KR101412717B1

KR101412717B1 - 스트렙토마이세스 시리칼라의 자일로글루카네이즈

Info

Publication number: KR101412717B1
Application number: KR1020120044526A
Authority: KR
Inventors: 홍순광; 지원재; 박다연; 임주현; 장용근
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2014-07-21
Also published as: KR20130121381A

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 시리칼라의 자일로글루카네이즈에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 자일로글루카네이즈 유전자, 이 유전자를 이용하여 자일로글루카네이즈를 생산하기 위한 재조합 벡터, 이 재조합 벡터로 형질전환한 형질전환 미생물 및 이 형질전환 미생물을 배양하여 자일로글루카네이즈를 생산하는 방법에 관한 것이며, 또한 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 자일로글루카네이즈를 이용하여 자일로글루칸을 분해하는 방법 및 자일로글루칸을 분해하여 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 자일로글루칸을 효율적으로 분해할 수 있어 리그노셀룰로오스형 생물자원을 보다 용이하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 이 분해과정을 통해 유용한 올리고당을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터, 형질전환체 또는 자일로글루카네이즈 제조방법을 이용하면 매우 효율적으로 자일로글루카네이즈를 제조할 수 있다.

Description

스트렙토마이세스 시리칼라의 자일로글루카네이즈{Xyloglucanase of Streptomyces coelicolor}

본 발명은 스트렙토마이세스 시리칼라의 자일로글루카네이즈에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 자일로글루카네이즈 유전자, 이 유전자를 이용하여 자일로글루카네이즈를 생산하기 위한 재조합 벡터, 이 재조합 벡터로 형질전환한 형질전환 미생물 및 이 형질전환 미생물을 배양하여 자일로글루카네이즈를 생산하는 방법에 관한 것이며, 또한 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 자일로글루카네이즈를 이용하여 자일로글루칸을 분해하는 방법 및 자일로글루칸을 분해하여 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

자일로글루칸(xyloglucan)은 리그노셀룰로오스(lignocellulose, 목부섬유소)형 생물자원에 많이 존재하는 헤미셀룰로오스(hemicellulose)형 다당류이다. 자세하게는 β-1,4-결합 셀로테트라오스를 주쇄로 하고, 이의 환원말단(reducing end)으로부터 시작하는 3개의 글루코오스(glucosyl) 잔기 중 2-3개 잔기의 6번 탄소가 α-D-자일로오스(xylosyl) 잔기로 치환된 형태이다. 또한, 자일로오스 잔기 중 일부는 갈락토오스(galactosyl), 아라비노오스(arabinosyl) 또는 푸코오스(fucosyl) 잔기로 치환되어 복잡한 구조를 나타낸다.

자일로글루칸 사슬은 서로 교차결합하여 인접 셀룰로오스 미세섬유 사이에 안정한 3차 구조 메트릭스를 제공하기 때문에, 리그노셀룰로오스형 생물자원을 완전히 분해하기 위해서는 자일로글루칸을 제거할 필요가 있다. 이에 기존에 많은 연구자들이 자일로글루칸 분해효소에 대해 연구하였지만, 지금까지 알려진 효소는 적은 수에 불과하다. 이와 관련된 연구 결과에 따르면, 몇 가지 셀룰레이즈(cellulase)가 CMC(carboxymethyl cellulose) 및 보리의 β-글루칸에 대한 주요 활성 뿐만 아니라 자일로글루칸에 대한 가수분해활성을 갖는 것으로 조사되었고, 최근에 몇몇 자일로글루카네이즈가 발견되었으나, 이들은 CMC 및 β-글루칸에 대한 활성이 결여되어 있거나, 낮은 활성을 나타낸다. 이들 자일로글루카네이즈는 GH(glycosidic hydrolase) 패밀리 5, 12 및 74에 속하는 새로운 그룹으로 분류한다.

한편, 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor)는 그람 양성(gram-positive)이며 균사를 형성하는 토양 미생물로, 방선균의 분자생물학적 연구를 위해 가장 많이 연구되는 균주 중 하나이다. 2002년 게놈서열이 분석되고 공개되어 있어(Bentley et al., 2002, Nature) 이 정보를 이용하여 유전자의 기능 및 유전자가 암호화하는 단백질에 관련된 다양한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 많은 유전자의 기능이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다.

본 발명자는 방선균인 스트렙토마이세스 시리칼라로부터 당분해와 관련된 유전자를 발굴하고 이 유전자를 이용하여 유용한 당분해 효소를 효율적으로 생산하기 위하여 연구 노력하였다. 또한 생산된 효소를 이용하여 유용한 올리고당을 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.

이에 스트렙토마이세스 시리칼라의 게놈서열로부터 당분해에 관여 할 것으로 예상되는 유전자들을 탐색하고, 그 중에서 기존에 알려진 셀룰레이즈와 상동성을 보이는 유전자를 선별하였으며, 선별한 유전자 관련 단백질을 효율적으로 생산하기 위한 재조합 벡터를 제조한 다음 이를 도입한 형질전환체를 이용하여 단백질을 생산하였다. 또한, 생산된 단백질의 기능을 분석하고, 효소반응을 최적화시킬 수 있는 방법을 연구하였다.

이의 결과, 본 발명자는 스트렙토마이세스 시리칼라의 SCO6545 유전자가 자일로글루카네이즈를 암호화하고 있다는 것을 밝혔고, 이 자일로글루카네이즈를 효율적으로 생산할 수 있는 재조합 벡터 및 형질전환체를 개발하였으며, 이 자일로글루카네이즈와 자일로글루칸을 효소반응시키면 네 가지 형태의 유용한 올리고당을 제조할 수 있음을 확인하였고, 상기 효소반응을 최적화할 수 있는 조건 또한 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 당분해 관련 유전자의 기능을 밝히고, 이 유전자를 이용하여 유용한 당분해 효소를 제조하는 방법, 이 당분해 효소를 이용하는 방법 및 이 당분해 효소를 이용하여 유용한 올리고당을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 당분해 효소를 효율적으로 생산하기 위한 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터 및 형질전환체를 이용하여 제조한 당분해 효소를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 유전자를 포함하고, 상기 유전자의 전사가 방선균 유래 프로모터에 의해 조절되는 구성으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터를 제공한다.

서열번호 1의 염기서열은 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) A3(2)의 게놈에 존재하는 유전자의 염기서열로 NCBI(미국 국립생물정보센터) 데이터베이스 상에 “SCO6545”로 명명되어 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 암호화한다.

