KR101944881B1

KR101944881B1 - 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법

Info

Publication number: KR101944881B1
Application number: KR1020170098801A
Authority: KR
Inventors: 곽지윤; 유민지
Original assignee: (주)카보엑스퍼트
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-02-01

Abstract

본 발명은 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법에 관한 것으로, 상세하게는 효소적 방법에 의해 제조된 말토덱스트린을 역상 크로마토그래피를 이용하여 말토덱스트린을 포도당의 중합 크기별로 분리 및 정제하는 방법이며, 각각의 분자별로 최소 83% 이상의 고순도로 분리할 수 있는 말토덱스트린의 분리정제 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법은 종래에 사용되던 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 비하여 고농도의 샘플주입이 가능하며, 분리능이 우수하여 짧은 시간 동안 분리하여도 효율적으로 분리할 수 있으며, 반응 부산물의 제거도 쉽게 이루어질 수 있다. 따라서 고순도의 단일 종류의 말토덱스트린을 대량 생산할 수 있으므로 고순도 말토덱스트린의 산업적 생산에 유용하게 활용될 것이다.

Description

역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법{Separation and purification method of maltodextrin using reverse phase chromatography}

본 발명은 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법에 관한 것이다.

말토덱스트린(maltodextrin)은 녹말을 묽은 산 또는 아밀라아제로 분해하여 생성하는 덱스트린 중에서, 아크로덱스트린보다는 중합도가 작고 맥아당이 되기까지 사이의 저 분자 덱스트린의 총칭이다. D-글루코오스만으로 이루어지는데 제법에 의해 여러 가지 구조 및 성질의 것이 있고, 중합도는 대개 3~5 정도의 것이 많다.

백색의 모정형 고체이고, 물 또는 70%(v/v) 에탄올에 녹으며, 환원성이 있고, 요오드에 의해 착색하지 않는다. 글루코오스 α-1, 4 결합으로 이루어진 노르말 사슬 모양의 소당류를 총칭해서 말하기도 한다. 즉 맥아당, 말토트리오스 및 그들의 중합 동족 계열을 가리킨다. 중합도 4, 5, 6, 7, 8, 9 등의 것을 각각 말토테트라오스(G4), 말토펜타오스(G5), 말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7), 말토옥타오스(G8), 말토노나오스(G9) 등이라 부른다.

말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7) 및 말토옥타오스(G8)를 전분으로부터 생산하는 방법으로는 산 가수분해 방법과 효소를 이용한 방법이 주로 이용되고 있다. 상기 효소를 이용한 방법으로는 미생물에서 유래한 알파-아밀라아제를 전분에 작용시켜 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 제조하는 방법이다. 그러나 상기 방법으로 제조하는 경우 말토헥사오스와 말토헵타오스의 수율이 저조하고, 글루코오스(G1, glucose), 말토오스(G2, maltose), 말토트라이오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스(G4, maltotetraose) 및 말토펜타오스(G5, maltopentaose) 등이 다량으로 생성되어 이를 제거하기 위해 컬럼 크로마토그래피, 유기용매를 이용한 분리 및 정제공정이 요구됨으로써 생산경비가 과다하게 소요될 뿐만 아니라 분리, 정제가 어려워 고순도의 말토헥사오스(G6) 및 말토헵타오스(G7)를 얻기가 매우 어렵다.

또한, 말토옥타오스(G8)의 경우, 사이클로덱스트린에 사이클로말토덱스트리네이즈(CyclomaltoDextrinase, CDase)를 작용시켜 효소적으로 합성하는 방법이 보고되어 있다(Uchida et al. Carbohydr. Res. 287:271-274. 1996). 그러나 반응과정에서 말토오스, 말토트라이오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스가 다량으로 생성되어 생산 수율이 저조하고 또한 부산물을 제거하는 정제과정이 요구되는 문제점이 있다.

