CN110106157A

CN110106157A - 一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre及其编码基因与应用

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Publication number: CN110106157A
Application number: CN201910306109.0A
Authority: CN
Inventors: 潘力; 董良波; 王斌
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-04-17
Also published as: CN110106157B

Abstract

本发明公开了一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS‑Tre及其编码基因与应用。经优化的高温海藻糖酶MS‑Tre，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明经优化的高温海藻糖酶MS‑Tre编码基因与优化前的编码基因相比，可以在黑曲霉中更高效表达，重组黑曲霉菌株可以高产海藻糖酶。本发明提供的海藻糖酶稳定性好，在高温条件下也能将二糖水解成单糖，降低淀粉液化后的冷却耗能和提高淀粉质原料的利用率，提高生物能源的利用效率，降低生产成本，本发明提供的海藻糖酶MS‑Tre及其编码基因对实现海藻糖酶工业化生产具有一定的现实意义和应用价值。

Description

一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre 及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre及其编码基因与应用。

背景技术

海藻糖trehalose(α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷)是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性二糖，广泛存在于包括细菌、真菌、原生动物、植物、哺乳动物在内的有机体中。

海藻糖酶(trehalase)是一种葡萄糖苷水解酶，在酶分类上归属于水解酶，分类编号为EC3.2.1.28，可以特异性将一分子的海藻糖水解生成两分子的葡萄糖，广泛存在于细菌、霉菌、植物和动物中。根据海藻糖酶发挥酶活性的pH环境不同，可以将海藻糖酶分为酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶，酸性海藻糖酶的最适pH大约是4.5-5.5，一般分泌到胞外发挥作用，将海藻糖水解为葡萄糖供细胞利用，中性海藻糖酶的最适pH大约是7.0，一般分布在胞内，主要是分解胞内的海藻糖供生命所需。现在研究得最多的酸性海藻糖酶来源于酵母和丝状真菌，酵母中的酸性海藻糖酶定位于液泡，在丝状真菌中则定位于细胞壁。

目前关于海藻糖酶的表达研究较少，研究主要集中在重组蛋白表达和酶学性质的测定方面，已报道的海藻糖酶重组表达宿主主要为大肠杆菌和毕赤酵母，而且重组表达的海藻糖酶活力和蛋白产量都很低。Yingchun Liu等人利用毕赤酵母作为表达宿主，表达来源于绿僵菌的一个海藻糖酶，发酵上清液酶活力为5.35U/mg蛋白，从1L发酵上清液中仅可以回收到0.2mg海藻糖酶(Dmitryjuk,KrystynaPurificationand characterization of acid trehalase from muscle of Ascaris suum(Nematoda)[J].Comparative Biochemistry&Physiology Part B,2003,136(1):61-69.)；Jin-Ha LEE等人在毕赤酵母中表达来源于蜜蜂的海藻糖酶，发酵液的海藻糖酶活力仅为5.1U/ml(LeeJ H,Saito S,Mori H,et al.Molecular Cloning of cDNA for Trehalase from theEuropean Honeybee,Apis mellifera L.and Its Heterologous Expression in Pichiapastoris[J].Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan,2007,71(9):10.)；Fabiana M.de Almeida等人在大肠杆菌里表达中性海藻糖酶，破碎后上清液酶活力为0.15U/ml(Almeida F M D,Bonini B M,Beton D,et al.Heterologous expression inEscherichia coli of Neurospora crassa neutral trehalase as an active enzyme.[J].Protein Expression&Purification,2009,65(2):185-189.)。酶学性质方面，鉴定表达出来的海藻糖酶分子量范围较广，在60kDa-170kDa，主要为中性海藻糖酶，最适pH为7.0左右，酸性海藻糖酶研究较少，最适的作用温度在30-40℃。

现如今的酒精发酵主要是以淀粉质原料为主，在玉米酒精工厂中未发酵残糖中二糖的主要成分通常是海藻糖，如果在发酵前用海藻糖酶将海藻糖水解为葡萄糖，就可以有更多的葡萄糖用于生产更多的乙醇。在欧洲，玉米酒精工厂的平均产能为2.2亿升(约合17.6万吨乙醇)，通过更好地转化降低残糖比如海藻糖，可为酒精工厂，仅在欧洲，可增产价值高至85万欧元的乙醇。

同时也有文献报道，在谷氨酸发酵过程中，在发酵的后期添加海藻糖酶，可以提高糖源的转化效率以及提高最后的谷氨酸产量(韩隽,姬慧军.海藻糖酶在谷氨酸发酵中的应用[J].广州化工,2017,45(7):73-74.)。

因此，海藻糖酶可以作为工业上淀粉质原料发酵生产过程的一个关键添加酶，可以与传统的α-淀粉酶、糖化酶形成一个复配酶，提高淀粉质原料的利用效率，提高能源利用率，从而达到降低生产成本的目的。而目前的文献报道中，关于海藻糖酶的研究，主要集中在酶学性质的测定方面，而且重组海藻糖酶的表达水平都很低，未见有专门的海藻糖酶高效表达文献报道。

工业上的淀粉液化主要在高温条件下进行，液化结束后冷却到一定温度后才能进行下一步的操作，所以工业上迫切需要筛选出在高温条件下能发挥酶活性，将液化后产生的大量二糖水解成单糖的海藻糖酶，从而降低淀粉液化后的冷却耗能和提高酵母酒精发酵过程中淀粉质原料的利用率，减少资源浪费，提高生物能源的利用效率。故筛选出适合于工业生产条件的高温海藻糖酶，而且实现海藻糖酶的高效表达甚至工业化规模表达具有一定的现实意义和应用价值。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre及其编码基因与应用。

本发明提供一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶氨基酸序列、经优化的编码上述高温海藻糖酶的基因、包含上述基因的重组表达载体、包含上述基因的重组菌株以及制备上述高温海藻糖酶的基因工程方法。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明的高温海藻糖酶原始基因来源于Myceliophthora sepedonium。

本发明提供的一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre，氨基酸序列(trehalase-PRT(经优化))如SEQ ID NO.1所示。

其中，经优化的高温海藻糖酶包括692个氨基酸，N端含信号肽序列。

本发明的经优化的海藻糖酶MS-Tre的最适pH为5.6，在pH4.5-7.0稳定性好，在pH4.0-6.0范围内反应，酶活力为最高酶活力的60％以上；最适温度为60℃，在55-65℃范围内反应，仍保持最高酶活力的80％以上。

本发明所述的一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre，其编码基因的核苷酸序列(trehalase-DNA(经优化))如SEQ ID NO.2所示，该编码基因可以在黑曲霉中高效表达。

本发明中的经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre结构基因全长为2079bp，N端含信号肽编码序列。

