KR100972204B1 - 원시균으로부터 글루코네이트 탈수효소를 정제하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 호열 및 호산성 원시균인 술포로버스 솔파타리쿠스으로부터 유래된 신규 열안정성 글루코네이트 탈수효소, 코딩 유전자, 및 발현 시스템에 관한 것이다. 상기 글루코네이트 탈수효소는 천연형의 분자량이 약 320,000 내지 380,000달톤이고, 모노머 단백질의 분자량이 약 40,000 내지 50,000달톤이며, 120℃ 이하의 온도에서 알돈산을 탈수하여 2-케토-3-데옥시-유도체를 제조하는 탈수반응을 촉매한다. 상기 글루코네이트 탈수효소는 천연 또는 재조합 숙주세포로부터 생산될 수 있으며, 제약, 농업, 및 다른 산업에 사용될 수 있다.

Description

원시균으로부터 글루코네이트 탈수효소를 정제하는 방법{A METHOD OF PURIFYING A GLUCONATE DEHYDRATASE FROM ARCHAEA}

본 발명은 원시균(archaea) 술포로버스 솔파타리쿠스 유래의 신규한 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 핵산, 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 및 이들의 용도에 관한 것과 이에 더하여, 재조합 글루코네이트 탈수효소의 제조 및 분리방법, 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 유도체를 촉매하는 방법에 관한 것이다.

초호열성 원시균(archaea) 80℃ 이상의 온도에서 최적을 성장하는 미생물이다. 이들 극도의 호열성 세균-유사 생물체중 많은 종이 주로 화산 및 지열에 의해 가열된 열수 환경, 예컨대 화산평원 (solfataric fields), 온천, 및 해수 열수분출구 등에서 분리되었다.

80℃ 부근에서 최적으로 생존하는 미생물을 발견하는 것은 학문적 및 산업적으로 매우 흥미있는 일이다. 생물체 및 이들이 효소들은 생화학적 촉매와 많은 산업적 화학전환 사이의 차이를 잇는 잠재적인 가교 역할을 수행한다. 그러나, 초호열성 미생물의 대사과정의 규정은 극히 최근으로 한정되어 있다.

이러한 소생태계에 서식하는 많은 초호열성 원시균에 있어서, 솔포러버스속 을 포함하는 Sulfolobales 오더(order)는 유기화합물 또는 수소를 전자 공여체로 사용하여 황원자를 황화수소로 전환하는 무기독립영양 대사를 가진다. 비록 솔포러버스가 황-산화 속(genus)이기는 하지만, 이들 속 균주는 당(sugar)을 사용하여 높은 세포밀도로 무기종속영양(chemoheterotrophically)으로 성장할 수 있다. 술포로버스 솔파타리쿠스는 80 - 85℃ 온도 및 pH 2 - 4에서, 글루코스를 유일한 탄소원 및 에너지원으로 하여 최적으로 자란다 (Grogan, J. Bacteriol. 171:6710-6719, 1989)).

솔포러브스에서, 글루코스 대사경로는 ¹⁴C-글루코스-표지 실험으로 최초로 De Rosa 등에 의해서 분석되었다 (Biochem . J. 224: 407-414, 1984). De Rosa 등의 실험에 의하면, 솔포러브스는 변형된 엔트너-도도로프(Entner-Doudoroff (ED)) 경로를 거쳐 피루베이트로 전환할 수 있음을 밝혔으며, 상기 ED 경로는 비인산화 중간체, 예컨대 글루코네이트, 2-케토-3-데옥시글루코네이트 (KDG), 및 글리세르알데히드를 생산한다. S. solfatarcus에서 비인산화 ED- 경로의 첫번째 반응은 글루코스 탈수소효소에 의한 NAD(P)⁺-의존성 산화를 통해 글루코스가 글루코네이트로 전환된다.

