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖的内切-作用酶。相比之下，外切-作用淀粉分解酶诸如β-淀粉酶(EC3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些特定产物淀粉酶如产麦芽糖α-淀粉酶(EC3.2.1.133)裂解底物的非还原端的多糖分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)和特定产物淀粉酶如麦芽糖四苷酶(maltotetraosidases,EC3.2.1.60)和麦芽糖六苷酶(maltohexaosidases,EC3.2.1.98)可产生特定长度的麦芽糖-低聚糖或特定麦芽糖低聚糖的富集糖浆。优选的葡糖淀粉酶为以下氨基酸序列的TrGA变体：

SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSAVHLTWSYASFLTAAARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGHTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYRDNHPLWIGTVNLEAGDVVEYKYIIVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS(SEQIDNO:3)；如USPN8058033中所公开。

“酶单位”在本文中是指在指定的测定条件下每个时间形成的产物的量。例如，“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)定义为在60℃、pH4.2下每小时从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1g葡萄糖的酶的量。“可溶性淀粉单元”(SSU)为在pH4.5、50℃下每分钟从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1mg葡萄糖的酶的量。DS是指“干固体”。

术语“淀粉”是指包括植物的复合多糖碳水化合物的任何物质，包括具有式(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数。该术语包括基于植物的物质诸如谷粒、谷物、草、块茎和根，并且更具体地由小麦、大麦、玉米、裸麦、稻、高粱、麸皮、树薯(cassava)、粟、蜀黍、马铃薯、甘薯和木薯(tapioca)获得的物质。术语“淀粉”包括颗粒状淀粉。术语“颗粒状淀粉”是指生的即未煮过的淀粉，例如未经受糊化的淀粉。

术语“液化液”是指已发生液化的淀粉。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。相似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而需注意，编码野生型、亲本或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本或参考多肽的任何多核苷酸。

提及野生型多肽应理解为包括多肽的成熟形式。“成熟”多肽或其变体为其中信号序列不存在，例如在多肽的表达期间或之后从多肽的未成熟形式裂解的多肽。

关于多肽的术语“变体”是指因为包括一个或多个天然存在的或人为的氨基酸取代、插入或缺失而不同于指定的野生型、亲本或参考多肽的多肽。相似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指核苷酸序列不同于指定的野生型、亲本或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的同一性将根据上下文而显而易见。

当用于提及受试细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示受试者从它的天然状态得到修饰。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或者表达与自然界中发现的基因相比以不同水平或在不同条件下的天然基因。重组核酸与天然序列相差一个或多个核苷酸，和/或重组核酸可操作地连接至异源性序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白质可与天然序列相差一个或多个氨基酸，和/或重组蛋白质与异源序列融合。包含编码淀粉酶的核酸的载体是重组载体。

术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其它指定的物质或组分从如在自然界中所发现的与它自然相关联的至少一种其它物质或组分去除。“分离的”多肽因此包括但不限于含有在异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养肉汤。

术语“纯化的”是指物质(例如，分离的多肽或多核苷酸)处于相对纯的状态，例如至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯或甚至是至少约99％纯。

术语“富集的”是指物质(例如，分离的多肽或多核苷酸)处于约50％纯、至少约60％纯、至少约70％纯或甚至是至少约90％纯或更多。

关于酶诸如淀粉酶或海藻糖酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露至升高的温度之后保持活性的能力。酶诸如淀粉酶的热稳定性是通过在限定的条件下损失一半的酶活性的数分钟、数小时或数天中得到的它的半衰期(t_1/2)来测量。半衰期可通过在暴露至升高的温度(即，挑战)之后测量残余的α-淀粉酶活性来计算。

关于酶的“pH范围”是指酶表现出催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”是指酶在宽泛的pH值范围内保持活性持续预定的时间段(例如，15min、30min、1小时)的能力。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们被称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母密码或三字母密码，其中氨基酸序列以标准氨基至羧基末端取向(即，N→C)呈现。

术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可以是单链或双链，并且可以是化学修饰的。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码是简并的，所以多于一个密码子可用于编码特定氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另外指明，否则核酸序列以5'至3'取向呈现。

“杂交”是指核酸的一条链与互补链形成双链体即碱基对的过程，如印迹杂交技术和PCR技术期间发生的过程。严格杂交条件通过在以下条件下的杂交来举例说明：65℃和0.1XSSC(其中1XSSC＝0.15MNaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH7.0)。杂交双链体核酸通过解链温度(T_m)来表征，其中一半的杂交核酸未与互补链配对。在双链体内错配的核苷酸使T_m降低。

“合成”分子是通过体外化学合成或酶合成而非通过有机体来产生。

相对于细胞所使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因”是指细胞含有整合进它的基因组或作为保持多个世代的附加体(episome)承载的非天然(例如，异源)核酸序列。非天然序列可以是内源序列。

在将核酸序列插入到细胞中的情形中，术语“引入的”是指如本领域中已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”为表达载体、噬菌体、病毒或其它DNA构建体，包括编码感兴趣的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸已引入其中的生物。示例性宿主菌株为能够表达感兴趣的多肽和/或发酵糖类的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源的”是指核苷酸或蛋白质不在宿主细胞中天然存在。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源的”是指核苷酸或蛋白质在宿主细胞中天然存在。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

“选择性标记”或“可选标记”是指能够在宿主中表达以有利于承载基因的宿主细胞的选择的基因。可选标记的示例包括但不限于抗微生物剂(例如，潮霉素、博莱霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势诸如营养优势的基因。

术语“载体”是指多核苷酸序列，其被设计用于将核酸引入到一个或多个细胞类型中。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

“表达载体”是指包含编码感兴趣的多肽的DNA序列的DNA构建体，该编码序列可操作地连接至能够在合适的宿主中实现DNA的表达的合适的控制序列。此类控制序列可包括用以实现转录的启动子、用以控制转录的任选操纵子序列、编码mRNA上的合适的核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译的终止的序列。

术语“可操作地连接”是指指定的组分处于使得它们以预期的方式起作用的关系(包括但不限于并置)中。例如，调控序列可操作地连接至编码序列，使得编码序列的表达处于调控序列的控制下。

“信号序列”是连接至蛋白质的N末端部分的氨基酸序列，该序列有利于将蛋白质分泌在细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式不含信号序列，信号序列在分泌过程期间被裂解掉。

“生物活性”是指序列具有指定的生物活性，诸如酶活性。

术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间可通过酶或酶制剂转换成产物的底物的摩尔数。比活性一般表达为单位(U)/毫克蛋白质。

如本文所用，“水硬度”为水中存在的矿物质(例如，钙和镁)的量度。

如本文所用，“有效量的淀粉酶”或类似表达是指在具体应用中足以产生可视的或以其它方式可测量的淀粉水解的淀粉酶的量。淀粉水解可导致例如织物或盘碟的可视的清洁、淀粉浆液或醪液的粘度减小等等。

“样本”为施加了污渍的一片材料，诸如织物。材料可为例如由棉花、聚酯或天然纤维与合成纤维的混合物制成。样本还可为纸材诸如滤纸或硝化纤维，或硬材料片诸如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但可包括血液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、乳酪、粘土、颜料、油或这些化合物的混合物。

“较小样本”为一段样本或以其它方式已从样本移除的节段，其已利用单孔冲头装置切割，或已利用定制制造的96孔冲头装置切割，其中多孔冲头的图案匹配于标准96孔微量滴定板。样本可为纺织物、纸材、金属或其它合适的材料。较小样本可具有在其置于24孔、48孔或96孔微量滴定板中之前或之后附连的污渍。较小样本还可通过将污渍施加到一小片材料来制成。例如，较小样本可为一片直径为5/8”或0.25”的脏污织物。定制制造的冲头是以它将96个样本同时递送至96孔板的所有孔的方式进行设计。该装置允许通过多次简单地加载相同的96孔板来递送每孔多于一个样本。多孔冲头装置可构想成将样本同时递送至任何格式板，包括但不限于24孔板、48孔板和96孔板。在另一个可构想的方法中，染污的测试平台可为涂覆有污垢底物的由金属、塑料、玻璃、陶瓷或另一合适的材料制成的珠粒。然后可将一个或多个经涂覆的珠粒置于96孔板、48孔板或24孔板或更大规格的含有合适的缓冲液和酶的孔中。

“包含酶的培养细胞材料”或类似语言是指包括酶作为组分的细胞裂解液或上清液(包括培养基)。细胞材料可来自出于产生酶的目的生长在培养物中的异源宿主。

“序列同一性百分比”是指当以预设参数使用CLUSTALW算法比对时，具体序列具有与指定参考序列的氨基酸残基至少一定百分比相同的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680。CLUSTALW算法的预设参数为：

