CN109182301A

CN109182301A - 一种二糖降解酶基因及其应用

Info

Publication number: CN109182301A
Application number: CN201810938509.9A
Authority: CN
Inventors: 李阳源; 黄江; 江民华; 陈丽芝; 王水生; 刘金山; 何小梅; 高芝
Original assignee: Yiduoli Biological Science & Tech Co Ltd Guangdong
Current assignee: Yiduoli Biological Science & Tech Co Ltd Guangdong
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: CN109182301B; WO2020034256A1

Abstract

本发明公开了一种二糖海藻糖酶的基因和应用。该二糖海藻糖酶基因TH3155的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因可以生产海藻糖酶TH3155，由1056个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该酶能够将海藻糖降解成葡萄糖。在发酵制酒精过程中添加一定量的本发明海藻糖酶，能将代谢过程中产生的海藻糖水解为葡萄糖，供酒精酵母利用，提高酒精产量，同时也降低了酒精发酵废水中海藻糖的残留，降低酒精发酵废水的处理成本。

Description

一种二糖降解酶基因及其应用

技术领域

本发明属于生物酶领域，具体涉及一种二糖降解酶基因及其应用。

背景技术

海藻糖酶(Trehalase)(EC3.2.1.28，α,α-trehalose glucohydrolase)首先是在1893年由Bourquelot在黑曲霉中发现的，而后的研究发现海藻糖酶广泛存在于微生物、昆虫、植物和无脊椎动物中，在葡萄糖的转运和能量贮存方面有重要作用。海藻糖酶是海藻糖水解酶，海藻糖酶可以将海藻糖分解为两分子的葡萄糖。目前，研究者们已经从很多生物体中分离出海藻糖酶。

海藻糖酶的催化残基分布在海藻糖酶标记结构域1和C末端之间，不是整体连接在一起而是分散在序列中。在不同的海藻糖酶中，这些保守的结构域分布是不同的。

糖苷水解酶的作用机制可以分为两类，保留催化机制和反转催化机制，海藻糖酶采用反转催化机制。在该机制中，酶分子中的活性残基(天冬氨酸或谷氨酸)起着重要的作用，一个氨基酸残基作为亲核基团，另一个氨基酸残基作为质子供体。具体的反应机制如下：(1)亲核基团(氨基酸残基)攻击水分子，水分子攻击底物的C1原子，形成桥状连接；(2)催化氨基酸残基(羧基和碱基)的羧基提供H⁺，其亲电攻击底物C1-O的O原子，形成中间体；(3)C1-O键断裂，形成产物。

研究表明，除了毕赤酵母(Pichia fermentans)是利用海藻糖磷酸化酶来分解海藻糖以外，所有真菌对海藻糖的分解都是通过海藻糖酶实现的，并且海藻糖是其专一的底物。根据最适pH和调节特性，真菌海藻糖酶可以分为酸性(非调节性)和中性(调节性)海藻糖酶。中性海藻糖酶是个胞内的酶，主要降解内源的海藻糖，例如在孢子萌发时期，细胞饥饿时期，或者细胞生长遭遇温度变换时。酸性海藻糖酶是个胞外的酶，能够帮助细胞吸收外源的海藻糖，所有的真菌在含有海藻糖为碳源的培养基中生长时，都需要酸性海藻糖酶。在很多真菌中，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和链珠菌(Candidautilis)等以及其他物种内，这2种酶都存在，但存在于不同亚细胞，生物化学和调控特性均不同，而且其功能是相对独立的，但这一现象多年来仍没有得到很好的解释。

酸性海藻糖酶的最适pH约为4.5，在pH4.5左右表现出最高酶活，酵母中的酸性海藻糖酶主要位于液泡，而丝状真菌的酸性海藻糖酶主要位于细胞壁。目前研究得较为深入的酸性海藻糖酶主要来源于酿酒酵母，该类酸性海藻糖酶属于一种液泡糖蛋白，它与中性海藻糖酶没有关联。此类酸性海藻糖酶不被ATP抑制，也不被磷酸化作用和Ca²⁺或Mn²⁺所激活，该类酸性海藻糖酶可被海藻糖诱导，同时被炭代谢物所抑制。目前已经报道的来源于丝状真菌的海藻糖酶以酸性海藻糖酶为主。丝状真菌酸性海藻糖酶是糖蛋白，主要存在于孢子、菌丝表面、液泡等中，较少分泌到培养基中。它们显示出良好的热稳定性，不被可逆的磷酸化作用。噬热真菌Scytalidium thermophilum和Humicola grisea酸性海藻糖酶被Ca²⁺或Mn²⁺所激活，ATP对其有轻微的抑制作用。然而，来源于Dictyostelium discoideum、Chaetomium acreum的酸性海藻糖酶对Ca²⁺、Mn²⁺、ATP并不敏感。