최근에 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 고온성 아밀라아제(Pyrococcus furiosus thermostable amylase, PFTA)를 이용하여 사이클로덱스트린으로부터 기타 소당류가 생성되지 않고 순도가 높은, 말토헵타오스(G7), 말토옥타오스(G8)를 제조하는 방법이 보고되었다. 그러나 상기 PFTA를 계속적으로 사용하는 경우 더 작은 당류로 가수분해가 진행되며, 초고온에서도 견디기 효소적 특성 때문에 적절한 반응시간 설정 및 반응 정지방법에 어려움이 있으며, 비고정화된 효소는 산업적인 규모의 생산에서는 비용, 재사용, 안정성, 생산효율, 산물의 순도 등에서 산업적 규모의 생산의 요구를 만족하기가 어렵다.

또한, 고온성 아밀라아제를 이용해 생산된 말토헥사오스(G6) 및 말토헵타오스(G7)는 각각 TmMT 당 전이 효소에 의해 당 전이하여 말토헥사오스(G6)로부터는 짝수의 중합도를 갖는 말토덱스트린 혼합물을, 말토헵타오스(G7)로부터는 홀수의 중합도를 갖는 말토덱스트린 혼합물을 생산하며, 생산된 말토덱스트린 혼합물을 중합도별로 분리 및 정제하기 위해 크로마토그래피법을 이용한다. 주로 사용되는 크로마토그래피법은 크기 배제 크로마토그래피법이지만 시간이 오래 걸리고, 분해능(resolution)이 낮아서 고순도 정제 시 수율이 낮다는 문제점이 있다.

한편, 말토덱스트린의 합성 또는 분리 정제 관련 기술로, 한국등록특허 제1655237호에 고정화된 아밀라아제를 이용한 말토덱스트린의 연속 제조방법이 개시되어 있고, 일본등록특허 제4806394호에 역상 칼럼 크로마토그래피를 사용한 헤파린 또는 저 분자량 헤파린을 구성하는 특정 그룹의 측정방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0062024호에 갈락토올리고당의 검출 정량 방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법에 대해서는 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법을 제공하고, 종래의 말토덱스트린 분리정제 방법인 크기 배제 크로마토그래피와 비교하여 본 발명의 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법이 분리능이 우수하여 분리정제의 시간을 단축할 수 있을 뿐만 아니라 고순도의 말토덱스트린을 획득할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(1) 레진(resin) 100 중량부에 대하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 고온성 아밀라아제(thermostable amylase) 3~5 중량부를 레진에 고정시키는 단계;

(2) 상기 고온성 아밀라아제가 고정된 레진을 칼럼에 충전시킨 후, 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린 중에서 선택된 어느 하나의 사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액을 공급하고, 45~60℃의 온도 조건 하에서 효소 반응을 유도하여 효소 반응 산물을 획득하는 단계;

(3) 상기 단계 (2) 이후에, 미반응한 사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액을 제거하는 단계;

(4) 상기 단계 (3) 이후에, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래 말토실전이효소(maltosyltransferase)를 첨가하여, 효소 반응 산물을 포도당 중합도가 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14인 말토덱스트린 혼합물; 또는 포도당 중합도가 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13인 말토덱스트린 혼합물로 전환하는 당 전이 반응을 수행하는 단계; 및

(5) 상기 단계 (4)에서 전환된 포도당의 중합도가 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14인 말토덱스트린 혼합물; 또는 포도당의 중합도가 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13인 말토덱스트린 혼합물;을 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)로 분리하는 단계;를 포함하는 말토덱스트린의 분리정제 방법을 제공한다.

본 발명은 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법에 관한 것으로, 효소적 방법에 의해 포도당 중합도 2 단위 차이로 제조된 말토덱스트린 혼합물을 역상 크로마토그래피를 이용하여 중합 크기별로 분리 및 정제함으로써, 각각의 분자별로 최소 83% 이상의 고순도로 분리할 수 있는 말토덱스트린의 분리정제 방법이다. 본 발명의 말토덱스트린의 분리정제 방법은 종래 방법에 비해 고순도일 뿐만 아니라, 분리정제 시간을 단축할 수 있으며, 한번에 많은 양의 고농도 시료를 로딩할 수 있어 매우 효율적으로 말토덱스트린을 분리정제할 수 있다.