이어서, 글루코네이트는 글루코네이트 탈수효소 (EC 4.2.1.39) 에 의해 2-케토-3-데옥시글루코네이트 (KDG)고 전환되고, 이는 KDG-알돌라제 (EC 4.1.2.20)에 의해 절단되어 피루베이트 및 글리세르알데히드가 된다. 또한, 비인산화 중간체를 포함하는 변형 ED 대사경로는 호열 및 오산성 원시균 Thermoplasma acidophilum 에 서도 발견되었다 (Budgen et al. FEBS Lett. 196:207-210, 1986). Thermoplasma acidophilum 는 상기 비인산화 경로를 거쳐 생성된 글리세르알데히드를 글리세르알데히드 탈수소효소를 사용하여 글리세레이트로 전환하고, 글리세레이트는 인산화되어 2-포스포글리세레이트가 형성된다. 이어서, 상기 중간체는 엔올라제 및 피루베이트 키나제에 의해 1분자의 피루베이트를 생성시킨다. 상기 비인산화 ED 대사경로는 호열 및 호산성 원시균인 S. solfataricus 및 T. acidophilum에서만 유일하게 발견되는 독특한 해당경로이다. 도 1은 비인산화 ED 경로를 보여준다.

인산화 중간체를 포함하는 또 다른 ED 대사경로는 글루코스를 피루베이트로 전환하는 몇몇 종에서 발견되는 신규 해당경로로 알려져 있다. 상기 대사과정은 Szymona 등에 의해서 eubacteria, Rhodobacter, sphaeroides로부터 최초로 밝혀졌으며, 이후 클로스트리다속 균주 및 할로박테리아에서도 밝혀졌다 (Conway, FEMS Microbiol. Rev . 103:1-28, 1992). 상기 대사경로에서, 글루코네이트 탈수효소에 의해 생성된 KDG는 KDG 키나제에 의해서 인산화되어 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 (KDPG)가 되고, 이어서 KDPG 알돌라제에 의해 절단되어 피루베이트와 글리세르알데히드-3-포스페이트가 생성된다. 글리세르알데히드-3-포스페이트는 산화되어 피루베이트가 되고, 글리세르알데히드3-포스페이트 탈수소효소, 포스포글리세레이트 뮤타제, 에놀라제 및 피루베이트 키나제가 포함되는 일반적인 경로를 포함하는 경로이다.

글루코네이트 탈수효소는 Kersters et al., Antonie van Leeuwenhoek. 37: 233-246 (1971); Kersters et al., Methods Enzymol . 42: 301-304 (1975); Bender et al., Eur . J. Biochem. 40: 309-321 (1973); Bender et al., Methods Enzymol . 90: 283-287 (1982)에 기술되어 있다. 글루코네이트를 이전 해당경로를 거쳐 대사하는 박테리아, Achromobacter 종, 및 Clostridium pasteurianum에서 상기 단백질을 정제하고, 특성화하였다. 생체내에서 동일한 촉매반응에 관여함에도 불구하고 각 효소는 생화학적 특성은 매우 다르다. 그러나, 호열 및 호산성 원시균인 S. solfataricus, 및 T. acidophilum에서, 글루코네이트 탈수효소의 생화학적 특성 및 자세한 기작은 알려져 있지 않다. 상기 두 가지 박테리아 유래의 두 가지 효소의 특성이 분석되기는 했지만, 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 유전자 또는 부분 아미노산 서열이 보고된 적이 없다. 따라서, S. solfataricus 및 T. acidophilum we의 게놈서열이 최근에 결정되었기는 하나, 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 추정 유전자는 상기 데이터베이스에 언급된 바 없다 (She et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA . 98: 7835-7840, 2001; Ruepp et al., Nature 407:508-513, 2000). 추가로, 알려진 글루코네이트 탈수효소는 약 50℃ 이상의 온도에서 수 시간 동안 열안정성을 유지할 수 없다. 따라서, 장기간 높은 온도에서 활성을 유지할 수 있는 신규 글루코네이트 탈수효소를 개발할 필요가 있다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 호열 및 호산성 원시균종으로부터 분리된 신규 열안정성 글루코네이트 탈수효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 글루코네이트 탈수효소 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 글루코네이트 탈수효소의 생물학적 발현 시스템 및 글루코네이트 탈수효소을 발현하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 글루코네이트 탈수효소의 정제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알돈산을 2-케토-3-데옥시 알돈산으로 전환하는 시험관내 방법을 제공하는 것이다.

