KR101655237B1 - 고정화된 아밀레이즈를 이용한 말토덱스트린의 연속 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고정화된 아밀레이즈를 이용한 말토덱스트린의 연속 제조방법에 관한 것으로, 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 고온성 아밀레이즈를 고정화시켜 사이클로덱스트린으로부터 96% 이상 고순도의 글루코스 분자수 6 내지 8개의 말토덱스트린을 연속적으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 비고정화된 효소에 의한 방법에 비해 효소가 더 안정적이며 효소 활성이 오랫동안 보전되는 효과가 있으며 제조 공정 및 조절이 용이하며 반응의 부산물 제거 또한 쉽게 이루어질 수 있다. 또한 본 발명은 저렴한 사이클로덱스트린으로부터 고부가가치의 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스를 고순도로 연속적으로 대량생산할 수 있으므로 말토덱스트린의 산업적 생산에 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

Description

고정화된 아밀레이즈를 이용한 말토덱스트린의 연속 제조방법{Continuous production method of maltodextrin using immobilized amylase}

본 발명은 고정화된 아밀레이즈를 이용한 말토덱스트린의 연속 제조방법에 관한 것이다.

말토덱스트린은 단백질 변성방지 효과 및 식품의 마스킹(masking) 효과와 부드러운 식감부여 등 식품분야에서 널리 이용되고 있는 기능성 당류이다. 말토덱스트린은 말토오스(G2, maltose), 말토트라이오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스(G4, maltotetraose), 말토펜타오스(G5, maltopentaose), 말토헥사오스(G6, maltohexaose), 말토헵타오스(G7, maltoheptaose), 말토옥타오스(G8, maltooctaose), 말토노나오스(G9, maltononaose) 등을 포함한다.

말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7) 및 말토옥타오스(G8)를 전분으로부터 생산하는 방법으로는 산 가수분해 방법과 효소를 이용한 방법이 주로 이용되고 있다. 상기 효소를 이용한 방법으로는 미생물에서 유래한 알파-아밀레이즈를 전분에 작용시켜 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 제조하는 방법이다. 그러나 상기 방법으로 제조하는 경우 말토헥사오스와 말토헵타오스의 수율이 저조하고, 글루코오스(G1, glucose), 말토오스(G2, maltose), 말토트라이오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스(G4, maltotetraose) 및 말토펜타오스(G5, maltopentaose) 등이 다량으로 생성되어 이를 제거하기 위해 컬럼크로마토그래피, 유기용매를 이용한 분리 및 정제공정이 요구됨으로써 생산경비가 과다하게 소요될 뿐만 아니라 분리, 정제가 어려워 고순도의 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 얻기가 매우 어렵다.

또한 말토옥타오스의 경우, 사이클로덱스트린에 사이클로말토덱스트리네이즈(CyclomaltoDextrinase, CDase)를 작용시켜 효소적으로 합성하는 방법이 보고되어 있다(Uchida et al. Carbohydr. Res. 287:271-274. 1996). 그러나 반응과정에서 말토오스, 말토트라이오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스가 다량으로 생성되어 생산 수율이 저조하고 또한 부산물을 제거하는 정제과정이 요구되는 문제점이 있다.

최근에 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 고온성 아밀레이즈(Pyrococcus furiosus thermostable amylase, PFTA)를 이용하여 사이클로덱스트린으로부터 기타 소당류가 생성되지 않고 순도가 높은, 말토헵타오스, 말토옥타오스를 제조하는 방법이 보고되었다. 그러나 상기 PFTA를 계속적으로 사용하는 경우 더 작은 당류로 가수분해가 진행되기 때문에 반응 혼합물을 1시간 열처리해야 하는 번거로움이 있으며, 비고정화된 효소(free enzyme)는 산업적인 규모의 생산에서는 비용, 재사용, 안정성, 생산효율, 산물의 순도 등에서 산업적 규모의 생산의 요구를 만족하기가 어렵다.