도 1은 본 발명의 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제방법에서, 단계별로 획득되는 고속액체크로마토그래피(HPAEC: High Pressured Anion Exchange Chromatography)를 나타낸 것으로, (A)는 α-CD이고, (B)는 PFTA 고정화 시스템을 통과한 후이며, (C)는 α-CD를 제거한 후이고, (D)는 TmMT 첨가한 후이다.
도 2는 α-CD으로부터 고정화효소에 의해 전환된 말토헥사오즈(G6)에 당 전이효소 TmMT를 처리하여 획득한 짝수 단위의 말토덱스트린 혼합물을 Biogel P2 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리정제한 크로마토그램이다.
도 3은 상기 도 2의 Biogel P2 크기 배제 크로마토그래피 분획을 각각 HPAEC으로 분석한 결과로, (a) #3, (b) #6, (c) #9, (d) #11, (e) #17, (f) #21, (g) #27, (h) #30, (i) #46, (j) #55이다.
도 4는 α-CD으로부터 고정화효소에 의해 전환된 말토헥사오즈(G6)에 당 전이효소 TmMT를 처리하여 획득한 짝수 단위의 말토덱스트린 혼합물을 Biogel P4 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리정제한 크로마토그램이다.
도 5는 상기 도 4의 Biogel P4 크기 배제 크로마토그래피 분획을 각각 HPAEC으로 분석한 결과로, (a) #1, (b) #3, (c) #6, (d) #9, (e) #12, (f) #16이다.
도 6은 α-CD으로부터 고정화효소에 의해 전환된 말토헥사오즈(G6)에 당 전이효소 TmMT를 처리하여 획득한 짝수 단위의 말토덱스트린 혼합물을 C18 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리정제한 크로마토그램이다.
도 7은 상기 도 6의 C18 역상 크로마토그램의 분획을 각각 HPAEC으로 분석한 결과로, (a) #1의 G2, (b) #2의 G4, (c) #3의 G6, (d) #4의 G8, (e) #5의 G10, (f) #7의 G12이다.
도 8은 β-CD으로부터 고정화효소에 의해 전환된 고순도의 말토헵타오즈(G7)에 당 전이효소 TmMT를 처리하여 획득한 짝수 단위의 말토덱스트린 혼합물을 C18 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리정제한 크로마토그램이다.
도 9는 상기 도 8의 C18 역상 크로마토그램의 분획을 각각 HPAEC으로 분석한 결과로, (a) #1의 G1, (b) #2의 G3, (c) #3의 G5, (d) #4의 G7, (e) #5의 G9, (f) #6의 G11, (g) #8의 G13이다.

본 발명은

(1) 레진(resin) 100 중량부에 대하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 고온성 아밀라아제(thermostable amylase) 3~5 중량부를 레진에 고정시키는 단계;

(4) 상기 단계 (3) 이후에, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래 말토실전이효소(maltosyltransferase)를 첨가하여, 효소 반응 산물을 포도당 중합도가 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14인 말토덱스트린 혼합물; 또는 포도당 중합도가 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13인 말토덱스트린 혼합물로 전환하는 당 전이 반응을 수행하는 단계; 및

(5) 상기 단계 (4)에서 전환된 포도당의 중합도가 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14인 말토덱스트린 혼합물; 또는 포도당의 중합도가 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13인 말토덱스트린 혼합물;을 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)로 분리하는 단계;를 포함하는 말토덱스트린의 분리정제 방법에 관한 것이다.

상기 고온성 아밀라아제의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 포도당의 분자수 6~8개의 말토덱스트린을 생성하는 활성을 의미한다. 본 발명의 아밀라아제는 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 분리된 아밀라아제를 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 아밀라아제를 생산하는 단계를 포함하는 아밀라아제의 생산방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 아밀라아제를 코딩하는 서열은 통상의 발현용 벡터, 예컨대 pET-22b(+) 벡터(프로모터: T7, 전사 종결 인자: T7, 선별 마커: 암피실린 저항성 유전자)에 삽입하여 재조합 벡터(pETPFTA-6h 벡터)를 제조할 수 있으나, 상기 발현용 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다.