中性海藻糖酶在pH 7.0时表现出最高酶活，主要位于胞质中。中性海藻糖酶属于严格的调控酶。酿酒酵母及K.lactis，S.pombe，T.delbeueckii，C.utilis，Pachysolentannophilus等真菌中性海藻糖酶皆被信号途径所调控，这一信号途径主要通过磷酸化作用来调控酶的可逆性激活，葡萄糖、氮源、热击、化学物质等因素可诱发这些信号途径激活。在体外，来源于酿酒酵母、K.lactis的中性海藻糖酶的活性可被Ca²⁺、Mn²⁺激活，ATP对其有轻微的抑制作用。它们的蛋白序列显示N端区域有2个共有的依赖于cAMP蛋白磷酸化位点和一个推测的Ca²⁺结合序列。

近年来，人们对酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶的生理功能进行了大量研究。有报道利用酿酒酵母的酸性和中性海藻糖酶突变体来研究这些酶的生理功能，结果表明，酸性海藻糖酶突变体仍然可以分解胞质内海藻糖，但不能以外源海藻糖为碳源；相反，中性海藻糖酶突变体在含海藻糖的培养基上可以正常生长。丝状真菌粗糙脉孢菌酸性海藻糖酶缺失体不能利用海藻酶作为碳源，但是它与野生型一样可以有效的分解胞质内海藻糖，在构巢曲霉中也有相似发现。Foster等研究表明，构巢曲霉、白色链珠菌和稻瘟病菌中的中性海藻糖酶可以分解细胞内海藻糖。根据对以上几种酵母和丝状真菌的研究得到的证据表明，酸性和中性海藻糖酶具有独特和独立的作用，分别分解细胞外和胞质内海藻糖。所以这两种类型的海藻糖酶共存可能是一个普遍现象，一方面使得可以在真菌中积累并分解海藻糖，同时又可以利用细胞外海藻糖作为碳源。

除了此之外，拟南芥中超表达海藻糖酶基因AtTRE1可以提高植物抵抗干旱胁迫的能力，而且海藻糖酶表达参与脱落酸介导的气孔关闭。海藻糖酶还能够将昆虫体内的海藻糖降解成葡萄糖，用于能量供应，调节海藻糖的含量来应对环境的改变。另外，研究显示，在动物中尿海藻糖酶活性升高和肾病综合征的复发有关，因此可以通过测量尿海藻糖酶来诊断肾脏疾病。

海藻糖酶的异源表达主要是在大肠杆菌表达系统中进行表达，但表达的蛋白经常局限于周质腔或细胞质中，且活性较低，这可能与基因中有稀有密码子、翻译后的蛋白质需要修饰、编码的蛋白质对大肠杆菌具有一定毒性、编码的蛋白质对大肠杆菌系统内的蛋白酶比较敏感、编码的蛋白质结构过于复杂等因素有关。随着时代的发展、科技的进步，也有一大部分海藻糖酶基因在家蚕杆状病毒表达系统、毕赤酵母表达系统、酿酒酵母表达系统中成功表达。对海藻糖酶基因进行分析，选择合适的表达系统对于海藻糖酶的高效表达显得尤为重要。另外，通过基因手段在分子水平上对海藻糖酶基因进行改造也是提高海藻糖酶酶活的一个重要策略。

目前已经报道的海藻糖酶基因大多来源于昆虫、植物、动物等，来源于里氏木霉的海藻糖酶基因及其在毕赤酵母表达，黑曲霉表达系统中表达生产的海藻糖酶在酒精等发酵工业中的应用未见相关报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种海藻糖酶基因。

本发明的另一目的在于提供一种海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该海藻糖酶具有分解海藻糖的用途。

本发明的再一目的在于提供上述海藻糖酶在发酵生产酒精中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种海藻糖酶基因，其核苷酸序列能编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

优选的，上述海藻糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种重组载体，其含有上述所述的海藻糖酶基因。

一种重组细胞，其含有上述所述的海藻糖酶基因。

优选的，该细胞中含有上述所述的重组载体。

上述所述的海藻糖酶或上述任一项所述的海藻糖酶基因在发酵生产酒精中的应用。

一种发酵制备海藻糖酶的方法，包括以下步骤：利用含有上述任一项所述海藻糖酶基因的重组表达载体，将重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；对重组菌株进行发酵，诱导表达、分泌海藻糖酶。

优选的，所述重组表达载体中的载体选自酵母表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、霉菌表达载体。