따라서, 상기 문제점을 극복하여 부산물의 생성없이 고순도의 말토헵타오스 및 말토옥타오스를 연속적으로 대량 생산할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

한국등록특허 제0735819호에는 '효소를 이용한 고순도 말토덱스트린의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0059366호에는 '내열성 아밀레이즈 변이효소 및 이를 이용한 말토덱스트린의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '고정화된 아밀레이즈를 이용한 말토덱스트린의 연속 제조방법'에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 고온성 아밀레이즈를 고정화시켜 사이클로덱스트린으로부터 96% 이상 고순도의 글루코스 분자수 6 내지 8개의 말토덱스트린을 연속적으로 생산할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 고온성 아밀레이즈 (thermostable amylase)를 레진에 고정화하는 단계를 포함하는 글루코스 분자수 6 내지 8개의 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 말토덱스트린의 연속 제조방법을 제공한다.

본 발명의 말토덱스트린 제조방법은 비고정화된 효소에 의한 방법에 비해 효소가 더 안정적이며 효소 활성이 오랫동안 보전되는 효과가 있으며 제조 공정 및 조절이 용이하며 반응의 부산물 제거 또한 쉽게 이루어질 수 있다. 또한 본 발명은 저렴한 사이클로덱스트린으로부터 고부가가치의 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스를 고순도로 연속적으로 대량생산할 수 있으므로 말토덱스트린의 산업적 생산에 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 고정화된 PFTA을 담은 PBR(Packed-bed reactor)를 이용한 β-사이클로덱스트린(β-CD)으로부터 연속적 G7 생성 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 유속(a), 기질농도(b), 반응온도(c) 변화에 따른 생산량(●), 생산성(■), 전환율(◆), 순도(▲)에 미치는 영향을 측정한 결과이다. (a) 및 (c)의 반응조건은 1%(w/v)의 기질이 포함된 pH 4.5(50 mM 소듐 아세트산 완충액)이었다. (a)에서 50℃의 고정 온도와 (b)에서 3 ㎖/분의 고정 유속에서 반응하였다. (c)는 1%(w/v)의 고정 기질과 3 ㎖/분의 고정 속도에서 반응하였다.
도 3은 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography)(C18 컬럼)을 이용하여 분리 전과 후의 반응물을 분석한 결과(a) 및 C18 컬럼으로 분리 후 동결 건조한 G7 및 G8 생성물을 HPAEC-PAD(High Performance Anion Exchange chromatography-Pulsed Amperometric Detection)를 이용하여 분석한 결과(b)이다.
도 4는 고정화된 PFTA 반응기의 사용 안정성을 분석한 결과이다. PBR은 20분간 작동되었으며 하루의 시간 간격을 두었다(a). PBR은 25시간 동안 연속적으로 작동되었다(b). 역가는 기질로부터 생산물로의 변환을 계산하여 측정되었으며, 조건은 50℃의 온도, 1%(w/v)의 기질, 3 ㎖/분의 유속이었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 고온성 아밀레이즈 (thermostable amylase)를 레진(resin)에 고정화하는 단계;

(b) 상기 고정화된 고온성 아밀레이즈를 컬럼에 충전시킨 후, 사이클로덱스트린을 포함하는 기질 용액을 상기 컬럼에 공급하여 효소 반응을 유도하여 효소 반응 산물을 생성하는 단계; 및

(c) 상기 효소 반응 산물에서 미반응 사이클로덱스트린을 제거하는 단계를 포함하는 글루코스 분자수 6 내지 8개의 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 말토덱스트린의 연속 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 고온성 아밀레이즈는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스 유래의 고온성 아밀레이즈일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 고온성 아밀레이즈의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 글루코스 분자수 6 내지 8개의 말토덱스트린을 생성하는 활성을 의미한다.

본 발명의 아밀레이즈는 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 분리된 아밀레이즈를 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 아밀레이즈를 생산하는 단계를 포함하는 아밀레이즈의 생산방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 아밀레이즈를 코딩하는 서열은 통상의 발현용 벡터, 예컨대 pET-22b(+) 벡터(프로모터: T7, 전사종결인자: T7, 선별마커: 암피실린 저항성 유전자)에 삽입하여 재조합 벡터(pETPFTA-6h 벡터)를 제조할 수 있으나, 상기 발현용 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다.