상기 형질전환용 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 예컨대 대장균, 유산균, 효모, 곰팡이 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형질전환 방법은 통상의 공지 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기 형질전환체를 배양하는 단계에서는 숙주세포에 따라 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 배양 조건 역시 숙주세포에 따라 달리 적용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예로 제조한 대장균 BL21(DE3)/pETPFRA-6h는 카나마이신이 첨가된 LB배지에서 30~37℃에서 배양하여, 다량의 아밀라아제 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 상기 형질전환체를 배양하는 단계 이후에, 형질전환체 균체로부터 아밀라아제 재조합 단백질을 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 정제단계는 형질전환체 균체를 파쇄하는 단계, 상등액을 취하여 열처리하는 단계 및 상등액을 취하여 니켈 친화성 크로마토그래피를 실시하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 단계 (2)에서 생성된 효소 반응 산물은 말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7) 또는 말토옥타오스(G8)인 것이 특징이며, 상기 단계 (2)의 알파-사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액의 농도는 5%(w/v)인 것이 바람직하다.

상기 단계 (3)에서, 미반응한 사이클로덱스트린이 알파-사이클로덱스트린인 경우, 알파-사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액의 제거는 1-데카놀(1-decanol)과 미반응한 알파-사이클로덱스트린의 몰 농도가 1:1이 되도록 1-데카놀(1-decanol)을 처리하여 형성된 침전물을 제거하는 것이 바람직하며, 미반응한 사이클로덱스트린이 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린인 경우, 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액의 제거는 1-헥사데카놀(1-hexadecanol)이 20%(v/v)이 되도록 반응액에 첨가하여 형성된 침전물을 제거하는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 단계 (3) 및 단계 (4) 사이에, 상기 효소반응 산물을 건조 및 분말화하는 단계를 추가할 수 있으며, 상기 단계 (4)는 50~70℃에서 8~12분 동안 수행하는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 단계 (5)의 역상 크로마토그래피는 C18 칼럼이 장착된 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 파이로코커스 퓨리오서스( Pyrococcus furiosus )에서 분리한 아밀라아제( PFTA)의 고정화 시스템 구축 (한국등록특허 제1655237호에 개시된 실험방법과 동일하게 수행하였다.)

레진을 물로 세척한 후, 메탄올을 이용하여 3시간 동안 흔들면서 레진을 활성화시켰다. 이후, 물로 다시 세척하고, 50mM Tris 완충용액(pH7.5)에 사용 전까지 보관하였다. 상기 완충용액을 제거한 후 PFTA 효소액을 첨가하였다. 이때 건조 레진 1g 당 효소는 각 1.5, 3, 4, 5, 10mg의 농도로 첨가하였다. PFTA 효소액과 레진의 혼합물은 12시간 동안 30℃에서 150rpm의 속도로 흔들면서 효소 고정화 반응을 시켰다. 50mM Tris 완충용액(pH7.5)을 이용하여 더 이상의 단백질이 씻겨 나오지 않을 때까지 씻어 주었다. 고정화된 효소의 역가를 70℃ 50mM 소듐 아세트산 완충용액(pH 4.5)에서 DNS법을 이용하여 측정하였다.

하기의 수학식 1을 이용하여 고정화 수율(1), 역가 수율(2) 및 고정화 효율(3)을 계산하였으며, 고정화된 효소는 매번 사용 후, 50mM Tris 완충용액(pH7.5)으로 세척 및 보관하였다.

[수학식 1]

고정화 수율(immobilization yield, %)=[(C₁-C₂)/C₁]×100 (1)

C₁: 고정화에 사용된 초기 단백질의 양, C₂: 고정화가 안 된 단백질의 양

역가 수율(activity yield, %)=[(specific activity of immobilized enzyme)/(specific activity of free enzyme)]×100 (2)

고정화 효율(%)=(activity yield)/(immobilization yield)]×100 (3)

실시예 2. 말토헥사오스(G6)의 제조

α-사이클로덱스트린(α-CD)의 농도가 5%(w/v)가 되도록 50mM 소듐 아세트산 완충용액(pH 4.5) 1ℓ에 용해시키고, 50℃의 온도 조건 하에서 레진 1g 당 3mg PFTA 효소가 고정화된 칼럼(400㎖)에 재순환 반응시켜 말토헥사오스를 제조하였다.