방선균 유래 프로모터에는 sgtR 프로모터(sgtRp), ermE 프로모터(ermEp), tipA 프로모터(tipAp) 등 다양한 프로모터가 존재하므로 본 발명의 재조합 벡터를 제조할 때 이들을 선택하여 사용할 수 있다. 이들 프로모터에 의해 전사가 조절될 수 있도록 구성된 여러 종류의 벡터들이 개발되어 있어, 이 벡터에 SCO6545를 클로닝하면 방선균 유래 프로모터에 의해 전사가 조절되는 구조의 재조합 벡터를 제조할 수 있다.

본 발명의 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터에 있어서, 상기 방선균 유래 프로모터는 ermE 프로모터인 것이 바람직하다. 본 발명에서 확인된 바에 따르면 ermE 프로모터를 사용할 경우 높은 활성을 갖는 자일로글루카네이즈를 효율적으로 제조할 수 있다. ermE 프로모터를 적용하기 위해서 pUWL201pw 벡터를 사용할 수 있다. 이 pUWL201pw 벡터는 도 1에 나타난 바와 같이 MCS(multi cloning site)의 인근에 ermE 프로모터가 위치하고 있어, MCS에 삽입된 유전자의 전사가 ermE 프로모터에 의해 조절되도록 구성되어 있다.

pUWL201pw 벡터를 사용하여 재조합 벡터를 제조할 경우, 도 2로 표시되는 pUWL201pw-SCO6545 재조합 벡터와 같은 형태로 구성하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 자일로글루카네이즈를 생산할 수 있는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 미생물 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 형질전환체를 제조하기 위한 숙주균주로 스트렙토마이세스 시리칼라를 포함한 다양한 종류의 방선균을 사용할 수 있으나, 본 발명에 따르면 이중 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans)를 사용하는 것이 바람직하다.

형질전환체는 숙주균주를 재조합 벡터로 형질전환시켜 제조할 수 있는데, 숙주균주에 따라 형질전환을 위한 방법이 다양하게 존재하므로, 적절한 방법을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 리비던스를 숙주균주로 사용하는 경우 PEG(polyethylene glycol)를 매개로한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 자일로글루카네이즈 제조방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환체를 배양하면 자일로글루카네이즈를 생산할 수 있는데, 이때 형질전환체의 배양조건은 일반적으로 숙주균주에 적합한 조건에 따르는 것이 바람직하며, 재조합 벡터의 선별마커(selection marker) 구성에 따라 형질전환체의 선택적 배양을 위해 항생제 등을 배지에 추가하여 배양하는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주균주로 스트렙토마이세스 리비던스를 사용할 경우 R2YE 배지를 사용하여 20 내지 35℃, 보다 바람직하게는 27 내지 29℃의 온도조건에서 배양하는 것이 바람직하며, pUWL201pw를 이용하여 제조한 재조합 벡터의 경우 티오스트렙톤(thiostrepton) 저항성 유전자가 선별마커로 포함되어 있으므로, 배지에 티오스트렙톤을 첨가하여 배양하면 형질전환체를 선택적으로 배양할 수 있다. 또한 이 경우 배양 1일째 배양액 내 다른 단백질들보다 자일로글루카네이즈의 함량이 가장 높기 때문에, 배양기간을 12 내지 48시간, 보다 바람직하게는 20 내지 28시간으로 하는 것이 바람직하다. 배양배지의 탄소원을 셀룰로오스 또는 자일로글루칸으로 하여 배양할 경우, 자일로글루칸의 생산효율을 높일 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명에 따르면, 상기 자일로글루카네이즈는 세포 외부로 분비되기 때문에 배양액을 수득하여 추가 정제과정을 거치면 고농도로 자일로글루카네이즈를 제조할 수 있다. 정제방법으로는 침전법, 컬럼 크로마토그래피 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 배양액에 황산암모늄을 처리하여 단백질을 농축하고, 겔여과(Gel filtration)를 실시한 다음 자일로글루카네이즈가 포함된 분획을 선택하여 초여과(Ultrafiltration)로 농축하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 자일로글루카네이즈 제조방법으로 제조된 자일로글루카네이즈를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 효소의 효소반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 자일로글루칸(xyloglucan) 분해 방법을 제공한다. 이때 효소는 자일로글루카네이즈이다.

서열번호 2의 아미노산 서열은 시그널 펩티드(signal peptide)가 포함된 형태이다. 이 단백질이 세포 내부에서 발현되었을 때에는 시그널 펩티드가 포함된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 형태로 존재하다가, 세포 외부로 분비되면서 시그널 펩티드가 잘려 서열번호 3의 아미노산 서열을 나타낼 것으로 예상된다. 본 발명에 따르면 서열번호 3의 아미노산 서열 형태에서 자일로글루칸을 분해하는 것을 확인하였으나, 서열번호 2의 아미노산 서열 형태에서도 자일로글루칸을 분해할 것이라 예상된다.

서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 효소는 스트렙토마이세스 시리칼라의 배양액 또는 이 균체를 사용한 통상의 정제방법을 통해 제조할 수 있으나, 본 발명의 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고 배양액으로부터 정제하는 방법을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 이 경우 보다 높은 농도로 또는 많은 양의 단백질을 제조할 수 있다.

효소반응을 유도하기 위해 완충액 상에 효소와 기질을 첨가하는 방법을 사용할 수 있는데, 이때 완충액은 주로 적정 pH 조건을 유지하는 역할을 한다.

본 발명에 따르면, 상기 효소반응은 pH 5 내지 7에서 이루어지는 것이 바람직하며, 40 내지 60℃의 온도조건에서 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 pH 5.5 내지 6.5, 45 내지 55℃의 온도조건에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 자일로글루칸(xyloglucan)을 기질로 하여, 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 효소의 효소반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 XXXG, XXLG, XLXG 및 XLLG 중에서 선택된 올리고당 제조방법을 제공한다.

상기 XXXG, XXLG, XLXG 및 XLLG는 자일로글루칸 올리고당으로, 여기서 X는 α-D-자일로피라노오스-(1→6)-β-D-글루코피라노오스[α-D-xylopyranose-(1→6)-β-D-glucopyranose]이며, L은 β-D-갈락토피라노오스-(1→2)-α-D-자일로피라노오스-(1→6)-β-D-글루코피라노오스[β-D-galactopyranose-(1→2)-α-D-xylopyranose-(1→6)-β-D-glucopyranose]이고, G는 D-글루코피라노오스(D-glucopyranose)를 의미한다. 즉, XXXG(도 12 참조)는 헵타(hepta)-올리고당, XXLG(도 13 참조)와 XLXG(도 14 참조)는 옥타(octa)-올리고당, XLLG(도 15 참조)는 노나(nona)-올리고당이다.