상기 형질전환용 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 예컨대 대장균, 유산균, 효모, 곰팡이 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형질전환 방법은 통상의 공지 방법으로 용이하게 실시할 수 있다.

상기 형질전환체를 배양하는 단계에서는 숙주세포에 따라 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 배양 조건 역시 숙주세포에 따라 달리 적용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예로 제조한 대장균 BL21(DE3)/pETPFRA-6h는 카나마이신이 첨가된 LB배지에서 30 내지 37℃에서 배양하여, 다량의 아밀레이즈 재조합 단백질을 생산할 수 있다.

상기 형질전환체를 배양하는 단계 이후에, 형질전환체 균체로부터 아밀레이즈 재조합 단백질을 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 정제단계는 형질전환체 균체를 파쇄하는 단계, 상등액을 취하여 열처리하는 단계 및 상등액을 취하여 니켈 친화성 크로마토그래피를 실시하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 정제된 효소는 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 정제된 효소는 고정화 담체 1g에 정제된 효소를 1~5mg을 첨가하여 흡착시킨 후 고정화 효소로 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 고정화된 고온성 아밀레이즈를 컬럼에 충전시킨 후, 사이클로덱스트린을 포함하는 기질 용액을 상기 컬럼에 공급하여 효소 반응을 유도하여 효소 반응 산물을 생성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 아밀레이즈는 α-1,4 글루코시드 및 α-1,6 글루코시드 결합을 분해하는 효소적 특성을 포함한다. 즉, 아밀레이즈는 말토덱스트린, 가용성 전분, 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 플루란(pullulan), 아카보오스(acarbose) 및 파라-나이트로페닐 말토펜타오사이드(pNPG5, p-nitrophenyl maltopentaoside)로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 작용하여 α-1,4 글루코시드 및 α-1,6 글루코시드 결합을 분해하여, 글루코오스, 말토오스, 말토테트라오스, 말토트라이오스, 판노오스, 아카비오신-글루코오스, 파라-나이트로페닐 글루코사이드(pNPG1, p -nitrophenyl glucoside), 파라-나이트로페닐 말토사이드(pNPG2, p-nitrophenyl maltoside) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 당화합물을 생성시킨다.

본 발명에 있어서, 상기 아밀레이즈에 대한 기질용액은 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액일 수 있다. 상기 사이클로덱스트린은 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 기질을 알파-사이클로덱스트린으로 하여 말토헥사오스를 제조하거나, 기질을 베타-사이클로덱스트린으로 하여 말토헵타오스를 제조하거나, 기질을 감마-사이클로덱스트린으로 하여 말토옥타오스를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 글루코오스 분자수 6 내지 8의 말토덱스트린을 건조 고형분 기준으로 85%(w/w) 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 96% 이상의 순도인 것을 제조할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 고정화된 아밀레이즈의 활성 역가가 85% 이상을 유지하는 상태로 6회 이상 사용 가능할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 (b) 단계의 기질 용액의 컬럼을 통과하는 유속은 0.17~1 컬럼 부피/분(= 1.33~7.85 ml/분)이고, 바람직하게는 0.375~0.51 컬럼 부피/분(= 3~4 ml/분)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 상기 컬럼 부피(column volume)는 본 발명의 재킷형 유리 컬럼의 내경이 1.0cm이고, 높이가 10cm이므로 1 컬럼 부피는 7.85ml이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 (b) 단계의 반응 온도는 45~50℃일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 (b) 단계의 사이클로덱스트린을 포함하는 기질 용액의 농도는 0.5%(w/v) 이상, 바람직하게는 0.5~1.5%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 고정된 아밀레이즈에 50℃의 온도에서 1.5%(w/v)의 기질 농도 용액을 3㎖/분의 유속으로 통과시켜 순도 95%의 말토덱스트린을 제조할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 효소 반응 산물에서 미반응 사이클로덱스트린을 제거하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 역상 크로마토그래피법을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. PFTA 의 발현 및 정제