上述任一项所述的海藻糖酶或海藻糖酶基因在发酵生产酒精中的应用。

一种发酵生产酒精的方法，包含如下步骤：向发酵原料中加入上述所述的海藻糖酶。

优选的，发酵过程中的pH值不超过7.0；更优选不超过6.0；最优选不超过5.0。

优选的，所述海藻糖酶的用量为每克发酵原料加入5-20U；更优选8～12U。

优选的，所述发酵原料选自玉米粉、淀粉渣、甘蔗蜜糖、薯中的至少一种。

本发明的有益效果是：

(1)本发明克隆到一个新的酸性海藻糖酶基因，该基因可以生产海藻糖酶，并能够将海藻糖降解成葡萄糖。

(2)本发明发现了新的酸性海藻糖酶TH3155，其由1056个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

(3)在发酵制酒精过程中添加一定量的本发明海藻糖酶，能将代谢过程中产生的海藻糖水解为葡萄糖，供酒精酵母利用，提高酒精产量，同时也降低了酒精发酵废水中海藻糖的残留，降低酒精发酵废水的处理成本。本发明的海藻糖酶在毕赤酵母和黑曲霉中产量高，可以大大节约成本，更重要的是应用效果好，提高酒精含量显著(发酵生产酒精行业中酒精含量提高2.36％以上，已经非常显著)。

附图说明

图1海藻糖酶TH3155在不同温度下的酶活力；

图2海藻糖酶TH3155在不同pH下的相对酶活力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1海藻糖酶基因TH3155的克隆

一、实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌Topl0、毕赤酵母X33、黑曲霉319菌株、质粒pPICzαA、质粒PBC-gla3、Zeocin抗生素均购自Invitrogen公司。

2、基因

菌株Trichoderma reesei，购自从广东微生物菌种保藏中心，从该菌株的基因组中扩增到一个海藻糖酶基因TH3155。

3、酶与试剂

超保真2×Master Mix PCR聚合酶，购自NEB公司；universai DNAPurification Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit、限制性内切酶购自上海生工公司。

4、培养基

大肠杆菌培养基为LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB+Amp培养基为LB培养基加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素。LB+Zeo培养基为LB培养基加入终浓度为25ug/mL的Zeocin。

酵母培养基为YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPD+Zeo培养基(YPD+Zeo培养基为YPD培养基加入终浓度为100μg/mL的Zeocin)。

二、实验方法与结果

1.Trichoderma reesei海藻糖酶基因TH3155的克隆

以Trichoderma reesei基因组为模板，设计3对引物(TH3155-F1～F3、TH3155-R1～R3)，PCR扩增3个片段，采用融合PCR的方法将3个片段融合，再以融合产物为模板，以TH3155-F1、TH3155-R3为引物，5'端引入EcoRI酶切位点，3'端引入Not I酶切位点，PCR扩增海藻糖酶基因全长TH3155，获得大小约为3.2kb的DNA片段，回收目的片段，引物序列如下：

TH3155-F1：CGTAGAATTCACAACACTCGTTGACCGCGTCACCAAGT(SEQ ID NO：3)；

TH3155-R1：GCGTCGACGTGGTTTGCATATTCATCAGGATCGGTCATGTTGGTCAGTGTC(SEQ IDNO：4)；

TH3155-F2：GACACTGACCAACATGACCGATCCTGATGAATATGCAAACCACGTCGACGC(SEQ IDNO：5)；

TH3155-R2：CCGTCGGGCGATTGCTTGTTGGCATAGTAGTCGAGGTCGTTGAGAGCAT(SEQ IDNO：6)；

TH3155-F3：ATGCTCTCAACGACCTCGACTACTATGCCAACAAGCAATCGCCCGACGG(SEQ IDNO：7)；

TH3155-R3：ACGTGCGGCCGCTTACAAACGCCGACGCATAAAGCTCCTCGGAT(SEQ ID NO：8)。

2.海藻糖酶基因TH3155序列的测定

将回收到的DNA目的片段与载体pPICzαA进行连接，再将连接产物转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中，在含Zeocin的平板中筛选重组转化子，挑取部分转化子培养，提取质粒进行双酶切验证，将双酶切获得的两个线性片段大小分别为3.2kb、3.3kb且单酶切获得的线性片段大小约为6.5kb的转化子送去测序。

3.海藻糖酶基因TH3155的核苷酸序列分析和氨基酸序列分析

用生物分析软件Vector NTI对测序结果进行分析，海藻糖酶基因TH3155的具有序列表中SEQ ID NO：1所述的碱基序列。具体而言，海藻糖酶的基因TH3155是由3171个碱基组成，含有完整的海藻糖酶基因TH3155的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。海藻糖酶基因TH3155编码一个含1056个氨基酸的蛋白质，预测该蛋白质的理论分子量大小为114.5KDa。