本发明提供的一种重组表达载体，插入了如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的重组表达载体包含有pMD20-T载体、黑曲霉中性淀粉酶启动子PamyA、黑曲霉tef终止子、构巢曲霉尿嘧啶(U)生物合成基因pyrG、黑曲霉中性淀粉酶编码基因最后1000bp序列(作为同源臂，如SEQ ID NO.5所示)以及所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的编码基因(trehalase-DNA(经优化))，使所述的高温海藻糖酶编码基因核苷酸序列位于诱导型启动子PamyA的下游并受其调控，而且能通过同源重组的方式整合至黑曲霉的中性淀粉酶位点。该重组载体为pMD20-PamyA-MS-Tre-Ttef-pyrG-amyA，将本发明的海藻糖酶基因优化序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与其它表达元件相连接，得到重组表达载体pMD20-PamyA-MS-Tre-Ttef-pyrG-amyA。

本发明提供的一种转基因细胞系，含有上述的重组表达载体。

进一步地，所述的转基因细胞系，宿主细胞为黑曲霉菌。

进一步地，所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的编码基因、所述重组表达载体，在制备所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的应用。

进一步地，所述制备所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的应用，包括以下步骤：

(1)构建重组表达载体；

(2)用步骤(1)构建的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株即转基因细胞系；

(3)培养重组菌株，用发酵培养基诱导重组菌株表达所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre；

(4)回收并纯化所述经优化的高温海藻糖酶MS-Tre(trehalase-PRT(经优化))。

所述转基因细胞系，在制备权利要求1所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的应用。

进一步地，本发明所用的表达宿主为黑曲霉(Aspergillus niger)。

本发明构建的通用表达载体含有黑曲霉中性淀粉酶的同源臂(amyA)，将海藻糖酶基因插入到一个构建好的通用表达载体中，同时使用黑曲霉中性淀粉酶启动子，使其可以通过同源重组的方式整合至黑曲霉宿主的中性淀粉酶位点，得到重组菌株Aspergillusniger-MS-Tre。

进一步地，步骤(2)中所述的重组菌株为转化了所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre编码基因的菌株。

本发明所述的经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre可应用于现有玉米淀粉发酵酒精和谷氨酸发酵原料的预处理。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明得到的重组菌株Aspergillus niger-MS-Tre(即转基因细胞系)在100mL发酵培养基中进行摇瓶发酵，第七天的发酵上清液中海藻糖酶活力达到34442.599U/ml，经过凝胶过滤层析纯化，从1ml发酵上清液中可以纯化得到4.3mg以上的重组海藻糖酶，仅从100ml的摇瓶发酵液就可以回收430mg以上重组海藻糖酶，纯化的重组海藻糖酶比酶活达到7334.2398U/mg，远高于现有文献报道的重组海藻糖酶表达纯化水平；

(2)本发明提供的海藻糖酶稳定性好，在高温条件下也具有活性，能将二糖水解成单糖；

(3)本发明提供的海藻糖酶可对现有玉米淀粉发酵酒精和谷氨酸发酵原料的预处理问题提供了一个具有经济价值和减少资源浪费的解决方案，玉米淀粉发酵酒精的淀粉预处理主要包括高温液化，但是现有的高温液化和酶法液化结束后，会产生很多二糖，而这些二糖中的主要成分是海藻糖，酵母发酵过程中也会产生许多海藻糖，而此海藻糖不能为酵母所利用，如果添加海藻糖酶，将产生的海藻糖水解成单分子的葡萄糖，为酵母所利用，可以提高最后乙醇的产量，提高了玉米淀粉的利用率，降低淀粉液化后的冷却耗能和提高淀粉质原料的利用率，减少资源浪费，提高生物能源的利用效率；对实现海藻糖酶的高效表达甚至工业化规模表达具有一定的现实意义和应用价值。

附图说明

图1是两个不同重组菌株第八天发酵上清液SDS-PAGE结果图，其中泳道1为氨基酸序列未优化的高温海藻糖酶转化子重组菌株Aspergillus niger-MSre第八天的发酵上清液，泳道2为氨基酸序列经过优化后的高温海藻糖酶转化子重组菌株Aspergillus niger-MS-Tre第八天发酵上清液，泳道M为Thermo Scientific Protein Ladders No.26616。

图2是经优化的高温海藻糖酶发酵上清液的SDS-PAGE结果图，其中泳道1为第一天发酵上清液，泳道2为第二天发酵上清液，泳道3为第三天发酵上清液，泳道4为第四天发酵上清液，泳道5为第五天发酵上清液，泳道6为第六天发酵上清液，泳道7为第七天发酵上清液，泳道8为第八天发酵上清液，泳道M为Thermo Scientific Protein Ladders No.26616，泳道C为宿主第七天发酵液上清液。

图3为发酵上清液的海藻糖酶MS-Tre活力测定结果图。

图4为经优化的高温海藻糖酶MS-Tre的最适温度图。

图5为经优化的高温海藻糖酶MS-Tre1的最适pH图。

图6为经优化的高温海藻糖酶MS-Tre凝胶过滤层析纯化洗脱峰SDS-PAGE结果图，其中泳道1为第七天发酵上清液，泳道2为凝胶过滤层析洗脱液，泳道M为ThermoScientific Protein Ladders No.26616。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

已报道的海藻糖酶表达基因有很大部分来源于酵母、里氏木霉和其它细菌，因为我们的表达宿主为黑曲霉，所以我们希望能从丝状真菌属里面筛选出一个合适的海藻糖酶基因，故我们将里氏木霉的海藻糖酶基因通过数据库比对的方法寻找同源性高的序列。由于淀粉液化都是在较高温度下进行的，液化结束冷却后才能进行下一步的处理，于是希望能从嗜热菌里面筛选出耐高温的或者在高温条件下还能发挥酶活性的海藻糖酶基因，最后从Myceliophthora sepedonium中筛选出海藻糖酶基因，该基因通过序列比对的方式，发现该基因的氨基酸序列与目前被验证的海藻糖酶氨基酸序列具有相似的结构序列，预测该基因的产物具有海藻糖酶活性，但是未有实验证明该基因的产物具有海藻糖酶活性。