缺失计数为与参考序列相比不相同的残基。包括在任何末端发生的缺失。例如，缺失C末端的五个氨基酸残基的变体500个氨基酸残基多肽具有相对于亲本多肽的99％(495/500个相同残基×100)的序列同一性百分比。此类变体由语言“具有与亲本至少99％序列同一性的变体”涵盖。

“融合的”多肽序列通过两个受试多肽序列之间的肽键来连接，即，可操作地连接。

术语“丝状真菌”是指真菌亚门的所有丝状形式，尤其是盘菌亚门物种。

术语“聚合度”(DP)是指给定糖类中无水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的示例为单糖葡萄糖和果糖。DP2的示例为二糖麦芽糖和蔗糖。术语“DE”或“右旋糖当量”定义为糖浆中作为总碳水化合物的一部分的还原糖，即D-葡萄糖，的百分比。

术语“干固体含量(ds)”是指以干重百分比计，浆液的总固体。术语“浆液”是指含有不溶性固体的含水混合物。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指产生生物化学品的过程，其中在相同处理步骤期间存在微生物有机体诸如产乙醇微生物和至少一种酶诸如淀粉酶。SSF包括将淀粉底物(颗粒状的、液化的或增溶的)同期水解成糖类包括葡萄糖，并且在相同反应器容器中将糖类发酵成醇或其它生物化学品或生物材料。

“产乙醇微生物”是指具有将糖或低聚糖转化成乙醇的能力的微生物。

术语“发酵饮料”是指通过包括发酵过程(诸如微生物发酵，例如细菌和/或真菌发酵)的方法生产的任何饮料。“啤酒”为此类发酵饮料的示例，并且术语“啤酒”是指包括通过发酵/酿造含有淀粉的植物材料所生产的任何发酵麦芽汁。常常，啤酒仅由麦芽或辅料或麦芽和辅料的任何组合来生产。

术语“麦芽”是指任何发芽的谷物谷粒，诸如发芽的大麦或小麦。

术语“辅料”是指不是麦芽(诸如大麦麦芽或小麦麦芽)的任何含有淀粉和/或糖的植物材料。辅料的示例包括普通粗磨玉米粉、细磨玉米粉、制啤酒用研磨酵母、稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘培的谷物、谷物片、裸麦、燕麦、马铃薯、木薯、树薯和糖浆(诸如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖糖浆、大麦和/或小麦糖浆)等等。

术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(诸如例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其它辅料或它们的组合的含水浆液，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。

术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化工艺中对谷粉进行提取后未发酵的液体流出物(run-off)。

“碘阳性淀粉”或“IPS”是指(1)在液化和糖化之后未水解的直链淀粉，或(2)回生(retrograded)淀粉聚合物。当利用碘测试糖化淀粉或糖类液体时，高DPn直链淀粉或回生淀粉聚合物结合碘并且产生特征蓝色。糖类液体因此称为“碘阳性糖类”、“蓝色糖类”或“蓝色sac”。

术语“回生淀粉”或“淀粉回生”是指在老化时自发地发生在淀粉糊料或凝胶中的变化。

术语“约”是指引用值的±15％。

2.本发明的酶

海藻糖酶

海藻糖酶为将一个海藻糖分子催化生成两个葡萄糖分子(α-D葡萄糖和β-D葡萄糖)的酶。海藻糖酶(α,α-海藻糖-1-C-葡萄糖水解酶，EC3.2.1.28)已报告来自许多生物包括原核生植物和动物。虽然不知道海藻糖存在于哺乳动物中，但是发现海藻糖酶存在于肾刷状缘膜和肠绒毛膜中。通过海藻糖酶的海藻糖水解是各种生物的重要生理过程，诸如真菌孢子萌发、昆虫飞行和恢复静止细胞的生长。已知至少两种类型的海藻糖酶，基于它们的最佳pH；酸性(细胞外)海藻糖酶和中性(胞质)海藻糖酶。本发明的海藻糖酶可使用本领域中已知的分子生物学技术从感兴趣的生物中分离。海藻糖酶可来源于原核生物或真核生物。例如，已知木霉属真菌具有至少两种海藻糖酶，酸性(细胞外)海藻糖酶和中性(胞质)海藻糖酶。原核海藻糖酶也是可购得的：MEGAZYMES(MegazymesInternational,Ireland)。海藻糖酶可以是可示出超过它的亲本分子的改善特性的变体海藻糖酶。

在一些实施方案中，本发明的酶具有与其它酶的限定的氨基酸序列同一性程度，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至是至少99％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，本发明的酶来源于具有限定的氨基酸序列同一性程度，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的亲本酶。

在一些实施方案中，本发明的酶包括一个或数个氨基酸残基相对于亲本酶的氨基酸序列的保守置换。示例性保守氨基酸置换列于表1中。一些保守突变可通过基因操纵产生，然而其它突变通过将合成氨基酸引入到多肽中或其它手段来产生。

表1.保守氨基酸置换

在一些实施方案中，本发明的酶包括一个或多个氨基酸残基的缺失、置换、插入或添加。在一些实施方案中，本发明的酶来源于亲本酶通过一个或数个氨基酸残基的保守置换得到的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的酶来源于亲本酶通过一个或多个氨基酸残基的缺失、置换、插入或添加得到的氨基酸序列。在所有情况下，表达“一个或多个氨基酸残基”是指10个或更少，即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基。

在一些实施方案中，本发明的酶由核酸编码，该核酸在严格条件下杂交至与编码本发明的酶的核酸互补的核酸序列。

本发明的酶可以是“前体”酶、“未成熟”酶或“全长”酶，在这些情况下它们可包含信号序列，或可以是“成熟”酶，在这种情况下它们可不含信号序列。多肽的成熟形式一般是最有用的。除非另有说明，否则本文所用的氨基酸残基编号是指相应多肽的成熟形式。本发明的酶多肽还可经过截短以除去N末端或C末端，只要所得的多肽保留酶活性即可。

本发明的酶可以是“嵌合”或“杂交”多肽，因为它包括第一酶多肽的至少一部分和第二酶多肽的至少一部分(此类嵌合酶最近被“重新发现”为结构域交换酶)。本发明的酶可还包含异源信号序列或表位例如以允许跟踪或纯化。示例性异源信号序列来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(AmyE或AprE)和链霉菌CelA。

在另一方面中，提供编码酶多肽的核酸。核酸可编码包含具有指定氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列的酶。在一些实施方案中，核酸编码具有与亲本酶至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至是至少99％氨基酸序列同一性的酶。在一些实施方案中，核酸具有与亲本酶至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至至少98％的核苷酸序列一致性。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括编码具有缺失、插入或置换的酶的核酸，诸如上文提及的那些。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可编码相同的多肽。

在另一个实施例中，核酸在严格条件或极严格条件下杂交至与编码具有与亲本酶至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至99％氨基酸序列同一性的酶的核酸互补的核酸。在一些实施方案中，核酸在严格条件或极严格条件下杂交至与具有亲本酶的序列的核酸互补的核酸。此类杂交条件描述于本文中但也是本领域中已知的。

核酸可编码包含信号序列的“全长”(“fl”或“FL”)酶、仅酶的不含信号序列的成熟形式、或酶的不含成熟形式的N末端或C末端的截短形式。优选地，核酸的长度足以编码活性酶。

编码酶的核酸能够可操作地连接至适用于在宿主细胞中表达酶的载体中的各种启动子和调节子。示例性启动子来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(AmyE或AprE)和链霉菌CelA。此类核酸还可连接至其它编码序列例如以编码嵌合多肽。

3.本发明的酶的产生

本发明的酶可在宿主细胞中例如通过分泌或细胞内表达来产生。包含酶的培养细胞材料(例如，全细胞肉汤)可在将酶分泌至细胞培养基中之后获得。任选地，根据最终酶的期望纯度，酶可从宿主细胞中分离或甚至是从细胞肉汤中分离。编码酶的基因可根据本领域中熟知的方法克隆并表达。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。尤其可用的宿主细胞包括黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)或里氏木霉(Trichodermareesei)。其它宿主细胞包括细菌细胞例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌以及链霉菌。

宿主细胞还可表达编码同源葡糖淀粉酶或异源葡糖淀粉酶(即不与宿主细胞同种的葡糖淀粉酶，或一种或多种其它酶)的核酸。葡糖淀粉酶可为变体葡糖淀粉酶，诸如在例如美国专利8,058,033(DaniscoUS公司)中公开的葡糖淀粉酶变体中的一种。另外，宿主可表达一种或多种辅助酶、蛋白质或肽。这些可有益于液化、糖化、发酵、SSF过程。此外，宿主细胞可产生除用于煮解各种原料的酶之外的生物化学品。此类宿主细胞可用于发酵或同时糖化和发酵过程以减少或消除对添加酶的需要。