하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고하여, 본 발명을 보다 더 잘 이해하고 많은 장점이 있음이 더욱 명백해질 것이다.

본 발명의 상기와 같은 목적을 달성하고자, 본 발명은 글루코네이트 탈수효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 글루코네이트 탈수효소 는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열과 서열동일성이 적어도 50%을 갖는 핵산서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열과 적어도 505 서열동일성(identity)을 갖는 핵산서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열가 서열동일성을 적어도 50%를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 알돈산로의 탈수반응을 촉매하는 것인 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열과 서열동일성이 적어도 50%을 갖는 핵산서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열과 적어도 50% 서열동일성(identity)을 갖는 핵산서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역 조절 서열의 조절하에서 위치하며 이들과 작동가능하도록 연결된 것인 발현구조체를 제공한다.

본 발명은 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역 조절 서열의 조절하에서 위치하며 이들과 작동가능하도록 연결된 벡터로 형질전환된 생명체(organism)를 제공하는 것이다.

본 발명은

(a) 전사 및 번역 조절 서열의 조절하에서 위치하며 이들과 작동가능하도록 연결된, 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하고;

(b) 상기 벡터를 숙주세포에 도입하고, 상기 단백질을 발현하는 형질전환체를 선택하고;

(c) 상기 단백질이 발현되는 조건하에서 상기 형질전환체를 배양하고, 그리고

(d) 상기 형질전환체의 내부 물질로부터 상기 단백질을 분리하는 것을 포함하며,

상기 단백질은 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 알돈산로의 탈수반응을 촉매하는 것인 단백질 제조방법을 제공한다.

본 발명은

(a) 전사 및 번역 조절 서열의 조절하에서 위치하며 이들과 작동가능하도록 연결된 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드을 포함하는 벡터를 제조하고;

(b) 상기 벡터를 숙주세포에 도입하고; 그리고

(c) 상기 단백질을 발현하는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하며,

상기 단백질은 단백질은 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 알돈산로의 탈수반응을 촉매하는 것인, 단백질을 발현하는 혈질전환체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은

(a) 글루코네이트 탈수효소를 생산하는 미생물의 배양용액으로부터 세포를 수확하고;

(b) 상기 세포내 물질로부터 상등액을 얻고;

(c) 상기 상등액에 DEAE-세파로스가 충진된 칼럼을 사용한 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 수집하고;

(d) (c) 단계에서 얻은 용출액에 Q-세파로스가 충진된 칼럼을 사용한 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 수집하고;

(e) (d) 단계에서 얻은 용출액에 페닐-세파로스가 충진된 칼럼을 사용한 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 수집하고; 그리고

(f) (e) 단계에서 얻은 용출액에 HR 5/5 칼럼을 사용한 크로마토그래피를 수행하여 분획을 얻는 단계를 포함하는,

글루코네이트 탈수효소의 정제방법을 제공한다.

본 발명은 0℃ 내지 120℃ 온도범위, 및 pH 1.5 내지 12조건하에서 물 또는 수성 용매중에서 알돈산에 대한 글루코네이트 탈수효소의 혼합비가 1 ug : 0.01 내지 1 mol로 첨가하여 글루코네이트 탈수효소를 알돈산에 접촉하는 단계를 포함하는, 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 알돈산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상세한 설명에서, 본 발명의 다양한 구체예를 설명하고 제공할 것이며, 이는 본 발명자들이 예시적으로 제공하는 것일 뿐이다. 실제적으로, 본 발명은 본 발명의 범위을 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 도면 및 상세한 설명은 예시적인 의도로 제공된다.