实施例2含海藻糖酶基因TH3155的毕赤酵母表达载体和宿主

海藻糖酶基因TH3155在毕赤酵母中的表达：用Pme I限制性内切酶将pPICzαA-TH3155重组表达载体酶切为线性化DNA片段，纯化DNA片段，采用电转化方法转化线性pPICzαA-TH3155DNA片段到表达宿主毕赤酵母X33感受态细胞中，涂布于YPD+Zeocin平板中，30℃倒置培养3-4天，挑取单菌落至2ml液体YPD培养基中，30℃，200rpm培养24小时，用1％甲醇诱导培养24小时，收集发酵液，离心，取上清即为粗酶液。

实施例3含海藻糖酶基因TH3155的黑曲霉表达载体和宿主

海藻糖酶基因TH3155在黑曲霉中的表达：用BglII限制性内切酶和PmeI限制性内切酶将pPICzαA-TH3155中的海藻糖酶基因TH3155构建到黑曲霉表达载体PBC-gla3，转化黑曲霉319菌株原生质体。涂布于TZ⁺潮霉素平板中，32℃倒置培养5-6天，挑取单菌落至20mL液体麦芽糊精培养基中，32℃，200rpm进行培养，筛选得到表达海藻糖酶的在重组黑曲霉。

实施例4海藻糖酶TH3155酶学性质的研究

(1)原理

海藻糖酶在一定条件下催化水解海藻糖，生成葡萄糖等还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色深浅与还原糖的量成正比，故可以在550nm的波长下进行比色，计算酶活力。

(2)酶反应体系

取1ml稀释适当倍数的发酵液加入1ml溶于pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液中的2％海藻糖溶液，50℃反应30分钟后终止反应，采用3,5-二硝基水杨酸法测定生成还原糖的量。

(3)海藻糖酶活定义

在上述条件下，每分钟产生1umol葡萄糖还原力的酶活力为一个酶活单位。

(4)试剂和溶液

乙酸-乙酸钠缓冲液：准确称取无水乙酸钠4.92g溶于水中，加冰乙酸，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，配好后用pH计校正至5.5。

DNS试剂：准确称取3，5-二硝基水杨酸6.3g放于盛有500ml蒸馏水的烧杯中，加氢氧化钠21g加热至50℃全溶，称取酒石酸钾钠182g放于300ml水中，加热溶解倒入前溶液中，加入苯酚5g，加无水亚硫酸钠5g，搅拌至完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，过滤，贮存于棕色瓶中放置7天后使用。

2％的海藻糖溶液：准确称取海藻糖2g，用pH5.5的乙酸乙酸钠缓冲液充分溶解定容至100ml(低温保存可用3天)。

(5)葡萄糖标准曲线的绘制

分别取0.1％标准葡萄糖液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，依次加入到刻度试管中，用蒸馏水补加至2.0ml，配制成每毫升分别含有葡萄糖100、200、300、400、500、600、700μg的标准液。分别加入DNS试剂3ml，于沸水中煮沸7分钟(样品放入重新沸腾时算起)，取出后立即加入蒸馏水10ml，混匀，冷却后，在分光光度计550nm比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值，以光密度为纵坐标，以对应的标准葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

空白样以0.5ml蒸馏水代替0.5ml标准葡萄糖液。

(6)具体测定步骤：

取1ml经适当稀释的酶液(实施例2酵母发酵所得酶液)加入3ml DNS充分混匀，50℃反应30min，加入1ml 2％海藻糖，在沸水中煮沸7分钟，冷却后加蒸馏水10ml混匀，按标准曲线时同样的操作测定光密度值OD₅₅₀。

取1ml经适当稀释的酶液(实施例2所得酶液)于50℃水浴锅预热8min，加1ml已经预热至50℃2％的海藻糖溶液于试管中，50℃反应30分钟后立即加入DNS试剂3ml，在沸水中煮沸7分钟，冷却后加蒸馏水10ml混匀，按标准曲线时同样的操作测定光密度值OD₅₅₀。

(7)酶活力的计算

酶活(u/ml)＝OD×K值÷30÷180×n

式中：

OD----样品与空白光密度值之差；

180---葡萄糖的分子量；

K-----标准曲线的斜率；

30-----酶反应时间；

n------发酵液稀释倍数。

(8)海藻糖酶TH3155的最适反应温度

在pH 5.5条件下，测定海藻糖酶TH3155在不同温度(30、35、40、45、50、55、58、60、65℃)下的酶活力，以50℃条件下的酶活为100％，计算相对酶活，其最适温度为45℃，发酵液最高酶活达到128U/ml(如图1所示)。

(9)海藻糖酶TH3155的最适反应pH

在50℃条件下，测定TH3155在不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)下的酶活力，以pH 5.5条件下的酶活为100％，计算相对酶活，其最适反应pH为3.5(如图2所示)，当pH达到6.0以上时，TH3155的相对酶活不超过60％。