3.1.载体

包含编码酶的核酸的DNA构建体可被构造成在宿主细胞中表达。因为遗传编码中熟知的简并性，所以编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可被设计并且利用常规技能制备。优化用于特定宿主细胞的密码子也是本领域中熟知的。编码酶的核酸可结合到载体中。载体可使用熟知的转化技术诸如下文公开的那些技术转移至宿主细胞。

载体可为可转化至宿主细胞中且在宿主细胞内复制的任何载体。例如，作为繁殖和扩增载体的方法，包含编码酶的核酸的载体可在细菌宿主细胞中转化和复制。载体还可转化至表达宿主中，使得编码核酸可表达为功能性酶。充当表达宿主的宿主细胞可包括例如丝状真菌。真菌遗传学库存中心(FGSC)菌株目录列出适用于在真菌宿主细胞中表达的载体。参见FGSC，菌株目录，UniversityofMissouri，在www.fgsc.net(2007年1月17日最后一次修改)。代表性载体为pJG153，它是可在细菌宿主中复制的无启动子Cre表达载体。参见Harrison等人(2011)AppliedEnviron.Microbiol.77:3916-22。pJG153可利用常规技能修饰以包含且表达编码酶变体的核酸。

编码酶的核酸能够可操作地连接至合适的启动子，从而允许在宿主细胞中转录。启动子可以是在所选宿主细胞中显示出转录活性的任何DNA序列并且可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。特别是在细菌宿主中用于指导编码酶的DNA序列的转录的示例性启动子为大肠杆菌(E.coli)的lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂水解酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，有用的启动子的示例为来源于编码以下的基因的启动子：米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。当编码酶的基因在菌种诸如大肠杆菌中表达时，合适的启动子可选自例如噬菌体启动子，包括T7启动子和噬菌体λ启动子。用于在酵母菌种中表达的合适的启动子的示例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Gal1和Gal10启动子以及巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)AOX1或AOX2启动子。cbh1为里氏木霉的内源性诱导型启动子。参见Liu等人(2008)“ImprovedheterologousgeneexpressioninTrichodermareeseibycellobiohydrolaseIgene(cbh1)promoteroptimization(通过纤维二糖水解酶I基因(cbh1)启动子优化改善里氏木霉中异源性基因表达)，”ActaBiochim.Biophys.Sin(上海)40(2):158-65。

编码序列能够可操作地连接至信号序列。编码信号序列的DNA可为与待表达的酶基因天然相关联或来自不同的属或种的DNA序列。可将包含DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列引入至真菌宿主细胞中并且可来源于相同的来源。例如，信号序列为可操作地连接至cbh1启动子的cbh1信号序列。

表达载体还可包含合适的转录终止子和在真核生物中可选地连接至编码酶的DNA序列的聚腺苷酸化序列。终止序列和聚腺苷酸化序列可适当地源自与启动子相同的来源。

载体还可包含使得载体在宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的示例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体还可包含选择性标记，例如其产物补充分离的宿主细胞中的缺陷的基因，诸如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。此外，载体可包含曲霉属选择标记诸如amdS、argB、niaD和xxsC，具有潮霉素抗性，或选择可通过共转化来实现。

细胞内表达可在一些方面中是有利的，例如当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞以产生大量酶用于后续的富集或纯化时。酶向培养基中的细胞外分泌还可用于制备包含分离的酶的培养细胞材料。

表达载体通常包括克隆载体的组分，诸如例如允许载体在所选宿主生物中自主复制的元件，和一个或多个为了选择目的在显型上可检测的标记。表达载体通常包含对照核苷酸序列诸如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏蛋白基因或一个或多个激活因子基因。另外，表达载体可包含编码能够将酶靶向宿主细胞细胞器官诸如过氧化物酶体或靶向特定宿主细胞隔室的氨基酸序列的序列。此类靶向序列包括但不限于序列SKL。为了在控制序列的指导下表达，酶的核酸序列以适于表达的方式可操作地连接至控制序列。

用于分别连接编码酶、启动子、终止子和其它元件的DNA构建体，以及将它们插入至含有为复制所必需的信息的合适的载体中的过程为本领域的技术人员所熟知(参见例如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor,1989，和第3版，2001)。

3.2.宿主细胞的转化和培养

包含DNA构建体或表达载体的分离细胞有利地用作酶的重组产生中的宿主细胞。细胞可用编码酶的DNA构建体，便利地通过将DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合在宿主染色体中来转化。这种整合一般被认为是一个优点，因为DNA序列更有可能被稳定地保持在细胞中。可根据常规方法来进行DNA构建体向宿主染色体中的整合，例如通过同源重组或异源重组来进行。另选地，细胞可用如上所述的表达载体结合不同类型的宿主细胞来转化。

合适的细菌宿主生物的示例为革兰氏阳性菌菌种，诸如芽胞杆菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短乳杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(先前为芽孢杆菌属)、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和苏云金芽孢杆菌；链霉菌属种，诸如鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)；乳酸菌种，包括乳球菌属(Lactococcussp.)，诸如乳酸乳球菌属(Lactococcuslactis)；乳杆菌属(Lactobacillussp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；明串珠菌属(Leuconostocsp.)；小球菌属(Pediococcussp.)；和链球菌属(Streptococcussp.)。另选地，可选择属于肠杆菌包括大肠杆菌或属于假单胞菌科的菌株的革兰氏阴性菌菌种作为宿主生物。

合适的酵母宿主生物可选自与生物技术相关的酵母种诸如但不限于酵母种类诸如毕赤酵母属(Pichiasp.)、汉逊酵母属(Hansenulasp.)，或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属或酵母属的一种，包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或属于裂殖酵母(Schizosaccharomyces)的一种，诸如例如像粟酒裂殖酵母(S.pombe)菌种。甲基营养酵母菌种巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的菌株可用作宿主生物。另选地，宿主生物可为汉逊酵母属菌种。在丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉属的菌种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。另选地，镰孢属菌种例如尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)或根毛霉(Rhizomucor)菌种诸如米黑根毛霉的菌株可用作宿主生物。其它合适的菌株包括嗜热真菌属(Thermomyces)和毛霉菌菌种。此外，木霉属(Trichodermasp.)诸如里氏木霉可用作宿主。转化曲霉属宿主细胞的合适的程序包括例如EP238023中所述的程序。真菌宿主细胞表达的酶可为糖基化的，即将包含糖基部分。糖基化模式可与野生型酶中存在的相同或不同。糖基化的类型和/或程度可使酶特性和/或生物化学特性发生变化。

有利的是使表达宿主的基因缺失，其中该基因缺陷可由转化的表达载体来处理。已知的方法可用于获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过使基因对于其指定用途而言无功能从而防止该基因表达有功能的蛋白的任何其它方式而实现基因失活。可使木霉属(Trichodermasp.)或已被克隆的其它丝状真菌宿主的任何基因缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。基因缺失可通过本领域中已知的方法，通过将待失活的期望基因的一种形式插入到质粒中来实现。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括诸如以下的技术：转化；电穿孔；细胞核显微注射；转导；转染，例如脂质转染介导和DEAE-糊精介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀一起温育；用DNA包被的微粒子弹进行高速轰击；以及原生质体融合。一般转化技术在本领域中是已知的。参见例如Sambrook等人(2001)，同上。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利6,022,725中。对于曲霉属菌种的转化，还参考Cao等人(2000)Science9:991-1001。用载体系统构建遗传上稳定的转化体，凭借所述载体系统编码酶的核酸被稳定整合进宿主细胞染色体中。然后通过已知的技术选择和纯化转化体。

制备用于转化的木霉属(Trichodermasp.)例如可涉及从真菌菌丝制备原生质体。参见Campbell等人(1989)Curr.Genet.16:53-56。菌丝可购自萌发的植物性芽孢。菌丝经煮解细胞壁的酶处理，得到原生质体。原生质体通过在悬浮培养基中存在渗透稳定剂得以保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露糖醇、氯化钾、硫酸镁等等。通常这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变化，例如，1.2M山梨醇溶液可用于悬浮培养基中。

将DNA摄取到宿主木霉属(Trichodermasp.)菌株中取决于钙离子浓度。一般来讲，约10-50mM之间的CaCl₂用于摄取溶液中。另外的合适化合物包括缓冲系统，诸如TE缓冲液(10mMTris、pH7.4；1mMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0和聚乙二醇。据信聚乙二醇融合细胞膜，因此允许培养基的内容物递送到木霉属(Trichodermasp.)菌株的细胞质中。此类融合在很多情况下得到整合进宿主染色体中的质粒DNA的多个拷贝。