본 명세서에서, '정제된(purified)' 또는 '분리된 (isolated)’함은 자연적으로 결합되는 세포 및 바이러스성 물질, 배양 배지(재조합 DNA 방법으로 생산하는 경우, 화학적 전구체, 또는 다른 화합물(화학적 합성하는 경우)이 실질적으로 없는 것을 의미한다. 더욱이, 상기 분리된 핵산 단편은 단편 자체로서 자연에 존재하지 않고 자연상태에서는 발견되지 않는 것이다.

본 명세서에서, "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 게놈 DNA, cDNA, 및 합성(예, 화학적 합성) DNA을 포함하는 RNA 및 DNA를 말한다. 상기 핵산은 이중 사슬, 또는 단일사슬일 수 있다. 단일사슬인 경우에는, 상기 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 사슬일 수 있다. 상기 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 동족체 또는 유도체(예, 이노신, 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 사용하여 합성할 수 있다.

본 명세서에서, "열안정성"이란 효소가 높은 온도에서 기능을 수행하고, 열에 내성이 있으며 높은 온도에서 변성되지 않는 것이다.

A. 열안정성 글루코네이트 탈수효소

본 명세서에서, 용어 "열안정성 글루코네이트 탈수효소"는

(1) 열안정성, 즉 60 -120 ℃ 범위, 바람직하게는 80 ℃ 이상, 더욱 바람직하게는 90 1℃ 이상의 온도의 열에 노출된 경우 효소적 활성을 실질적으로 유지하며; 및

(2) 알돈산을 2-케토-3-데옥시 알돈산으로, 더욱이 바람직하게는 글루콘산을 2-케토-3-데옥시 글루콘산으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다.

본 발명의 글루코네이트 탈수효소는 호열 및 호산성 원시균(thermoacidophilic archaea), 바람직하게는 술포로버스 속에 속하는 미생물, 더욱 바람직하게는 술포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 술포로버스 액시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 술포로버스 쉬바테(Sulfolobus shibatae), 술포로버스 토코다이(Sulfolobus tokodaii), 술포로버스 메탈리쿠스(Sulfolobus metallicus), 술포로버스 하코넨시스(Sulfolobus hakonensis), 술포로버스 브리에르레이(Sulfolobus brierleyi), 술포로버스 이스라디쿠스(Sulfolobus islandicus), 술포로버스 텡총엔시스(Sulfolobus tengchongensis, ), 술포로버스 쑤리지엔시스(Sulfolobus thuringiensis), 술포로버스 양민젠시스(Sulfolobus yangmingensis), 술포로버스속 균주, 써모플라즈마 액시도필럼(Thermoplasma acidophilum), 써모플라즈 볼카니움(Thermoplasma volcanium), 페로플라즈마 액시도필럼(Ferroplasma acidophilum), 또는 술포로버스 균주AMP12/99, CH7/99, FF5/00, MV2/99, MVSoil3/SC2, NGB23/00, NGB6/00, NL8/00, NOB8H2, RC3, RC6/00, 및 RCS1/01.로부터 분리 또는 정제될 수 있다.

본 발명의 글루코네이트 탈수효소는 열에 안정하고, 약 80℃ 내지 약 90℃ 온도에서 30분간 처리한 후에도 촉매활성을 유지한다. 열안정성을 갖는 범위는 0℃ 내지 120℃ 온도, 바람직하게는 20℃ 내지 100℃ 온도범위, 및 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 90℃ 온도범위이고, 최적 온도는 약 85℃이다. 글루코네이트 탈수효소 pH 범위 1.5 내지 12, 바람직하게는 1.5 내지 10, 더욱 바람직하게는 4.0 내지 9.0, 및 가장 바람직하게는 6 내지 8에서 활성을 유지하며, 이는 효소가 활성상 태인 광범위한 혼성 조건을 제공할 수 있다.

