KR20090059366A - 내열성 아밀레이즈 변이효소 및 이를 이용한말토올리고당의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파이로코커스 퓨리어서스(Pyrococcus furiosus)에서 분리된 내열성 아밀레이즈를 특정위치변이방법을 이용하여 서열을 변경한 아밀레이즈에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정위치의 아미노산을 변경하여 기존의 아밀레이즈에 비하여 사이클로덱스트린의 개환속도가 사슬형 말토올리고당 특히, 말토헵타오스(G7)의 분해속도에 비하여 현저하게 빠른 내열성 아밀레이즈 및 이를 이용한 사슬형 말토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

변이효소, 아밀레이즈, 말토헵타오스, 반응속도

Description

내열성 아밀레이즈 변이효소 및 이를 이용한 말토올리고당의 제조 방법{THERMOSTABLE AMYLOLYTIC MUTANT ENZYME AND PREPARATION OF HIGHLY PURIFIED MALTOOLIGOSACCHARIDE USING THE SAME}

본 발명은 기존의 내열성 아밀레이즈의 변이효소 및 이를 이용한 고순도의 말토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

말토올리고당은 단백질 변성방지 효과 및 식품의 마스킹(masking) 효과와 부드러운 식감부여 등 식품분야에서 널리 이용되고 있는 기능성 당류이다. 통상적으로, 말토올리고당은 말토스(maltose, G2), 말토트라이오스(maltotriose, G3), 말토테트라오스(maltotetraose, G4), 말토펜타오스(maltopentaose, G5), 말토헥사오스(maltohexaose, G6), 말토헵타오스(maltoheptaose, G7), 말토옥타오스(maltoctaose, G8), 말토노나오스(maltononaose, G9) 등을 포함하며, 이 중 그 기능성 등으로 인하여 산업적으로 각광을 받고 있는 것은 말토헵타오스(maltoheptaose, G7), 말토옥타오스(maltoctaose, G8), 말토노나오스(maltononaose, G9) 등 글루코오스 분자수 6개 이상의 말토올리고당이다.

전분으로부터 상기 말토헵타오스와 말토옥타오스 (G8) 등을 생산은 주로 화 학적 방법인 산가수분해 방법과 생물학적 방법인 효소를 이용한 방법을 통하여 이루어지고 있다. 상기 효소를 이용한 방법으로는 미생물에서 유래한 알파-아밀레이즈를 이용하여 전분으로부터 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 제조하는 방법 등이 있다. 그러나, 상기 방법에 의할 경우 분자수 6개 이상의 말토올리고당에 관한 수율이 저조하고, 글루코오스(glucose, G1), 말토스, 말토트라이오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스 등이 다량으로 생성되어 이를 제거하기 위하여 컬럼크로마토그래피를 수행하거나, 유기용매를 이용한 분리 및 정제공정 등 복잡하고 고가의 비용이 드는 어려운 공정의 추가 수행이 요구된다. 따라서, 상기 방법은 정제과정에 의한 정제율의 한계에 의해 고순도의 말토헵타오스 또는 말토옥타오스 등을 얻기가 어려울 뿐만 아니라, 높은 비용이 요구되어 비경제적인 문제점이 있다(E. Ben Messaoud et al. Enzyme Microb. Technol. 34:662-666. (2004)).

따라서, 부산물의 생성을 최소한으로 하여, 추가적인 정제과정을 수행하지 아니하고 산업적으로 요구되는 고순도의 탄소수 6 이상의 말토올리고당 특히, 말토헵타오스 또는 말토옥타오스를 생산할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 요구사항을 해결하기 위한 것으로, 기존의 모효소와 비교하여, 말토올리고당의 가수분해 속도에 대한 사이클로덱스트린 개환속도가 현저하게 빠른, 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래의 내열성 아밀레이즈(thermastable amylase)의 변이효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 내열성 아밀레이즈의 변이효소를 이용하여 말토올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래의 내열성 아밀레이즈(thermastable amylase)의 변이효소를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 변이효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 변이효소를 이용하여 사이클로덱스트린으로부터 고순도의 글루코오스 분자수 6 내지 8개의 말토올리고당을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명자는 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 내열성 아밀레이즈(thermostable amylase)로부터 유전자변이방법을 이용하여 상기 아밀레이즈의 특정위치의 아미노산을 치환시킨 변이효소가 모효소인 상기 내열성 아밀레이즈에 비하여 말토올리고당에 대한 가수분해의 반응속도를 기준으로 한 사이클로덱스트린 환 구조의 개환속도가 현저하게 높으므로, 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에 상기 변이효소를 반응시켜 고순도의 말토헥타오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 제조할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래의 내열성 아밀레이즈(thermastable amylase)의 변이효소에 관한 것이다.

상기 변이효소는 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 특정위치의 아미노산을 변경하여 모효소인 상기 내열성 아밀레이즈에 비하여 사이클로덱스트린의 환구조를 개열하는 속도 즉, 개환속도가 개환에 의해 생성된 말토올리고당의 가수분해 속도에 비하여 현저하게 빠른 것을 특징으로 하는 변이효소일 수 있다.

상기 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈는 열 안정성 및 pH 안정성이 매우 우수한 것일 수 있다. 상기 내열성 아밀레이즈는 60℃ 내지 95℃에서 안정하고, pH 3 내지 pH 11에서 안정성을 갖는다. 또한, 상기 내열성 아밀레이 즈는 65℃ 내지 95℃와 pH 4 내지 pH 6의 조건에서 효소 활성을 갖으며, 상기 내열성 아밀레이즈의 바람직한 반응 조건은 85℃ 내지 90℃와 pH 4 내지 pH 4.5일 수 있다. 또한, 상기 내열성 아밀레이즈는 통상의 알파-아밀레이즈와는 달리 열 안정성을 위해 칼슘 이온을 요구하지 않는다.

상기 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 변이효소는 상기 모효소인 내열성 아밀레이즈의 우수한 열 안정성 및 pH 안정성을 그대로 유지하는 한편, 야생형 내열성 아밀레이즈에 비하여, 말토올리고당에 대한 가수분해속도를 기준으로 한 사이클로덱스트린의 개환속도가 현저하게 개선된 우수한 특성이 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 사이클로덱스트린의 개환속도가 말토올리고당의 가수분해 속도에 비하여 13 내지 15배 빠르고, 말토올리고당의 가수분해속도를 기준으로 한 상대적인 개환속도의 경우 기존의 야생형 내열성 아밀레이즈에 비하여 50% 정도 개선된 것으로 확인되었다.

이러한 개환속도의 개선은 반응시간을 조절함으로써 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 기질로부터 탄소수 6 내지 8개의 말토올리고당으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 제조함에 있어서, 기존의 야생형 효소와 달리 단순한 분리공정만으로도 고순도의 목적하는 말토올리고당을 제조가 가능할 수 있다는 점에서 매우 우수한 산업적 효과로 평가될 수 있다.

야생형 내열성 아밀레이즈의 기존의 장점인 우수한 열 안정성 및 pH 안정성을 그대로 유지하면서도, 사이클로덱스트린에 대한 개환능의 현저한 개선이라는 유 리한 효과를 얻을 수 있는 것은, 특정 위치의 아미노산 즉, 야생형 내열성 아밀레이즈의 415번째 아미노산 서열만을 글리신에서 글루탐산으로 변경하였기 때문으로 분석된다. 상기 특정 위치의 아미노산의 변경은 통상의 유전자 조작 방법으로 수행할 수 있고, 일 예로 특정위치유전자변이방법을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 특정 위치의 아미노산이 변경된 변이효소는 특정위치유전자변이방법을 수행하여 상기 415번째 아미노산 서열이 변경된 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하여 PCR을 수행함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 변이효소는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이효소일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 변이효소일 수 있다. 상기 변이효소의 크기는 약 77kDa의 분자량을 갖는다.

또한, 본 발명은 상기 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 변이효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 내열성 아밀레이즈 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 염기서열은 기존의 야생형 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 1244번째 핵산을 구아닌(G, guanine)에서 아데닌(A, adenine)으로 치환시켜, 415번째 아미노산이 글리신이 아닌 글루탐산을 암호화하도 록 유전자변형시킨 염기서열입니다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 내열성 아밀레이즈 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 통상의 발현용 벡터, 예컨대 pTKND6xH 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 제조한 재조합 벡터일 수 있으며, 상기 발현용 벡터는 숙주 세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 변이효소 제조방법은 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 내열성 아밀레이즈 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하는 방법일 수 있으며, 상기 재조합 벡터를 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵 생물에서 유래된 진핵세포에 형질전환시켜 상기 변이효소를 발현시키는 방법일 수 있다.