根据数据库中的目的基因(海藻糖酶基因)以及氨基酸序列(海藻糖酶)，对目的基因已知氨基酸序列进行优化，得到的优化后氨基酸序列(trehalase-PRT(经优化))如SEQID NO.1所示。根据优化后的氨基酸序列，再对其核苷酸序列进行优化，使其适合于在黑曲霉(Aspergillus niger)中高效表达，体外合成优化的核苷酸序列(trehalase-DNA(经优化)，如SEQ ID NO.2所示)；同时作为对照，我们也根据目的基因已知的氨基酸序列(如SEQID NO.14所示)，不对氨基酸序列进行优化，但对其核苷酸序列进行优化(如SEQ ID NO.15所示)，使其适用黑曲霉的密码子偏好性。设计引物以合成的目的基因核苷酸序列为模板扩增目的基因片段。将扩增到的目的基因片段、黑曲霉amyA启动子片段和线性化的通用表达载体进行连接，构建包含有目的基因片段的表达载体。转化黑曲霉原生质体，并对转化子进行PCR上下游鉴定和表达框扩增，挑选阳性克隆，接种液体CD培养，最后接种至发酵培养基中发酵，每天取样测定上清液中的海藻糖酶活力，SDS-PAGE检测发酵上清液中重组海藻糖酶的表达量，从而确定该基因的产物具有海藻糖酶活性，该基因确实是一个海藻糖酶编码基因，而且与已知的海藻糖酶氨基酸序列相比，本发明提供的优化后的海藻糖酶在黑曲霉中可以更高效地表达。

实施例1、通用表达载体的构建

以黑曲霉基因组为模板，做PCR扩增(Prime STAR premix HS(购自takara公司))，使用引物Ttef-fw(如SEQ ID NO.8所示，Primer表示引物的意思，下同)和引物Ttef-rev(如SEQ ID NO.9所示)扩增tef终止子(如SEQ ID NO.3所示)，使用引物amyA-fw(如SEQ IDNO.12所示)和引物amyA-rev(如SEQ ID NO.13所示)扩增中性淀粉酶amyA编码基因的最后1000bp(如SEQ ID NO.5所示)，以构巢曲霉基因组为模板使用引物pyrG-fw(如SEQ IDNO.10所示)和引物pyrG-rev(如SEQ ID NO.11所示)扩增pyrG标记(如SEQ ID NO.4所示)，得到的PCR产物分别命名为Ttef、amyA、pyrG(分别如SEQ ID NO.3、如SEQ ID NO.5、如SEQID NO.4所示)，使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit试剂盒，将Ttef、pyrG、amyA、T载体pMD20-T(如SEQ ID NO.6所示)四个片段连接成为一个环状质粒pMD20-Ttef-pyrG-amyA(具体参考NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit试剂盒说明书)。连接产物转化大肠杆菌Match1T1(购自takara公司)感受态，37℃培养12h后挑取转化子于液体LB+Amp(终浓度100μg/ml)培养基，37℃条件下、摇床转速为200rpm培养12h，做菌液电泳，初步筛选出阳性转化子。菌液电泳筛选到的阳性转化子提质粒、酶切验证，挑选最后质粒大小正确而且酶切验证正确的阳性转化子3个送去测序公司测序。拿到测序结果后与模板序列做比对，挑选测序完全正确的转化子于液体LB+Amp(终浓度100μg/ml)培养基，37℃条件下、摇床转速为200rpm培养12h，提质粒，用限制性内切酶EcoRV酶切4h，同时用去磷酸化酶FastAP做去磷酸化处理，防止载体自连，最后得到线性化的通用表达载体。

实施例2、含目的基因表达载体构建

分别以合成的氨基酸序列优化后的MS-Tre基因核苷酸序列、合成的氨基酸序列未优化的MSre基因核苷酸序列、黑曲霉基因组为模板，以引物Tre1-fw(如SEQ ID NO.18所示)和引物Tre-rev(如SEQ ID NO.19所示)扩增得到氨基酸序列优化后的MS-Tre基因序列(如SEQ ID NO.2所示)，以引物Tre2-fw(如SEQ ID NO.20所示)和引物Tre-rev(如SEQ IDNO.19所示)扩增得到氨基酸序列未优化的MSre基因序列(如SEQ ID NO.2所示)，以引物PamyA-fw(如SEQ ID NO.16所示)和引物PamyA-rev(如SEQ ID NO.17所示)扩增得到黑曲霉中性淀粉酶启动子PamyA序列(如SEQ ID NO.7所示)。将3个PCR扩增得到的PCR片段，两两与线性化通用表达载体做infusion PCR连接。连接产物转化大肠杆菌Match1T1(购自takara公司)感受态，37℃培养12h以后挑取转化子于液体LB+Amp(终浓度100μg/ml)培养基，37℃条件下、摇床转速为200rpm培养12h，做菌液电泳，初步筛选出阳性转化子。菌液电泳筛选到的阳性转化子提质粒、酶切验证，挑选最后质粒大小正确而且酶切验证正确的阳性转化子3个送去测序公司测序。拿到测序结果后与模板序列做比对，挑选测序完全正确的转化子，接种100mL液体LB+Amp(终浓度100μg/ml)培养基培养，提质粒，得到氨基酸序列优化后的表达载体pMD20-PamyA-MS-Tre-Ttef-pyrG-amyA和氨基酸序列未优化的表达载体pMD20-PamyA-MSre-Ttef-pyrG-amyA

实施例3、表达载体pMD20-PamyA-MS-Tre-Ttef-pyrG-amyA和pMD20-PamyA-MSre-Ttef-pyrG-amyA质粒在黑曲霉中的转化

按照(Gomi K,Iimura Y,Hara S.Integrative transformation of Aspergillusoryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB gene[J].Agricultural and biological chemistry,1987,51(9):2549-2555.)中提供的步骤制备宿主菌黑曲霉(ΔpyrG)的原生质体，将上述得到的得到表达载体pMD20-PamyA-MS-Tre-Ttef-pyrG-amyA和pMD20-PamyA-MSre-Ttef-pyrG-amyA质粒分别转化入原生质体中，涂布高渗CD培养基(包含1M蔗糖，0.3％(w/v)NaNO₃，0.2％(w/v)KCl，0.05％(w/v)MgSO₄.7H₂O，0.1％(w/v)K₂HPO₄.3H₂O，0.001％(w/v)FeSO₄.7H₂O，2％(w/v)琼脂粉，pH5.5，w/v的单位为g/mL)，放入30℃培养箱，5d后观察转化子生长情况。

实施例4、黑曲霉转化子目的基因PCR鉴定

待上述转化子在高渗CD板上长出后，挑至新的普通CD固态板(包含2％(w/v)葡萄糖，0.3％(w/v)NaNO₃，0.2％(w/v)KCl，0.05％(w/v)MgSO₄.7H₂O，0.1％(w/v)K₂HPO₄.3H₂O，0.001％(w/v)FeSO₄.7H₂O，2％(w/v)琼脂粉，pH5.5，w/v的单位为g/mL)，放入30℃培养箱培养5d至菌落长大，待菌落长大后，挑菌落的一小部分至淀粉固态板上，放入30℃培养箱中培养，待淀粉板上的菌落长大后，将菌体刮下至1.5ml EP管中，加入溶菌缓冲液，用组织研磨器研磨提取基因组。