글루코네이트 탈수효소의 기질인 알돈산은 D-글루코네이트, D-갈락토네이트, D-갈락토헵토네이트, D-아라보네이트, D-글루쿠로네이트, L-굴로네이트 , D-타타레이트, D-글루카레이트, L-이소발레레이트, L-쓰레오네이트, D-리보네이트, L-타타레이트, D-굴로네이트 , 및 D-갈락타레이트을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일예에서, S. solfataricus. 유래의 글루코네이트 탈수효소의 바람직한 기질은 D-글루코네이트이다.

본 발명의 글루코네이트 탈수효소는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열동일성을 가지고, 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드서열과 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 서열을 포함한다. 바람직한 핵산 서열은 SEQ ID NO:1 의 염기서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 핵산 서열은 두 가지 코딩 서열 (5'말단 및 3'말단)을 갖는 바로 인접한 연결서열(immediately contiguous sequence을) 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일예에서, S. solfataricus (Ss) 유래 글루코네이트 탈수효소 (Ss 글루코네이트 탈수효소라 함)을 분리하고 특성을 분석하였다. 상기 Ss 글루코네이 트 탈수효소는 천연형에서 약 320,000 내지 380,000 달톤, 변성(환원) 조건하에서 SDS-PAGE에서 분석한 결과 약 40,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 가진다. 이러한 결과는 천연 형태에서 S. solfataricus 유래 글루코네이트 탈수효소는 8개의 동일한 서브유니트로 구성된 옥타머(octoamer)임을 말한다. Ss 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 유전자 서열은 SEQ ID NO:1의 핵산서열을 포함한다.

B. 분리 및 정제 열안정성 글루코네이트 탈수효소

호열 및 호산성 원시균종으로부터 글루코네이트 탈수효소를 분리 및 정제하거나, 화학적 합성, 또는 원색 또는 진핵 숙주(예, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충, 및 포유동물의 배양 세포)에서 발현하여 생물학적으로 합성할 수 있다.

글루코네이트 탈수효소를 본 기술분야에서 알려진 기술, 즉 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다. 크로마토그래피는 카르복시기, 카르복시메틸, 술포, 술포메틸, 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 트리메틸아미노메틸, 트리에틸아미노에틸, 디메틸-2-히드록시에틸아미노메틸, 디에틸-2-히드록시프로필아미노에틸, 포스포기, 알킬 (예, 헥실, 옥틸, 페닐) 및 히드록실아파티트(hyroxylapatite)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능기가 부착된 통상의 레진으로 수행할 수 있다. 레진 매트릭스는 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트 및 폴리스티렌으로 이루어지는 군에서 선택할 수 있다.

본 발명의 일예에서, 본 발명은 실온이하의 온도, 바람직하게는 약 4 ℃에서 글루코네이트 탈수효소를 분리 및 정제하는 방법을 제공한다.

첫 번째 단계에서, 글루코네이트 탈수효소를 발현하는 세포를 일반적으로 원심분리 또는 여과방법으로 수확한다. 두 번째 단계에서, 글루코네이트 탈수효소 제조수율 및 활성을 증가시키기 위해서, 안정화제 등을 포함하는 완충액을 첨가한다.

두 번째 단계에서, 세포를 용해하고 상등액을 분리하고 세포 파쇄물을 제거한다. 세포 용해는 일반적으로 물리적인 스트레스 및/또는 효소분해 등을 사용하여 수행한다. 상등액의 분리는 일반적으로 원심분리로 수행한다.

세 번째 단계에서, 추가로 상등액을 약음이온 교환칼럼이 구비된 크로마토그래프로 정제한다. 일예에서, 두 번째 단계에서 얻어진 상등액을 칼럼 완충액 (50 mM Tris, pH 7.2)으로 평형화시킨 DEAE-세파로스 (Piscataway, N.J., USA) 칼럼에 도입한다. 상기 칼럼을 칼럼 완충액으로 세척하여 원하지 않는 거대분자를 제겅하고, 결합된 단백질을 칼럼 완충액 농도구배 0 - 1.0 molar (M) NaCl으로 상기 칼럼으로부터 용출한다. Ss 글루코네이트 탈수효소의 경우, 약 0.5 M NaCl 농도에서 용출된다. 용출 분획을 수집하고 원심분리하여 불용성 물질을 제거한다. 수집된 용출액을 침전, 투석 및 회수하여 부분적으로 정제된 글루코네이트 탈수효소를 포함하는 분획을 얻는다.