이때 효소반응은 상기 자일로글루칸 분해 방법에서와 동일하게 적용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올리고당 제조방법으로 제조된 올리고당을 제공한다.

본 발명에 따르면, 자일로글루칸을 효율적으로 분해할 수 있어 리그노셀룰로오스형 생물자원을 보다 용이하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 이 분해과정을 통해 유용한 올리고당을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터, 형질전환체 또는 자일로글루카네이즈 제조방법을 이용하면 매우 효율적으로 자일로글루카네이즈를 제조할 수 있다.

도 1은 pUWL201pw 벡터의 지도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 pUWL201pw-SCO6545 재조합 벡터의 지도이다.
도 3의 A는 제조된 pUWL201pw-SCO6545 재조합 벡터를 NdeI 및 HindIII 제한효소로 처리한 후 전기영동하여 나타낸 사진이다.
도 3의 B는 pUWL201pw-SCO6545 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스 TK24를 형질전환하여 제조한 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 전기영동하여 나타낸 사진이다.
도 4는 형질전환체 배양액의 농축액(A)과 균체 파쇄 후 상등액(B)을 SDS-PAGE로 분석하여 나타낸 사진이다. M : 단백질 분자량 마커, p* : pUWL201pw 형질전환체(대조군), 5 : pUWL201pw-SCO6545 형질전환체.
도 5는 본 발명 자일로글루카네이즈(SCO6545 단백질)의 아비셀에 대한 친화력을 실험하여 나타낸 SDS-PAGE 사진이다. 1 : 형질전환체 배양액을 황산암모늄 침전한 다음 완충액으로 투석한 단백질 샘플, 2 : 1의 단백질 샘플과 아비셀을 혼합한 다음 원심분리하여 수득한 상등액 샘플, 3 : 2에서 수득한 침전물을 세척한 다음 1M NaCl이 포함된 완충액을 첨가한 후 원심분리하여 수득한 상등액 샘플, 4 : 3에서 수득한 침전물에 멸균수를 첨가한 후 원심분리하여 수득한 상등액 샘플, 5 : 4에서 수득한 침전물에 8M 우레아를 첨가한 후 원심분리하여 수득한 샘플.
도 6의 A는 배양 후 24시간 간격으로 샘플링한 형질전환체 배양액 내의 균체 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6의 B는 배양 후 24시간 간격으로 샘플링한 형질전환체 배양액 내의 단백질량을 브래드포드 방법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6의 C는 배양 후 24시간 간격으로 샘플링한 형질전환체 배양액 내에서 세포외부로 분비된 단백질의 양을 확인하기 위한 SDS-PAGE 사진이다.
도 7의 A는 본 발명의 자일로글루카네이즈를 정제하는 과정에서 겔여과 과정의 단백질 용출 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 7의 B는 정제된 자일로글루카네이즈의 SDS-PAGE 사진이다. M : 단백질 분자량 마커, 1 : pUWL201pw 형질전환체(대조군) 배양액, 2 : pUWL201pw-SCO6545 형질전환체 배양액, 3 : 정제된 자일로글루카네이즈.
도 8은 정제된 자일로글루카네이즈의 자일로글루카네이즈 활성 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 9의 A는 정제된 자일로글루카네이즈를 다양한 기질과 효소반응시킨 후 생성된 환원당을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9의 B는 정제된 자일로글루카네이즈를 다양한 기질과 효소반응시킨 후 TLC를 수행한 결과를 나타내는 사진이다. S : 마커, C2 : 셀로비오스(cellobiose), C3 : 셀로트리오스(cellotriose), C4 : 셀로테트라오스(cellotetraose), C5 : 셀로펜타오스(cellopentaose), C6 : 셀로헥사오스(cellohexaose).
도 9의 C는 형질전환체를 자일로글루칸을 단일 탄소원으로 하는 최소배지에서 배양한 다음 콩고레드 용액으로 염색하여 나타낸 사진이다.
도 10의 A는 본 발명 자일로글루카네이즈의 온도별 효소활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10의 B는 본 발명 자일로글루카네이즈의 pH별 효소활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10의 C는 50℃의 온도조건에서 10분 간격으로 본 발명 자일로글루카네이즈의 효소활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10의 D는 60℃의 온도조건에서 10분 간격으로 본 발명 자일로글루카네이즈의 효소활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10의 E는 50℃, pH6의 조건에서 본 발명 자일로글루카네이즈의 효소반응속도(enzyme kinetics)를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 10의 F는 효소반응속도 분석 결과를 바탕으로 작성한 라인위버-버크 그래프이다.
도 11의 A는 금속이온에 따른 본 발명 자일로글루카네이즈의 효소활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11의 B는 본 발명 자일로글루카네이즈의 효소반응 시간에 따른 반응액의 액화정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 XXXG 자일로글루칸 올리고당의 화학구조이다.
도 13은 XXLG 자일로글루칸 올리고당의 화학구조이다.
도 14는 XLXG 자일로글루칸 올리고당의 화학구조이다.
도 15는 XLLG 자일로글루칸 올리고당의 화학구조이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 재조합 벡터 제조

중합효소연쇄반응(PCR) 과정에서 발생할 수 있는 에러(error) 확률을 줄이기 위해 SCO6545 유전자를 두 부분으로 나누어 클로닝하였다.

먼저 S. coelicolor A3(2)의 염색체 DNA를 주형으로 하고 표 1의 6545-F 및 6545-1-R 프라이머 세트와 6545-2-F 및 6545-R 프라이머 세트를 사용한 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 각각 약 1.8kb와 약 1.1kb 크기의 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하여 각각 pGEM-6545(1)과 pGEM-6545(2)를 제작하였다. 제작된 벡터의 염기서열을 분석하여 PCR 에러 유무를 확인하였고 성공적으로 클로닝된 것을 확인하였다.

프라이머	길이(mer)	서열(5'→3')	제한효소
6545-F	28	GCGAGTCCGAATTCGACTCCGACACCGG	EcoRI
6545-1-R	27	CGCAGATCTTCCGCTCGACGGACAGCG	BglII
6545-2-F	27	CGCTGTCCGTCGAGCGGAAGATCTGCG	BglII
6545-R	28	CCCCCATATGCGAAGAACCCGGATCCTC	NdeI

제조된 pEGM-6545(1) 및 pGEM-6545(2) 벡터를 이용하여 SCO6545 유전자를 방선균용 벡터이며 ermE 프로모터(ermEp)를 보유하고 있는 pUWL201pw 벡터(도 1 참조)에 클로닝하였다.

pEGM-6545(1)은 EcoRI와 BglII 제한효소로 처리하고, pGEM-6545(2)는 BglII와 NdeI 제한효소로 처리한 다음, 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하고 DNA 추출 키트(Gel extraction kit, 다인바이오, 한국)를 사용하여 절단된 각각의 삽입(insert) DNA를 회수하였다. 두 종류의 각 삽입(insert) DNA를 세 단편 결찰(3 fragment ligation) 방법을 이용하여 NdeI과 EcoRI으로 절단된 pUWL201pw 벡터에 삽입함으로써 pUWL201pw-SCO6545 재조합 벡터(도 2 참조)를 제작하였다.