일 예로는, 상기 변이효소 제조방법은 (a) 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 내열성 아밀레이즈의 아미노산 염기서열 중, 415번째인 글리신을 특정위치유전자변이방법을 이용하여 글루탐산으로 치환시킨 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 배양하여 상기 변이효소를 제조하는 단계를 포함하는 제조방법일 수 있다.

상기 (a) 단계에서, 상기 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번 호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 벡터는 통상의 발현용 벡터, 예컨대 pTKND6xH 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 숙주 세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의해 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 pTKND6xH 벡터에 삽입시켜 제조된 벡터의 개열지도를 도 1에 나타내었다.

상기 (b) 단계에서, 상기 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 예컨대 대장균, 유산균, 효모, 곰팡이 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 숙주세포에 재조합벡터를 형질전환시키는 방법은 통상의 형질전환방법에 의할 수 있다.

상기 (c) 단계에서, 형질전환체를 배양하는 단계로, 숙주세포에 따라 적합한 조성의 배양배지를 이용할 수 있고, 배양 조건 역시 숙주세포의 종류에 따라 적절하게 선택하여 적용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따라, 숙주세포로 Escherichia coli MC1061를 이용하는 경우, 배양배지는 가나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB배지를 사용하였으며, 배양조건은 37℃에서 22시간 배양하여, 다량의 내열성 아밀레이즈 변이효소를 제조하였다.

또한 상기 변이효소 제조방법은 상기 (c) 단계후에, 상기 형질전환체를 배양한 배양으로부터 상기 변이효소를 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 정제단계는 형질전환체 균체를 파쇄하는 단계; 상기 파쇄된 균체를 포함하는 배양액을 원심분리한 후, 상등액을 취하여 열처리하는 단계; 및 상기 열처리한 상등액에 대하여 변이효소 정제단계, 예를 들어 니켈 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 변이효소를 이용하여 사이클로덱스트린으로부터 고순도의 글루코오스 분자수 6 내지 8개의 말토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것일 수 있다.

상기 말토올리고당 제조방법은 사이클로덱스트린에 상기 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 변이효소를 반응시켜 글루코오스 분자수 6 내지 8개의 말토올리고당을 제조하는 방법일 수 있다. 상기 제조방법은 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택된 사이클로덱스트린일 수 있으며, 바람직하게는 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린일 수 있다. 상기 말토올리고당은 말토헵타오스 또는 말토옥타오스일 수 있다. 상기 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 내열성 아밀레이즈의 변이효소는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이효소일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 변이효소일 수 있다.

상기 제조방법은 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택된 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액에, 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 내열성 아밀레이즈 변이효소를 pH 4 내지 pH 6, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 4.5 및 65℃ 내지 95℃, 바람직하게는 85℃ 내지 90℃의 조건에서 반응시켜, 글루코오스 분자수 6 내지 8개의 사슬형 말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 제조하는 방법일 수 있으며, 바람직하게는 상기 방법은 기질을 베타-사이클로덱스트린으로 하여, 말토헵타오스를 제조하거나, 기질을 감마-사이클로덱스트린으로 하여, 말토옥타오스를 제조하는 방법일 수 있다.

상기 제조방법의 효소 반응시간(h)은 효소의 양 및 기질의 양에 따라 "0.3 x 기질의 양 / 반응시간" 내지 "0.5 x 기질의 양 / 반응시간"일 수 있고, 바람직하게는 0.35 x 기질의 양 / 반응시간 내지 0.45 x 기질의 양 / 반응시간일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.38 x 기질의 양 / 반응시간 내지 0.42 x 기질의 양 / 반응시간일 수 있다. 상기 반응시간은 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린을 기질로 하여, 최적 반응온도를 기준으로 65℃ 내지 95℃ 및 최적 반응 pH를 기준으로 pH 4 내지 pH 6의 조건과 기질의 양 즉, 기질의 농도를 변화시키면서 측정한 결과, 90% 이상의 순도, 바람직하게는 95% 이상의 순도의 글루코오스 6 내지 8의 말토올리고당을 높은 수율로 생산할 수 있는 반응시간을 통계적으로 확인한 결과이다.

또한, 상기 제조방법은 상기 사이클로덱스트린과 상기 내열성 아밀레이즈 변이효소를 반응시켜 수득한 반응물을 분리 또는 정제하는 과정을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리 또는 정제하는 과정은 상기 반응물을 여과 및 냉각으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 수행하고, 활성탄을 이용하여 농축하는 단계, 박막크로마토그래피(Thin-layer Chromatography, TLC)를 수행하는 단계 및 소수성 컬럼크로마토그래피를 수행하는 단계에서 선택된 1 이상의 단계를 1회 또는 2회 이 상 반복하여 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 고순도의 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 말토올리고당, 바람직하게는 말토헵타오스 또는 말토옥타오스는 혈중 아밀레이즈 활성 측정에 이용되는 고가의 진단 시약 원료로 사용되거나 화학시약용으로 사용될 수 있으며, 상기 말토올리고당을 포함하는 혼합 농축액의 경우 저감미 신소재로서 식품에 널리 활용될 수 있다.

본 발명의 변이효소는 기존의 야생형 내열성 아밀레이즈의 장점이 열 및 pH에 대한 안정성을 그대로 유지할 뿐만 아니라, 기존의 야생형 효소에 비하여 이상 말토올리고당에 대한 가수분해능에 비해 사이클로덱스트린의 환 개열능이 현저하게 개선되는 개선된 효과가 있다. 이러한 개선된 효과 즉, 높은 개환속도로 인하여 사이클로덱스트린을 기질로 반응시키는 경우, 부산물인 사이클로덱스트린을 개환시킨 말토올리고당의 가수분해물을 최소화할 수 있어, 단순한 분리공정만으로도 산업적으로 유용한 고순도의 탄소수 6 내지 8개의 말토올리고당을 생산할 수 있고, 추가적인 고비용의 정제공정을 요구하지 아니하여, 그 산업적 효과가 매우 크다 할 것이다. 또한, 기존의 변이효소들과 달리, 본 발명의 변이효소는 실험실에서만 이용가능한 시스템이 아닌 산업현장에서 이용가능한 시스템에서도 유효하게 작용할 수 있음이 확인되어, 산업적 가치가 매우 크다 할 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하기 이해시키기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1: 파이로코커스 퓨리오서스( Pyrococcus furiosus ) 유래 내열성 아밀레이즈( thermastable amylase )의 변이효소의 제조

1-1. 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 제조

본 발명의 변이효소는 야생형 파이로코커스 퓨리오서스 유래 내열성 아밀레이즈의 아미노산 서열에 대하여 415번째 아미노산을 글리신에서 글루탐산으로 변경하기 위하여, QuikChange^TM(Stratagene, USA)법으로 상기 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 1244번째 핵산을 "구아닌(guanine, G)"에서 "아데닌(adenine, A)"으로 point mutation시켰다. 상기 야생형 파이로코커스 퓨리오서스 유래 내열성 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 대한민국 등록특허 제10-0735819호에 기재된 pETPFTA-6h 벡터를 이용하였다.

상기 야생형 파이로코커스 퓨리오서스 유래 내열성 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 North Carolina 주립대학 (Raleigh, NC)의 A. M. Grunden 박사 로부터 제공받은 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) DSM 3638의 염색체 DNA를 주형 DNA로 이용하고, 정방향 프라이머 PFTA-Fnd(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 PFTA-Rxo(서열번호 4)을 프라이머로 사용하여, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 수득하였다. 또한, 상기 pETPFTA-6h 벡터는 상기 수득한 PCR 산물을 제한효소 NdeI과 XhoI로 처리하고, 이를 동일한 제한 효소로 처리한 pET-22b(+) 발현벡터와 함께 라이게이션하여 제조하였다.

상기 pETPFTA-6h 벡터에 대해 NdeI과 XhoI를 처리하여 수득한 상기 야생형 파이로코커스 퓨리오서스 유래 내열성 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 QuikChange^TM(Stratagene, USA)법으로 상기 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 1244번째 핵산을 "구아닌(guanine, G)"에서 "아데닌(adenine, A)"으로 point mutation시켜 변이효소(G415E)인 개량형 내열성 아밀레이즈를 제조하였으며, 상기 개량형 내열성 아밀레이즈에 대한 PCR은 하기 표 1에 기재된 서열번호 5의 정방향 프라이머(G415E-F)와 서열번호 6의 역방향 프라이머(G415E-R)의 프라이머 쌍을 이용하였고, 하기 표 2의 조건으로 PCR을 수행하였다(Kim, Y. W.; Lee, S. S.; Warren, R. A. J.; Withers, S. G. J. Biol. Chem., 279, 31033-31040(2004)).

