JP7090291B2 - ソホロースの製造方法 - Google Patents
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Description
非特許文献1には、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)に由来するβ-1,2-オリゴグルカンホスホリラーゼをグルコース及びグルコース-1-リン酸に作用させ、ソホロースを製造する方法が開示されている。
特許文献2には、アクレモニウム(Acremonium)属菌に由来するエンド型のβ-1,2-グルカナーゼをβ-1,2-グルカンに作用させ、ソホロースを製造する方法が開示されている。
<1> パラバクテロイデス・ディスタソニス由来のエキソ-β-1,2-グルカナーゼを直鎖β-1,2-グルカンに作用させる工程を含むソホロースの製造方法であって、前記エキソ-β-1,2-グルカナーゼが以下の酵素学的性質を有するソホロースの製造方法。
(i)基質特異性及び作用特性
直鎖β-1,2-グルカンにエキソ的に作用してソホロースを生成する。
(ii)至適pH
30℃の条件下で、pH6.5。
(iii)至適温度
pH6.5の条件下で、40℃。
(iv)安定pH
30℃、1時間の条件下で、pH5.5~10で安定。
(v)温度安定性
pH6.5、1時間の条件下で、30℃まで安定。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号1において1~18番目のアミノ酸残基を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質。
(c)前記(a)又は(b)のアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エキソ-β-1,2-グルカナーゼ活性を有するタンパク質。
(d)前記(a)又は(b)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ、エキソ-β-1,2-グルカナーゼ活性を有するタンパク質。
本明細書において「~」を用いて示された数値範囲は、「~」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
アミノ酸配列の記載は左側がN末端側であり、アミノ酸残基は当分野で周知の1文字表記(例えば、グリシン残基であれば「G」)又は3文字表記(例えば、グリシン残基であれば「Gly」)を用いて表記する。
本実施形態の第1の態様に係るエキソ-β-1,2-グルカナーゼは、直鎖β-1,2-グルカンに作用してソホロースを生成するものである。第1の態様に係るエキソ-β-1,2-グルカナーゼの起源は特に制限されず、いかなる起源であってもよい。一例としては、パラバクテロイデス・ディスタソニス(Parabacteroides distasonis)由来のエキソ-β-1,2-グルカナーゼが挙げられる。
(i)基質特異性及び作用特性
直鎖β-1,2-グルカンにエキソ的に作用してソホロースを生成する。
(ii)至適pH
30℃の条件下で、pH6.5。
(iii)至適温度
pH6.5の条件下で、40℃。
(iv)安定pH
30℃、1時間の条件下で、pH5.5~10で安定。
(v)温度安定性
pH6.5、1時間の条件下で、30℃まで安定。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号1において1~18番目のアミノ酸残基を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質。
(c)上記(a)又は(b)のアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エキソ-β-1,2-グルカナーゼ活性を有するタンパク質。
(d)上記(a)又は(b)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ、エキソ-β-1,2-グルカナーゼ活性を有するタンパク質。
(i)基質特異性及び作用特性
直鎖β-1,2-グルカンにエキソ的に作用してソホロースを生成する。
(ii)至適pH
30℃の条件下で、pH6.5。
(iii)至適温度
pH6.5の条件下で、40℃。
(iv)安定pH
30℃、1時間の条件下で、pH5.5~10で安定。
(v)温度安定性
pH6.5、1時間の条件下で、30℃まで安定。
本実施形態に係るポリヌクレオチドは、上述した第2の態様に係るエキソ-β-1,2-グルカナーゼをコードするものである。
本実施形態に係る発現ベクターは、本実施形態に係るポリヌクレオチドを含むものである。本実施形態に係る発現ベクターは、本実施形態に係るポリヌクレオチドをベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより作製することができる。
本実施形態に係る形質転換体は、本実施形態に係る発現ベクターが導入されたものである。
宿主に発現ベクターを導入する方法としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、DEAEデキストラン法、遺伝子銃法等が挙げられる。
本実施形態に係るエキソ-β-1,2-グルカナーゼの製造方法は、本実施形態に係る形質転換体を培養し、培養物から上述した第2の態様に係るエキソ-β-1,2-グルカナーゼを回収する工程を含むものである。
本実施形態に係るソホロースの製造方法は、本実施形態に係るエキソ-β-1,2-グルカナーゼを直鎖β-1,2-グルカンに作用させる工程を含むものである。
例えば、無機リン酸の存在下、スクロースホスホリラーゼ及びβ-1,2-オリゴグルカンホスホリラーゼをスクロース及びグルコースに作用させることで、直鎖β-1,2-グルカンを得ることができる(K. Abe et al.,J. Appl. Glycosci.,62(2),47-52(2015))。