设计扩增目的基因片段的引物，表达框鉴定引物要求能扩出目的基因的表达框，所以表达框鉴定引物的正向引物MS-Tre-fw(如SEQ ID NO.25所示)设在PamyA(如SEQ IDNO.7所示)上，反向引物MS-Tre-rev(如SEQ ID NO.26所示)设在Ttef上；上游鉴定引物的正向引物UP-fw(如SEQ ID NO.21所示)设在PamyA上，反向引物UP-rev(如SEQ ID NO.22所示)设在目的基因片段上，下游鉴定引物的正向引物Down-fw(如SEQ ID NO.23所示)设在目的基因片段上，反向引物Down-rev(如SEQ ID NO.24所示)设在标记pyrG上。

以转化子的基因组为模板，用引物UP-fw和UP-rev检测目的基因表达框的上游片段，用引物Down-fw和Down-rev检测目的基因表达框的下游片段，用引物MS-Tre-fw和引物MS-Tre-rev检测目的基因的表达框，同时以构建的表达载体质粒为模板作为阳性对照，以宿主基因组为模板作为阴性对照，筛选上游、下游和表达框鉴定都正确的转化子。

实施例5、黑曲霉阳性转化子接种液体CD和发酵培养基

PCR上游鉴定、下游鉴定和表达框鉴定都正确的转化子从固态CD板上刮下，加无菌水用低速组织研磨器研磨后，接种至液体CD(包含2％(w/v)葡萄糖，0.3％(w/v)NaNO₃，0.2％(w/v)KCl，0.05％(w/v)MgSO₄.7H₂O，0.1％(w/v)K₂HPO₄.3H2O，0.001％(w/v)FeSO₄.7H₂O，0.05％(w/v)琼脂粉，pH5.5，w/v的单位为g/mL)中，30℃培养箱中静置培养5天后，接种至发酵培养基(包含5％淀粉，3％玉米浆，2％豆粕粉，此处百分号表示为质量百分含量)，30℃条件，摇床转速为250rpm条件发酵，每隔24h取一次样，测定每天发酵上清液的海藻糖酶活力，通过SDS-PAGE检测上清液中的重组海藻糖酶含量。

实施例6、发酵上清液海藻糖酶活性测定

海藻糖酶可以将一分子的非还原性二糖海藻糖水解生成两分子的还原性单糖葡萄糖，通过DNS法检测最后产生的还原性单糖葡萄糖的量，来测定发酵上清液中的海藻糖酶活力。

发酵上清液经凝胶过滤层析分离纯化所述经优化的高温海藻糖酶MS-Tre。

发酵上清液经0.22μm滤膜过滤后，上GE Healthcare HiPrep16/60Sephacryl S-200 High Resolution凝胶过滤层析柱，用50mM PBS(含0.15M NaCl)洗脱，流速为0.5ml/min，收集各个洗脱峰的洗脱液，DNS法测定各个洗脱峰的海藻糖酶活力，SDS-PAGE检测各个洗脱峰溶液的蛋白条带。

从图1和图2发酵上清液SDS-PAGE结果图、图3发酵上清液的海藻糖酶活力测定结果图可以看出，含有氨基酸序列优化后的MS-Tre编码基因表达载体的重组菌株Aspergillus niger-MS-Tre在100mL发酵培养基中进行摇瓶发酵，第七天的发酵上清液中海藻糖酶活力达到34442.599U/ml，目的蛋白条带大小为90kDa左右，在第四天之后蛋白条带就很粗，目的蛋白浓度很高，而氨基酸序列未经过优化的Msre编码基因表达载体转化入宿主黑曲霉后，得到重组菌株Aspergillus niger-MSre，虽然PCR鉴定证明目的基因片段已经整合至宿主的基因组中，但重组菌株Aspergillus niger-MSre在100mL发酵培养基中进行摇瓶发酵，培养7天后，发酵上清液中未见目的蛋白条带。至此证明，与未优化相比，经优化的高温海藻糖酶MS-Tre编码基因(trehalase-DNA(经优化))可以在黑曲霉中高效表达，而且目的蛋白表达量很高。

结合图6的凝胶过滤层析纯化洗脱峰SDS-PAGE结果图可以看出，经过纯化的重组海藻糖酶基本去除了其它的杂蛋白，经蛋白浓度测定和洗脱峰海藻糖酶活力测定，纯化的重组海藻糖酶比酶活达到7334.2398U/mg，从1ml发酵上清液中可以纯化得到4.3mg以上目的重组海藻糖酶，远高于现有文献报道的重组海藻糖酶表达纯化水平。

从图4的经优化的高温海藻糖酶MS-Tre的最适温度结果图、图5的经优化的高温海藻糖酶MS-Tre的最适pH结果可以看出，本发明的经优化的海藻糖酶MS-Tre(trehalase-PRT(经优化))的最适pH为5.6，在pH4.5-7.0稳定性好，在pH4.5-7.0范围内反应，酶活力为最高酶活力的60％以上；最适温度为60℃，在55-65℃范围内反应，仍保持最高酶活力的80％以上。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre及其编码基因与应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 692

<212> PRT

<213> 嗜热真菌(Myceliophthora sepedonium)

<400> 1

Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly

1 5 10 15

Leu Ala Leu Tyr Ile Asn Gly Ser Val Thr Ala Pro Cys Asp Ser Pro

20 25 30

Ile Tyr Cys Gln Gly Glu Leu Leu Lys Ala Val Glu Leu Ala Arg Pro

35 40 45

Phe Val Asp Ser Lys Thr Phe Val Asp Met Pro Thr Ile Lys Pro Val

50 55 60

Asp Glu Val Leu Ala Ala Phe Ser Lys Leu Ser Leu Pro Leu Ser Asn

65 70 75 80

Asn Ser Glu Leu Asn Ala Phe Leu Tyr Glu Asn Phe Ala Gln Ala Gly

85 90 95

His Glu Leu Glu Glu Val Pro Asp Ser Glu Leu Glu Thr Asp Ala Lys

100 105 110

Phe Leu Asp Lys Leu Glu Asp Arg Thr Ile Lys Glu Phe Val Gly Lys

115 120 125

Val Ile Asp Ile Trp Pro Asp Leu Thr Arg Arg Tyr Ala Gly Pro Ser

130 135 140

Asn Cys Thr Glu Cys Ala Asn Ser Phe Ile Pro Val Asn Arg Thr Phe

145 150 155 160

Val Val Ala Gly Gly Arg Phe Arg Glu Pro Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr

165 170 175

Trp Ile Val Glu Gly Leu Leu Arg Thr Gly Gly Ala Phe Thr His Ile

180 185 190

Ser Lys Asn Ile Ile Glu Asn Phe Leu Asp Phe Val Asp Thr Ile Gly

195 200 205

Phe Ile Pro Asn Gly Ala Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Arg Ser Gln Pro