实施例5海藻糖酶TH3155在发酵生产酒精过程中的应用

方法：将玉米粉与拌料水混合，料水比为1:2.25，用3M的磷酸溶液调pH至5.5，按20U/g玉米粉的用量加入耐高温α-淀粉酶，搅拌均匀后加热至95℃并维持90min；降温至室温，用3M的磷酸溶液调pH至4.3，按100U/g玉米粉的用量加入糖化酶，100U/g玉米粉的用量加入酸性蛋白酶，10U/g的用量玉米粉加入海藻糖酶TH3155，玉米粉的0.1％的量加入酵母活化液，摇匀后放入已升温至32℃的电热恒温培养箱中恒温发酵。发酵结束后，利用高效液相色谱结合有机酸分析柱检测发酵液中酒精含量，以不添加海藻糖酶TH3155作为空白对照。

结果：实验结果显示发酵结束时含海藻糖酶TH3155实验组的酒精含量为113.7g/L，空白对照的酒精含量为111.9g/L，含海藻糖酶TH3155实验组的酒精含量比空白对照的酒精含量高1.61％。

实施例6海藻糖酶TH3155在发酵生产酒精过程中的应用

方法：将玉米粉与拌料水混合，料水比为1:2.25，用3M的磷酸溶液调pH至5.5，按20U/g玉米粉加入耐高温α-淀粉酶，搅拌均匀后加热至95℃并维持90min；降温至室温，用3M的磷酸溶液调pH至4.3，按100U/g玉米粉加入糖化酶，100U/g玉米粉加入酸性蛋白酶，10U/g玉米粉加入海藻糖酶TH3155，玉米粉的0.1％加入酵母活化液摇匀后放入已升温至40℃的电热恒温培养箱中恒温发酵。发酵结束后，利用高效液相色谱结合有机酸分析柱检测发酵液中酒精含量，以不添加海藻糖酶TH3155作为空白对照。

结果：实验结果显示发酵结束时含海藻糖酶TH3155的实验组的酒精含量为113.5g/L，高于空白对照的酒精含量为110.8g/L，含海藻糖酶TH3155的实验组的酒精含量比空白对照的酒精含量高2.44％。

实施例7海藻糖酶TH3155在发酵生产酒精过程中的应用

方法：将玉米粉与拌料水混合，料水比为1:2.0，用3M的磷酸溶液调pH至5.5，按20U/g玉米粉加入耐高温α-淀粉酶，搅拌均匀后加热至95℃并维持90min；降温至室温，用3M的磷酸溶液调pH至4.3，按100U/g玉米粉加入糖化酶，100U/g玉米粉加入酸性蛋白酶，10U/g玉米粉加入海藻糖酶TH3155，玉米粉的0.1％加入酵母活化液摇匀后放入已升温至35℃的电热恒温培养箱中恒温发酵。发酵结束后，利用高效液相色谱结合有机酸分析柱检测发酵液中酒精含量，以不添加海藻糖酶TH3155作为空白对照。

结果：实验结果显示发酵结束时含海藻糖酶TH3155的实验组的酒精含量为121.5g/L，高于空白对照的酒精含量为118.7g/L，含海藻糖酶TH3155的实验组的酒精含量比空白对照的酒精含量高2.36％。

上述结果说明，在酒精发酵过程中添加一定量的本发明海藻糖酶，能将代谢过程中产生的海藻糖水解为葡萄糖，供酒精酵母利用，提高酒精产量，同时也降低了酒精发酵废水中海藻糖的残留，降低酒精发酵废水的处理成本。

在发酵生产酒精过程中，酒精酵母由于受温度、底物浓度及后期逐渐积累的酒精等胁迫因子的影响，代谢过程会积累一定量的海藻糖，而海藻糖属于由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原糖，此糖不能被酒精酵母所利用。因为海藻糖形成与葡萄糖利用处于直接竞争关系，非发酵性海藻糖的增加，必然会影响原料的利用率，降低酒精的理论收率；同时由于积累的海藻糖残留在发酵液中，对酒精发酵的废水处理也会产生不利影响。因此发酵法制酒精过程中添加一定量的海藻糖酶，将代谢过程中产生的海藻糖水解为葡萄糖，供酒精酵母利用，可以提高酒精产量，由此可见，本发明海藻糖酶在发酵制酒精等工业领域具有广泛的应用价值，对海藻糖酶进行深入研究有非常重要的意义。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司