제작된 재조합 벡터를 NdeI과 EcoRI 제한효소 절단하고, 전기영동하여 SCO6545 유전자의 삽입여부를 확인한 결과, SCO6545 유전자가 성공적으로 삽입되어 있음이 확인되었다(도 3의 A 참조).

실시예 2. 형질전환체 제조

PEG 형질전환방법을 사용하여 상기 실시예 1에서 제조된 pUWL201pw-SCO6545 재조합 벡터로 S. lividans TK24를 형질전환시켜 형질전환체(SCO6545 형질전환체)를 제조하였다.

형질전환체로부터 플라스미드 DNA 추출 키트(Plasmid mini-prep kit, 다인바오, 한국)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고 전기영동하여 형질전환 유무를 확인한 결과, pUWL201pw-SCO6545가 성공적으로 도입되었음이 확인되었다(도 3의 B 참조).

또한, 대조군으로 사용하기 위해 pUWL201pw 벡터(SCO6545가 삽입되지 않은 상태)를 이용하여 동일한 방법으로 형질전환체를 제조하였다.

실시예 3. SCO6545 단백질( 자일로글루카네이즈 ) 제조

상기 실시예 2에서 제조한 각 형질전환체를 각각 R2YE 액체배지에서 4일간 배양한 다음 각 균체배양액을 원심분리하여 상등액과 균체로 분리하였다. 균체가 제거된 배양액은 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 단백질만을 침전시켜 샘플을 준비하였고, 균체는 20mM Tris-Cl(pH7.0) 완충용액(buffer)으로 두 번 세척한 다음 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고 원심분리하여 상등액만을 샘플로 준비하였다.

SDS-PAGE 분석을 실시하여 상기 각 샘플의 단백질을 분석하였다.

이의 결과, pUWL201pw-SCO6545 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 과발현되어 세포외부로 분비되는 단백질(SCO6545 단백질)을 확인할 수 있었다. 이 단백질은 93.2kDa의 분자량을 갖는 것으로 예상되는데, 실제로 SDS-PAGE 결과 예상분자량과 일치하는 것으로 나타났다(도 4 참조).

실시예 4. SCO6545 단백질의 아비셀(Avicel)에 대한 친화력( affinity ) 테스트

아비셀(Avicel)을 기질로 하는 엑소-글루카네이즈(exo-glucanase) 활성은 셀룰레이즈(cellulase)의 다양한 활성 중 하나이다. 이러한 특성을 이용하여 SCO6545 단백질의 특성을 알아보았다.

상기 실시예 2에서 제조한 각 형질전환체를 R2YE 액체배지에서 4일간 진탕배양한 후 원심분리하여 상등액만을 취하였고 이를 75% 황산암모늄(Ammonium sulfate)으로 농축하였다. 농축된 단백질을 20mM Tris-Cl(pH7.0) 완충액에 현탁한 다음, 같은 완충액으로 12시간 투석을 실시하여 염(salt)을 제거하였다. 투석된 단백질을 아비셀과 섞어 4℃에서 12시간 방치한 후 원심분리하여 상등액(완충액층)과 침전물(아비셀-단백질 복합체)로 나누었다. 상등액을 제거한 침전물을 같은 완충액으로 3회 세척하여 비특이적으로 결합한 단백질들을 제거하였다. 또한 1M NaCl이 함유된 완충액을 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 제거함으로써 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하였다. 침전물에 다시 멸균수를 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 취하고 침전물에는 8M 우레아(Urea)를 첨가하고 다시 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 각각의 단계에서 제거된 단백질들과 마지막 단계에서 수득된 단백질을 각각 SDS-PAGE로 분석하였다. 이의 결과 제조된 단백질이 아비셀과 높은 친화도를 갖는 것으로 나타났다(도 5 참조).

실시예 5. 형질전환체의 성장 정도에 따른 SCO6545 단백질의 생산 효율

상기 실시예 2에서 제조한 각 형질전환체를 단일 탄소원으로 셀룰로오스(cellulose)가 포함된 R2YE 액체배지에서 28℃, 200rpm의 조건으로 진탕배양하였고, 배양 중 24시간 간격으로 10㎖씩 샘플링한 다음 원심분리하여 균체와 상등액으로 분리하였다. 상등액이 완전히 제거된 균체는 무게를 측정하여 성장곡선을 그리는데 사용하였다. 회수된 상등액에는 TCA(Trichloroacetic acid)를 10%가 되도록 첨가하고 얼음 상에서 30분간 방치한 후 원심분리하여 단백질 침전물을 회수하였다. 단백질 침전물을 100mM Tris-Cl(pH8.0) 완충액으로 재현탁하여 10% SDS-PAGE에서 전기영동함으로써 발현량을 확인하였다. 또한 세포외 단백질량을 결정하기 위해 브래드포드(Bradford) 방법으로 595nm의 파장에서 OD값을 측정하였다. SCO6545 형질전환체는 배양 3일째 정체기(stationary phase)로 접어들어 배양 4일째까지 유지되다가 배양 5일째부터 성장이 감소되었다. 벡터만 도입된 형질전환체와 비교하여 균체량이 약 2배정도 증가된 것으로 관찰되었다. 배양액 내 단백질은 천천히 증가하여 배양 4일째 가장 높은 값을 보였고 천천히 감소하는 것으로 관찰되었다. 배양액 내 고발현된 SCO6545 단백질은 배양초기부터 급격히 증가되어 발현되고 배양후기에도 발현량이 유지되었다. 배양 1일째 배양액 내 다른 단백질들보다 SCO6545 단백질의 함량이 가장 높은 것으로 관찰되어 차후에 SCO6545 단백질 정제를 위한 배양은 같은 조건하에서 1일까지만 배양하여 사용하기로 하였다(도 6 참조).