명칭	유전자서열	서열번호
G415E-F	5'-TGGATGTTGCTCATGAGGTTCCTCCAGAA-3'	5
G415E-R	5'-TTCTGGAGGAACCTCATGAGCAACATCCA-3'	6

Denaturation	Pre-denaturation	95℃/ 5 min
Amplification	Denaturation	95℃/ 30 sec	16 cycles
	Annealing	55℃/ 30 sec
	Extension	72℃/ 16 min
Final Extension	Final Extension	72℃/ 20 min

상기 PCR을 수행한 결과, 벡터 전체를 포함하는 약 7.3kb의 PCR 산물을 수득하였으며, 그 결과를 서열번호 7에 나타내었다. 상기 수득한 PCR 산물을 라이게이션하여, pETPFTA-6h(G415E)를 제조하였다. 상기 벡터 pETPFTA-6h(G415E)를 제한효소 NdeI과 XhoI로 처리하고, 약 2.0 kbp 길이의 조각을 아가로스 전기영동을 통해 분리하여, 이를 동일한 제한 효소로 처리한 pTKND6xH 발현벡터와 함께 라이게이션하여 pTKND6xHPFTA(G415E)를 제조하였으며, 상기 pTKND6xHPFTA(G415E)의 재조합벡터의 개열지도를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 재조합 벡터 pTKND6xHPFTA(G415E)는 상기 point mutation시켜 제조한 변이효소(G415E)인 개량형 내열성 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레이티드를 PCR로 증폭시킨 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레이티드의 3' 말단에 6개의 부가적인 아미노산 잔기(6-His)를 포함하고 있고, 가나마이신 내성유전자(kanamycin resistance gene)을 포함하고 있다.

1-2. 형질전환체의 제조

상기 변이효소(G415E)인 개량형 내열성 아밀레이즈를 대량생산하기 위하여, 상기 재조합 벡터 pTKND6xHPFTA(G415E)로 형질전환된 형질전환체를 제조하였다.

우선, 5 ml LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli MC1061를 접종하여 37 ℃에서 12시간 배양하고, 상기 배양한 배양액 1.0 ml을 새로운 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 600 nm에서 흡광도(OD₆₀₀)가 이 0.5가 될 때까지 배양하였다. 상기 배양액으로부터 수득한 배양액 1.5 ml를 4℃ 및 7000xg의 조건으로 5분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 0.75 ml의 형질전환용액I(50 mM CaCl₂)으로 현탁하고, 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후, 4℃ 및 6000xg의 조건으로 2분 동안 원심분리하여 균체를 회수하고, 상기 회수된 균체는 0.15 ml의 형질전환용액II(100 mM CaCl₂)으로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 상기 얼음속에서 방치한 현탁액 0.15 ml과 상기 재조합 벡터 pTKND6xHPFTA(G415E)를 포함하는 라이게이션 반응액 500 ng을 혼합하고, 얼음 속에서 추가로 1시간 방치한 뒤 42℃에서 2분간 열 충격을 주었다.

상기 형질전환을 수행한 반응액을 0.8 ml의 LB 액체 배지와 혼합하고 37 ℃에서 1시간 배양시킨 후, 가나마이신(최종농도 100 μg/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.

1차 선별된 균주를 가나마이신이 포함된 LB 액체 배지 5 ml에 접종하여 37 ℃에서 22시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 플라스미드 분리 키트로 회수된 균체로부터 플라스미드를 분리하고 NdeI과 XhoI 제한 효소로 절단하여, 약 2.0 kb의 개량된 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함되어 있음을 확인한 1종의 균주를 선별하였다.

1-3. 변이효소의 정제

상기에서 선별한 형질전환주는 37 ℃에서 12시간 배양한 후, 4ㅀC 및 7,000xg의 조건에서 30분동안 원심분리를 수행하여 균체를 회수하고, 300mM NaCl과 10mM 이미다졸이 함유된 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 현탁한 후 초음파 분쇄하였다. 상기 초음파를 이용하여 분쇄한 분쇄액을 4ㅀC 및 10,000xg의 조건으로 30분간 원심분리 수행한 후, 상등액을 취하고, 70℃에서 20분간 열처리한 다음 4ㅀC 및 10,000xg의 조건으로 원심분리하고 상등액을 수득하였다. 상기 상등액은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 주입하여, 정제하였으며, 상기 정제 단계별 시료의 전기영동 사진을 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에 나타난 바와 같이, SDS-PAGE상에서 나타난 결과를 MALDI-TOF/MS 방법으로 결과치를 수정한 결과 상기 변이효소의 분자량이 이론값과 일치하는 약 77kDa의 분자량을 나타내는 것으로 확인되어, 개량된 아밀레이즈 재조합 변이효소는 E. coli에서 성공적으로 발현되었으며, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 과정을 통하여 효율적으로 정제된다는 것을 확인하였다.

1-4. 폴리뉴클레오티드의 염기서열 분석

상기 실시예 1-2에서 선발하고, 상기 실시예 1-3을 통하여 재조합 변이효소가 성공적으로 발현되는 것을 확인한 균주인 E. coli MC1061/pTKND6xHPFTA(G415E)로부터 pTKND6xHPFTA(G415E)를 분리하였으며, 이의 염기서열을 ABI377 PRISM 자동 서열분석기(Perkin-Elmer Co, USA)로 분석하였고, 상기 분석된 결과가 실시예 1-1의 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 증폭한 약 4.8kb의 PCR 산물의 염기서열과 일치함을 확인하여, 상기 E. coli MC1061/pTKND6xHPFTA(G415E)에 도입된 재조합벡터 pTKND6xHPFTA(G415E)에 개량된 아밀레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 성공적으로 삽입되어 있음을 확인하였다.

실시예2; 변이효소의 사이클로덱스트린 개환속도와 말토올리고당의 가수분해속도의 비교

2-1. 효소 역가

50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 1%(w/v)의 농도로 용해시킨 베타-사이클로덱스트린 기질 용액 150 ㎕에 상기 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5) 120 ㎕을 추가로 첨가하여 기질용액을 제조하고, 90 ℃에서 5분간 열처리하였다. 상기 열처리한 기질용액에 상기 실시예 1에서 제조한 내열성 아밀레이즈 변이효소를 30 ㎕넣고 90 ℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 3,5-디나이트로살리실릭산(DNS)를 넣어 반응을 중단시킨 뒤 5분간 끓여 발색시켜 575 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도와 말토스 표준 곡선를 비교하여, 1분당 1μmol의 말토스를 생산하는 효소량을 1 단위(unit)로 정하였다.

2-2. 반응속도의 비교

실시예 1에서 제조한 변이효소의 기질에 대한 반응속도 차이 즉, 사이클로덱스트린 개환속도와 말토올리고당의 가수분해속도를 비교하기 위하여, 베타-사이클로덱스트린과 말토헵타오스를 기질로 하여 각각의 반응 속도를 측정하였다.

보다 구체적으로는,

각각의 기질 즉, 베타-사이클로덱스트린과 말토헵타오스를 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 1%(w/v)의 농도로 용해시킨 용액 150 ㎕에 상기 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5) 120 ㎕을 추가로 첨가하여 기질용액을 제조하고, 90 ℃에서 5분간 열처리하였다. 상기 열처리한 각각의 기질용액에 상기 실시예 1의 파이로코커스 퓨리오서스 유래 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈와 상기 실시예 1에서 제조한 내열성 아밀레이즈 변이효소 30 ㎕(0.07 unit)를 각각 첨가하여 반응용액을 제조하고, 90 ℃에서 반응을 진행(incubation)시키면서, 2분, 4분, 6분, 8분 및 10분이 경과된 시점에, 상기 반응용액으로부터 각각 50 ㎕씩 반응시료를 취하였다.

상기 반응시료는 반응용액으로부터 분리한 후, 즉시 끓는 물에서 15분간 열처리하여 반응을 종결시켰다. 각각의 기질인 베타-사이클로덱스트린과 말토헵타오스의 가수분해 양을 측정하기 위하여, 상기 반응을 종결시킨 반응시료에 대해 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High-Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC)를 수행하고 이를 분석하여 각각의 기질인 베타-사이클로덱스트린과 말토헵타오스의 잔존 양을 정량하였다.

구체적으로는, 상기 반응을 종결시킨 반응시료를 초순수수로 100배 희석한 후에, 0.45 ㎛박막여과지로 여과하였으며, 상기 주입된 시료양은 20 ㎕이었고, 주입 유속은 분당 1 ml로 하였다. 상기 고성능 음이온 교환 크로마토그래피는 GP40 그래디언트 펌프(Dionex Co., USA), ED40 전기화학적 검출기(Dionex Co., USA) 및 카보팩-컬럼(CarboPac PA1)을 이용하여 수행하였고, A 용매로는 150 mM의 가성소다액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 소듐 아세테이트를 녹인 것을 B 용매로 사용하였고, 상기 B 용매는 A 용매 사용 후, 40분 후에 B 용매가 40분 동안 0%에서 40%가 되도록 직선적으로 농도구배를 걸어주었으며, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)를 수행한 결과 즉, 용출물의 조성을 정량된 수치로 분석하였다.