네 번째 단계에서, 글루코네이트 탈수효소를 포함하는 분획을 강음이온 교환 칼럼으로 크로마토그래피를 수행하여 더욱 정제한다. 구체적 일예에서, 상기 분획을 칼럼 완충액 (50 mM Tris, pH 7.2)으로 평형화시킨 (Q-세파로스 (Piscataway, N.J., USA)로 크로마토그래피를 수행한다. 상기 칼럼을 칼럼 완충액으로 세척하여 바람직하지 못한 거대분자를 제거하고, 칼럼 완충액 농도구배 0 - 1.0 molar (M) NaCl 으로 상기 칼럼으로부터 용출한다. Ss 글루코네이트 탈수효소의 경우, 약 0.5 M NaCl 농도에서 용출된다. 용출 분획을 수집하고 원심분리하여 불용성 물질을 제거한다. 수집된 용출액을 침전, 투석 및 회수하여 부분적으로 정제된 글루코네이트 탈수효소를 포함하는 분획을 얻는다.

글루코네이트 탈수효소의 순도를 증가시키기 위해서, 네번째 단계에서 얻어진 분획에 대해 1.0 M NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)로 평형화시킨 페닐-세파로스 칼럼을 통한 크로마토그래피를 수행한다. 동일한 완충액으로 세척한 후에, 칼럼 완충액 농도구배 0.0 - 1.0 M NaCl 으로 상기 칼럼으로부터 효소를 용출한다. 활성분획을 0.5 ml/min 유속으로 수집하고, 농축, 한외여과, 및 50 mM Tris-HCl, pH 7.2로 평형화시킨 Mono Q HR 5/5 칼럼에 도입한다. 선형 농도구배 0.0 - 1.0 M NaCl로 상기 효소를 용출한다. 활성분획을 수집하고, 한외여과로 농축하고, HiTrap^TM 탈염 (Pharmacia, Sweden) 으로 탈염처리를 하여 효소 분획에 남아있는 NaCl을 제거한다.

C. 분리 및 정제된 글루코네이트 탈수효소, 및 이의 유전자 확인

알려진 방법, 예컨대 자동화 Edman 분해법등과 같은 방법으로 분리 및/또는 정제된 글루코네이트 탈수효소의 아미노산 서열를 부분적으로 또는 전부 결정한다. 결정된 아미노산 서열을 이용하여 데이터베이스에 있는 상동을 갖는 신규 단백질을 스크리닝 및/또는 코딩 핵산을 유추한다. 그런 후에, 다양한 생물체에서 얻어진 글 루코네이트 탈수효소의 코딩 유전자를 적합한 방법, PCR, 서열결정, 등과 같은 방법으로 얻는다.

표적 생물체는 술포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 술포로버스 액시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 술포로버스 쉬바테(Sulfolobus shibatae), 술포로버스 토코다이(Sulfolobus tokodaii), 술포로버스 메탈리쿠스(Sulfolobus metallicus), 술포로버스 하코넨시스(Sulfolobus hakonensis), 술포로버스 브리에르레이(Sulfolobus brierleyi), 술포로버스 이스라디쿠스(Sulfolobus islandicus), 술포로버스 텡총엔시스(Sulfolobus tengchongensis, ), 술포로버스 쑤리지엔시스(Sulfolobus thuringiensis), 술포로버스 양민젠시스(Sulfolobus yangmingensis), 술포로버스속 균주, 써모플라즈마 액시도필럼(Thermoplasma acidophilum), 써모플라즈 볼카니움(Thermoplasma volcanium), 페로플라즈마 액시도필럼(Ferroplasma acidophilum), 또는 술포로버스 균주AMP12/99, CH7/99, FF5/00, MV2/99, MVSoil3/SC2, NGB23/00, NGB6/00, NL8/00, NOB8H2, RC3, RC6/00, 및 RCS1/01을 포함하는 원시균종일 수 있다.