<120> 一种二糖降解酶基因及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3171

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 1

acaacactcg ttgaccgcgt caccaagtgt ctcagcagac acgacggctc agacgcggaa 60

tcccacttca gcaaaaacgt ctacaagacc gacttcgccg gcgtaacgtg ggacgaggac 120

aactggctgc tcagcacgac gcagctcaag cagggcgcct tcgaggcccg cggctccgtg 180

gccaatggct acctgggcat caacgtcgcc agcgtcgggc cctttttcga ggtcgacacc 240

gaggaggacg gcgatgtcat cagcggctgg cccctgttct cgaggcggca gtcgtttgcg 300

accgttgccg gcttctggga cgcgcagccg cagatgaacg ggaccaactt cccgtggctc 360

tcgcagtacg gctccgacac ggccatcagc ggcatcccgc actggagcgg cctcgtcctg 420

gacctcgggg gcggcacgta cctcgatgcc acggtcagca acaagaccat ctcccacttc 480

cgctcgacct acgactacaa ggccggcgtg ctgagctggt cgtacaagtg gacgcccaag 540

ggcaacaagg gctcctttga catctcgtac cgcctctttg ccaacaagct gcacgtgaac 600

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gccatcttcg cggcggtgcg gccaaatggc gtcgccaacg tcacggccta cgtctatgct 780

gatatcaccg gatctggagg cgtcaacctg tcgagccgca agatcgtgca caacaagccg 840

tatgtacacg ccaacgcatc gtccattgca caggctgtcc ccgtcaagtt cgccgccgga 900

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ccggaggccg ccgagagaat cacaaactac cgcctcgcgc gatacggcca ggccaaggag 1380