대장균(Esherichia coli) BL21(DE3)에 PFTA(Pyrococcus furiosus thermostable amylase) 발현 플라스미드(pETPFTA-6h)를 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균은 37℃에서 100mg/㎖의 카나마이신(kanamycin) 항생제를 첨가한 LB 배지(bacto trypton 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 0.5%)에서 12시간 동안 키웠다. 원심분리(1,200×g, 4℃, 20분)하여 배지를 제거한 다음 효소 정제 전까지 대장균을 얼려서 보관하였다. 용균 완충액(50 mM Tris buffer(pH 7.0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)를 첨가한 후 초음파 분해(sonication)하여 균 추출액을 얻었다. 원심분리(20,000×g, 4℃, 20분)를 하여 침전물을 제거한 다음, 70℃에서 20분간 열처리를 통하여 열에 약한 내생적 대장균 단백질을 제거하였다. 원심분리(20,000×g, 4℃, 20분) 후 상등액을 포집하였고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(nickel-nitilotriacetic acid affinity chromatography)를 이용하여 PFTA를 정제하였다. PFTA의 분자량은 SDS-PAGE를 통하여 측정하였다.

Bradford 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정하였으며, 표준물질로 BSA(bovine serum albumin)을 이용하였다. 효소의 역가는 50 mM 소듐 아세트산 완충액(pH 4.5) 조건에서 70℃에서 DNS(3,5-dinitrosalicyclic acid) 방법을 이용하여 측정하였다. 270㎕의 기질 β-CD(1%) 용액과 30㎕의 효소액을 반응시켰다. 효소 역가 단위(unit, U)은 1분 동안 1μmol 환원당을 전환시키는 효소의 양으로 정의하였다.

2 PFTA 고정화 및 준비

먼저 레진(resin)을 물로 세척한 후 메탄올을 이용하여 3시간 동안 흔들면서 레진을 활성화시켰다. 물로 다시 세척한 다음, 50 mM Tris 완충액(pH 7.5)에 사용 전까지 보관하였다. 완충액를 제거한 다음 PFTA 효소액을 첨가하였다. 이 때 건조 레진 1g당 효소는 각 1.5, 3, 4, 5, 10 mg의 농도로 첨가하였다. PFTA 효소액과 레진의 혼합물은 12시간 동안 30℃에서 150rpm의 속도로 흔들면서 효소 고정화 반응을 시켰다. 50 mM Tris 완충액(pH 7.5)를 이용하여 더 이상의 단백질이 씻겨 나오지 않을 때까지 씻어 주었다. 고정화된 효소의 역가를 70℃, 50 mM 소듐 아세트산 완충액(pH 4.5)에서 DNS법을 이용하여 측정하였다. 하기의 수학식 1을 이용하여 고정화 수율(1), 역가 수율(2) 및 고정화 효율(3)은 계산하였다. 고정화된 효소는 매번 사용 후, 50 mM Tris 완충액(pH 7.5)으로 세척 및 보관하였다.

3. 효소 충진 반응장치( packed - bed reactor , PBR )의 전반적 구조

고정화된 PFTA(7.85 mL)를 재킷형 유리 컬럼(jacketed glass column; 1.0cm i.d x 15.0cm: 전체부피 중 7.85 mL 만을 사용하고 adaptor를 사용하여 dead volume을 제거하였음)에 채워 넣었다. 기질 용액은 튜브연동 펌프(peristatic pump)를 통하여 공급되었으며, 반응하지 않은 β-CD를 제거하기 위해 효소반응 장치 컬럼 끝에 바로 C18 유리 컬럼을 연결하였다. PBR(고정화된 효소가 들어 있는 컬럼)의 온도는 항온 수조를 이용하여 유지하였다. 상기 PBR를 이용한 생산 시스템은 도 1에 나타내었다.