이후 증발농축기로 4배 농축하였으며, 미반응한 α-사이클로덱스트린(α-CD)을 제거하기 위해 1-데카놀(decanol) 몰 농도와 미반응물 α-CD 몰 농도가 1:1이 되도록 1-데카놀(decanol)을 처리한 후, 형성된 침전물을 제거하였다. 이후, 상등액을 건조하여 분말화하였다.

실시예 3. 말토헵타오스(G7)의 제조

β-사이클로덱스트린(β-CD)의 농도가 5%(w/v)가 되도록 50mM 소듐 아세트산 완충용액(pH 4.5) 1ℓ에 용해시키고, 50℃의 온도 조건 하에서 레진 1g 당 3mg PFTA 효소가 고정화된 칼럼(400㎖)에 재순환 반응시켜 말토헵타오스를 제조하였다.

이후 증발농축기로 4배 농축하였으며, 미반응한 베타-사이클로덱스트린(β-CD)을 제거하기 위해 농축한 반응액과 1-헥사데카놀(decanol)을 8:2 비율로 혼합하여 형성된 침전물을 제거하였다. 이후, 상등액을 건조하여 분말화하였다.

실시예 4. 고순도 말토덱스트린의 분리 및 정제

상기 실시예 2 및 3에서 생산한 말토헥사오스(G6) 및 말토헵타오스(G7) 건조 분말을 50mM phosphate 완충용액(pH6.5)에 녹인 후, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)에서 분리한 말토실 전이효소(TmMT)를 기질 1mg 당 1Unit을 첨가하고, 10분 동안 60℃에서 반응하였다. 이후 반응정지를 위하여 10분 동안 끓이고, 50%(w/v)가 되도록 농축한 후 여과하였다.

이후, C18 역상크로마토그래피를 이용하여 말토덱스트린을 분자별로 분리하여 각 분획물을 감압 건조하였다. 상기 건조방법은 필요에 따라 다양하게 사용할 수 있는데, 일례로, 동결 건조, 감압 건조, 분무 건조, 열풍 건조 등 건조방법에 영향을 받지는 않는다. 본 발명의 역상 크로마토그래피를 이용하는 말토덱스트린의 분리정제 방법이 수율이 높고, 분리시간이 짧으며, 최소 83% 이상의 분리정제가 가능하다는 것을 확인하였다(도 1).

상기 C18 역상크로마토그래피는 분취용 고성능크로마토그래피 장치(Prep-HPLC, LC-Forte/R, YMC, 일본)에 C18 칼럼(YMC-Triart C18, 50㎛, 500mm×50mmi.d)이 장착된 것을 사용하였고, 말토헥사오스(G6)로부터 당 전이 효소 TmMT 반응 혼합물 또는 말토헵타오스(G7)로부터 당 전이효소 TmMT 반응 혼합물을 50%(w/v)의 농도가 되도록 증류수에 녹인 시료 20㎖을 주입하였으며, 이동상은 증류수로 사용하여 20㎖/min의 유속으로 분리 정제하였다.

한편, 비교예로, C18 역상크로마토그래피 대신에 종래에 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피의 조건은 두 가지로 하였다. Bio-rad 사 제품으로, Biogel P2가 충진된 유리 칼럼(500mm×50mm, 3개 직렬 연결)과 Biogel P4가 충진된 유리 컬럼(1200mm×15mm, 2개 직렬 연결)을 이용하였으며, 각각의 조건에 말토헥사오스(G6)부터의 TmMT 반응 혼합물 또는 말토헵타오스(G7) 및 TmMT 반응 혼합물 25%(w/v)이 되도록 물에 녹인 시료 2㎖을 주입하였다. 증류수를 이동상으로 사용하였고, 1.1㎖/min의 유속으로 분리정제하였다.