通常木霉属(Trichodermasp.)的转化使用通常在10⁵至10⁷/mL，尤其2×10⁶/mL的密度下的原生质体或经过渗透性处理的细胞，可将100μL体积的含这些原生质体或细胞的适当溶液(例如，1.2M山梨醇和50mMCaCl₂)与期望的DNA混合。一般来讲，将高浓度的PEG添加到摄取溶液中。可将0.1体积至1体积的25％PEG4000添加到原生质体悬浮液中；然而，将约0.25体积添加至原生质体悬浮液中是可用的。还可将添加剂诸如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等等添加到摄取溶液中以有利于转化。类似的程序可用于其它真菌宿主细胞。参见例如，美国专利6,022,725。

3.3.表达

产生酶的方法可包括在有利于产生酶的条件下培养如上所述的宿主细胞并且从细胞和/或培养基中回收酶。

用于培养细胞的培养基可以是适合于生长所考虑的宿主细胞和获得酶的表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可购自商业供应商或可根据公布的配方(例如，如美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目录中所述)进行制备。

从宿主细胞分泌的酶可用于全肉汤制备。在本发明的方法中，制备重组微生物的耗尽全发酵肉汤可使用本领域中已知的任何培养方法来实现，得到酶的表达。发酵可因此理解为包括在合适的培养基中和在允许酶表达或分离的条件下进行在实验室或工业发酵中的摇瓶培养、小规模发酵或大规模发酵(包括连续式、分批、分批补料或固态发酵)。术语“耗尽全发酵肉汤”在本文定义为包括培养基、细胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级的内容物。应当理解，术语“耗尽全发酵肉汤”还涵盖使用本领域中熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。

从宿主细胞分泌的酶可便利地通过熟知程序从培养基回收，包括通过离心或过滤从培养基分离细胞，以及借助于盐诸如硫酸铵沉淀出培养基的蛋白质性组分，然后使用色谱程序诸如离子交换色谱法、亲和色谱法等。

在载体中编码酶的多核苷酸能够可操作地连接至控制序列，控制序列能够提供宿主细胞对编码序列的表达，即载体是表达载体。控制序列可例如通过添加另外的转录调控元件来修饰，以使控制序列指导的转录的水平更响应于转录调节子。控制序列可尤其包含启动子。

宿主细胞可在允许酶表达的合适的条件下培养。酶的表达可为组成型的，使得它们可连续地产生，或可为诱导型的，这需要刺激来引发表达。就诱导型表达而言，蛋白质产生可在需要时通过例如将诱导剂物质，例如地塞米松或IPTG或槐糖，添加到培养基中来引发。多肽还可在体外无细胞系统诸如TNT^TM(Promega)兔网织红细胞系统中重组地产生。

表达宿主还可在有氧条件下在适当的宿主培养基中培养。根据宿主的需要和期望酶的产生，可提供搅拌和透气的组合或摇动，其中产生在适于该宿主的温度下发生，例如约25℃至约75℃(例如，30℃至45℃)。培养可发生约12小时至约100小时或更长时间(以及它们之间的任何小时值，例如24小时至72小时)。通常，同样根据关于产生酶的宿主所需的培养条件，培养肉汤的pH为约4.0至约8.0。

3.4.酶活性的鉴定

为了评估酶在宿主细胞中的表达，测定可测量表达的蛋白质、对应的mRNA或酶活性。例如，合适的测定包括RNA印迹、逆转录酶聚合酶链反应和原位杂交，杂交使用适当的标记杂交探针。合适的测定还包括例如通过直接测量培养基中的产物的测定来测量样品中的酶活性。例如，葡萄糖浓度可使用葡萄糖试剂试剂盒15-UV号(SigmaChemical公司)或仪器诸如Technicon自动分析仪来测定。α-淀粉酶活性还可通过任何已知的方法来测量，诸如PAHBAH或ABTS测定。海藻糖酶活性可如实施例节中所述进行测量。测定还在本领域中已知测量其它酶活性。

3.5.用于富集和纯化本发明的酶的方法

发酵、分离和浓缩技术是本领域中熟知的，并且可使用常规方法来制备浓缩的含有酶多肽的溶液。

在发酵之后，获得发酵肉汤，通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮固体，包括残余的粗发酵材料，获得酶溶液。一般使用过滤、离心、微量过滤、旋转真空转筒过滤、超滤、离心之后进行超滤、提取或色谱法等。

希望使含有酶多肽的溶液浓缩以优化回收。使用未浓缩的溶液需要增加的温育时间以收集富集的或纯化的酶多肽。

含有酶的溶液使用常规浓缩技术来浓缩，直到获得期望的酶水平。浓缩含有酶的溶液可通过本文讨论的任何技术来实现。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。

将酶溶液浓缩成浓缩的酶溶液，直到浓缩的含有酶多肽的溶液的酶活性处于期望的水平。

在发酵期间，酶多肽积聚在培养肉汤中。对于期望酶的分离、富集或纯化，培养肉汤经过离心或过滤以消除细胞，并且所得无细胞液体用于酶富集或纯化。在一个实施方案中，使用硫酸铵，使无细胞肉汤在约70％饱和度下经历盐析；然后将70％饱和度-沉淀部分溶解于缓冲液中并且施加至柱诸如SephadexG-100柱，并且洗脱以回收酶活性部分。对于另外的富集或纯化，可使用常规过程诸如离子交换或亲和力色谱法。

对于产生规模回收，酶多肽可一般如上所述通过经由用聚合物絮凝除去细胞来富集或部分纯化。另选地，酶可通过微量过滤之后进行通过使用可用的膜和设备来超滤的浓缩来富集或纯化。然而，对于一些应用，酶不必富集或纯化，并且全肉汤培养物可裂解且使用，而不需另外的处理。酶可然后被处理成例如颗粒料。

4.海藻糖酶的组合物和用途

本发明的海藻糖酶可用于多种工业应用。例如，海藻糖酶可用于淀粉酶转化过程，尤其是发生液化的淀粉的糖化和发酵过程。期望的最终产物可以是可通过淀粉底物的酶转化所产生的任何产物。例如，期望产物可为富含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，其可用于其它过程，诸如制备HFCS，或可转化成多种其它有用的产物，诸如抗坏血酸中间体(例如，葡萄糖酸盐；2-酮基-L-古洛糖酸；5-酮基-葡萄糖酸盐；和2,5-二酮基葡萄糖酸盐)；1,3-丙二醇；芳族氨基酸(例如，酪氨酸、苯基丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如，乳酸、丙酮酸、琥珀酸、异柠檬酸、葡萄糖酸和草酰乙酸)；氨基酸(例如，丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸和甘氨酸)；抗生素；抗微生物剂；酶；维生素；和激素。

淀粉转化过程可为设计来产生用于燃料或饮用(即，可饮醇)的醇的前体至(或同时)发酵过程。本领域的技术人员了解可用于产生这些最终产物的各种发酵条件。海藻糖酶还可用于食品制备的组合物和方法。以下更详细地描述海藻糖酶的这些各种用途。

4.1.淀粉底物的制备

本领域的技术人员了解可用于制备用于本文公开的过程中的淀粉底物的可用方法。例如，可用的淀粉底物可获自块茎、根、茎、豆类、谷物或全粒。更具体地，颗粒状的淀粉可获自玉米、玉米棒、小麦、大麦、裸麦、黑小麦、蜀黍、西米、粟、树薯、木薯、高粱、稻、豌豆、香蕉或马铃薯。玉米含有约60％-68％的淀粉；大麦含有约55％-65％的淀粉；粟含有约75％-80％的淀粉；小麦含有约60％-65％的淀粉；并且精米含有70％-72％的淀粉。具体地说，设想的淀粉底物为玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可为碾磨淀粉或全淀粉并且包括玉米固体，诸如玉米种仁、玉米麸皮和/或玉米棒。淀粉还可为高度精炼的生淀粉或淀粉精炼过程的原料。各种淀粉还为可商购获得的。例如，玉米淀粉购自Cerestar、Sigma和KatayamaChemicalIndustry公司(Japan)；小麦淀粉购自Sigma；甘薯淀粉购自WakoPureChemicalIndustry公司(Japan)；并且马铃薯淀粉购自NakaariChemicalPharmaceutical公司(Japan)。

淀粉底物可为来自研磨全粒的粗制淀粉，其含有非淀粉部分，例如胚芽残余物和纤维。研磨可包括湿式研磨或干式研磨或碾磨。在湿式研磨中，全粒浸泡在水或稀酸中以将谷粒分离成它的组分部分，例如，淀粉、蛋白质、胚芽、油、种仁纤维。湿式研磨有效地分离胚芽和粗粉(即，淀粉颗粒料和蛋白质)并且尤其适用于生产糖浆。在干式研磨或碾磨中，全种仁被碾磨成细粉并且常常被处理而无需将谷粒分成它的组分部分。在一些情况下，回收来自种仁的油。干式碾磨的谷粒因此将包含除淀粉之外显著量的非淀粉碳水化合物复合物。干式碾磨淀粉底物可用于生成乙醇和其它生物化学品。待处理的淀粉可具有高度精炼的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。