상기 분석된 정량된 수치를 이용하여, 베타-사이클로덱스트린의 환 개열 반응속도 즉, 개환속도와 말토헵타오스의 가수분해속도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 상기 반응속도는 초기 속도를 의미하는 것으로, 각 측정 시점에서 분석된 생성물의 양을 시간에 대한 그래프로 표현하여 직선을 이루는 구간의 기울기를 초기속도로 하였으며, Michaelis-Menten equation을 바탕으로 하여 여러 기질농도에서 그 초기속도를 구하여 Km값과 K _cat 값을 계산하였으며, 상기 반응속도는 K _cat /Km의 식으로 구하였다.

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 내열성 아밀레이즈의 변이효소는 말토헵타오스의 가수분해속도에 비하여 베타-사이클로덱스트린의 개환속도가 13배 빠른 것으로 확인되었다.

상기 변이효소의 말토올리고당에 대한 가수분해속도 대비 사이클로덱스트린의 개환속도와 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈의 말토올리고당에 대한 가수분해속도 대비 사이클로덱스트린의 개환속도는 13:9로 약 50%가 향상된 것이다. 이러한 효소의 가수분해능에 비한 환 개열능의 현저한 개선효과는 사이클로덱스트린을 기질로 하여 반응을 진행시킬 경우, 부산물에 해당하는 글루코오스 또는 글루코오스 2 내지 5의 말토올리고당의 생성량을 최소화할 수 있어 특별한 정제과정의 추가 수행없이 산업적으로 유용한 탄소수 6 내지 8의 말토올리고당을 제조할 수 있다는 점에서 그 산업적 효과가 매우 크다할 것이다.

실시예3: 사이클로덱스트린으로부터 말토올리고당 제조과정에서 효소에 따른 부산물의 생성정도 확인

실시예 1에서 제조한 변이효소를 이용하여 실제로 사이클로덱스트린으로부터 말토올리고당을 제조하였다.

보다 구체적으로는,

50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 1%(w/v)의 농도로 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린을 용해시킨 용액 450 ㎕에 상기 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5) 360 ㎕을 추가로 첨가하여 기질용액을 제조하고, 90 ℃에서 5분간 열처리하였다. 상기 열처리한 기질용액에 상기 실시예 1의 파이로코커스 퓨리오서스 유래 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈와 상기 실시예 1에서 제조한 내열성 아밀레이즈 변이효소 각각 90 ㎕(0.22 unit)를 첨가하여 반응용액을 제조하고, 90 ℃에서 반응을 진행(incubation)시키면서, 5분, 10분, 20분 및 30분이 경과된 시점에, 상기 반응용액으로부터 각각 150 ㎕씩 반응시료를 취하였다.

상기 반응시료는 반응용액으로부터 분리한 후, 즉시 끓는 물에서 15분간 열처리하여 반응을 종결시켰다.

실시예 2에서 확인한 개환반응속도와 가수분해반응속도의 차이에 의한 각각의 효소 종류에 따른 반응생성물의 차이 즉, 글루코오스 및 탄소수 2 내지 탄소수 5의 말토올리고당의 생성여부를 확인하기 위하여, 상기 반응을 종결시킨 반응시료에 대해 박막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)분석을 수행하여 반응산물을 분석하였다.

구체적으로, 상기 박막 크로마토그래피는 상기 반응을 종결시킨 반응시료를 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1 ㎕씩 로딩하고, 아이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트 및 증류수의 비가 3:1:1(v/v/v)인 전개액에서 1회 전개시킨 후, 건조시키고, 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5%(w/v)황산을 함유한 메탄올에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분 동안 발색시키는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 5에 나타내었다.

상기 도 3 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 반응을 진행시키지 아니한 반응용액은 기질인 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린만이 말토테트라오스와 유사한 크기에 나타났으며, 이후, 각 효소와 시간에 따른 반응결과에 의해 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린의 분해 산물이 나타났다.

상기 도 3의 모효소인 파이로코커스 퓨리오서스 유래 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈의 결과에서 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당을 확인할 수 있어, 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린으로부터 말토헵타오스 또는 말토옥타오스를 생산하는 경우, 최저 반응시간인 5분간 반응을 수행한 결과에서도 부산물이 나타나는 것으로 확인되었다. 한편, 개량효소인 실시예 1의 변이효소의 경우, 기질이 베타-사이클로덱스트린인 경우, 20분간 반응을 수행한 경우에도 말토헵타오스 외에 저분자량의 말토올리고당이 확인되지 아니하였으며, 30분간 반응을 수행한 경우의 결과 확인된 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당 위치의 밴드와 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈를 이용하여 5분간 반응을 수행한 결과 확인된 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당 위치의 밴드가 비슷한 정도로 확인되었고, 기질이 감마-사이클로덱스트린인 경우, 30분간 반응을 수행한 경우에도 저분자량 즉, 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당이 확인되지 아니하였으며, 다만 30분간 반응을 수행한 경우의 결과 확인된 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당 위치의 밴드와 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈를 이용하여 5분간 반응을 수행한 결과 확인된 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당 위치의 밴드가 비슷한 정도로 확인되었다.

상기 확인된 결과로부터, 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈의 경우 사이클로덱스트린의 개환과 함께 말토올리고당의 가수분해가 진행됨으로써, 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린을 이용하여 말토헵타오스 또는 말토옥타오스를 생산하는 경우 부산물의 생성으로 인한 문제점이 발생될 수 있는 반면, 개량된 실시예 1의 변이효소의 경우, 베타-사이클로덱스트린의 개환속도가 가수분해속도에 비해 현저히 높아, 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린의 개환이 일정 수준 이상 수행되기 전에는 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린의 개환에 의해 생성된 말토올리고당의 가수분해가 수행되지 않는다는 것이 분석되었다.

상기 분석된 바에 의하면, 실시예 1의 변이효소는 반응속도의 차이가 일정 시간동안 반응을 수행하는 경우 반응산물의 종류 즉, 글루코오스 및 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당의 생성여부와 직접적인 관련이 있으므로, 효소 사용량 및 반응시간을 조절하여, 사이클로덱스트린으로부터 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 부산물인 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당의 생성량을 최소화하면서 생성할 수 있어, 고순도의 탄소수 6 내지 8의 말토올리고당을 생성할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: 사이클로덱스트린으로부터 말토올리고당 제조과정에서 효소에 따른 부산물의 생성정도의 정량확인

사이클로덱스트린으로부터 말토올리고당을 생성할 경우, 상기 실시예 1의 파이로코커스 퓨리오서스 유래 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈와 상기 실시예 1에서 제조한 내열성 아밀레이즈 변이효소에 따른 생성물과 부산물의 생성정도를 정량적으로 확인하기 위하여, 소수성 컬럼크로마토그래피와 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다.

4-1. 반응시료의 분리 및 정제

베타-사이클로덱스트린과 감마-사이클로덱스트린을 기질로 하여 각각의 효소에 따른 생성물인 말토헵타오스 및 말토옥타오스와 부산물인 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 5개의 말토올리고당의 생성정도를 정량적으로 분석하기 위하여, 우선 반응시료로부터 말토올리고당을 수소성 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하였다.

구체적으로, 약 5 ml의 부틸 세파로스(butyl-separose) 수지를 컬럼에 충진 시킨 후, 증류수 20 ml을 흘려보내 컬럼을 안정화시키고, 상기 실시예 3에서 얻은 반응시료를 주입하였으며, 말토옥타오스의 경우, 기질로 베타-사이클로덱스트린 대신 감마-사이클로덱스트린을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하여 수득한 시료를 주입하였다. 사이클로덱스트린의 경우, 사이클로덱스트린이 가지는 환 내부의 소수성 특성으로 인하여, 수지에 결합할 수 있으므로, 상기 반응을 수행한 결과, 미반응 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린은 선택적으로 수지에 결합되어 분리될 수 있으며, 반응결과물인 말토올리고당은 친수성 물질이므로, 수지에 결합되지 않고 용출되었다. 미반응 기질인 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린은 재사용을 위하여 수지를 충전시킨 컬럼에 90℃의 증류수를 흘려보내 용출시켜 수득하였다.

4-2. 말토올리고당의 정량적 분석(말토헵타오스의 순도분석)

실시예 4-1에 의해 반응시료로부터 분리 및 정제하여 수득한 말토올리고당의 조성을 확인하여, 말토올리고당에 대한 정량적 분석을 수행하기 위하여, 실시예 4-1에서 수득한 용출액에 대하여 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)를 수행하였따.