실시예 6. SCO6545 단백질( 자일로글루카네이즈 )의 정제

SCO6545 단백질을 정제하기 위해서, 우선 상기 실시예 2에서 제조한 SCO6545 형질전환체를 단일 탄소원으로 셀룰로오스가 포함된 R2YE 액체배지에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 취하였다. 최종농도 75%가 되도록 황산암모늄을 처리하여 단백질 농축을 실시한 후 3×인산완충액(Phosphate buffered saline, PBS, pH7.4)으로 탈염하였다(overnight). 겔여과(Gel filtration)는 슈퍼덱스(Superdex) 200 HR(10/30) 컬럼(column)을 사용하였고 3×PBS 완충액과 0.5㎖/분의 유속 조건에서 수행하였다(도 7의 A 참조). 각각의 분획(fraction)은 10% SDS-PAGE를 실시하여 단백질 양상을 파악하였고, SCO6545 단백질이 포함된 분획만을 선택하여 혼합한 다음 초여과(Ultrafiltration)로 농축하였다.

상기 각 정제 단계 이후에 수득한 단백질의 농도, 활성 및 수율 등은 표 2와 같다.

정제한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며(도 7의 B 참조), 자일로글루칸이 함유된 플레이트 상 페이퍼 디스크 분산 방법으로 자일로글루카네이즈 활성을 측정하였다(도 8 참조).

단백질 샘플	부피 (㎖)	총단백질량 (㎎)	활성 (units/㎖)	총활성 (units)	특수 활성 (units/㎎)	정제 배수	수율 (%)
상등액	250	32.75	100	25000	763	1	100
황산암모늄 침전	7	5.411	2777	19439	3592	4.7	77.7
겔여과	6	0.12	690	4140	34500	45.2	16.5

실시예 7. SCO6545 단백질( 자일로글루카네이즈 )의 효소적 특성

상기 실시예 6에서 정제한 SCO6545 단백질을 CMC(Carboxyl methyl cellulose), 아비셀, 갈락탄(Galactan), 베타-글루칸(beta-glucan), 자일로글루칸(xyloglucan) 등의 기질과 1시간동안 40℃에서 효소반응한 후 유리되는 환원당(reducing sugar)을 측정(흡광도 측정)하여 각각의 기질에 대한 반응을 관찰하였다.

이의 결과, 자일로글루칸에 대해서 가장 높은 효소활성을 나타내었다(도 9의 A 참조). 또한 셀룰로오스형 기질(Glucose, cellobiose, cellotriose, cellotetrose, cellopentaose, cellohexoase)을 사용하여 효소반응 후 박층크로마토그래피(Thin layer chromatography)를 실시하여 분석하였으나 분해산물이 확인되지 않았다(도 9의 B 참조).

상기 실시예 2에서 제조한 각 형질전환체를 단일 탄소원으로 0.3% 자일로글루칸이 포함된 최소 고체배지에서 28℃의 배양조건으로 3일 동안 배양한 다음 0.2% 콩고 레드(congo red) 용액으로 염색한 후 1M NaCl 용액으로 탈염색하여 자일로글루카네이즈(xyloglucanase) 활성을 측정하였다. 벡터만 도입된 형질전환체에서는 활성이 관찰되지 않는 반면에 SCO6545 형질전환체에서는 콜로니 주변에 배양 2일째부터 강한 자일로글루카네이즈 활성이 관찰되었다(도 9의 C 참조).

SCO6545 단백질의 최적 pH 조건을 알아보기 위해서, 정제된 단백질을 pH4부터 pH11의 조건(pH4-5, Citrate buffer; pH6-8, potassium phosphate buffer; pH9-11, Glycin-NaOH buffer)에서 자일로글루칸을 기질로 하여 효소활성을 측정하였다. 이의 결과, pH6의 조건에서 가장 높은 효소활성이 관찰되었다(도 10의 B 참조).

SCO6545 단백질의 최적 효소반응 온도를 알아보기 위해서, 20℃에서 90℃까지의 온도조건에서 각각의 활성을 측정한 결과, 50℃에서 가장 높은 효소활성이 관찰되었다(도 10의 A 참조). 또한 50℃와 60℃에서의 온도 안정성을 측정한 결과, 50℃에서는 효소반응이 진행됨에 따라서 느린 속도로 효소활성이 감소하는 반면, 60℃에서는 반응 10분경과 후 급속히 효소활성이 감소하는 것으로 관찰되었다(도 10의 C 및 D 참조).

따라서 SCO6545 단백질의 효소반응은 pH6과 50℃에서 최적임을 알 수 있었다.

금속이온(metal ion)이 SCO6545 단백질의 효소활성에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 2가 양이온인 Ca² ⁺, Co² ⁺, Cu² ⁺, Ni² ⁺, Mg² ⁺, Zn² ⁺과 1가 양이온인 Na⁺ 그리고 킬레이트제(chelating reagent)인 EDTA를 첨가한 완충액 상에서 효소활성을 측정하였다. 그 결과, Co² ⁺와 EDTA의 첨가에 의해서 각각 21%와 13% 활성의 감소가 관찰되었다. 그 외의 금속이온들에 대해서는 큰 영향이 나타나지 않았다. 또한 효소반응 시간에 따른 반응액의 액화 정도를 측정하였다(도 11 참조).

50℃, pH6의 조건 하에서 수행된 효소반응속도(enzyme kinetics) 분석 결과, Km, Vmax, Kcat은 각각 0.57㎎/㎖, 35.2μmol/min, 196sec^- ¹으로 관찰되었다(도 10의 E 및 F 참조).