4.2.淀粉的糊化和液化

如本文所用，术语“液化(liquefaction或liquefy)”是指淀粉转化成较不粘稠且较短链的糊精的过程。一般来讲，此过程涉及淀粉的糊化同时或之后添加α-淀粉酶，尽管任选地可添加另外的液化诱导酶。在一些实施方案中，如上所述制备的淀粉底物用水制浆。淀粉浆液可含有以干固体的重量百分比的形式约10％-55％、约20％-45％、约30％-45％、约30％-40％或约30％-35％的淀粉。可用例如计量泵将α-淀粉酶(EC3.2.1.1)添加到浆液中。通常用于此应用的α-淀粉酶为热稳定的细菌α-淀粉酶，诸如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。α-淀粉酶通常例如以约1500个单位每千克淀粉干物质供应。为了优化α-淀粉酶稳定性和活性，通常将浆液的pH调节至约pH5.5-6.5并且还添加约1mM钙(约40ppm游离的钙离子)。嗜热脂肪芽孢杆菌变体或其它海藻糖酶可需要不同的条件。在液化之后剩余在浆液中的细菌α-淀粉酶可通过多种方法失活，包括降低后续的反应步骤中的pH或在酶是依赖于钙的情况下通过除去浆液中的钙。

淀粉加上α-淀粉酶的浆液可连续泵送通过蒸汽加热至105℃的喷射蒸煮器。糊化在这些条件下快速发生，并且结合有显著的剪切力，酶活性使淀粉底物开始水解。在喷射蒸煮器中的停留时间是短暂的。部分糊化的淀粉可穿过一系列保持在105℃-110℃下的保持管中并且保持5min-8min以完成糊化过程(“初级液化”)。水解成需要的DE是在85℃-95℃或更高温度下在保持槽中约1小时至2小时来完成(“二级液化”)。这些槽可含有导流板以阻止返混。如本文所用，术语“二级液化的分钟”是指从二级液化开始到测量右旋糖当量(DE)的时间所流逝的时间。然后使浆液冷却至室温。此冷却步骤可为30分钟至180分钟，或更长时间。液化淀粉通常呈具有约10％-50％；约10％-45％；约15％-40％；约20％-40％；约25％-40％；或约25％-35％的干固体含量(w/w)的浆液的形式。

在具体实施方案中，出于生产高纯度葡萄糖糖浆、HFCS、麦芽糖糊精等的目的，淀粉液化是在90℃-115℃的温度范围下进行。

4.3.糖化

使用α-淀粉酶，任选地在其它酶的存在下，液化淀粉可糖化成富含低DP(例如，DP1+DP2)糖类的糖浆。糖化产物的确切组分取决于使用的酶的组合，以及处理的颗粒状淀粉的类型。有利地，使用提供的海藻糖酶可获得的糖浆可含有糖化淀粉中总低聚糖的超过30％，例如45％-65％或55％-65％的重量百分比的DP2。糖化淀粉中(DP1+DP2)的重量百分比可超过约70％，例如，75％-85％或80％-85％。淀粉酶还产生在糖浆产物中相对高收率的葡萄糖，例如DP1>20％。

尽管液化通常以连续过程的形式进行，但是糖化常常以分批过程进行。糖化通常在约60℃-65℃的温度和约4.0-4.5的pH，例如pH4.3下最有效，这需要冷却液化淀粉且调节液化淀粉的pH。糖化可例如在介于约40℃、约50℃或约55℃至约60℃或约65℃之间的温度下进行。糖化通常在搅拌槽中进行，其可能需要数小时来填满或清空。酶通常在槽填满时以固定比率添加到干燥的固体中，或在填充阶段开始时以单剂量的形式添加。制备糖浆的糖化反应通常在约24-72小时，例如24-48小时内进行。当达到最大DE或期望DE时，反应通过例如加热至85℃持续5min来停止。进一步温育将导致较低的DE，最终至约90DE，因为积聚的葡萄糖通过酶逆反应和/或利用热力学平衡的途径再聚合成异麦芽糖/或其它逆产物。当使用淀粉酶时，糖化最佳是在约30℃至约75℃，例如45℃-75℃或47℃-74℃的温度范围下进行。糖化可在约pH3至约pH7，例如pH3.0-pH7.5、pH3.5-pH5.5、pH3.5、pH3.8或pH4.5的pH范围内进行。

淀粉酶可以组合物的形式添加到浆液中。淀粉酶可以约0.6-10ppmds，例如2ppmds的量添加到颗粒状淀粉底物的浆液中。淀粉酶可以全肉汤、澄清酶、富集酶、部分纯化酶或纯化酶的形式添加。例如用PAHBAH测定来测量，淀粉酶的比活性可为约300U/mg的酶。淀粉酶还可以全发肉汤产物的形式添加。

淀粉酶可以分离的酶溶液的形式添加到浆液中。例如，淀粉酶可以由表达淀粉酶的宿主细胞所产生的培养细胞材料的形式添加。淀粉酶还可在发酵或SSF过程期间由宿主细胞分泌到反应培养基中，使得酶连续地提供到反应中。产生且分泌淀粉酶的宿主细胞还可表达另外的酶，诸如葡糖淀粉酶。例如，美国专利5,422,267公开在酵母中使用葡糖淀粉酶用于生产酒精饮料。例如，宿主细胞例如里氏木霉或黑曲霉可工程化以在糖化期间共表达淀粉酶和葡糖淀粉酶，例如HgGA、TrGA或TrGA变体。宿主细胞可经过基因修饰，以使不表达它的内源性葡糖淀粉酶和/或其它酶、蛋白质或其它物质。宿主细胞可工程化以表达广谱的各种糖化酶。例如，重组酵母宿主细胞可包含编码葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、利用戊糖的酶、α-淀粉酶、普鲁兰酶、异淀粉酶和/或异普鲁兰酶的核酸。参见例如WO2011/153516A2。

4.4.异构化

通过用淀粉酶处理所产生的可溶性淀粉水解产物可转化成高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，诸如高果糖玉米糖浆(HFCS)。此转化可使用葡萄糖异构酶，尤其是固定在固体支持体上的葡萄糖异构酶来实现。pH增加至约6.0至约8.0，例如pH7.5(取决于异构酶)，并且Ca²⁺通过离子交换来除去。合适的异构酶包括IT(NovozymesA/S)；IMGI和G993、G993、G993液体和IGI。在异构化之后，混合物通常含有约40％-45％果糖，例如42％果糖。

4.5.发酵

可溶性淀粉水解产物，尤其是富含葡萄糖的糖浆，可通过通常在约32℃，诸如针对产醇酵母30℃至35℃的温度下，将淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵。发酵的温度和pH将取决于发酵生物。EOF产物包括代谢物，诸如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、衣康酸和其它羧酸、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸和其它氨基酸、ω3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1,3-丙二醇、丙酮酸、2,3-丁二醇和其它生物物质。

产乙醇微生物包括酵母诸如酿酒酵母，和细菌例如运动发酵单胞菌(Zymomonasmoblis)，其表达醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物可表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，这些酶将木糖转化成木酮糖。例如可经受高温的改善的产乙醇微生物菌株为本领域中已知的，并且可使用。参见Liu等人(2011)ShengWuGongChengXueBao(生物工程学报)27:1049-56。酵母的商业来源包括ETHANOL(LeSaffre)；(Lallemand)；RED(RedStar)；(DSMSpecialties)；和(Alltech)。通过发酵产生其它代谢物诸如柠檬酸和乳酸的微生物也是本领域中已知的。参见例如，Papagianni(2007)Biotechnol.Adv.25:244-63；John等人(2009)Biotechnol.Adv.27:145-52。

糖化和发酵过程可以SSF过程的形式进行。发酵可包括例如乙醇的后续富集、纯化和回收。在发酵期间，肉汤或“啤酒”的乙醇含量可达到约8％-18％v/v，例如14％-15％v/v。肉汤可蒸馏以产生富集的例如96％纯乙醇溶液。另外，通过发酵生成的CO₂可用CO₂涤气器收集、压缩且销售用于其它用途，例如碳酸饮料或干冰生产。发酵过程的固体废物可用作富含蛋白质的产品，例如牲畜饲料。

如上所述，SSF过程可用在整个SSF中连续地表达且分泌淀粉酶的真菌细胞进行。表达淀粉酶的真菌细胞可为发酵微生物，例如产乙醇微生物。乙醇生产因此可使用表达足够的淀粉酶或海藻糖酶使得必须外源性添加的酶较少或不必外源性添加酶的真菌细胞进行。真菌宿主细胞可来自适当工程化的真菌菌株。也可使用表达且分泌除淀粉酶或海藻糖酶之外的其它酶的真菌宿主细胞。此类细胞可表达葡糖淀粉酶和/或普鲁兰酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶纤维素酶、木聚糖酶、其它半纤维素酶、蛋白酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶或其它酶。