구체적으로는, 상기 실시예 4-1에서 수득한 용출액을 초순수수로 100배 희석한 후에, 0.45 ㎛박막여과지로 여과하였으며, 상기 주입된 시료양은 20 ㎕이었고, 주입 유속은 분당 1 ml로 하였다. 상기 고성능 음이온 교환 크로마토그래피는 GP40 그래디언트 펌프(Dionex Co., USA), ED40 전기화학적 검출기(Dionex Co., USA) 및 카보팩-컬럼(CarboPac PA1)을 이용하여 수행하였고, A 용매로는 150 mM의 가성소다액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 소듐 아세테이트를 녹인 것을 B 용매로 사용하였고, 상기 B 용매는 A 용매 사용 후, 40분 후에 B 용매가 40분 동안 0%에서 40%가 되도록 직선적으로 농도구배를 걸어주었으며, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)를 수행한 결과 즉, 용출물의 조성을 도 4 및 도 6과 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.

상기 도 4 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 미반응 베타-사이클로덱스트린은 소수성 컬럼크로마토그래피를 이용한 것만으로도 비교적 간단히 제거될 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 도 4 및 표 4에 기재된 바와 같이, 모효소인 파이로코커스 퓨리오서스 유래 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈의 결과에서 다량의 글루코오스 및 글루코오스 분자 2 내지 6개의 말토올리고당을 확인할 수 있었고, 베타-사이클로덱스트린으로부터 말토헵타오스을 생산하는 경우, 말토헵타오스의 순도가 86% 정도임이 분석되었다. 한편, 개량효소인 실시예 1의 변이효소의 경우, 글루코오스나 말토스는 검출되지 아니하였고, 이 외의 글루코오스 분자 3 내지 6개의 말토올리고당도 소량 확인되었으며, 베타-사이클로덱스트린으로부터 말토헵타오스을 생산하는 경우, 말토헵타오스의 순도가 약 96%에 해당함이 분석되어, 순도가 10% 정도 개선됨을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 도 6 및 표 5에 나타난 바와 같이, 개량효소인 실시예 1의 변이효소(G415E 변이효소)는 모효소인 파이로코커스 퓨리오서스 유래 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈에 비하여 현저히 높은 말토옥타오스 순도를 나타내었다. 보다 상세하게는, 개량효소인 실시예 1의 변이효소의 경우, 글루코오스, 말토스, 말토트리오스, 말토펜타오스 및 말토헥사오스의 총 함량은 0.5% 이하였으며, 말토헵타오스는 약 1% 가량 확인되었으며, 말토테트라오스는 약 2% 가량 확인되었다. 모효소인 파이로코커스 퓨리오서스 유래 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈와 비교하면, 말토테트라오스의 경우 변이효소에서 확인된 양은 모효소에서 확인된 양의 약 70% 정도이었고, 글루코오스 등 나머지 불순물의 경우, 변이효소에서 확인된 양은 모효소에서 확인된 양의 약 50% 이하로 감소되었다. 전체적으로는 변이효소를 이용한 경우, 말토옥타오스의 순도는 약 95%로 확인되었으나, 모효소의 경우 90%에도 못미치는 것으로 확인되어, 변이효소의 경우 모효소와 달리 추가적인 정제 공정 없이 사용할 수 있을 정도의 순도를 나타내어 산업적으로 그 유용성이 매우 큰 것으로 확인되었다.

일반적으로 시약으로 사용되는 사이클로덱스트린의 순도는 약 96% 정도이고, 임상시약의 경우 약 90% 이상이면 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기 확인된 결과로부터, 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈의 경우 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린의 개환과 함께 말토올리고당의 가수분해가 진행됨으로써, 베타-사이클로덱스트린을 이용하여 말토헵타오스를 생산하거나 감마-사이클로덱스트린을 이용하여 말토옥타오스를 생산하는 경우, 말토헵타오스 또는 말토옥타오스의 순도가 90%에 미치니 아니하는 86% 또는 88%에 해당하여 산업적 이용을 위해 추가적인 정제과정이 필요한 반면, 개량된 실시예 1의 변이효소의 경우, 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린의 개환속도가 가수분해속도에 비해 현저히 높아, 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린의 개환이 일정 수준 이상 수행되기 전에는 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린의 개환에 의해 생성된 말토올리고당의 가수분해가 수행되지 않으므로, 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈와 동일한 반응시간 동안 반응을 수행한 결과, 말토헵타오스의 순도가 약 96%에 해당하고 말토옥타오스의 순도가 약 95%에 해당하여 추가적인 정제과정 없이도 산업적 이용이 가능한 것이 확인되었다.

즉, 야생형(wild-type) 내열성 아밀레이즈의 경우, 95%의 순도를 얻기 위해서는 전체 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린의 기질 중, 약 20% 정도에 대하여 반응을 수행한 시점에서 반응을 정지시켜야 하고 더 반응을 진행시킨 경우, 예를 들어 기질의 약 50% 정도에 대하여 반응을 수행한 시점에서는 순도가 85% 이하로 떨어지므로, 추가적인 정제공정을 수행하지 않고는 제한적인 반응만을 수행할 수 있어 산업적으로 그 의미가 크지 않으나, 개량된 실시예 1의 변이효소의 경우, 기질의 약 50% 정도에 대하여 반응을 수행한 시점에서도 약 95% 이상의 순도를 유지하여 추가적인 정제공정을 수행하지 않을 수 있어 산업적으로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

실시예5; 고순도 말토헵타오스의 대량 제조

개량된 실시예 1의 변이효소가 산업현장에서의 대량생산시스템에서도 상기 실시예 2 내지 4와 같이 작용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 고순도 말토헵타오스를 대량제조하였다.

보다 상세하게는, pH 4.5로 조절된 증류수 용해된 15%(w/v) 베타-사이클로덱스트린 기질용액 5000ml에, 실시예 1의 변이효소를 기질 g당 2 unit 첨가하고, 85℃에서 60rpm으로 교반하면서 2시간동안 반응시켰다. 상기 2시간 동안의 반응을 수행한 후, 반응의 종결은 반응액의 pH를 pH 2로 낮추는 방법으로 수행하였다.

상기 반응을 종결시킨 반응액을 얼음물을 이용하여 0℃로 냉각한 후, 도 7과 같은 방법으로 분리, 정제하여 얻어진 산물을 분석하였다. 상세하게는 상기 냉각된 반응액을 여과를 통하여 고형분을 제거하고, 다시 활성탄을 통과시켜 기타 불순물을 제거한 뒤, 4 ℃에서 50Brix까지 농축을 수행하여 베타-사이클로덱스트린을 결정화시켜 제거하고 다시 한번 같은 방법으로 결정화를 수행하였다. 상기 베타-사이클로덱스트린을 제거한 용액을 다시 흡착 크로마토그래피를 통과시켜 용액에 잔존하는 베타-사이클로덱스트린을 제거한 후, 다시 활성탄을 통과시켜 기타 불순물을 제거하였다. 상기 불순물을 제거한 최종 산물을 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, pH 4.5로 조절된 증류수 용해된 15%(w/v) 베타-사이클로덱스트린 기질용액 5000ml을 이용하여 개량된 실시예 1의 변이효소가 산업현장에서의 대량생산시스템에서도 유효하게 작용할 수 있는 것으로 확인되었다.

보다 상세하게는, 흡착 크로마토그래피를 이용하지 아니하고, 단순히 활성탄 및 2회의 결정화 방법만으로도 94.6%의 우수한 순도의 말토헵타오스를 수득하였으며, 이 때의 수율도 약 80% 정도에 해당하는 우수한 수율을 나타내었다.

뿐만 아니라, 95% 이상의 순도의 말토헵타오스를 얻기 위하여, 비교적 단순한 흡착 크로마토그래피를 수행한 결과, 말토헵타오스의 순도는 약 96%의 우수한 순도를 나타내었고, 수율도 약 76%에 해당하여, 본 발명의 변이효소가 산업현장에서의 대량생산시스템에서도 유효하게 작용할 수 있음이 확인되었다. 즉, 상기 결과로부터 본 발명의 변이효소의 산업적 가치가 매우 크다는 것이 확인되었다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 변이효소의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터인 pTKND6xHPFTA(G415E)의 개열지도이다.

도 2은 본 발명의 실시예에 따른 변이효소의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터인 pTKND6xHPFTA를 E. coli MC1061에 형질전환시킨 형질전환체로부터 수득한 변이효소의 정제 단계별 전기영동 사진으로, M은 사이즈 마커이고, 레인1은 상기 형질전환체인 E. coli MC1061/pTKND6xHPFTA(G415E)를 초음파 분쇄하여 수득한 상등액이고, 레인2는 상기 상등액을 열처리한 것이며, 레인3은 상기 열처리한 상등액을 Ni-NTA 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제한 것이다.