210 215 220

Pro Leu Leu Thr Leu Met Val Lys Ser Tyr Val Asp Tyr Thr Asn Asp

225 230 235 240

Thr Ser Ile Leu Asp Arg Ala Leu Pro Leu Leu Ile Lys Glu His Glu

245 250 255

Phe Phe Met Asn Asn Arg Thr Val Ser Ile Thr Gly Ser Asn Gly Lys

260 265 270

Glu Tyr Thr Leu Asn Arg Tyr His Val Glu Asn Asn Gln Pro Arg Pro

275 280 285

Glu Ser Phe Arg Glu Asp Tyr Ile Thr Ala Asn Asn Gly Ser Tyr Tyr

290 295 300

Ala Ser Ser Gly Ile Ile Tyr Pro Val Lys Thr Pro Leu Asn Glu Thr

305 310 315 320

Glu Lys Ala Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Thr Gly Ala Glu Ser Gly

325 330 335

Trp Asp Tyr Thr Ser Arg Trp Leu Gly Val Pro Ser Asp Ala Ala Arg

340 345 350

Asp Val Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Leu Asn Val Arg Asp Ile Val Pro

355 360 365

Val Asp Leu Asn Ser Ile Leu Tyr Gln Asn Glu Val Ile Ile Ala Glu

370 375 380

Tyr Leu Glu Lys Ala Gly Asn Ser Ser Ala Ala Lys Arg Phe Ala Thr

385 390 395 400

Ala Ala Glu Gln Arg Ser Glu Ala Met Tyr Ser Leu Met Trp Asn Ala

405 410 415

Thr His Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Asn Leu Thr Asp Asn Thr Gln His

420 425 430

Ile Phe Val Pro Ala Asp Glu Asp Thr Ala Ser Gln Asp Arg Ile Glu

435 440 445

Ala Pro Pro Gly Gln Gln Val Phe Phe His Ile Ala Gln Leu Tyr Pro

450 455 460

Phe Trp Thr Gly Ala Ala Pro Ala Ser Leu Lys Ala Asn Pro Leu Ala

465 470 475 480

Val Gln Gln Ala Tyr Ala Arg Val Ala Arg Met Leu Asp Ile Lys Lys

485 490 495

Gly Ala Ile Pro Ala Thr Asn Tyr Arg Thr Gly Gln Gln Trp Asp Gln

500 505 510

Pro Asn Val Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Leu Met Lys Gly Leu Leu

515 520 525

Asn Thr Pro Ala Thr Phe Gly Lys Ser Asp Pro Ala Tyr Gln Ser Val

530 535 540

Gln Asn Leu Ala Leu Arg Leu Ala Gln Arg Tyr Leu Asp Ser Thr Phe

545 550 555 560

Cys Thr Trp Tyr Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ser Asp Phe Pro Gln Leu

565 570 575

Glu Gly Val Thr Pro Gly Ala Thr Gly Val Met Phe Glu Lys Tyr Ala

580 585 590

Asp Asn Ala Thr Asn Val Ala Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Glu Val Val

595 600 605

Glu Gly Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Leu Ile Trp Ala Ala Asp Val