aacgtcaaga cggcctatgc gggctcccag aacgagacct tcttctcggc ctctgcggcc 1440

gtgttcccgt ggaccagcgg ccggtacggc aactgtaccg ctactggccc ctgctgggac 1500

tacgagtacc atttgaacgg cgacattggc atttctctgg tcaaccagtg ggtggtgaac 1560

ggtgacacca aggactttga gaagaatctc ttcccagtgt acgactcggt tgcccagctg 1620

tacggcaacc tgctccggcc gaacaagacg tcgtggacac tgaccaacat gaccgatcct 1680

gatgaatatg caaaccacgt cgacgccggt ggatacacca tgccgctcat cgcagagacg 1740

ctccaaaagg ccaacagctt ccgccagcag tttggcatcg agcagaacaa gacgtggaac 1800

gacatggcgt ccaacgtcct ggttcttcgc gagaacgggg tgacgctcga gttcacggcc 1860

atgaacggaa ccgcagtggt caagcaggcc gatgtgatta tgctcaccta ccccctgagt 1920

tacggcacca actacagcgc gcaagatgct ctcaacgacc tcgactacta tgccaacaag 1980

caatcgcccg acggaccggc catgacatat gccttcttct ccatcgtcgc caacgaaatc 2040

tctccctcgg gctgctcggc ctacacgtac gcgcaaaacg ccttcaagcc ctacgtccgc 2100

gcccccttct accagatatc cgagcagctc atcgacgatg ccagcgtcaa cggcggcacg 2160

caccctgcct acccgttcct caccggccac ggcggcgccc accaggtcgt cctctttggc 2220

tacctcggcc tccggctggt gccagacgac gtcatccaca tcgagcccaa cctgccccct 2280

cagatcccgt atctgagata caggacgttt tactggcgcg gctggcccat ctcggcctgg 2340

tccaactaca cgcacacgac cctcagccgc gccgccggcg ttgctgcgct cgagggggcg 2400

gaccagcggt ttgctcgcaa gcccatcacc atccacgccg gccccgaaca ggacccaaca 2460

gcgtaccggc tgcccgtcaa gggctccgtc gtgatcccca acaagcagat cggctctcag 2520

cagacatacg ccggcaacct ggtgcagtgc cacgccgcca gctctcccaa cgactacgtg 2580

ccgggccagt tccccattgc cgccgtcgat ggcgccacgt ctaccaagtg gcagcccgcc 2640

tccgccgaca aggtcagctc catcaccgtg tcactggaca aggaggacgt gggatctctg 2700

gtgtcgggct tccatttcga ctgggcccag gcccctcccg tcaacgccac cgtcatcttc 2760

cacgacgagg cccttgcgga tcctgccacg gcgctcgcct ccgcgcacaa gcacaactcc 2820

aagtacacaa ccgtcacctc gttgacaaac attgagctgt ccgacccgta cgtttcgacc 2880

aaggacctca acgccattgc catccccatt ggcaacacga ccaacgtcac cctctcgcac 2940

cccgtggccg cttcccgata tgcatccctc ctcatcgtcg ggaaccaggg cctcgacccc 3000

gtggacgtca aagcaaagaa cggcaccggc gctacggtgg cggagtgggc tatctttggc 3060

catggcaagg agcactctgg caagccgagc tctcacagca agaggaggtt gaatgtccgg 3120

accgcggcca ctttgtcgaa tccgaggagc tttatgcgtc ggcgtttgta a 3171

<210> 2

<211> 1056

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 2

Thr Thr Leu Val Asp Arg Val Thr Lys Cys Leu Ser Arg His Asp Gly

1 5 10 15

Ser Asp Ala Glu Ser His Phe Ser Lys Asn Val Tyr Lys Thr Asp Phe

20 25 30

Ala Gly Val Thr Trp Asp Glu Asp Asn Trp Leu Leu Ser Thr Thr Gln

35 40 45

Leu Lys Gln Gly Ala Phe Glu Ala Arg Gly Ser Val Ala Asn Gly Tyr

50 55 60

Leu Gly Ile Asn Val Ala Ser Val Gly Pro Phe Phe Glu Val Asp Thr

65 70 75 80

Glu Glu Asp Gly Asp Val Ile Ser Gly Trp Pro Leu Phe Ser Arg Arg

85 90 95

Gln Ser Phe Ala Thr Val Ala Gly Phe Trp Asp Ala Gln Pro Gln Met

100 105 110

Asn Gly Thr Asn Phe Pro Trp Leu Ser Gln Tyr Gly Ser Asp Thr Ala

115 120 125

Ile Ser Gly Ile Pro His Trp Ser Gly Leu Val Leu Asp Leu Gly Gly

130 135 140

Gly Thr Tyr Leu Asp Ala Thr Val Ser Asn Lys Thr Ile Ser His Phe

145 150 155 160

Arg Ser Thr Tyr Asp Tyr Lys Ala Gly Val Leu Ser Trp Ser Tyr Lys

165 170 175

Trp Thr Pro Lys Gly Asn Lys Gly Ser Phe Asp Ile Ser Tyr Arg Leu

180 185 190

Phe Ala Asn Lys Leu His Val Asn Gln Ala Val Val Asp Met Gln Val

195 200 205

Thr Ala Ser Lys Asn Val Gln Ala Ser Ile Val Asn Val Leu Asp Gly

210 215 220

Phe Ala Ala Val Arg Thr Asp Phe Val Glu Ser Gly Glu Asp Gly Ser

225 230 235 240

Ala Ile Phe Ala Ala Val Arg Pro Asn Gly Val Ala Asn Val Thr Ala

245 250 255

Tyr Val Tyr Ala Asp Ile Thr Gly Ser Gly Gly Val Asn Leu Ser Ser

260 265 270

Arg Lys Ile Val His Asn Lys Pro Tyr Val His Ala Asn Ala Ser Ser

275 280 285

Ile Ala Gln Ala Val Pro Val Lys Phe Ala Ala Gly Arg Thr Val Arg

290 295 300

Val Thr Lys Phe Val Gly Ala Ala Ser Ser Asp Ala Phe Lys Asn Pro

305 310 315 320

Lys Gln Val Ala Lys Lys Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ser Asn Gly Tyr

325 330 335

Thr Lys Ser Leu Lys Ala His Val Glu Glu Trp Ala Thr Val Met Pro

340 345 350

Glu Ser Ser Val Asp Ser Phe Ala Asp Pro Lys Thr Gly Lys Leu Pro

355 360 365

Ala Asp Ser His Ile Val Asp Ser Ala Ile Ile Ala Val Thr Asn Thr

370 375 380

Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Thr Val Gly Lys Asn Gly Ile Lys Ala Val

385 390 395 400

Asp Gly Ala Pro Val Asn Val Asp Ser Ile Ser Val Gly Gly Leu Thr

405 410 415

Ser Asp Ser Tyr Ala Gly Gln Ile Phe Trp Asp Ala Asp Leu Trp Met

420 425 430

Gln Pro Gly Leu Val Ala Ala His Pro Glu Ala Ala Glu Arg Ile Thr

435 440 445

Asn Tyr Arg Leu Ala Arg Tyr Gly Gln Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr

450 455 460

Ala Tyr Ala Gly Ser Gln Asn Glu Thr Phe Phe Ser Ala Ser Ala Ala

465 470 475 480

Val Phe Pro Trp Thr Ser Gly Arg Tyr Gly Asn Cys Thr Ala Thr Gly

485 490 495

Pro Cys Trp Asp Tyr Glu Tyr His Leu Asn Gly Asp Ile Gly Ile Ser

500 505 510

Leu Val Asn Gln Trp Val Val Asn Gly Asp Thr Lys Asp Phe Glu Lys

515 520 525

Asn Leu Phe Pro Val Tyr Asp Ser Val Ala Gln Leu Tyr Gly Asn Leu

530 535 540

Leu Arg Pro Asn Lys Thr Ser Trp Thr Leu Thr Asn Met Thr Asp Pro

545 550 555 560

Asp Glu Tyr Ala Asn His Val Asp Ala Gly Gly Tyr Thr Met Pro Leu

565 570 575

Ile Ala Glu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Phe Arg Gln Gln Phe Gly