도 3은 본 발명의 실시예에 따른 베타-싸이클로덱스트린에 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 내열성 아밀레이즈와 상기 모효소로부터 제조된 변이효소(G415E)의 개량된 파이로코커스 퓨리오서스 아밀레이즈(G415E)를 반응시켜 수득한 가수분해산물을 박막크로마토그래피(Thin-layer Chromatography, TLC)로 분석한 결과를 시간별로 나타낸 사진이다.

도 4은 본 발명의 실시예에 따른 베타-싸이클로덱스트린에 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 내열성 아밀레이즈와 상기 모효소로부터 제조된 변이효소(G415E)의 개량된 파이로코커스 퓨리오서스 아밀레이즈(G415E)를 반응시켜 수득한 가수분해산물을 박막크로마토그래피(Thin-layer Chromatography, TLC)를 이용하여 분리한 결과물을 소수성 컬럼크로마토그래피를 이용하여 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 순도를 분석한 결과를 나타낸 사진이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 따른 감마-싸이클로덱스트린에 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 내열성 아밀레이즈와 상기 모효소로부터 제조된 변이효소(G415E)의 개량된 파이로코커스 퓨리오서스 아밀레이즈(G415E)를 반응시켜 수득한 가수분해산물을 박막크로마토그래피(Thin-layer Chromatography, TLC)로 분석한 결과를 시간별로 나타낸 사진이다.

도 6은 본 발명의 실시예에 따른 감마-싸이클로덱스트린에 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 내열성 아밀레이즈와 상기 모효소로부터 제조된 변이효소(G415E)의 개량된 파이로코커스 퓨리오서스 아밀레이즈(G415E)를 반응시켜 수득한 가수분해산물을 박막크로마토그래피(Thin-layer Chromatography, TLC)를 이용하여 분리한 결과물을 소수성 컬럼크로마토그래피를 이용하여 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 순도를 분석한 결과를 나타낸 사진이다.