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> Xyloglucanase of Streptomyces coelicolor <130> PA120309-C01 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2673 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 1 gtgcgaagaa cccggatcct caccgtgctg ctggccctcg cggccggtct gctggcgggc 60 agtccgcccg cggcgtcggc cgccgagccg gcgccgcggg cggccgtcgc cgccgacagc 120 tacacctgga agaacgcccg catcgacggc ggcggtttcg tccccggcat cgtcttcaac 180 cggaccgaga aggacctggc ctacgcccgc accgacatcg gaggcgccta ccgctggcag 240 gaggagtccc acacctggac gccgctcctc gaccacgtcg gctgggacga ctgggggcac 300 acgggcgtgg tcgctctcgc ctccgacgcc gtcgatccgg accgggtcta cgcggcggtc 360 ggcacgtaca ccaacgactg ggacccgacc aacggcgcgg tgctgcgctc cgccgaccgg 420 ggtgcgagct gggagaaggc ggacctgccg ttcaagctgg gcggcaacat gcccggccgc 480 ggcatgggtg agcgcctggc cgtcgacccg cacgacaacg acgtgctgta cctgggcgcc 540 cccagcggcc acggactgtg gcggtccacc gacgcgggcg tcacctggtc cgaggtgacg 600 gccttcccga accccgggaa ctacgcgcag gacccgaacg acacgtccgg ctacgcctcc 660 gacaaccagg gcatcacctg ggtcaccttc gacgagtcga cgggcggcgg cgcgggcacg 720 gccacgcgga ccctctacgt cggggtcgcg gacaaggaga acgccgtcta ccgctcgacc 780 gacgcgggcg cgacctggga gcggctcgcc gggcagccga cgggttacct ggcccacaag 840 ggtgtgctgg acgcggagaa cggctacctg tacctcgcct acagcgacac cggcggcccg 900 tacgacggcg gcaagggccg gctgtaccgg tacgcgacgg cgaccggcac ctggacggac 960 atcagcccgg ccgcggaggc ggacacctac tacggcttca gcggcctgac cgtcgaccgg 1020 cagcggccgg ggacggtgat ggcgaccgcg tacagctcgt ggtggccgga cacgcagatc 1080 ttccgctcga cggacagcgg cgcgacatgg tcccaggcgt ggagctacac ctcgtacccg 1140 gaccgcgaga accgctacac gatggacgtc tcctcgtccc cctggctcac ctggggcgcg 1200 aacccggcgc cgcccgagca gaccccgaag ctgggctgga tgacggaggc tctggagatc 1260 gacccgttcg actcggaccg gatgatgtac ggcacgggcg ccacggtcta cggcacggag 1320 aacctgacga actgggacga cgagggcggc acgttcgccg tcgagccgat ggtgcggggc 1380 ctggaggaga cggccgtcaa cgacctggcc tcccccccgt cgggtgcccc gctgctcagc 1440 gccctgggtg acgtcggcgg cttccggcac accagcctga ccgaggtccc gtcgatgatg 1500 tacacctcgc cgaacttcac ctcgacgacg agcctggact tcgcggagac gaagccggac 1560 gtcgtggtcc gggcgggcaa tctcgactcc ggtccgcaca tcgcgttctc cacggacaac 1620 ggcgccaact ggttcggcgg caccgacccg tccggggtga gcggcggcgg cacggtcgcg 1680 gcgggcgcgg acggcagccg cttcgtgtgg agcccggagg gtgccggcgt gcagtacacg 1740 accggcttcg gtacgtcctg gcaggcgtcg accggcctcc cggcgggcgc gatcgtcgag 1800 tcggaccggg tgaaccccgc gaccttctac ggcttcaagt ccgggaggtt ctacgtcagt 1860 acggacggcg gcgcgacctt caccgcctcg gccgcgaccg ggctgcccgc cggtgacggc 1920 gtccgcttca aggcgctgcc gggcggggag ggcgacgtct ggctggccgg cggggcggcg 1980 gacggcccgt acggcctgtg gcactcgacg gacggcggcg ggaccttcac caggctgccc 2040 ggtgtcgacg cggcggacac cgtcggcttc ggcaaggcgg ccccgggagc gtcgtaccag 2100 accctcttca ccagcgcgga gatcggcggg gtgcgcggca tcttccgctc caccgacgcg 2160 ggcgcgacct ggacccgggt caacgacgac gcccaccagt ggggctggac cggcgccgcc 2220 atcaccggcg acccgcgggt ctacggccgg gtgtacgtgg cgaccaacgg ccgcggcgtg 2280 atctacggcg acacctcgga cacgggcggg ggcaccgatc cgggtcccgg acccgacccc 2340 acccccaccg gcgcctgcga ggtgacgtac acggtcacga accagtggcc gggcggcttc 2400 caggcggacg tccgcctcac caacaccggc acgtcggcct ggaacggctg gtccctcgac 2460 tggtccttcc ccggcggcca ggaggtgacc cggatgtgga acgccgagca cacccaggcc 2520 ggtacgtcgg tgacggcgag gaacgtcggc tggaacgccg gtgtggcccc cggtgcctcg 2580 gtcggcttcg ggttcaccgg gagccggtcg gggaccaacg cggaaccgga ggggttcgcc 2640 gtcgccggac gcgcgtgccc gaccgctacg tga 2673 <210> 2 <211> 890 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 2 Met Arg Arg Thr Arg Ile Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gly Ser Pro Pro Ala Ala Ser Ala Ala Glu Pro Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Val Ala Ala Asp Ser Tyr Thr Trp Lys Asn Ala Arg Ile 35 40 45 Asp Gly Gly Gly Phe Val Pro Gly Ile Val Phe Asn Arg Thr Glu Lys 50 55 60 Asp Leu Ala Tyr Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Gln 65 70 75 80 Glu Glu Ser His Thr Trp Thr Pro Leu Leu Asp His Val Gly Trp Asp 85 90 95 Asp Trp Gly His Thr Gly Val Val Ala Leu Ala Ser Asp Ala Val Asp 100 105 110 Pro Asp Arg Val Tyr Ala Ala Val Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Trp Asp 115 120 125 Pro Thr Asn Gly Ala Val Leu Arg Ser Ala Asp Arg Gly Ala Ser Trp 130 135 140 Glu Lys Ala Asp Leu Pro Phe Lys Leu Gly Gly Asn Met Pro Gly Arg 145 150 155 160 Gly Met Gly Glu Arg Leu Ala Val Asp Pro His Asp Asn Asp Val Leu 165 170 175 Tyr Leu Gly Ala Pro Ser Gly His Gly Leu Trp Arg Ser Thr Asp Ala 180 185 190 Gly Val Thr Trp Ser Glu Val Thr Ala Phe Pro Asn Pro Gly Asn Tyr 195 200 205 Ala Gln Asp Pro Asn Asp Thr Ser Gly Tyr Ala Ser Asp Asn Gln Gly 210 215 220 Ile Thr Trp Val Thr Phe Asp Glu Ser Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240 Ala Thr Arg Thr Leu Tyr Val Gly Val Ala Asp Lys Glu Asn Ala Val 245 250 255 Tyr Arg Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp Glu Arg Leu Ala Gly Gln 260 265 270 Pro Thr Gly Tyr Leu Ala His Lys Gly Val Leu Asp Ala Glu Asn Gly 275 280 285 Tyr Leu Tyr Leu Ala Tyr Ser Asp Thr Gly Gly Pro Tyr Asp Gly Gly 290 295 300 Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Tyr Ala Thr Ala Thr Gly Thr Trp Thr Asp 305 310 315 320 Ile Ser Pro Ala Ala Glu Ala Asp Thr Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Leu 325 330 335 Thr Val Asp Arg Gln Arg Pro Gly Thr Val Met Ala Thr Ala Tyr Ser 340 345 350 Ser Trp Trp Pro Asp Thr Gln Ile Phe Arg Ser Thr Asp Ser Gly Ala 355 360 365 Thr Trp Ser Gln Ala Trp Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Arg Glu Asn 370 375 380 Arg Tyr Thr Met Asp Val Ser Ser Ser Pro Trp Leu Thr Trp Gly Ala 385 390 395 400 Asn Pro Ala Pro Pro Glu Gln Thr Pro Lys Leu Gly Trp Met Thr Glu 405 410 415 Ala Leu Glu Ile Asp Pro Phe Asp Ser Asp Arg Met Met Tyr Gly Thr 420 425 430 Gly Ala Thr Val Tyr Gly Thr Glu Asn Leu Thr Asn Trp Asp Asp Glu 435 440 445 Gly Gly Thr Phe Ala Val Glu Pro Met Val Arg Gly Leu Glu Glu Thr 450 455 460 Ala Val Asn Asp Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gly Ala Pro Leu Leu Ser 465 470 475 480 Ala Leu Gly Asp Val Gly Gly Phe Arg His Thr Ser Leu Thr Glu Val 485 490 495 Pro Ser Met Met Tyr Thr Ser Pro Asn Phe Thr Ser Thr Thr Ser Leu 500 505 510 Asp Phe Ala Glu Thr Lys Pro Asp Val Val Val Arg Ala Gly