此过程的变型为“补料分批发酵”系统，其中底物随着发酵进程以增量的形式添加。当分解代谢物阻遏可抑制细胞代谢并且当希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是可用的。补料分批系统中实际底物浓度通过可测量因素诸如pH、溶解氧和废气诸如CO₂的分压的变化来估计。分批和补料分批发酵是常见的并且是本领域中熟知的。

连续发酵为开放系统，其中将限定的发酵培养基连续地添加到生物反应器中，并且同时除去等量的条件培养基用于处理。连续发酵一般将培养物保持于恒定高密度下，其中细胞主要处于对数期生长中。连续发酵允许细胞生长和/或产物浓度的调节。例如，将有限的营养物质诸如碳源或氮源保持在固定比率下并且允许所有其它参数适度。因为生长保持在稳态，所以由于排除培养基导致的细胞损失应针对发酵中的细胞生长速率来平衡。优化连续发酵过程且使产物形成速率最大的方法是工业微生物学领域中熟知的。

4.6.组合物

本发明的海藻糖酶用于各种淀粉酶底物的发酵。海藻糖酶可用于液化液的发酵。海藻糖酶还可用于同时糖化和发酵(SSF)。海藻糖酶可以合适的pH、温度和时间使用。使用海藻糖酶可改善发酵培养基中酵母的健康状态，如通过增加的乙醇生产所证实，和/或海藻糖的连续降解，如通过较低的DP2水平或海藻糖水平所证实。某些真菌海藻糖酶可对于此类功能更有效。海藻糖酶可以任何期望浓度使用，例如在发酵中约0.1μg/g至1mg/g的DS。优选的浓度包括在发酵中0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2、4、6、8、10、20、50、100μg/g的DS。

海藻糖酶可与葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)组合，例如木霉属葡糖淀粉酶或其变体。示例性葡糖淀粉酶为里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)和其变体，它们具有优异的比活性和热稳定性。参见美国已公布的专利申请2006/0094080、2007/0004018和2007/0015266(DaniscoUS公司)。合适的TrGA变体包括具有葡糖淀粉酶活性且具有与野生型TrGA至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的变体。α淀粉酶有利地增加TrGA催化的糖化过程中所产生的葡萄糖的收率。

另选地，葡糖淀粉酶可为来源于植物(包括藻类)、真菌或细菌的另一种葡糖淀粉酶。例如，葡糖淀粉酶可为黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶或它的变体(例如，Boel等人(1984)EMBOJ.3:1097-1102；WO92/00381；WO00/04136(NovoNordiskA/S))；和泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(例如，WO84/02921(Cetus公司))。其它设想的曲霉属葡糖淀粉酶包括具有增强的热稳定性的变体，例如G137A和G139A(Chen等人(1996)Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995)Prot.Eng.8:575-582)；N182(Chen等人(1994)Biochem.J.301:275-281)；A246C(Fierobe等人(1996)Biochemistry,35:8698-8704)；和在A435和S436位中具有Pro残基的变体(Li等人(1997)ProteinEng.10:1199-1204)。其它设想的葡糖淀粉酶包括篮状菌(Talaromyces)葡糖淀粉酶，尤其来源于埃默森篮状菌(T.emersonii)(例如，WO99/28448(NovoNordiskA/S)、T.leycettanus(例如，美国专利RE32,153(CPCInternational公司))、杜邦篮状菌(T.duponti)或嗜热篮状菌(T.thermophilus)(例如，美国专利4,587,215)。设想的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属的葡糖淀粉酶，尤其是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(例如，EP135138(CPCInternational公司)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(例如，WO86/01831(MichiganBiotechnologyInstitute)))。合适的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，诸如WO00/04136(NovoNordiskA/S)的SEQIDNO:2中所示的葡糖淀粉酶。商业葡糖淀粉酶也是合适的，诸如AMG200L；AMG300L；SAN^TMSUPER和AMG^TME(Novozymes)；300和OPTIDEXL-400(DaniscoUS公司)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TMPLUS(DSM)；G900(EnzymeBio-Systems)；和G990ZR(具有低蛋白酶含量的黑曲霉葡糖淀粉酶)。其它仍合适的葡糖淀粉酶包括烟曲霉(Aspergillusfumigatus)葡糖淀粉酶、篮状菌葡糖淀粉酶、草根霉葡糖淀粉酶、栓菌(Trametes)葡糖淀粉酶、嗜热丝孢菌葡糖淀粉酶、阿太菌(Athelia)葡糖淀粉酶或腐质霉(Humicola)葡糖淀粉酶(例如，HgGA)。葡糖淀粉酶通常以约0.1-2个葡糖淀粉酶单位(GAU)/gds，例如约0.16GAU/gds、0.23GAU/gds或0.33GAU/gds的量添加。

可与海藻糖酶一起使用的其它合适的酶包括植酸酶、蛋白酶、普鲁兰酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、不同的α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、其它半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、氧化还原酶或其组合。例如，支化酶诸如异淀粉酶(EC3.2.1.68)可以本领域的技术人员熟知的有效量添加。普鲁兰酶(EC3.2.1.41)例如也是合适的。普鲁兰酶通常以100U/kgds添加。另外合适的酶包括蛋白酶诸如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括获自曲霉属诸如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉属(例如，米黑毛霉(M.miehei))；根霉属；和木霉属。

β-淀粉酶(EC3.2.1.2)为外切-作用产麦芽糖淀粉酶，其催化将1,4-α-糖苷键水解成支链淀粉酶和相关的葡萄糖聚合物，从而释放出麦芽糖。β-淀粉酶分离自各种植物和微生物。参见Fogarty等人(1979)ProgressinIndustrialMicrobiology中，第15卷，第112-115页。这些β-淀粉酶具有在40℃至65℃范围内的最佳温度和在约4.5至约7.0范围内的最佳pH。设想的β-淀粉酶包括但不限于大麦的β-淀粉酶BBA1500、DBA、OPTIMALT^TMME、OPTIMALT^TMBBA(DaniscoUS公司)；和NOVOZYM^TMWBA(NovozymesA/S)。

包含本发明的海藻糖酶的组合物可为含水或不含水的制剂、颗粒料、粉末、凝胶、浆液、糊料等，组合物可还包含本文列出的附加酶中的任何一种或多种以及缓冲液、盐、防腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等等。此类组合物可结合浆液、水浴、洗涤机、食品或饮品产品等中已经存在的内源性酶或其它成分来起作用，例如内源性植物(包括藻类)酶、先前处理步骤的残余酶等等。

实施例

实施例1：材料和方法

液化所有以下基于实验室的发酵利用从工业燃料乙醇植物收集的液化液样品来完成。液化液是在工厂收集且带回实验室用于即刻冷冻且储存。在发酵使用当天，将液化液在水浴中升温至发酵温度。在发酵之前，使用硫酸将液化液pH调节至发酵的起始pH(4.8)。因为这些液化液来自燃料乙醇植物，所以大部分回糟(也称为稀塔馏物)已用于产生这些液化液样品。回糟的这种添加可导致工业范围发酵以可测量的海藻糖水平开始。

发酵：

同时糖化和发酵(SSF)或发酵实验通过长期内部方案使用100g-规模发酵来进行。所有发酵比较在三重复(n＝3)100g-规模烧瓶条件的情况下进行，并且本文显示的数据是那些三重复发酵的平均。发酵在受控温度(32℃等温或36℃斜坡温度特征图)摇动培养箱(150rpm摇动)内进行。在酶投配之前，还将600ppm脲和0.1％酵母(通常是干投)添加至液化液。所有海藻糖酶投配在开始发酵时与SSF(GENENCOR的包含葡糖淀粉酶的酶共混物)投配一起进行。仅对于实施例2，为了相等稀释比较，海藻糖酶投配包括感兴趣的酶加上使总投配体积达到670μL(获得8ug/gDSTrnT(EH)所需的最大体积)所必需的体积的水。

样品制备：

将发酵肉汤取样到2mL管中用于后续的3min13000rpm离心。将0.500mL上清液等分试样移取到玻璃管中，之后添加50μL1M硫酸以使GA活性灭活。在5分钟温育之后，利用DI水将发酵样品稀释至10x稀释液。这个过程为有机酸HPLC分析的取样的内部标准方案，该过程不仅使酶在分析之前灭活，还有意地提供相当于HPLC移动相水平的背景硫酸。使用0.22μm尼龙注射器式过滤器将此样品制剂的大约1mL等分试样过滤并且置于HPLC样品小瓶中。