도 7은 본 발명의 실시예에 따른 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 내열성 아밀레이즈의 변이효소를 베타-싸이클로덱스트린에 반응시킨 후에, 상기 반응액을 용매 침전 또는 소수성 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 대량으로 분리 정제하는 공정도 이다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION <120> THERMOSTABLE AMYLOLYTIC MUTANT ENZYME AND PREPARATION OF HIGHLY PURIFIED MALTOOLIGOSACCHARIDE USING THE SAME <130> dpp20072717kr <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1935 <212> DNA <213> Pyrococcus furious amylase G415E <220> <221> CDS <222> (1)..(1935) <400> 1 atg tat aag ctc gtc agt ttc aga gat agc gag atc ttt gga aga gtt 48 Met Tyr Lys Leu Val Ser Phe Arg Asp Ser Glu Ile Phe Gly Arg Val 1 5 10 15 gca gag gtg gaa ttt tcc cta ata aga gaa gga agc tat gca tac ctc 96 Ala Glu Val Glu Phe Ser Leu Ile Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Tyr Leu 20 25 30 ctt ggt gac ttt aat gca ttt aat gag gga agt ttt aga atg gag caa 144 Leu Gly Asp Phe Asn Ala Phe Asn Glu Gly Ser Phe Arg Met Glu Gln 35 40 45 gaa gga aag aat tgg aag att aaa atc gcc ctt cca gaa ggg gta tgg 192 Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ile Lys Ile Ala Leu Pro Glu Gly Val Trp 50 55 60 cac tat gct ttt tca ata gat ggg aaa ttc gtc tta gat cca gat aat 240 His Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Gly Lys Phe Val Leu Asp Pro Asp Asn 65 70 75 80 cct gaa aga aga gta tat act aga aag ggt tac aaa ttc cac aga gaa 288 Pro Glu Arg Arg Val Tyr Thr Arg Lys Gly Tyr Lys Phe His Arg Glu 85 90 95 gtt aat gtt gca aga att gtc aaa agt gac gat ttg gtt ttc cat act 336 Val Asn Val Ala Arg Ile Val Lys Ser Asp Asp Leu Val Phe His Thr 100 105 110 cct tct ctc ctg tat ctg tat gaa att ttt ggg agg gtt cac gtt ctt 384 Pro Ser Leu Leu Tyr Leu Tyr Glu Ile Phe Gly Arg Val His Val Leu 115 120 125 tta agg aca caa aag ggg gta ata aaa ggg gca act ttc ctg ggg gag 432 Leu Arg Thr Gln Lys Gly Val Ile Lys Gly Ala Thr Phe Leu Gly Glu 130 135 140 aag cat gtt cct atg agg aag aag gct tct gat gag cta ttt gat tac 480 Lys His Val Pro Met Arg Lys Lys Ala Ser Asp Glu Leu Phe Asp Tyr 145 150 155 160 ttt gag gtt atc gta gaa gga gga gat aag agg tta aat tat tca ttt 528 Phe Glu Val Ile Val Glu Gly Gly Asp Lys Arg Leu Asn Tyr Ser Phe 165 170 175 gaa gta tta aca atg gaa gga gcg aaa ttt gag tat ggt caa ttt aag 576 Glu Val Leu Thr Met Glu Gly Ala Lys Phe Glu Tyr Gly Gln Phe Lys 180 185 190 gcg aga ccc ttc agt atc gaa ttt cca acc tgg gtt att gac agg gta 624 Ala Arg Pro Phe Ser Ile Glu Phe Pro Thr Trp Val Ile Asp Arg Val 195 200 205 ttc tat caa ata atg cca gac aaa ttt gct agg tct agg aaa att caa 672 Phe Tyr Gln Ile Met Pro Asp Lys Phe Ala Arg Ser Arg Lys Ile Gln 210 215 220 gga att gcc tat cca aaa gat aaa tat tgg gga gga gat cta atc gga 720 Gly Ile Ala Tyr Pro Lys Asp Lys Tyr Trp Gly Gly Asp Leu Ile Gly 225 230 235 240 att aag gaa aag ata gac cac ctt gtg aac ctt gga ata aat gca ata 768 Ile Lys Glu Lys Ile Asp His Leu Val Asn Leu Gly Ile Asn Ala Ile 245 250 255 tat tta act cca atc ttc agt tcc ctc aca tat cat gga tat gac ata 816 Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Ser Ser Leu Thr Tyr His Gly Tyr Asp Ile 260 265 270 gtt gat tat ttc cac gtt gca agg aga ctt gga gga gac agg gcc ttt 864 Val Asp Tyr Phe His Val Ala Arg Arg Leu Gly Gly Asp Arg Ala Phe 275 280 285 gtg gat ttg tta tct gag ctt aaa agg ttt gat ata aag gtt atc ctt 912 Val Asp Leu Leu Ser Glu Leu Lys Arg Phe Asp Ile Lys Val Ile Leu 290 295 300 gat ggg gta ttt cac cat acg agc ttt ttc cac cca tat ttc caa gat 960 Asp Gly Val Phe His His Thr Ser Phe Phe His Pro Tyr Phe Gln Asp 305 310 315 320 gtt gta agg aag ggg gaa aat agc agc ttt aaa aac ttt tac agg att 1008 Val Val Arg Lys Gly Glu Asn Ser Ser Phe Lys Asn Phe Tyr Arg Ile 325 330 335 att aaa ttt cca gta gtc tca aaa gaa ttt ctt caa atc ctc cat tca 1056 Ile Lys Phe Pro Val Val Ser Lys Glu Phe Leu Gln Ile Leu His Ser 340 345 350 aaa tct tcc tgg gaa gaa aag tac aaa aag ata aaa tcc ctt ggc tgg 1104 Lys Ser Ser Trp Glu Glu Lys Tyr Lys Lys Ile Lys Ser Leu Gly Trp 355 360 365 aat tac gag agc ttt ttc tca gtt tgg ata atg ccg aga tta aac cac 1152 Asn Tyr Glu Ser Phe Phe Ser Val Trp Ile Met Pro Arg Leu Asn His 370 375 380 gat aat cca aag gtt aga gag ttt atc aag aat gtg att ctt ttc tgg 1200 Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Phe Ile Lys Asn Val Ile Leu Phe Trp 385 390 395 400 aca aat aag ggg gtc gat gga ttt aga atg gat gtt gct cat gag gtt 1248 Thr Asn Lys Gly Val Asp Gly Phe Arg Met Asp Val Ala His Glu Val 405 410 415 cct cca gaa gtg tgg aaa gaa gtt aga gaa gca ttg cca aaa gaa aag 1296 Pro Pro Glu Val Trp Lys Glu Val Arg Glu Ala Leu Pro Lys Glu Lys 420 425 430 tac tta att gga gaa gtt atg gat gat gca agg tta tgg ctg ttt gat 1344 Tyr Leu Ile Gly Glu Val Met Asp Asp Ala Arg Leu Trp Leu Phe Asp 435 440 445 aaa ttc cat gga gtc atg aac tat cgg ctc tat gat gca atc tta agg 1392 Lys Phe His Gly Val Met Asn Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Ile Leu Arg 450 455 460 ttt ttt gga tat gag gag att aca gcc gag gaa ttc tta aat gaa cta 1440 Phe Phe Gly Tyr Glu Glu Ile Thr Ala Glu Glu Phe Leu Asn Glu Leu 465 470 475 480 gag ctc tta agc tcg tat tat ggc cca gca gag tat cta atg tat aat 1488 Glu Leu Leu Ser Ser Tyr Tyr Gly Pro Ala Glu Tyr Leu Met Tyr Asn 485 490 495 ttt tta gac aat cat gat gtt gag aga ttt ttg gat ata gtt ggg gat 1536 Phe Leu Asp Asn His Asp Val Glu Arg Phe Leu Asp Ile Val Gly Asp 500 505 510 aag agg aag tac gtg tgt gct ttg gtc ttc ttg atg act tac aaa ggt 1584 Lys Arg Lys Tyr Val Cys Ala Leu Val Phe Leu Met Thr Tyr Lys Gly 515 520 525 att cca tct ctc ttc tac gga gat gaa ata ggg ttg aga ggg att aat 1632 Ile Pro Ser Leu Phe Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Gly Ile Asn 530 535 540 ctc caa gga atg gaa tct tcc aga gca cca atg ttg tgg aat gaa gaa 1680 Leu Gln Gly Met Glu Ser Ser Arg Ala Pro Met Leu Trp Asn Glu Glu 545 550 555 560 gag tgg gat caa agg att ttg gag ata aca aag aca cta gta aag att 1728 Glu Trp Asp Gln Arg Ile Leu Glu Ile Thr Lys Thr Leu Val Lys Ile 565 570 575 agg aaa aac aat aaa gcc ctc ctt ttt ggt aat ttt gtc ccg gtg aag 1776 Arg Lys Asn Asn Lys Ala Leu Leu Phe Gly Asn Phe Val Pro Val Lys 580 585 590 ttt aaa aga aaa ttc atg gta tac aag agg gaa cac atg gga gag aga 1824 Phe Lys Arg Lys Phe Met Val Tyr Lys Arg Glu His Met Gly Glu Arg 595 600 605 act atc gtt gcc att aac tac tca aat tca cgc gtt aaa gaa cta gga 1872 Thr Ile Val Ala Ile Asn Tyr Ser Asn Ser Arg Val Lys Glu Leu Gly 610 615 620 ata aca att cct gaa tat tcg ggc gtg ata att aat gaa gat aaa gtg 1920 Ile Thr Ile Pro Glu Tyr Ser Gly Val Ile Ile Asn Glu Asp Lys Val 625 630 635 640 aaa ttg ata aag tac 1935 Lys Leu Ile Lys Tyr 645 <210> 2 <211> 645 <212> PRT <213> Pyrococcus furious amylase G415E <400> 2 Met Tyr Lys Leu Val Ser Phe Arg Asp Ser Glu Ile Phe Gly Arg Val 1 5 10 15 Ala Glu Val Glu Phe Ser Leu Ile Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Tyr Leu 20 25 30 Leu Gly Asp Phe Asn Ala Phe Asn Glu Gly Ser Phe Arg Met Glu Gln 35 40 45 Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ile Lys Ile Ala Leu Pro Glu Gly Val Trp 50 55 60 His Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Gly Lys Phe Val Leu Asp Pro Asp Asn 65 70 75 80 Pro Glu Arg Arg Val Tyr Thr Arg Lys Gly Tyr Lys Phe His Arg Glu 85 90 95 Val Asn Val Ala Arg Ile Val Lys Ser Asp Asp Leu Val Phe His Thr 100 105 110 Pro Ser Leu Leu Tyr Leu Tyr Glu Ile Phe Gly Arg Val His Val Leu 115 120 125 Leu Arg Thr Gln Lys Gly Val Ile Lys Gly Ala Thr Phe Leu Gly Glu 130 135 140 Lys His Val Pro Met Arg Lys Lys Ala Ser Asp Glu Leu Phe Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Glu Val Ile Val Glu Gly Gly Asp Lys Arg Leu Asn Tyr Ser Phe 165 170 175 Glu Val Leu Thr Met Glu Gly Ala Lys Phe Glu Tyr Gly Gln Phe Lys 180 185 190 Ala Arg Pro Phe Ser Ile Glu Phe Pro Thr Trp Val Ile Asp Arg Val 195 200 205 Phe Tyr Gln Ile Met Pro Asp Lys Phe Ala Arg Ser Arg Lys Ile Gln 210 215 220 Gly Ile Ala Tyr Pro Lys Asp Lys Tyr Trp Gly Gly Asp Leu Ile Gly 225 230 235 240 Ile Lys Glu Lys Ile Asp His Leu Val Asn Leu Gly Ile Asn Ala Ile 245 250 255 Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Ser Ser Leu Thr Tyr His Gly Tyr Asp Ile 260 265 270 Val Asp Tyr Phe His Val Ala Arg Arg Leu Gly Gly Asp Arg Ala Phe 275 280 285 Val Asp Leu Leu Ser Glu Leu Lys Arg Phe Asp Ile Lys Val Ile Leu 290 295 300 Asp Gly Val Phe His His Thr Ser Phe Phe His Pro Tyr Phe Gln Asp 305 310 315 320 Val Val Arg Lys Gly Glu Asn Ser Ser Phe Lys Asn Phe Tyr Arg Ile 325 330 335 Ile Lys Phe Pro Val Val Ser Lys Glu Phe Leu Gln Ile Leu His Ser 340 345 350 Lys Ser Ser Trp Glu Glu Lys Tyr Lys Lys Ile Lys Ser Leu Gly Trp 355 360 365 Asn Tyr Glu Ser Phe Phe Ser Val Trp Ile Met Pro Arg Leu Asn His 370 375 380 Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Phe Ile Lys Asn Val Ile Leu Phe Trp 385 390 395 400 Thr Asn Lys Gly Val Asp Gly Phe Arg Met Asp Val Ala His Glu Val 405 410 415 Pro Pro Glu Val Trp Lys Glu Val Arg Glu Ala Leu Pro Lys Glu Lys 420 425 430 Tyr Leu Ile Gly Glu Val Met Asp Asp Ala Arg Leu Trp Leu Phe Asp 435 440 445 Lys Phe His Gly Val Met Asn Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Ile Leu Arg 450 455 460 Phe Phe Gly Tyr Glu Glu Ile Thr Ala Glu Glu Phe Leu Asn Glu Leu 465 470 475 480 Glu Leu Leu Ser Ser Tyr Tyr Gly Pro Ala Glu Tyr Leu Met Tyr Asn 485 490 495 Phe Leu Asp Asn His Asp Val Glu Arg Phe Leu Asp Ile Val Gly Asp 500 505 510 Lys Arg Lys Tyr Val Cys Ala Leu Val Phe Leu Met Thr Tyr Lys Gly 515 520 525 Ile Pro Ser Leu Phe Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Gly Ile Asn 530 535 540 Leu Gln Gly Met Glu Ser Ser Arg Ala Pro Met Leu Trp Asn Glu Glu 545 550 555 560 Glu Trp Asp Gln Arg Ile Leu Glu Ile Thr Lys Thr Leu Val Lys Ile 565 570 575 Arg Lys Asn Asn Lys Ala Leu Leu Phe Gly Asn Phe Val Pro Val Lys 580 585 590 Phe Lys Arg Lys Phe Met Val Tyr Lys Arg Glu His Met Gly Glu Arg 595 600 605 Thr Ile Val Ala Ile