610 615 620

Phe Gly Asn Lys Leu Lys Arg Pro Asp Cys Gly Asn Ile Thr Ala Ala

625 630 635 640

His Thr His Ser Ser Ala Lys Arg Gly Leu Glu Glu Asn Lys Leu Pro

645 650 655

Arg Arg Ala Val Glu Leu Asp Pro Trp Asp Ala Ala Trp Thr Lys Met

660 665 670

Phe Gly Arg Ser Lys Leu Arg Arg Arg Glu Ala Glu Asp Val Arg Lys

675 680 685

Arg Trp Met Ser

690

<210> 2

<211> 2079

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

atgtcgttcc gatctctact cgccctgagc ggcctcgtct gcacagggtt ggcactctac 60

atcaacggtt ccgtcaccgc tccttgcgac agccctatct actgccaggg cgagctgctc 120

aaggctgtgg agctggctcg acctttcgtc gacagcaaga ccttcgtgga catgcctacc 180

atcaagccgg tcgacgaggt gctcgccgct ttctccaagc tgagcctccc tctgtccaac 240

aacagcgagc tgaacgcttt cctctacgag aacttcgccc aggctggcca tgagctggag 300

gaggtccctg actccgagct cgagaccgac gccaagttcc tggacaagct cgaggaccgc 360

accatcaagg agttcgtcgg caaggtgatc gacatctggc ctgacctgac ccgacgatac 420

gctggtccct ccaactgcac cgagtgcgcc aacagcttca tcccggtcaa ccgcaccttc 480

gtcgtggctg gtggtcgatt ccgagagccc tactactggg actcctactg gatcgtggag 540

ggtctgctcc gaaccggtgg tgccttcacc cacatcagca agaacatcat cgagaacttc 600

ctcgacttcg tggacaccat cggcttcatc cccaacggtg cccgcatcta ctacctgaac 660

cgctcccagc cccctctgct caccctcatg gtcaagtcct acgtggacta caccaacgac 720

accagcatcc tggaccgagc tctccctctg ctcatcaagg agcacgagtt cttcatgaac 780

aaccgcaccg tctccatcac cggcagcaac ggcaaggagt acaccctgaa ccgctaccat 840

gtggagaaca accagcctcg acctgagtcc ttccgagagg actacatcac cgctaacaac 900

ggcagctact acgcctccag cggtatcatc taccccgtca agacccctct gaacgagacc 960

gagaaggccg ctctgtactc caacctcgct accggtgctg agtccggttg ggactacacc 1020

agccgatggc tcggtgtccc ttccgacgct gctcgagacg tgtacttccc tctgcgcagc 1080

ctcaacgtcc gcgacatcgt cccggtggac ctgaacagca tcctctacca gaacgaggtg 1140

atcatcgctg agtacctcga gaaggctggt aactccagcg ctgctaagcg attcgctacc 1200

gctgctgagc agcgatccga ggctatgtac agcctgatgt ggaacgccac ccactggtcc 1260

tacttcgact acaacctcac cgacaacacc cagcatatct tcgtccctgc tgacgaggac 1320

accgctagcc aggaccgaat cgaggctcct cctggtcagc aggtgttctt ccacatcgcc 1380

cagctgtacc ctttctggac cggtgctgct cctgcttccc tgaaggctaa ccctctcgct 1440

gtccagcagg cttacgctcg agtggcccgc atgctcgaca tcaagaaggg cgccatcccc 1500

gctaccaact accgcaccgg tcagcagtgg gaccagccta acgtctggcc tccgctgcag 1560

catatcctca tgaagggcct gctcaacacc cctgctacct tcggcaagtc cgacccggcc 1620

taccagagcg tgcagaacct cgctctgcga ctcgctcagc gatacctgga ctccaccttc 1680

tgcacctggt acgctaccgg tggttccacc agcgacttcc ctcagctcga gggtgtcacc 1740

cctggtgcta ccggtgtgat gttcgagaag tacgctgaca acgctaccaa cgtcgctggt 1800

ggtggtggcg agtacgaggt cgtggagggc ttcggttgga ccaacggtgt cctgatctgg 1860

gccgctgacg tgttcggcaa caagctcaag cgacctgact gcggtaacat caccgctgct 1920

cacacccatt ccagcgctaa gcgcggcctg gaggagaaca agctccctcg acgagctgtc 1980

gagctggacc cttgggacgc cgcttggacc aagatgttcg gtcgctccaa gctccgacga 2040

cgagaggctg aggacgtgcg caagcgctgg atgagctga 2079

<210> 3

<211> 489

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 3

gcggacattc gatttatgcc gttatgactt ccttaaaaaa gcctttacga atgaaagaaa 60

tggaattaga cttgttatgt agttgattct acaatggatt atgattcctg aacttcaaat 120

ccgctgttca ttattaatct cagctcttcc cgtaaagcca atgttgaaac tattcgtaaa 180

tgtacctcgt tttgcgtgta ccttgcttat cacgtgatat tacatgacct ggacagagtt 240

ctgcgcgaaa gtcataacgt aaatcccggg cggtaggtgc gtcccgggcg gaaggtagtt 300

ttctcgtcca ccccaacgcg tttatcaacc tcaactttca acaaccatca tgccaccaaa 360

agcgcgtaaa acaaagcgag atttgattga gcaagagggc aggatccaat gcgcgattca 420

agacattaaa aatggaaaat ttcaaaaaat tgcgcccgca gcgcgtgcat acaaaattca 480

tcccaatac 489

<210> 4

<211> 1398

<212> DNA

<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400> 4

gcaacttcct cgagaacgcg ccgcagacaa tgctctctat cctggtggca ggcgtcaagt 60

acccagaggc agcagcgggc ttaggagcgg cctgggttgt tctccgcacc ctctacatgc 120

tgggctatat ttatagcgac aagccgaacg gcaccggcag gtacaatggt tcgctgtact 180

tgcttgcgca agcgggtctt tggggattga gcgcatttgg tgttgcaaag gatttgatgt 240

aaatgtagtc gacatcttag cacagagggg agagttgata aaatgtggtc tgtttgaatg 300

atagtcgggt tcgtgaccta tattcgtgat agtggagata ggtctgcgcc tatcttatcg 360

ggccggagca aaaattccac cgcagcgggg tgagttttcg ttatacagcc atcccacttc 420

cagcttcaaa ttgtcagttt aatccagccc aattcaatca ttggagaacc gccatcatgt 480

cttcgaagtc ccacctcccc tacgcaattc gcgcaaccaa ccatcccaac cctttaacat 540

ctaaactctt ctccatcgcc gaggagaaga aaaccaacgt caccgtctcc gcagacgtta 600

ctacttccgc cgagctcctc gatcttgctg accgtacatc ctgcaccaat gcccctccag 660

gataacaaat agctgatgcg tagtgagtac aggcctaggc ccctatatcg cagttctgaa 720

aacccacatc gacatcctca ccgatctcac cccgtcgacc ctttcctcgc tccaatccct 780

cgcgacaaag cacaacttcc tcatctttga ggaccgcaag ttcatcgaca tcggcaacac 840

cgtgcaaaag cagtaccacg gtggcgctct ccgcatctcc gaatgggcac acatcatcaa 900

ctgcgccatc ctgccgggcg aagggatcgt cgaggccctc gcacagacaa ccaagtctcc 960

tgactttaaa gacgcgaatc aacgaggtct cctgattctt gccgagatga cgagtaaggg 1020

atctcttgcg acaggggagt acacggcacg ctcggttgag tacgcgcgga agtataaggg 1080

gtttgtgatg ggattcgtga gtacaagggc gttgagtgag gtgctgcccg aacagaaaga 1140

ggagagcgag gattttgtcg tctttacgac tggggtgaat ctgtcggata agggggataa 1200

gctggggcag cagtatcaga cacctgggtc ggcggttggg cgaggtgcgg actttatcat 1260

tgcgggtagg ggcatctata aggcggacga tccagtcgag gcggttcaga ggtaccggga 1320

ggaaggctgg aaagcttacg agaaaagagt tggactttga gtgtgagtgg aaatgtgtaa 1380

cggtattgac taaaaggg 1398

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 5

acaaagccgc aggcgtgtac tgtatcggcg aggtgctcga cggtgatccg gcctacactt 60

gtccctacca gaacgtcatg gacggcgtac tgaactatcc catgtatggt tcctccaacc 120

atgagccttc ttgcaagtct catctcctaa cgaaacggct aaaaccagtt actatccact 180

cctcaacgcc ttcaagtcaa cctccggcag catggacgac ctctacaaca tgatcaacac 240

cgtcaaatcc gactgtccag actcaacact cctgggcaca ttcgtcgaga accacgacaa 300

cccacggttc gcttcgtaag tcttcccttt tattttccgt tcccaatttc cacacagaac 360

cccacctaac aagagcaaag ttacaccaac gacatagccc tcgccaagaa cgtcgcagca 420

ttcatcatcc tcaacgacgg aatccccatc atctacgccg gccaagaaca gcactacgcc 480

ggcggaaacg accccgcgaa ccgcgaagca acctggctct cgggctaccc gaccgacagc 540

gagctgtaca agttaattgc ctccgcgaac gcaatccgga actatgccat tagcaaagat 600

acaggattcg tgacctacaa ggtaagcaca acctctaagc ataccctaat ggcctatctt 660

cagagtatct gacacaagag actaatcact ggcaatacag aactggccca tctacaaaga 720

cgacacaacg atcgccatgc gcaagggcac agatgggtcg cagatcgtga ctatcttgtc 780

caacaagggt gcttcgggtg attcgtatac cctctccttg agtggtgcgg gttacacagc 840

cggccagcaa ttgacggagg tcattggctg cacgaccgtg acggttggtt cggatggaaa 900

tgtgcctgtt cctatggcag gtgggctacc tagggtattg tatccgactg agaagttggc 960

aggtagcaag atctgtagta gctcgtgaag ggtggagagt 1000

<210> 6

<211> 2737

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 6

atcggatccc cgggtaccga gctcgaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 60

ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 120

gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 180

cgaatggccc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 240

tagtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg 300

ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 360

gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 420

gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 480

gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 540

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 600

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 660

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 720

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 780

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 840

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 900

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 960

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 1020

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 1080

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 1140

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 1200

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 1260

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 1320

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 1380

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 1440

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 1500

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 1560

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 1620

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 1680

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 1740

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 1800

gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 1860

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 1920

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 1980

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 2040

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 2100

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 2160

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 2220

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 2280

ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 2340

cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 2400

gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt 2460

tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag 2520

cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg 2580

cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc 2640

tatgaccatg attacgccaa gctatttagg tgacactata ggggaaagct tgcatgcctg 2700

caggtcgact ctagaggatc tactagtcat atggatt 2737

<210> 7

<211> 616

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Asperguillus niger)

<400> 7

aattcatggt gttttgatca ttttaaattt ttatatggcg ggtggtgggc aactcgcttg 60

cgcgggcaac tcgcttaccg attacgttag ggctgatatt tacgtaaaaa tcgtcaaggg 120

atgcaagacc aaaccgttaa atttccggag tcaacagcat ccaagcccaa gtccttcacg 180

gagaaacccc agcgtccaca tcacgagcga aggaccacct ctaggcatcg gacgcaccat 240

ccaattagaa gcagcaaagc gaaacagccc aagaaaaagg tcggcccgtc ggccttttct 300

gcaacgctga tcacgggcag cgatccaacc aacaccctcc agagtgacta ggggcggaaa 360

tttatcggga ttaatttcca ctcaaccaca aatcacagtc gtccccggta ttgtcctgca 420

gacggcaatt taacggcttc tgcgaatcgc ttggattccc cgcccctggc cgtagagctt 480

aaagtatgtc ccttgtcgat gcgatgtatc acaacatata aatactggca agggatgcca 540

tgcttggagt ttccaactca atttacctct atccacactt ctcttccttc ctcaatcctc 600

tatatacaca actggg 616

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 8

atctactagt catatggatt gggcccgata tcgcggacat tcgatttatg ccgtt 55

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 9

cgcgttctcg aggaagttgc gtattgggat gaattttgta tgcac 45

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 10

gcaacttcct cgagaacgcg c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 11

cccttttagt caataccgtt acac 24

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 12

aacggtattg actaaaaggg acaaagccgc aggcgtgtac tg 42

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 13

tcggtacccg gggatccgat tctagagggc ccactctcca cccttcacga gcta 54

<210> 14

<211> 694

<212> PRT

<213> 嗜热真菌(Myceliophthora sepedonium)

<400> 14

Met Ala Leu Arg His Ile Ala Ala Ala Ala Ile Ala Gly Leu Ala Ser

1 5 10 15

Arg Thr Ala Ala Leu Tyr Ile Asn Gly Ser Val Thr Ala Pro Cys Asp

20 25 30

Ser Pro Ile Tyr Cys Gln Gly Glu Leu Leu Lys Ala Val Glu Leu Ala

35 40 45

Arg Pro Phe Val Asp Ser Lys Thr Phe Val Asp Met Pro Thr Ile Lys

50 55 60

Pro Val Asp Glu Val Leu Ala Ala Phe Ser Lys Leu Ser Leu Pro Leu

65 70 75 80

Ser Asn Asn Ser Glu Leu Asn Ala Phe Leu Tyr Glu Asn Phe Ala Gln

85 90 95

Ala Gly His Glu Leu Glu Glu Val Pro Asp Ser Glu Leu Glu Thr Asp

100 105 110

Ala Lys Phe Leu Asp Lys Leu Glu Asp Arg Thr Ile Lys Glu Phe Val

115 120 125

Gly Lys Val Ile Asp Ile Trp Pro Asp Leu Thr Arg Arg Tyr Ala Gly

130 135 140

Pro Ser Asn Cys Thr Glu Cys Ala Asn Ser Phe Ile Pro Val Asn Arg

145 150 155 160

Thr Phe Val Val Ala Gly Gly Arg Phe Arg Glu Pro Tyr Tyr Trp Asp

165 170 175

Ser Tyr Trp Ile Val Glu Gly Leu Leu Arg Thr Gly Gly Ala Phe Thr

180 185 190

His Ile Ser Lys Asn Ile Ile Glu Asn Phe Leu Asp Phe Val Asp Thr

195 200 205

Ile Gly Phe Ile Pro Asn Gly Ala Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Arg Ser

210 215 220

Gln Pro Pro Leu Leu Thr Leu Met Val Lys Ser Tyr Val Asp Tyr Thr

225 230 235 240

Asn Asp Thr Ser Ile Leu Asp Arg Ala Leu Pro Leu Leu Ile Lys Glu

245 250 255

His Glu Phe Phe Met Asn Asn Arg Thr Val Ser Ile Thr Gly Ser Asn

260 265 270

Gly Lys Glu Tyr Thr Leu Asn Arg Tyr His Val Glu Asn Asn Gln Pro

275 280 285

Arg Pro Glu Ser Phe Arg Glu Asp Tyr Ile Thr Ala Asn Asn Gly Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Ile Tyr Pro Val Lys Thr Pro Leu Asn

305 310 315 320

Glu Thr Glu Lys Ala Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Thr Gly Ala Glu

325 330 335

Ser Gly Trp Asp Tyr Thr Ser Arg Trp Leu Gly Val Pro Ser Asp Ala

340 345 350

Ala Arg Asp Val Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Leu Asn Val Arg Asp Ile

355 360 365

Val Pro Val Asp Leu Asn Ser Ile Leu Tyr Gln Asn Glu Val Ile Ile

370 375 380

Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Gly Asn Ser Ser Ala Ala Lys Arg Phe

385 390 395 400

Ala Thr Ala Ala Glu Gln Arg Ser Glu Ala Met Tyr Ser Leu Met Trp

405 410 415

Asn Ala Thr His Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Asn Leu Thr Asp Asn Thr

420 425 430

Gln His Ile Phe Val Pro Ala Asp Glu Asp Thr Ala Ser Gln Asp Arg

435 440 445

Ile Glu Ala Pro Pro Gly Gln Gln Val Phe Phe His Ile Ala Gln Leu

450 455 460

Tyr Pro Phe Trp Thr Gly Ala Ala Pro Ala Ser Leu Lys Ala Asn Pro

465 470 475 480

Leu Ala Val Gln Gln Ala Tyr Ala Arg Val Ala Arg Met Leu Asp Ile

485 490 495

Lys Lys Gly Ala Ile Pro Ala Thr Asn Tyr Arg Thr Gly Gln Gln Trp

500 505 510

Asp Gln Pro Asn Val Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Leu Met Lys Gly

515 520 525

Leu Leu Asn Thr Pro Ala Thr Phe Gly Lys Ser Asp Pro Ala Tyr Gln

530 535 540

Ser Val Gln Asn Leu Ala Leu Arg Leu Ala Gln Arg Tyr Leu Asp Ser

545 550 555 560

Thr Phe Cys Thr Trp Tyr Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ser Asp Phe Pro