Asn Leu 515 520 525 Asp Ser Gly Pro His Ile Ala Phe Ser Thr Asp Asn Gly Ala Asn Trp 530 535 540 Phe Gly Gly Thr Asp Pro Ser Gly Val Ser Gly Gly Gly Thr Val Ala 545 550 555 560 Ala Gly Ala Asp Gly Ser Arg Phe Val Trp Ser Pro Glu Gly Ala Gly 565 570 575 Val Gln Tyr Thr Thr Gly Phe Gly Thr Ser Trp Gln Ala Ser Thr Gly 580 585 590 Leu Pro Ala Gly Ala Ile Val Glu Ser Asp Arg Val Asn Pro Ala Thr 595 600 605 Phe Tyr Gly Phe Lys Ser Gly Arg Phe Tyr Val Ser Thr Asp Gly Gly 610 615 620 Ala Thr Phe Thr Ala Ser Ala Ala Thr Gly Leu Pro Ala Gly Asp Gly 625 630 635 640 Val Arg Phe Lys Ala Leu Pro Gly Gly Glu Gly Asp Val Trp Leu Ala 645 650 655 Gly Gly Ala Ala Asp Gly Pro Tyr Gly Leu Trp His Ser Thr Asp Gly 660 665 670 Gly Gly Thr Phe Thr Arg Leu Pro Gly Val Asp Ala Ala Asp Thr Val 675 680 685 Gly Phe Gly Lys Ala Ala Pro Gly Ala Ser Tyr Gln Thr Leu Phe Thr 690 695 700 Ser Ala Glu Ile Gly Gly Val Arg Gly Ile Phe Arg Ser Thr Asp Ala 705 710 715 720 Gly Ala Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Asp Ala His Gln Trp Gly Trp 725 730 735 Thr Gly Ala Ala Ile Thr Gly Asp Pro Arg Val Tyr Gly Arg Val Tyr 740 745 750 Val Ala Thr Asn Gly Arg Gly Val Ile Tyr Gly Asp Thr Ser Asp Thr 755 760 765 Gly Gly Gly Thr Asp Pro Gly Pro Gly Pro Asp Pro Thr Pro Thr Gly 770 775 780 Ala Cys Glu Val Thr Tyr Thr Val Thr Asn Gln Trp Pro Gly Gly Phe 785 790 795 800 Gln Ala Asp Val Arg Leu Thr Asn Thr Gly Thr Ser Ala Trp Asn Gly 805 810 815 Trp Ser Leu Asp Trp Ser Phe Pro Gly Gly Gln Glu Val Thr Arg Met 820 825 830 Trp Asn Ala Glu His Thr Gln Ala Gly Thr Ser Val Thr Ala Arg Asn 835 840 845 Val Gly Trp Asn Ala Gly Val Ala Pro Gly Ala Ser Val Gly Phe Gly 850 855 860 Phe Thr Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asn Ala Glu Pro Glu Gly Phe Ala 865 870 875 880 Val Ala Gly Arg Ala Cys Pro Thr Ala Thr 885 890 <210> 3 <211> 863 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 3 Ala Glu Pro Ala Pro Arg Ala Ala Val Ala Ala Asp Ser Tyr Thr Trp 1 5 10 15 Lys Asn Ala Arg Ile Asp Gly Gly Gly Phe Val Pro Gly Ile Val Phe 20 25 30 Asn Arg Thr Glu Lys Asp Leu Ala Tyr Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly 35 40 45 Ala Tyr Arg Trp Gln Glu Glu Ser His Thr Trp Thr Pro Leu Leu Asp 50 55 60 His Val Gly Trp Asp Asp Trp Gly His Thr Gly Val Val Ala Leu Ala 65 70 75 80 Ser Asp Ala Val Asp Pro Asp Arg Val Tyr Ala Ala Val Gly Thr Tyr 85 90 95 Thr Asn Asp Trp Asp Pro Thr Asn Gly Ala Val Leu Arg Ser Ala Asp 100 105 110 Arg Gly Ala Ser Trp Glu Lys Ala Asp Leu Pro Phe Lys Leu Gly Gly 115 120 125 Asn Met Pro Gly Arg Gly Met Gly Glu Arg Leu Ala Val Asp Pro His 130 135 140 Asp Asn Asp Val Leu Tyr Leu Gly Ala Pro Ser Gly His Gly Leu Trp 145 150 155 160 Arg Ser Thr Asp Ala Gly Val Thr Trp Ser Glu Val Thr Ala Phe Pro 165 170 175 Asn Pro Gly Asn Tyr Ala Gln Asp Pro Asn Asp Thr Ser Gly Tyr Ala 180 185 190 Ser Asp Asn Gln Gly Ile Thr Trp Val Thr Phe Asp Glu Ser Thr Gly 195 200 205 Gly Gly Ala Gly Thr Ala Thr Arg Thr Leu Tyr Val Gly Val Ala Asp 210 215 220 Lys Glu Asn Ala Val Tyr Arg Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp Glu 225 230 235 240 Arg Leu Ala Gly Gln Pro Thr Gly Tyr Leu Ala His Lys Gly Val Leu 245 250 255 Asp Ala Glu Asn Gly Tyr Leu Tyr Leu Ala Tyr Ser Asp Thr Gly Gly 260 265 270 Pro Tyr Asp Gly Gly Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Tyr Ala Thr Ala Thr 275 280 285 Gly Thr Trp Thr Asp Ile Ser Pro Ala Ala Glu Ala Asp Thr Tyr Tyr 290 295 300 Gly Phe Ser Gly Leu Thr Val Asp Arg Gln Arg Pro Gly Thr Val Met 305 310 315 320 Ala Thr Ala Tyr Ser Ser Trp Trp Pro Asp Thr Gln Ile Phe Arg Ser 325 330 335 Thr Asp Ser Gly Ala Thr Trp Ser Gln Ala Trp Ser Tyr Thr Ser Tyr 340 345 350 Pro Asp Arg Glu Asn Arg Tyr Thr Met Asp Val Ser Ser Ser Pro Trp 355 360 365 Leu Thr Trp Gly Ala Asn Pro Ala Pro Pro Glu Gln Thr Pro Lys Leu 370 375 380 Gly Trp Met Thr Glu Ala Leu Glu Ile Asp Pro Phe Asp Ser Asp Arg 385 390 395 400 Met Met Tyr Gly Thr Gly Ala Thr Val Tyr Gly Thr Glu Asn Leu Thr 405 410 415 Asn Trp Asp Asp Glu Gly Gly Thr Phe Ala Val Glu Pro Met Val Arg 420 425 430 Gly Leu Glu Glu Thr Ala Val Asn Asp Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gly 435 440 445 Ala Pro Leu Leu Ser Ala Leu Gly Asp Val Gly Gly Phe Arg His Thr 450 455 460 Ser Leu Thr Glu Val Pro Ser Met Met Tyr Thr Ser Pro Asn Phe Thr 465 470 475 480 Ser Thr Thr Ser Leu Asp Phe Ala Glu Thr Lys Pro Asp Val Val Val 485 490 495 Arg Ala Gly Asn Leu Asp Ser Gly Pro His Ile Ala Phe Ser Thr Asp 500 505 510 Asn Gly Ala Asn Trp Phe Gly Gly Thr Asp Pro Ser Gly Val Ser Gly 515 520 525 Gly Gly Thr Val Ala Ala Gly Ala Asp Gly Ser Arg Phe Val Trp Ser 530 535 540 Pro Glu Gly Ala Gly Val Gln Tyr Thr Thr Gly Phe Gly Thr Ser Trp 545 550 555 560 Gln Ala Ser Thr Gly Leu Pro Ala Gly Ala Ile Val Glu Ser Asp Arg 565 570 575 Val Asn Pro Ala Thr Phe Tyr Gly Phe Lys Ser Gly Arg Phe Tyr Val 580 585 590 Ser Thr Asp Gly Gly Ala Thr Phe Thr Ala Ser Ala Ala Thr Gly Leu 595 600 605 Pro Ala Gly Asp Gly Val Arg Phe Lys Ala Leu Pro Gly Gly Glu Gly 610 615 620 Asp Val Trp Leu Ala Gly Gly Ala Ala Asp Gly Pro Tyr Gly Leu Trp 625 630 635 640 His Ser Thr Asp Gly Gly Gly Thr Phe Thr Arg Leu Pro Gly Val Asp 645 650 655 Ala Ala Asp Thr Val Gly Phe Gly Lys Ala Ala Pro Gly Ala Ser Tyr 660 665 670 Gln Thr Leu Phe Thr Ser Ala Glu Ile Gly Gly Val Arg Gly Ile Phe 675 680 685 Arg Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Asp Ala 690 695 700 His Gln Trp Gly Trp Thr Gly Ala Ala Ile Thr Gly Asp Pro Arg Val 705 710 715 720 Tyr Gly Arg Val Tyr Val Ala Thr Asn Gly Arg Gly Val Ile Tyr Gly 725 730 735 Asp Thr Ser Asp Thr Gly Gly Gly Thr Asp Pro Gly Pro Gly Pro Asp 740 745 750 Pro Thr Pro Thr Gly Ala Cys Glu Val Thr Tyr Thr Val Thr Asn Gln 755 760 765 Trp Pro Gly Gly Phe Gln Ala Asp Val Arg Leu Thr Asn Thr Gly Thr 770 775 780 Ser Ala Trp Asn Gly Trp Ser Leu Asp Trp Ser Phe Pro Gly Gly Gln 785 790 795 800 Glu Val Thr Arg Met Trp Asn Ala Glu His Thr Gln Ala Gly Thr Ser 805 810 815 Val Thr Ala Arg Asn Val Gly Trp Asn Ala Gly Val Ala Pro Gly Ala 820 825 830 Ser Val Gly Phe Gly Phe Thr Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asn Ala Glu 835 840 845 Pro Glu Gly Phe Ala Val Ala Gly Arg Ala Cys Pro Thr Ala Thr 850 855 860