580 585 590

Ile Glu Gln Asn Lys Thr Trp Asn Asp Met Ala Ser Asn Val Leu Val

595 600 605

Leu Arg Glu Asn Gly Val Thr Leu Glu Phe Thr Ala Met Asn Gly Thr

610 615 620

Ala Val Val Lys Gln Ala Asp Val Ile Met Leu Thr Tyr Pro Leu Ser

625 630 635 640

Tyr Gly Thr Asn Tyr Ser Ala Gln Asp Ala Leu Asn Asp Leu Asp Tyr

645 650 655

Tyr Ala Asn Lys Gln Ser Pro Asp Gly Pro Ala Met Thr Tyr Ala Phe

660 665 670

Phe Ser Ile Val Ala Asn Glu Ile Ser Pro Ser Gly Cys Ser Ala Tyr

675 680 685

Thr Tyr Ala Gln Asn Ala Phe Lys Pro Tyr Val Arg Ala Pro Phe Tyr

690 695 700

Gln Ile Ser Glu Gln Leu Ile Asp Asp Ala Ser Val Asn Gly Gly Thr

705 710 715 720

His Pro Ala Tyr Pro Phe Leu Thr Gly His Gly Gly Ala His Gln Val

725 730 735

Val Leu Phe Gly Tyr Leu Gly Leu Arg Leu Val Pro Asp Asp Val Ile

740 745 750

His Ile Glu Pro Asn Leu Pro Pro Gln Ile Pro Tyr Leu Arg Tyr Arg

755 760 765

Thr Phe Tyr Trp Arg Gly Trp Pro Ile Ser Ala Trp Ser Asn Tyr Thr

770 775 780

His Thr Thr Leu Ser Arg Ala Ala Gly Val Ala Ala Leu Glu Gly Ala

785 790 795 800

Asp Gln Arg Phe Ala Arg Lys Pro Ile Thr Ile His Ala Gly Pro Glu

805 810 815

Gln Asp Pro Thr Ala Tyr Arg Leu Pro Val Lys Gly Ser Val Val Ile

820 825 830

Pro Asn Lys Gln Ile Gly Ser Gln Gln Thr Tyr Ala Gly Asn Leu Val

835 840 845

Gln Cys His Ala Ala Ser Ser Pro Asn Asp Tyr Val Pro Gly Gln Phe

850 855 860

Pro Ile Ala Ala Val Asp Gly Ala Thr Ser Thr Lys Trp Gln Pro Ala

865 870 875 880

Ser Ala Asp Lys Val Ser Ser Ile Thr Val Ser Leu Asp Lys Glu Asp

885 890 895

Val Gly Ser Leu Val Ser Gly Phe His Phe Asp Trp Ala Gln Ala Pro

900 905 910

Pro Val Asn Ala Thr Val Ile Phe His Asp Glu Ala Leu Ala Asp Pro

915 920 925

Ala Thr Ala Leu Ala Ser Ala His Lys His Asn Ser Lys Tyr Thr Thr

930 935 940

Val Thr Ser Leu Thr Asn Ile Glu Leu Ser Asp Pro Tyr Val Ser Thr

945 950 955 960

Lys Asp Leu Asn Ala Ile Ala Ile Pro Ile Gly Asn Thr Thr Asn Val

965 970 975

Thr Leu Ser His Pro Val Ala Ala Ser Arg Tyr Ala Ser Leu Leu Ile

980 985 990

Val Gly Asn Gln Gly Leu Asp Pro Val Asp Val Lys Ala Lys Asn Gly

995 1000 1005

Thr Gly Ala Thr Val Ala Glu Trp Ala Ile Phe Gly His Gly Lys

1010 1015 1020

Glu His Ser Gly Lys Pro Ser Ser His Ser Lys Arg Arg Leu Asn

1025 1030 1035

Val Arg Thr Ala Ala Thr Leu Ser Asn Pro Arg Ser Phe Met Arg

1040 1045 1050

Arg Arg Leu

1055

Claims

1.一种海藻糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种海藻糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列能编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的一种海藻糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

4.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的海藻糖酶基因。

5.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的海藻糖酶基因。

6.权利要求1所述的海藻糖酶或权利要求2～3任一项所述的海藻糖酶基因在发酵生产酒精中的应用。

7.一种发酵制备海藻糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用含有权利要求2或3所述海藻糖酶基因的重组表达载体，将重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；对重组菌株进行发酵，诱导表达、分泌海藻糖酶。

8.一种发酵生产酒精的方法，其特征在于，包含如下步骤：向发酵原料中加入权利要求1所述的海藻糖酶；发酵过程中的pH值不超过7.0。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述海藻糖酶的用量为每克发酵原料加入5～20U。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述发酵原料选自玉米粉、淀粉渣、甘蔗蜜糖、薯中的至少一种。