对于通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换(HPAEC-PAD)的离子色谱法的海藻糖测定，将上文经10x稀释的样本制剂的单独0.500mL等分试样在9mMNaOH(中和之前添加以杀死酶活性的酸)中再稀释10倍。使用0.22um尼龙注射器式过滤器将此100x稀释液样品过滤到2mLIC小瓶中用于HPAEC-PAD分析。

有机酸HPLC分离

柱：Rezex^TM有机酸(ROA)，300×7.80mm

防护柱：SecurityGuard^TMCarbo-H筒。

柱温：65℃

移动相：0.01N硫酸。

流速：0.6mL/min或0.7mL/min

注入体积：20μL

检测：保持在40℃下的差分折射率

使用HPAE-PAD的高级碳水化合物分离：

仪器：ICS-5000

柱：CarboPacPA20，250×4mm。

防护柱：CarboPacPA20G，50×4mm。

柱温：35℃

移动相：以10mM和200mMNaOHMP浓度(由50％溶液制成)梯度洗脱

梯度：初始1mMNaOH等度洗脱5min，之后进行单级梯度洗脱至33mM，后续进行再生和平衡

流速：0.5mL/min

注入体积：10μL

检测：柱后金电化学电池(4步脉冲电流测量模式)

海藻糖酶投配水平是通过Bradford测定基于总蛋白质水平。TraT#9，摇瓶，772μg/mL总蛋白质，Endo-H处理；TrnT#22，摇瓶，369μg/mL总蛋白质，Endo-H处理；TaaT#24，摇瓶，914μg/mL总蛋白质，Endo-H处理；Megazyme海藻糖酶比活性：150U/mg(40℃，pH5.5)，2100U/mL。

实施例2：由木霉属纤维素酶制备的海藻糖酶活性

发酵如上所述进行55小时(hr)。测试的样品如下：1.SSF(对照)2.具有添加的基准海藻糖酶(MEGAZYMES的原核生物海藻糖酶；目录号E-TREH)的SSF；3.具有250μL里氏木霉菌株的纤维素酶混合物(TRIO)的SSF。海藻糖酶、DP1、DP2和乙醇(EtOH)的含量是在55h的发酵结束(EOF)时间点测定且在表1中示出。

表1

样品	DP1(％wt/v)	DP2(％wt/v)	EtOH(％wt/v)
				SSF	0.05	0.47	16.41
SSF+基准海藻糖酶	0.11	0.26	16.55
				SSF+里氏木霉纤维素酶混合物	0.05	0.16	16.76

相比于对照，从投配发酵的里氏木霉纤维素酶混合物(TRIO)看到在乙醇生产中大于0.3％wt/v增加(16.76％wt/v对16.41％wt/v)。另外，相比于基准海藻糖酶，从投配发酵的里氏木霉纤维素酶混合物(TRIO)看到在乙醇生产中大于0.2％wt/v增加(16.76％wt/v对16.55％wt/v)。此改善的收率似乎可归因于海藻糖作为组分时DP2水平的降低。这表明里氏木霉纤维素酶混合物具有海藻糖酶活性(数据未示出)。此结果还表明里氏木霉纤维素酶中的海藻糖酶相较于基准海藻糖酶具有改善的稳定性和/或活性。

实施例3：里氏木霉(细胞外)海藻糖酶和中性(胞质)海藻糖酶(分别为TraT和 TrnT)的生产

各候选海藻糖酶的序列可以以下购得：中性(胞质)海藻糖酶GH37(tre2)＝JGIPID123226＝GenbankEGR46144.1；氨基酸序列：

mpplfslaallgtailtihsnvahalyingsviapcdspiychgdilreielahpfsdsktfvdmpakrplseiqtafanlpkplrndsslqtflasyfadaggeliqvpranlttnptflskindtvieqfvtqvidiwpdltrryagdaavkncsscpnsfipvnrtfvvaggrfrepyywdsywivegllrtggafvgiarntidnfldfierfgfvpngarlyylnrsqppllsrmvkvyidhtndtailrralpllvkehefwtrnrtvdvrvnnktyvlnqyavqntqprpesfredfqtannrsyyaasgiiypatkplnesqieelyanlasgaesgndytarwladpsdamrdvyfplrslnnkdivpvdlnsilygnelaiaqfynqtgnttaarewsslaanrsasiqavfwnetlfsyfdynltsssqniyvpldkdavaldrqtappgkqvlfhvgqfypfwtgaapeylrnnpfavtrifdrvksyldtrpggipasnvntgqqwdqpnvwpphmhilmeslnsvpatfseadpayqdvrnlslrlgqryldftfctwratggstsetpklqgltdqdvgimfekyndnstnaaggggeyqvvegfgwtngvllwtadtfgsqlkrpqcgnimaghpapskrsavqldmwdasrvkkfgrraegrmgtlhaw(SEQIDNO:1)

酸性(细胞外)海藻糖酶GH65(tre1)＝JGIPID123456＝GenbankEGR45658.1(JGI–联合基因组研究所)。氨基酸序列：

mrstvtsaaallsllqlvspvhgttlvdrvtkclsrhdgsdaeshfsknvyktdfagvtwdednwllsttqlkqgafeargsvangylginvasvgpffevdteedgdvisgwplfsrrqsfatvagfwdaqpqmngtnfpwlsqygsdtaisgiphwsglvldlgggtyldatvsnktishfrstydykagvlswsykwtpkgnkgsfdisyrlfanklhvnqavvdmqvtasknvqasivnvldgfaavrtdfvesgedgsaifaavrpngvanvtayvyaditgsggvnlssrkivhnkpyvhanassiaqavpvkfaagrtvrvtkfvgaassdafknpkqvakkaaaaglsngytkslkahveewatvmpessvdsfadpktgklpadshivdsaiiavtntyyllqntvgkngikavdgapvnvdsisvggltsdsyagqifwdadlwmqpglvaahpeaaeritnyrlarygqakenvktayagsqnetffsasaavfpwtsgrygnctatgpcwdyeyhlngdigislvnqwvvngdtkdfeknlfpvydsvaqlygnllrpnktswtltnmtdpdeyanhvdaggytmpliaetlqkansfrqqfgieqnktwndmasnvlvlrengvtleftamngtavvkqadvimltyplsygtnysaqdalndldyyankqspdgpamtyaffsivaneispsgcsaytyaqnafkpyvrapfyqiseqliddasvnggthpaypfltghggahqvvlfgylglrlvpddvihiepnlppqipylryrtfywrgwpisawsnythttlsraagvaalegadqrfarkpitihagpeqdptayrlpvkgsvvipnkqigsqqtyagnlvqchaasspndyvpgqfpiaavdgatstkwqpasadkvssitvsldkedvgslvsgfhfdwaqappvnatvifhdealadpatalasahkhnskyttvtsltnielsdpyvstkdlnaiaipignttnvtlshpvaasryasllivgnqgldpvdvkakngtgatvaewaifghgkehsgkpsshskrrlnvrtaatlsnprsfmrrrl(SEQIDNO:2)

从基因组DNA扩增，克隆到大肠杆菌中的标准木霉表达载体中，定序，煮解且凝胶纯化出细菌DNA，PCR扩增剔除表达盒。进行剔除海藻糖酶向LVS-EndoTDelete菌株的PEG转化且置于VOGEL板上。转化发生在3-4天后。挑选出各稳定海藻糖酶的大约100个转化体。将各稳定转化体转移到24孔板且允许在28℃下在Aachen培养基中生长6天。通过蛋白质表达(SDS-PAGE凝胶)和活性(MEGAZYMES海藻糖酶活性测定)筛选转化体的发酵肉汤。将顶部转化体一式两份接种到250mL摇瓶中在Aachen培养基中以及在缓释微滴定板中在NREL培养基中。允许培养物在28℃下生长6天。肉汤样品通过活性测定/SDS-Page针对最高活性/表达来检验。选择顶部转化体用于14L评估。选择最终顶部候选海藻糖酶：LVS-ETD里氏木霉酸性海藻糖酶#23。

实施例4：发酵期间TraT和TrnT稳定性/活性与TaaT和基准海藻糖酶的比较

海藻糖酶投配组中各组的海藻糖动力学的全面发酵性能图在图1(TraT)、图2(TrnT)和图3(TaaT；深绿木霉(Trichodermaatroviride)海藻糖酶)中示出。这些比较中的每一个还包括对照和基准(MEGAZYMES)发酵。预期对照的海藻糖时间特征图初始具有海藻糖的较小减少，接着后来在发酵中几乎相等的增加。此对照中的这些海藻糖动力学可归因于酵母细胞中和外的自然流动和/或已知存在的微量水平的背景海藻糖酶。