4. 고정화 PFTA 의 안정성 및 반응장치의 시스템 설치

고정화 효소의 안정성과 재 사용성을 연구하고자 고정화된 PFTA는 재킷형 유리 컬럼에 채웠다. 상기 실험을 위해서 C18 컬럼은 제거되었다. 하루의 시간 간격을 두고 50℃에서 20분간 1%의 기질을 3 ㎖/분의 속도로 PBR에 흘려 주었다. 매 사용 후 컬럼에 남아 있을 수 있는 기질과 생성물을 Tris 완충액을 이용하여 세척하였다. 매 회마다 기질에서 생성물로 변환된 양을 측정함으로써 매 회 상대적 역가를 측정하였다. 생성된 말토덱스트린은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High Performance Anion Exchange chromatography, HPAEC)와 펄스 전류 측정장치(pulsed amperometric detection, PAD)을 이용하여 정량하였다.

5. 말토헥타오스(maltoheptaose, G7)의 장기 지속적 생산

Multiple preparative HPLC를 이용하여 PBR 시스템으로 G7의 지속적 생산을 실험하였다. 최적 조건하에 25시간 동안 기질을 PBR에 흘려주었다. 반응되지 않은 β-CD의 제거 효율을 높이기 위해 C18 컬럼 대신 C18 카트리지(cartridge)를 여러개 연결하였다.

6. 고순도의 G7 과 G8 의 생산

PFTA PBR 시스템은 순수한 말토덱스트린을 최적으로 생산되는 조건하에 조작되었다. 반응되지 않은 β-CD는 C18 컬럼을 통하면서 제거되었으며 직선의 말토덱스트린은 모아졌다. 모아진 말토덱스트린 용액은 감압 진공 농축기를 통하여 농축 후, 동결건조를 통하여 가루로 만들었다. G7와 G8의 순도는 HPAEC-PAD를 이용하여 측정되었다.

실시예 1: 효소의 고정화에 있어 단백질 충진양의 확인

고정화에 있어 PFTA의 양의 영향을 알고자 여러 농도의 PFTA를 실험하였다. 실험 조건내에서는 고정화되지 않고 남은 효소는 없었다. 역가 수율과 고정화 수율은 모든 조건에서 동일하게 나타났다(표 1). 고정화 효소의 농도가 증가할수록(1.5에서 5 mg/g 농도의 사이에서) 고정화 효율이 증가함을 보였다. 건조 레진 1g 당 5 mg의 단백질 농도일 때 가장 높은 고정화 효율 값을 보였다. 최적의 실험을 위해 PFTA 고정화는 건조 레진 1g 당 3 mg의 단백질 농도로 진행되었다.

효소 양(mg/g 건조 레진)	고정화 수율(%)	역가 수율(%)	고정화 효율(%)
1.5	100	0.795	0.798
3	100	12.0	12.0
4	100	12.4	12.4
5	100	14.7	14.7
10	100	6.21	6.21

실시예 2: G7 생산에 있어 속도의 영향

G7의 연속적 생산을 위하여 PBR에 1,200 U의 고정화된 효소를 담고 50℃에서 실험을 하였다. 속도에 따른 G7 생산에 대한 영향은 도 2a에 나타내었다. 속도가 증가함에 생산량과 전환율은 감소한 반면 생산성과 순도는 증가하였다. 속도가 3~4 ㎖/분일때 G7은 최고의 생산성(298~306mg/h)과 순도(95.3~95.7%)를 확인하였다. 속도가 1 ㎖/분일때 순도는 85.71%였다.

실 시예 3: G7 생산에 있어 기질의 농도와 온도의 영향

50℃에서 β-CD 기질의 농도를 0.5~1.5% 농도로 변화를 주어 실험하였다. 농도가 증가할수록 생산량 및 생산성이 증가하였다(도 2b). 1~1.5% 농도 범위 내에서는 기질 농도가 증가하여도 생성된 G7의 순도에는 영향이 없는 것으로 확인되었다. 반면 과도한 기질의 공급으로 인하여 β-CD에서 G7으로의 전환율은 급격히 감소하는 것으로 보였다.

G7 생산에 대한 온도가 미치는 영향을 도 2c에 나타내었다. 40~60℃에서 온도가 증가할수록 생산성과 전환율이 급격히 증가하였다. 45℃와 50℃에서 가장 높은 순도를 보였다.