Asn Tyr Ser Asn Ser Arg Val Lys Glu Leu Gly 610 615 620 Ile Thr Ile Pro Glu Tyr Ser Gly Val Ile Ile Asn Glu Asp Lys Val 625 630 635 640 Lys Leu Ile Lys Tyr 645 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFTA-Fnd <400> 3 caattgctac acatatgtat aagctcg 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFTA-Rxo <400> 4 gcggatgggt actcgaggag gcaccacct 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G415E-F <400> 5 tggatgttgc tcatgaggtt cctccagaa 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G415E-R <400> 6 ttctggagga acctcatgag caacatcca 29 <210> 7 <211> 7369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pETPFTA-6His DNA circular <400> 7 tatgtataag ctcgtcagtt tcagagatag cgagatcttt ggaagagttg cagaggtgga 60 attttcccta ataagagaag aagctatgca tacctccttg gtgactttaa tgcatttaat 120 gagggaagtt ttagaatgta taagctcgtc agtttcagag atagcgagat ctttggaaga 180 gttgcagagg tggaattttc cctaataaga gaaggaagct atgcatacct ccttggtgac 240 tttaatgcat ttaatgaggg aagttttaga atggagcaag aaggaaagaa ttggaagatt 300 aaaatcgccc ttccagaagg ggtatggcac tatgcttttt caatagatgg gaaattcgtc 360 ttagatccag ataatcctga aagaagagta tatactagaa agggttacaa attccacaga 420 gaagttaatg ttgcaagaat tgtcaaaagt gacgatttgg ttttccatac tccttctctc 480 ctgtatctgt atgaaatttt tgggagggtt cacgttcttt taaggacaca aaagggggta 540 ataaaagggg caactttcct gggggagaag catgttccta tgaggaagaa ggcttctgat 600 gagctatttg attactttga ggttatcgta gaaggaggag ataagaggtt aaattattca 660 tttgaagtat taacaatgga aggagcgaaa tttgagtatg gtcaatttaa ggcgagaccc 720 ttcagtatcg aatttccaac ctgggttatt gacagggtat tctatcaaat aatgccagac 780 aaatttgcta ggtctaggaa aattcaagga attgcctatc caaaagataa atattgggga 840 ggagatctaa tcggaattaa ggaaaagata gaccaccttg tgaaccttgg aataaatgca 900 atatatttaa ctccaatctt cagttccctc acatatcatg gatatgacat agttgattat 960 ttccacgttg caaggagact tggaggagac agggcctttg tggatttgtt atctgagctt 1020 aaaaggtttg atataaaggt tatccttgat ggggtatttc accatacgag ctttttccac 1080 ccatatttcc aagatgttgt aaggaagggg gaaaatagca gctttaaaaa cttttacagg 1140 attattaaat ttccagtagt ctcaaaagaa tttcttcaaa tcctccattc aaaatcttcc 1200 tgggaagaaa agtacaaaaa gataaaatcc cttggctgga attacgagag ctttttctca 1260 gtttggataa tgccgagatt aaaccacgat aatccaaagg ttagagagtt tatcaagaat 1320 gtgattcttt tctggacaaa taagggggtc gatggattta gaatggatgt tgctcatgag 1380 gttcctccag aagtgtggaa agaagttaga gaagcattgc caaaagaaaa gtacttaatt 1440 ggagaagtta tggatgatgc aaggttatgg ctgtttgata aattccatgg agtcatgaac 1500 tatcggctct atgatgcaat cttaaggttt tttggatatg aggagattac agccgaggaa 1560 ttcttaaatg aactagagct cttaagctcg tattatggcc cagcagagta tctaatgtat 1620 aattttttag acaatcatga tgttgagaga tttttggata tagttgggga taagaggaag 1680 tacgtgtgtg ctttggtctt cttgatgact tacaaaggta ttccatctct cttctacgga 1740 gatgaaatag ggttgagagg gattaatctc caaggaatgg aatcttccag agcaccaatg 1800 ttgtggaatg aagaagagtg ggatcaaagg attttggaga taacaaagac actagtaaag 1860 attaggaaaa acaataaagc cctccttttt ggtaattttg tcccggtgaa gtttaaaaga 1920 aaattcatgg tatacaagag ggaacacatg ggagagagaa ctatcgttgc cattaactac 1980 tcaaattcac gcgttaaaga actaggaata acaattcctg aatattcggg cgtgataatt 2040 aatgaagata aagtgaaatt gataaagtac ctcgagcacc accaccacca ccactgacat 2100 aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat 2160 ccggattggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 2220 tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 2280 cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 2340 tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 2400 tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 2460 cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 2520 ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 2580 gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcaggtgg 2640 cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa 2700 tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa 2760 gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 2820 tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 2880 tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 2940 ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt 3000 atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 3060 cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga 3120 attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac 3180 gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 3240 ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 3300 gatgcctgca gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct 3360 agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 3420 gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 3480 gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 3540 ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 3600 tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 3660 tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 3720 catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 3780 gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 3840 aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 3900 gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 3960 gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 4020 gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4080 atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4140 cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 4200 cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 4260 agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 4320 tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 4380 gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 4440 catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 4500 agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 4560 ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 4620 atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc 4680 cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 4740 cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 4800 ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagctgcggt 4860 aaagctcatc agcgtggtcg tgaagcgatt cacagatgtc tgcctgttca tccgcgtcca 4920 gctcgttgag tttctccaga agcgttaatg tctggcttct gataaagcgg gccatgttaa 4980 gggcggtttt ttcctgtttg gtcactgatg cctccgtgta agggggattt ctgttcatgg 5040 gggtaatgat accgatgaaa cgagagagga tgctcacgat acgggttact gatgatgaac 5100 atgcccggtt actggaacgt tgtgagggta aacaactggc ggtatggatg cggcgggacc 5160 agagaaaaat cactcagggt caatgccagc gcttcgttaa tacagatgta ggtgttccac 5220 agggtagcca gcagcatcct gcgatgcaga tccggaacat aatggtgcag ggcgctgact 5280 tccgcgtttc cagactttac gaaacacgga aaccgaagac cattcatgtt gttgctcagg 5340 tcgcagacgt tttgcagcag cagtcgcttc acgttcgctc gcgtatcggt gattcattct 5400 gctaaccagt aaggcaaccc cgccagccta gccgggtcct caacgacagg agcacgatca 5460 tgcgcacccg tggggccgcc atgccggcga taatggcctg cttctcgccg aaacgtttgg 5520 tggcgggacc agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa gattccgaat accgcaagcg 5580 acaggccgat catcgtcgcg ctccagcgaa agcggtcctc gccgaaaatg acccagagcg 5640 ctgccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac agtcataagt gcggcgacga 5700 tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg 5760 gtcgagatcc cggtgcctaa tgagtgagct aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc 5820 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 5880 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc 5940 aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg 6000 gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggtta acggcgggat ataacatgag 6060 ctgtcttcgg tatcgtcgta tcccactacc gagatatccg caccaacgcg cagcccggac 6120 tcggtaatgg cgcgcattgc gcccagcgcc atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg 6180 ggaacgatgc cctcattcag catttgcatg gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag 6240 tcgccttccc gttccgctat cggctgaatt tgattgcgag tgagatattt atgccagcca 6300 gccagacgca gacgcgccga gacagaactt aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg 6360 tgacccaatg cgaccagatg ctccacgccc agtcgcgtac cgtcttcatg ggagaaaata 6420 atactgttga tgggtgtctg gtcagagaca tcaagaaata acgccggaac attagtgcag 6480 gcagcttcca cagcaatggc atcctggtca tccagcggat agttaatgat cagcccactg 6540 acgcgttgcg cgagaagatt gtgcaccgcc gctttacagg cttcgacgcc gcttcgttct 6600 accatcgaca ccaccacgct ggcacccagt tgatcggcgc gagatttaat cgccgcgaca 6660 atttgcgacg gcgcgtgcag ggccagactg gaggtggcaa cgccaatcag caacgactgt 6720 ttgcccgcca gttgttgtgc cacgcggttg ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct 6780 tccacttttt cccgcgtttt cgcagaaacg tggctggcct ggttcaccac gcgggaaacg 6840 gtctgataag agacaccggc atactctgcg acatcgtata acgttactgg tttcacattc 6900 accaccctga attgactctc ttccgggcgc tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc 6960 cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca 7020 gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga 7080 gatggcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc 7140 gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc 7200 gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat 7260 cgagatctcg atcccgcgaa attaatacga ctcactatag gggaattgtg agcggataac 7320 aattcccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatataca 7369

Claims (7)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 내열성 아밀레이즈 변이효소.
2. 제1항에 있어서, 상기 내열성 아밀레이즈는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 변이효소.
3. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 내열성 아밀레이즈 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
5. 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택된 사이클로덱스트린에 제1항 또는 제2항의 내열성 아밀레이즈 변이효소를 반응시키는 단계를 포함하는 글루코오스 분자수 6 내지 8개의 사슬형 말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 말토올리고당 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린이 베타-사이클로덱스트린이고, 상기 말토올리고당은 말토헵타오스이거나, 상기 사이클로덱스트린이 감마-사이클로덱스트린이고, 상기 말토올리고당은 말토옥타오스인 제조방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 반응은 pH 4 내지 pH 6 및 65℃ 내지 95℃의 조건에서 수행하는 것인 제조방법.

Images