当比较投配海藻糖酶的发酵时，对于22小时取样时间看到完整的海藻糖水解。然而，发酵中稍后的时间点显示性能的显著差异。具体地讲，对于两种里氏木霉海藻糖酶，在发酵的整个过程中海藻糖水平保持较低(图1和图2)。然而，深绿木霉特征图示出在稍后时间点处细胞外海藻糖水平的显著增加。因为在所有样品中海藻糖水平初始减小至低于可检测限，所以海藻糖水平向发酵结束的这种显著升高证明了TaaT稳定性/活性问题。此海藻糖酶应用稳定性问题还对于基准(Megazyme)海藻糖酶是明显的(在图1、图2和图3中的每一者中示出；虚线；注意在发酵的稍后时间点处海藻糖的显著增加)。

实施例5：在EtOH发酵中添加TraT的效应

基于上文的结果，针对改善在发酵中乙醇的生产的有效性，对将TraT添加到发酵中进行评估。如上文在实施例1中所述设置发酵，其中(1)未添加海藻糖酶(对照)，(2)在发酵开始时添加0.5μg/gDSTraT，或(3)在发酵开始时添加0.25μg/gDSTraT。使发酵进行72小时，其中在0、24、32、48、56和72小时时取样。发酵以36℃温度斜坡进行，不仅更指示了发酵植物条件，还向酵母细胞提供更具应力的环境。

如图4中所示，相比于对照(未添加海藻糖酶)，在发酵开始时添加0.5μg/gDS或0.25μg/gDSTraT导致在整个发酵中减小的海藻糖水平。相比于在对照中约0.35％wt/v(48h时间点)，在TraT样品中观察到的海藻糖峰水平(32h时间点)为约0.2％wt/v。在这些时间点还测量了DP2水平且在图5中示出。在所有样品中DP2水平减小，但是，此减小对于经海藻糖酶TraT处理的发酵更突出。

图6示出含有TraT的发酵在EOF(72小时)时的EtOH水平(％v/v)显著高于对照发酵(未添加海藻糖酶)。需注意，观察到的EtOH的增加高于预期，预期是仅基于酵母对葡萄糖的增加的消耗，此消耗来源于海藻糖通过海藻糖酶的水解。例如，如果在细胞外上清液环境中0.2％wt/v海藻糖水平在发酵结束时完全水解，那么预期0.14％v/v乙醇增加。然而，在这些实验中看到较大的乙醇增加。具体地，热倾斜发酵示出海藻糖超过对照的0.22％wt/v减少(图4，0.5μg/gDSTraT)，并且因此预期0.12％v/v乙醇减少。相反，测量到大于预期约50％的增加(约0.28％v/v乙醇增加；图6，0.5μg/gDSTraT)。此数据还示出，EOFDP2水平不是乙醇由于海藻糖酶处理而增加的量的绝对确定因子。尽管两个剂量示出类似的72小时EOF海藻糖水平，但是较高剂量在整个SSF中保持更低的海藻糖水平，示出乙醇产生的最大增加。

参照此发现，另外的实验室级发酵数据示出，将海藻糖酶添加到SSF在发酵期间使发酵酵母活性保持更长时间，从而实现额外的乙醇转化。具体地，在发酵开始时添加海藻糖酶使酵母达到高于对照发酵的EOF乙醇水平(参见图7和图8)。

实施例6：

在后续发酵中海藻糖酶处理对海藻糖水平的效应

如上所述进行发酵。然而，在具有海藻糖酶处理的第一发酵之后，来自那些发酵的回糟用于制备后续发酵反应。在各种时间点测量海藻糖的量。数据在下表和图9中示出。如可见，海藻糖特征图进行一些发酵达到较低水平。此外，在结束海藻糖酶试验之后的海藻糖特征图示出减少海藻糖的更长时间的效应。不希望受理论束缚，可能的是，这两个效应都归因于使回糟海藻糖水平再平衡所需的时间，如通过得到此数据的具体燃料乙醇植物的尺寸和比率所支持。

尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域的技术人员来说将显而易见，所述实施方案仅以举例的方式提供。众多变化、改变和替代在不脱离本发明的情况下现将被本领域技术人员所想到。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。意图在于，以下权利要求书定义本发明的范围并且因此可涵盖处于这些权利要求书范围内的方法和结构以及其等效物。

Claims (29)

1.一种提高发酵反应中从液化液生产乙醇的方法，所述方法包括：

a)用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵所述液化液；以及

b)在所述发酵结束时回收乙醇和其它期望发酵产物，其中所述经海藻糖酶处理的发酵相比于未经海藻糖酶处理的发酵反应产生增加的乙醇。

2.一种降低发酵产物中DP2的最终浓度的方法，所述方法包括：

a)用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵液化液；以及

b)在所述发酵结束时回收期望发酵产物，其中所述DP2浓度相比于未经海藻糖酶处理的发酵减小。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为TrG4变体，SEQIDNO:3。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述海藻糖酶来自真核生物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述海藻糖酶来自丝状真菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所丝状真菌为木霉属。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述海藻糖酶为酸性海藻糖酶。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述海藻糖酶为中性海藻糖酶。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述海藻糖酶以约0.1μg/gDS至约1000μg/gDS的液化液的浓度添加。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述海藻糖酶以约0.25μg/gDS至约100μg/gDS的液化液的浓度添加。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述海藻糖酶以约0.5μg/gDS至约10μg/gDS的液化液的浓度添加。

12.一种提高在发酵反应中从液化液生产乙醇的方法，所述方法包括：

a)用葡糖淀粉酶、发酵生物和发酵稳定的海藻糖酶发酵所述液化液；以及

b)在所述发酵结束时回收乙醇和其它期望发酵产物，其中所述经海藻糖酶处理的发酵相比于未经海藻糖酶处理的发酵产生增加的乙醇。

13.一种通过在发酵反应中发酵生物而在时间上延长乙醇生产的方法，所述方法包括在所述发酵开始时添加海藻糖酶。

14.一种通过在发酵反应中发酵生物而在时间上延长乙醇生产的方法，所述方法包括在所述发酵期间添加海藻糖酶。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为TrG4变体，SEQIDNO:3。

16.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述海藻糖酶以在发酵培养基中约0.1μg/gDS至约1000μg/gDS的浓度添加。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述海藻糖酶以在发酵培养基中约0.25μg/gDS至约100μg/gDS的浓度添加。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述海藻糖酶以在发酵培养基中约0.5μg/gDS至约10μg/gDS的浓度添加。

19.一种改善发酵反应中乙醇生产的方法，所述方法包括在整个所述发酵反应中保持海藻糖水平低于阈值水平，其中所述阈值水平低于所述发酵开始时所述海藻糖浓度的两倍(％wt/v)。

20.一种改善发酵反应中乙醇生产的方法，所述方法包括将海藻糖酶添加到所述发酵反应，从而在整个所述发酵反应中保持海藻糖水平低于阈值水平，其中所述阈值水平低于未将海藻糖酶添加到过程中时在发酵期间将存在的所述海藻糖浓度的一半(％wt/v)。

21.根据上述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括附加酶，所述附加酶选自：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、普鲁兰酶、还原酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。

22.一种用于乙醇生产的改善的发酵方法，所述方法包括使用海藻糖水平低于0.05％wt/v的回糟或稀塔馏物。

23.一种用于乙醇生产的改善的发酵方法，所述方法包括在所述发酵反应中使用海藻糖水平低于0.1％wt/v的回糟或稀塔馏物。

24.一种用于在发酵反应中改善乙醇生产的方法，所述方法通过将海藻糖从所述回糟中除去。

25.一种用于通过除去海藻糖来改善在包含液化液和回糟的发酵反应中的乙醇生产的方法，所述方法包括在发酵反应中使用海藻糖酶，其中海藻糖水平低于所述发酵反应的0.01％w/v。

26.一种用于通过从包含回糟的液化中除去海藻糖来改善发酵反应中乙醇生产的方法，所述方法包括通过用海藻糖酶处理来除去回糟中的海藻糖，其中海藻糖水平低于所述回糟的0.05％w/v。

27.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中乙醇生产的增加量相比于未经海藻糖酶处理的发酵为0.1％(v/v)或更大、0.15％(v/v)或更大、0.2％(v/v)或更大、0.25％(v/v)或更大、0.3％(v/v)或更大、0.4％(v/v)或更大、1.0％或更大。

28.一种提高在发酵反应中从液化液生产乙醇的方法，所述方法包括：

a)用一种或多种淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵所述液化液；以及

b)在所述发酵结束时回收乙醇和其它期望发酵产物，其中所述经海藻糖酶处理的发酵相比于未经海藻糖酶处理的发酵反应产生增加的乙醇。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种淀粉酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶或产麦芽糖淀粉酶。