실시예 4: PFTA PBR 시스템을 이용한 순수한 G7 및 G8 생산

본 실험에서는 G7 생산에 있어 역상 크로마토그래피 방법을 사용하였다. C18 컬럼 사용 전 후를 비교한 결과 β-CD를 완전히 제거할 수 있었으며, 최종 산물의 순도는 96% 이상이었다(도 3a). 도 3b에 개시된 바와 같이 G7의 순도는 94.3±0.7%에 달했다. 또한 1%의 γ-CD 기질을 사용하는 것을 제외하고 다른 조건은 같은 방법으로 G8 생산의 최적 조건을 실험하였으며, 그 결과 G8의 생산량, 생산성, 전환율 및 순도는 각각 5.20±0.42mg/㎖, 936±75mg/h, 52.0±4.2% 및 97.0±0.2%이었다.

실시예 5: 고정화된 PFTA 의 조작 안정성 및 G7 의 연속 생산

하루의 간격을 두고 50℃에서 반복 실험을 하였다. 처음의 역가보다 6번째의 실험에서는 85%의 역가를 보였고, 순도의 변화는 없었다(도 4a).

장기간 지속적 생산의 조작 안정성을 위한 실험을 수행하였다. β-CD 제거의 효율을 증가시키기 위해 C18 컬럼에서 4개의 C18 카트리지로 바꾸어 주었다. 25시간 동안 3 ㎖/분의 속도로 실험하였다. PBR의 지속적 조작 안정성은 도 4b에 나타내었다. 처음 12시간 안에 18% 생산성이 감소된 이후 25시간까지 82% 생산량이 유지 되었다(도 4b).