また、アセトバクター(Acetobacter)属菌の培養上清に含まれる直鎖β-1,2-グルカンをエタノール沈殿により回収し、脱塩することによっても、直鎖β-1,2-グルカンを得ることができる(A. Amemura et al.,J. Gen. Microbiol.,131,301-307(1985))。
まず、リゾビウム・レグミノサルム・トリフォリイ(Rhizobium reguminosarum trifolii)(NBRC(IFO)13338)を500mLの培地(0.5w/v% マンニトール、0.1w/v% 酵母エキス、0.1w/v% MgSO4、0.07w/v% K2HPO4、0.01w/v% KH2PO4)に播種し、25℃で培養した。培地を遠心分離(15000rpm、10分間)して培養上清を回収した後、濃縮した。次いで、アセトンを終濃度30v/v%となるように加えて上清を回収し、さらにアセトンを終濃度90v/v%となるよう加えて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を水に溶解した後、精製イオン交換樹脂(アンバーライトMB-4、オルガノ(株))で脱塩し、ゲル濾過クロマトグラフィー(カラム:XK100(GE Healthcare)、担体:HW-40F(東ソー(株)))に供した。環状β-1,2-グルカンを含む画分を回収し、凍結乾燥して300μLの水に再溶解した。
まず、パラバクテロイデス・ディスタソニス(DSM20701)のゲノムDNA(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)を鋳型として、PCR法によりBDI_3064遺伝子を増幅した。PCR用酵素としては、KOD-Plus-(東洋紡(株))を用いた。フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列は以下のとおりである。塩基配列中の下線部は、制限酵素NdeI及びXhoIの認識部位を示す。
フォワードプライマー:5’-CAGCTTGCATATGGTGGAGAAACCTTAC-3’(配列番号3)
リバースプライマー:5’-GCACTCGAGTTTTATGGATTGAATCTTTTG-3’(配列番号4)
実施例1においてHisTrap FF crudeカラムにより精製した組換えBDI_3064タンパク質を、UnoQカラム(Bio-Rad)により精製した。そして、UnoQカラムにより精製した組換えBDI_3064タンパク質1.0mgを、平衡バッファー(20mM MESバッファー(pH6.5)、150mM NaCl)により平衡化したSuperdex200(Hiload 16/60、GE Healthcare)にアプライし、ゲル濾過クロマトグラフィーにより組換えBDI_3064タンパク質の分子量を測定した。標準タンパク質としては、オボアルブミン(45kDa)、コンアルブミン(75kDa)、アルドラーゼ(158kDa)、フェリチン(440kDa)、及びサイログロブリン(669kDa)を用いた。
平均重合度25の直鎖β-1,2-グルカン及び環状β-1,2-グルカンのそれぞれを基質として、以下のように組換えBDI_3064タンパク質の作用特性を確認した。
組換えBDI_3064タンパク質のpH及び温度プロフィールは、以下のような手順で確認した。まず、組換えBDI_3064タンパク質によりSop4を分解し、分解産物をアーモンド由来β-グルコシダーゼ(オリエンタル酵母工業(株))で分解する。アーモンド由来β-グルコシダーゼは、Sop2にのみ作用しグルコースまで分解するが、重合度nが3以上のSopnには作用しない。このため、組換えBDI_3064タンパク質により生成したSop2のみがグルコースまで分解される。生成したグルコースをGOPOD(グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ)法で定量することにより反応速度を決定し、この反応速度を酵素活性とする。
各種多糖、0.1mg/mL 組換えBDI_3064タンパク質、及び50mM MESバッファー(pH6.5)を混合した反応液を30℃で24時間反応させた後、100℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止させた。多糖としては、平均重合度25の直鎖β-1,2-グルカン、リケナン、ラミナリン、アラビノガラクタン、パキマン、カルボキシメチル化カードラン(CM-カードラン)、カルボキシメチル化パキマン(CM-パキマン)、グルコマンナン、タマリンドキシログルカン、ポリガラクツロン酸、カルボキシメチルセルロース(CM-セルロース)、ヒドロキシエチルセルロース、及びアラビナンを用いた。そして、直鎖β-1,2-グルカンを基質とした場合にはGOPOD法により酵素活性を測定し、その他の多糖を基質とした場合にはPAHBAH(p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド)法により酵素活性を測定した。
まず、0.2w/v% 各種オリゴ糖、0.325mg/mL 組換えBDI_3064タンパク質、及び50mM MESバッファー(pH6.5)を混合した反応液を30℃で反応させた。オリゴ糖としては、Sop3、Sop4、Sop5、Sop6、ラミナリビオース(Lam2)、ラミナリトリオース(Lam3)、ラミナリテトラオース(Lam4)、セロビオース(Cel2)、セロトリオース(Cel3)、セロテトラオース(Cel4)、及びゲンチオビオース(Gen2)を用いた。Sop4、Sop5、Sop6を基質とした場合には、反応開始から0分後、2.5分後、5分後、7.5分後、10分後、15分後、30分後、1時間後に反応液をサンプリングし、各サンプルを100℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止させた。その他のオリゴ糖を基質とした場合には、反応開始から0時間後、1時間後、6時間後、24時間後に反応液をサンプリングし、各サンプルを100℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止させた。