크기 배제 크로마토그래피법을 이용한 경우, 도 2 내지 도 5에 개시한 바와 같이 분리 시간이 약 33~35시간으로 매우 길고 분해능이 좋지 않다는 것을 확인하였으며, 본 발명의 C18 역상크로마토그래피법을 이용한 결과는 분리 시간이 약 7시간 정도로, 5배 정도 감축하는 효과가 있을 뿐만 아니라, 분해능이 매우 우수하다는 것을 도 6 내지 도 9에 개시하였다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Separation and purification method of maltodextrin using reverse phase chromatography <130> PN17104 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 653 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 1 Met Tyr Lys Leu Val Ser Phe Arg Asp Ser Glu Ile Phe Gly Arg Val 1 5 10 15 Ala Glu Val Glu Phe Ser Leu Ile Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Tyr Leu 20 25 30 Leu Gly Asp Phe Asn Ala Phe Asn Glu Gly Ser Phe Arg Met Glu Gln 35 40 45 Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ile Lys Ile Ala Leu Pro Glu Gly Val Trp 50 55 60 His Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Gly Lys Phe Val Leu Asp Pro Asp Asn 65 70 75 80 Pro Glu Arg Arg Val Tyr Thr Arg Lys Gly Tyr Lys Phe His Arg Glu 85 90 95 Val Asn Val Ala Arg Ile Val Lys Ser Asp Asp Leu Val Phe His Thr 100 105 110 Pro Ser Leu Leu Tyr Leu Tyr Glu Ile Phe Gly Arg Val His Val Leu 115 120 125 Leu Arg Thr Gln Lys Gly Val Ile Lys Gly Ala Thr Phe Leu Gly Glu 130 135 140 Lys His Val Pro Met Arg Lys Asn Ala Ser Asp Glu Leu Phe Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Glu Val Ile Val Glu Gly Gly Asp Lys Arg Leu Asn Tyr Ser Phe 165 170 175 Glu Val Leu Thr Met Glu Gly Ala Lys Phe Glu Tyr Gly Gln Phe Lys 180 185 190 Ala Arg Pro Phe Ser Ile Glu Phe Pro Thr Trp Val Ile Asp Arg Val 195 200 205 Phe Tyr Gln Ile Met Pro Asp Lys Phe Ala Arg Ser Arg Lys Ile Gln 210 215 220 Gly Ile Ala Tyr Pro Lys Asp Lys Tyr Trp Gly Gly Asp Leu Ile Gly 225 230 235 240 Ile Lys Glu Lys Ile Asp His Leu Val Asn Leu Gly Ile Asn Ala Ile 245 250 255 Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Ser Ser Leu Thr Tyr His Gly Tyr Asp Ile 260 265 270 Val Asp Tyr Phe His Val Ala Arg Arg Leu Gly Gly Asp Arg Ala Phe 275 280 285 Val Asp Leu Leu Ser Glu Leu Lys Arg Phe Asp Ile Lys Val Ile Leu 290 295 300 Asp Gly Val Phe His His Thr Ser Phe Phe His Pro Tyr Phe Gln Asp 305 310 315 320 Val Val Arg Lys Gly Glu Asn Ser Ser Phe Lys Asn Phe Tyr Arg Ile 325 330 335 Ile Lys Phe Pro Val Val Ser Lys Glu Phe Leu Gln Ile Leu His Ser 340 345 350 Lys Ser Ser Trp Glu Glu Lys Tyr Lys Lys Ile Lys Ser Leu Gly Trp 355 360 365 Asn Tyr Glu Ser Phe Phe Ser Val Trp Ile Met Pro Arg Leu Asn His 370 375 380 Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Phe Ile Lys Asn Val Ile Leu Phe Trp 385 390 395 400 Thr Asn Lys Gly Val Asp Gly Phe Arg Met Asp Val Ala His Gly Val 405 410 415 Pro Pro Glu Val Trp Lys Glu Val Arg Glu Ala Leu Pro Lys Glu Lys 420 425 430 Tyr Leu Ile Gly Glu Val Met Asp Asp Ala Arg Leu Trp Leu Phe Asp 435 440 445 Lys Phe His Gly Val Met Asn Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Ile Leu Arg 450 455 460 Phe Phe Gly Tyr Glu Glu Ile Thr Ala Glu Glu Phe Leu Asn Glu Leu 465 470 475 480 Glu Leu Leu Ser Ser Tyr Tyr Gly Pro Ala Glu Tyr Leu Met Tyr Asn 485 490 495 Phe Leu Asp Asn His Asp Val Glu Arg Phe Leu Asp Ile Val Gly Asp 500 505 510 Lys Arg Lys Tyr Val Cys Ala Leu Val Phe Leu Met Thr Tyr Lys Gly 515 520 525 Ile Pro Ser Leu Phe Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Gly Ile Asn 530 535 540 Leu Gln Gly Met Glu Ser Ser Arg Ala Pro Met Leu Trp Asn Glu Glu 545 550 555 560 Glu Trp Asp Gln Arg Ile Leu Glu Ile Thr Lys Thr Leu Val Lys Ile 565 570 575 Arg Lys Asn Asn Lys Ala Leu Leu Phe Gly Asn Phe Val Pro Val Lys 580 585 590 Phe Lys Arg Lys Phe Met Val Tyr Lys Arg Glu His Met Gly Glu Arg 595 600 605 Thr Ile Val Ala Ile Asn Tyr Ser Asn Ser Arg Val Lys Glu Leu Gly 610 615 620 Ile Thr Ile Pro Glu Tyr Ser Gly Val Ile Ile Asn Glu Asp Lys Val 625 630 635 640 Lys Leu Ile Lys Tyr Leu Glu His His His His His His 645 650