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Continuous production method of maltodextrin using immobilized amylase <130> PN15281 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 653 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 1 Met Tyr Lys Leu Val Ser Phe Arg Asp Ser Glu Ile Phe Gly Arg Val 1 5 10 15 Ala Glu Val Glu Phe Ser Leu Ile Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Tyr Leu 20 25 30 Leu Gly Asp Phe Asn Ala Phe Asn Glu Gly Ser Phe Arg Met Glu Gln 35 40 45 Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ile Lys Ile Ala Leu Pro Glu Gly Val Trp 50 55 60 His Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Gly Lys Phe Val Leu Asp Pro Asp Asn 65 70 75 80 Pro Glu Arg Arg Val Tyr Thr Arg Lys Gly Tyr Lys Phe His Arg Glu 85 90 95 Val Asn Val Ala Arg Ile Val Lys Ser Asp Asp Leu Val Phe His Thr 100 105 110 Pro Ser Leu Leu Tyr Leu Tyr Glu Ile Phe Gly Arg Val His Val Leu 115 120 125 Leu Arg Thr Gln Lys Gly Val Ile Lys Gly Ala Thr Phe Leu Gly Glu 130 135 140 Lys His Val Pro Met Arg Lys Asn Ala Ser Asp Glu Leu Phe Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Glu Val Ile Val Glu Gly Gly Asp Lys Arg Leu Asn Tyr Ser Phe 165 170 175 Glu Val Leu Thr Met Glu Gly Ala Lys Phe Glu Tyr Gly Gln Phe Lys 180 185 190 Ala Arg Pro Phe Ser Ile Glu Phe Pro Thr Trp Val Ile Asp Arg Val 195 200 205 Phe Tyr Gln Ile Met Pro Asp Lys Phe Ala Arg Ser Arg Lys Ile Gln 210 215 220 Gly Ile Ala Tyr Pro Lys Asp Lys Tyr Trp Gly Gly Asp Leu Ile Gly 225 230 235 240 Ile Lys Glu Lys Ile Asp His Leu Val Asn Leu Gly Ile Asn Ala Ile 245 250 255 Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Ser Ser Leu Thr Tyr His Gly Tyr Asp Ile 260 265 270 Val Asp Tyr Phe His Val Ala Arg Arg Leu Gly Gly Asp Arg Ala Phe 275 280 285 Val Asp Leu Leu Ser Glu Leu Lys Arg Phe Asp Ile Lys Val Ile Leu 290 295 300 Asp Gly Val Phe His His Thr Ser Phe Phe His Pro Tyr Phe Gln Asp 305 310 315 320 Val Val Arg Lys Gly Glu Asn Ser Ser Phe Lys Asn Phe Tyr Arg Ile 325 330 335 Ile Lys Phe Pro Val Val Ser Lys Glu Phe Leu Gln Ile Leu His Ser 340 345 350 Lys Ser Ser Trp Glu Glu Lys Tyr Lys Lys Ile Lys Ser Leu Gly Trp 355 360 365 Asn Tyr Glu Ser Phe Phe Ser Val Trp Ile Met Pro Arg Leu Asn His 370 375 380 Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Phe Ile Lys Asn Val Ile Leu Phe Trp 385 390 395 400 Thr Asn Lys Gly Val Asp Gly Phe Arg Met Asp Val Ala His Gly Val 405 410 415 Pro Pro Glu Val Trp Lys Glu Val Arg Glu Ala Leu Pro Lys Glu Lys 420 425 430 Tyr Leu Ile Gly Glu Val Met Asp Asp Ala Arg Leu Trp Leu Phe Asp 435 440 445 Lys Phe His Gly Val Met Asn Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Ile Leu Arg 450 455 460 Phe Phe Gly Tyr Glu Glu Ile Thr Ala Glu Glu Phe Leu Asn Glu Leu 465 470 475 480 Glu Leu Leu Ser Ser Tyr Tyr Gly Pro Ala Glu Tyr Leu Met Tyr Asn 485 490 495 Phe Leu Asp Asn His Asp Val Glu Arg Phe Leu Asp Ile Val Gly Asp 500 505 510 Lys Arg Lys Tyr Val Cys Ala Leu Val Phe Leu Met Thr Tyr Lys Gly 515 520 525 Ile Pro Ser Leu Phe Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Gly Ile Asn 530 535 540 Leu Gln Gly Met Glu Ser Ser Arg Ala Pro Met Leu Trp Asn Glu Glu 545 550 555 560 Glu Trp Asp Gln Arg Ile Leu Glu Ile Thr Lys Thr Leu Val Lys Ile 565 570 575 Arg Lys Asn Asn Lys Ala Leu Leu Phe Gly Asn Phe Val Pro Val Lys 580 585 590 Phe Lys Arg Lys Phe Met Val Tyr Lys Arg Glu His Met Gly Glu Arg 595 600 605 Thr Ile Val Ala Ile Asn Tyr Ser Asn Ser Arg Val Lys Glu Leu Gly 610 615 620 Ile Thr Ile Pro Glu Tyr Ser Gly Val Ile Ile Asn Glu Asp Lys Val 625 630 635 640 Lys Leu Ile Lys Tyr Leu Glu His His His His His His 645 650

Claims (8)

1. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 고온성 아밀레이즈 (thermostable amylase)를 레진(resin) g당 3~5mg의 양으로 레진에 고정화하는 단계로서, 상기 고정화된 아밀레이즈는 활성 역가가 85% 이상을 유지하는 상태로 6회 이상 사용 가능하며;
   (b) 상기 고정화된 고온성 아밀레이즈를 컬럼에 충전시킨 후, 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사이클로덱스트린을 포함하는 기질 용액을 상기 컬럼에 유속 0.375~0.51 컬럼 부피/분으로 공급하여 45~50℃ 온도 조건 하에서 효소 반응을 유도하여 효소 반응 산물을 생성하는 단계; 및
   (c) 상기 효소 반응 산물에서 미반응 사이클로덱스트린을 제거하는 단계를 포함하는 글루코스 분자수 6 내지 8개의 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 말토덱스트린의 순도가 건조 고형분 기준으로 90%(w/w) 이상인 것을 특징으로 하는 말토덱스트린의 연속 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 사이클로덱스트린을 포함하는 기질 용액의 농도는 0.5%(w/v) 이상인 것을 특징으로 하는 말토덱스트린의 연속 제조방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 역상 크로마토그래피법을 이용하는 것을 특징으로 하는 말토덱스트린의 연속 제조방법.

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