0.25~4.0mMのSop4に対して3.3μg/mLの組換えBDI_3064タンパク質を30℃にて反応させた。分解産物をアーモンド由来β-グルコシダーゼで分解し、生成したグルコースをGOPOD法で定量し、Sop2当量に変換した。反応速度論量は、データ解析プログラム(KaleidaGraph ver.3.51、(株)ヒューリンクス)にて、実験値を下記式(1)のミカエリス-メンテン式にフィッティングすることにより算出した。式(1)中、Kmはミカエリス定数を示し、kcatは触媒活性を示し、[S]は基質濃度を示し、[E]0は全酵素濃度を示す。
まず、0.2w/v% Sop5R又はSop6R、組換えBDI_3064タンパク質、及び50mM MESバッファー(pH6.5)を混合した反応液を30℃で反応させた。組換えBDI_3064タンパク質の濃度は、Sop5Rについては6.5μg/mL、Sop6Rについては33μg/mLとした。反応開始から0分後、2.5分後、5分後、7.5分後、10分後、15分後、30分後、1時間後に反応液をサンプリングし、各サンプルを100℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止させた。
平均重合度25の直鎖β-1,2-グルカンと組換えBDI_3064タンパク質とを反応させた際のソホロースの反応収率を、1.5mLチューブスケール(反応液量1mL)で求めた。
平均重合度25の直鎖β-1,2-グルカンと組換えBDI_3064タンパク質とを500mLスケールで反応させ、ソホロースを製造した。
Claims (3)
- パラバクテロイデス・ディスタソニス由来のエキソ-β-1,2-グルカナーゼを直鎖β-1,2-グルカンに作用させる工程を含むソホロースの製造方法であって、前記エキソ-β-1,2-グルカナーゼが以下の酵素学的性質を有するソホロースの製造方法。
(i)基質特異性及び作用特性
直鎖β-1,2-グルカンにエキソ的に作用してソホロースを生成する。
(ii)至適pH
30℃の条件下で、pH6.5。
(iii)至適温度
pH6.5の条件下で、40℃。
(iv)安定pH
30℃、1時間の条件下で、pH5.5~10で安定。
(v)温度安定性
pH6.5、1時間の条件下で、30℃まで安定。 - 下記(a)~(d)から選択されるいずれか1種であるエキソ-β-1,2-グルカナーゼを直鎖β-1,2-グルカンに作用させる工程を含むソホロースの製造方法。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号1において1~18番目のアミノ酸残基を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質。
(c)前記(a)又は(b)のアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エキソ-β-1,2-グルカナーゼ活性を有するタンパク質。
(d)前記(a)又は(b)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ、エキソ-β-1,2-グルカナーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記エキソ-β-1,2-グルカナーゼがパラバクテロイデス・ディスタソニス由来である請求項2に記載のソホロースの製造方法。
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JP2017082216 | 2017-04-18 | ||
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ABE, Koichi et al.,Biochemical and structural analyses of a bacterial endo-β-1,2-glucanase reveal a new glycoside hydr,Journal of Biological Chemistry,2017年03月07日,Vol.292, No.18,p.7487-7506 |
Conserved hypothetical protein [Parabacteroides distasonis ATCC 8503],Database Genbank, Accession No. ABR44770.1 [online] <URL : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABR4,2014年01月31日 |
REESE, Elwyn T. et al.,β-D-1,2-GLUCANASES IN FUNGI,Canadian Journal of Microbiology,1961年,Vol.7, No.3,p.309-317 |
XU, Jian et al.,Evolution of symbiotic bacteria in the distal human intestine,PLOS BIOLOGY,2007年,Vol.5, No.7,e156 |
田中信清 ほか,新規1,2-β-グルカン分解酵素の単離同定及び機能解析,日本農芸化学会2015年度大会講演要旨集,2015年03月05日,2E32p05 |
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