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 유전자를 포함하고, 상기 유전자의 전사가 방선균 유래 프로모터에 의해 조절되는 구성으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터.
제 1항에 있어서,
상기 방선균 유래 프로모터는 ermE 프로모터인 것을 특징으로 하는 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터.
제 2항에 있어서,
상기 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터는
도 2로 표시되는 pUWL201pw-SCO6545인 것을 특징으로 하는 자일로글루카네이즈 생산용 재조합 벡터.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 자일로글루카네이즈 생산용 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 미생물 형질전환체.
제 4항에 있어서,
상기 스트렙토마이세스 속 미생물은 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans)인 것을 특징으로 하는 자일로글루카네이즈 생산용 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 미생물 형질전환체.
제 4항의 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 자일로글루카네이즈 제조방법.
삭제
서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 효소의 효소반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 자일로글루칸(xyloglucan) 분해 방법.
제 8항에 있어서,
상기 효소반응이 pH 5 내지 7에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 자일로글루칸 분해 방법.
제 8항에 있어서,
상기 효소반응이 40 내지 60℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 자일로글루칸 분해 방법.
자일로글루칸(xyloglucan)을 기질로 하여, 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 효소의 효소반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 XXXG, XXLG, XLXG 및 XLLG 중에서 선택된 올리고당 제조방법.
상기 XXXG, XXLG, XLXG 및 XLLG에서 X는 α-D-자일로피라노오스-(1→6)-β-D-글루코피라노오스[α-D-xylopyranose-(1→6)-β-D-glucopyranose]이며, L은 β-D-갈락토피라노오스-(1→2)-α-D-자일로피라노오스-(1→6)-β-D-글루코피라노오스[β-D-galactopyranose-(1→2)-α-D-xylopyranose-(1→6)-β-D-glucopyranose]이고, G는 D-글루코피라노오스(D-glucopyranose)이다.
제 11항에 있어서,
상기 효소반응이 pH 5 내지 7에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고당 제조방법.
제 11항에 있어서,
상기 효소반응이 40 내지 60℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고당 제조방법.
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