Claims

(1) 레진(resin) 100 중량부에 대하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 고온성 아밀라아제(thermostable amylase) 3~5 중량부를 레진에 고정시키는 단계;
(2) 상기 고온성 아밀라아제가 고정된 레진을 칼럼에 충전시킨 후, 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린 중에서 선택된 어느 하나의 사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액을 공급하고, 45~60℃의 온도 조건 하에서 효소 반응을 유도하여 말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7) 또는 말토옥타오스(G8)를 획득하는 단계;
(3) 상기 단계 (2) 이후에, 미반응한 사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액을 제거하는 단계;
(4) 상기 단계 (3) 이후에, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래 말토실전이효소(maltosyltransferase)를 첨가하여, 상기 효소 반응 산물인 말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7) 또는 말토옥타오스(G8)를 포도당 중합도가 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14인 말토덱스트린 혼합물; 또는 포도당 중합도가 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13인 말토덱스트린 혼합물로 전환하는 당 전이 반응을 50~70℃에서 8~12분 동안 수행하는 단계; 및
(5) 상기 단계 (4)에서 전환된 포도당의 중합도가 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14인 말토덱스트린 혼합물; 또는 포도당의 중합도가 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13인 말토덱스트린 혼합물;을 C18 칼럼이 장착된 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)로 분리하는 단계;를 포함하는 말토덱스트린의 분리정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)에서 사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액의 농도는 0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 말토덱스트린의 분리정제 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 미반응한 사이클로덱스트린이 알파-사이클로덱스트린인 경우, 알파-사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액의 제거는 1-데카놀(1-decanol)과 미반응한 알파-사이클로덱스트린의 몰 농도가 1:1이 되도록 1-데카놀(1-decanol)을 처리하여 형성된 침전물을 제거하는 것을 특징으로 하는 말토덱스트린의 분리정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 미반응한 사이클로덱스트린이 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린인 경우, 미반응한 베타-사이클로덱스트린 또는 감마-사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액의 제거는 1-헥사데카놀(1-hexadecanol)의 농도가 20%(v/v)이 되도록 감마-사이클로덱스트린을 포함하는 반응 용액에 첨가하여 형성된 침전물을 제거하는 것을 특징으로 하는 말토덱스트린의 분리정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (3) 및 단계 (4) 사이에, 상기 효소반응 산물을 건조 및 분말화하는 단계를 추가하는 것을 특징으로 하는 말토덱스트린의 분리정제 방법.
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