565 570 575

Gln Leu Glu Gly Val Thr Pro Gly Ala Thr Gly Val Met Phe Glu Lys

580 585 590

Tyr Ala Asp Asn Ala Thr Asn Val Ala Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Glu

595 600 605

Val Val Glu Gly Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Leu Ile Trp Ala Ala

610 615 620

Asp Val Phe Gly Asn Lys Leu Lys Arg Pro Asp Cys Gly Asn Ile Thr

625 630 635 640

Ala Ala His Thr His Ser Ser Ala Lys Arg Gly Leu Glu Glu Asn Lys

645 650 655

Leu Pro Arg Arg Ala Val Glu Leu Asp Pro Trp Asp Ala Ala Trp Thr

660 665 670

Lys Met Phe Gly Arg Ser Lys Leu Arg Arg Arg Glu Ala Glu Asp Val

675 680 685

Arg Lys Arg Trp Met Ser

690

<210> 15

<211> 2085

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 15

atggccctgc gccacatcgc cgctgccgct atcgctggtc tggcttcccg aaccgctgct 60

ctctacatca acggttccgt caccgctcct tgcgacagcc ctatctactg ccagggcgag 120

ctgctcaagg ctgtggagct ggctcgacct ttcgtcgaca gcaagacctt cgtggacatg 180

cctaccatca agccggtcga cgaggtgctc gccgctttct ccaagctgag cctccctctg 240

tccaacaaca gcgagctgaa cgctttcctc tacgagaact tcgcccaggc tggccatgag 300

ctggaggagg tccctgactc cgagctcgag accgacgcca agttcctgga caagctcgag 360

gaccgcacca tcaaggagtt cgtcggcaag gtgatcgaca tctggcctga cctgacccga 420

cgatacgctg gtccctccaa ctgcaccgag tgcgccaaca gcttcatccc ggtcaaccgc 480

accttcgtcg tggctggtgg tcgattccga gagccctact actgggactc ctactggatc 540

gtggagggtc tgctccgaac cggtggtgcc ttcacccaca tcagcaagaa catcatcgag 600

aacttcctcg acttcgtgga caccatcggc ttcatcccca acggtgcccg catctactac 660

ctgaaccgct cccagccccc tctgctcacc ctcatggtca agtcctacgt ggactacacc 720

aacgacacca gcatcctgga ccgagctctc cctctgctca tcaaggagca cgagttcttc 780

atgaacaacc gcaccgtctc catcaccggc agcaacggca aggagtacac cctgaaccgc 840

taccatgtgg agaacaacca gcctcgacct gagtccttcc gagaggacta catcaccgct 900

aacaacggca gctactacgc ctccagcggt atcatctacc ccgtcaagac ccctctgaac 960

gagaccgaga aggccgctct gtactccaac ctcgctaccg gtgctgagtc cggttgggac 1020

tacaccagcc gatggctcgg tgtcccttcc gacgctgctc gagacgtgta cttccctctg 1080

cgcagcctca acgtccgcga catcgtcccg gtggacctga acagcatcct ctaccagaac 1140

gaggtgatca tcgctgagta cctcgagaag gctggtaact ccagcgctgc taagcgattc 1200

gctaccgctg ctgagcagcg atccgaggct atgtacagcc tgatgtggaa cgccacccac 1260

tggtcctact tcgactacaa cctcaccgac aacacccagc atatcttcgt ccctgctgac 1320

gaggacaccg ctagccagga ccgaatcgag gctcctcctg gtcagcaggt gttcttccac 1380

atcgcccagc tgtacccttt ctggaccggt gctgctcctg cttccctgaa ggctaaccct 1440

ctcgctgtcc agcaggctta cgctcgagtg gcccgcatgc tcgacatcaa gaagggcgcc 1500

atccccgcta ccaactaccg caccggtcag cagtgggacc agcctaacgt ctggcctccg 1560

ctgcagcata tcctcatgaa gggcctgctc aacacccctg ctaccttcgg caagtccgac 1620

ccggcctacc agagcgtgca gaacctcgct ctgcgactcg ctcagcgata cctggactcc 1680

accttctgca cctggtacgc taccggtggt tccaccagcg acttccctca gctcgagggt 1740

gtcacccctg gtgctaccgg tgtgatgttc gagaagtacg ctgacaacgc taccaacgtc 1800

gctggtggtg gtggcgagta cgaggtcgtg gagggcttcg gttggaccaa cggtgtcctg 1860

atctgggccg ctgacgtgtt cggcaacaag ctcaagcgac ctgactgcgg taacatcacc 1920

gctgctcaca cccattccag cgctaagcgc ggcctggagg agaacaagct ccctcgacga 1980

gctgtcgagc tggacccttg ggacgccgct tggaccaaga tgttcggtcg ctccaagctc 2040

cgacgacgag aggctgagga cgtgcgcaag cgctggatga gctga 2085

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 16

atctactagt catatggatt gggcccgata tcaattcatg gtgttttgat cattttaaat 60

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 17

cccagttgtg tatatagagg attg 24

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 18

cctctatata cacaactggg atgtcgttcc gatctctact cg 42

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 19

tgcgcaagcg ctggatgagc tgagcggaca ttcgatttat gcc 43

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 20

cctctatata cacaactggg atggccctgc gccacatcgc 40

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 21

gagtcaacag catccaagcc 20

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 22

ggtagtagat gcgggcacc 19

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 23

cacccagcat atcttcgtcc 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 24

gggtacttga cgcctgcca 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 25

ctggccgtag agcttaaag 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 26

gataagcaag gtacacgca 19

Claims

1.一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，插入了权利要求2中所述SEQ ID NO.2所述核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，包含有pMD20-T载体、黑曲霉中性淀粉酶启动子PamyA、黑曲霉tef终止子、构巢曲霉尿嘧啶生物合成的基因pyrG、黑曲霉中性淀粉酶编码基因最后1000bp序列以及所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的编码基因。

5.一种转基因细胞系，其特征在于，含有权利要求3所述的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的转基因细胞系，其特征在于，所述转基因细胞系为黑曲霉。

7.权利要求2所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的编码基因、权利要求3所述重组表达载体在黑曲霉表达经优化的高温海藻糖酶MS-Tre的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建重组表达载体；

（2）用步骤（1）构建的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株，即转基因细胞系；

（3）培养重组菌株，用发酵培养基诱导重组菌株表达所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre；

（4）回收并纯化所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre。

9.权利要求5所述转基因细胞系在制备权利要求1所述经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre的应用。

10.权利要求1所述的一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre在酒精发酵与谷氨酸发酵中的应用。