본 발명의 일예에서, 적어도 6개의 연속적인 아미노산을 코딩하는 게놈 DNA 부분을 합성하고 글루코네이트 탈수효소의 전장 유전자를 클로닝하기 위한 프로브로 사용한다. Ss 글루코네이트 탈수효소의 코딩 핵산 및 주위 서열을 동정한다. Ss 글루코네이트 탈수효소의 개방 해독틀을 SEQ ID NO:1에 나타내고, 3' 및 5'말단의 서열을 포함하는 핵산서열을 SEQ ID NO:5에 나타냈다.

또한, 본 명세서에 기술된 S. solfataricus 의 뉴클레오타이드 서열과 다른 종 또는 균주(strain)의 대응 부분의 서열과 정확하게 일치하지 않을 수도 있기 때문에, 가양성(false positive)을 제거하기 위해서 충분히 엄격학 조건하에서 혼성화할 수 있도록 하기 위해서 6개 아미노산을 코딩하는 약 18 염기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 필요할 수도 있다.

또는 본 발명에 따른 정제된 Ss 글루코네이트 탈수효소로 면역화된 토끼로부터 얻어지는 다클론성 항혈청을 사용하여 S. solfataricus 부분적 게놈 발현 라이브러리를 검색하여 적절한 코딩 서열을 얻을 수도 있다.

D. 열안정성 글루코네이트 탈수효소의 발현 시스템

재조합 DNA (rDNA) 기술을 이용하여 글루코네이트 탈수효소를 생산할 수 있다. 열안정성 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 유전자는 발현시스템에 작동가능하도록 연결되어 있어 적합한 숙주에서 발현할 수 있는 rDNA이다. 벡터 및 발현의 예는 본 명세서에 기재되어 있다.

열안정성 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 유전자눈 야생형 DNA, 또는 촉매 활성 또는 열안정성에 실질적을 변화를 야기하는 않는 것이나, 상기 핵산변화는 효소의 바람직한 특성을 변화하는 경우에는 허용가능한 것으로서, 핵산 변형, 치환, 결실 또는 추가에 의해 변형된 DNA일 수 있다.

(1) 글루코네이트 탈수효소 발현을 위한 제작

글루코네이트 탈수효소를 발현하기 위해서, 전사 및 번역 조절 서열의 조절 하에서 위치하며 이들과 작동가능하도록 연결된 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드을 포함하는 발현 구조체를 제조할 수 있다. 상기 전사 및 번역 조절서열은 숙주세포에 따라서 상기 전사 및 번역 조절서열이 결합된 외래 유전자의 전사 및 발현에 영향을 미칠 수 있는 구체적 생명체(즉, 박테리아, 효모, 곰팡이, 식물, 곤충, 동물 및 사람), 세포, 또는 조직에서 기능할 수 있는 것일 수 있다. 상기 전사 및 번역 조절서열을 예는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 및 종결자일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아닌다.

상기 프로모터는 하류에 위치하는 구조 서열의 전사를 지시하는, 고발현 유전자로부터 유래된 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 예컨대 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈카르보실라제 데카르복실라제(pyruvate decarboxylase), 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이성화효소, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이성화효소, 포스포글루코스 이성화효소, 및 글루코키나제 등의 해당효소를 코딩하는 오페론으로부터 유래될 수 있다. 성장조건에 따라 조절되는 추가의 장점을 갖는 다른 프로모터도 사용할 수 있으며, 이들 프로모터의 예로는 알코올 탈수소효소 2, 이오스시토크롬 (ioscytochrome) C, α-인자, 산 포스파타제, 열충격(heat shock) 단백질, 질소대사 관련 분해효소들, 및 말토스와 갈락토스 이용관련 효소를 포함한다. 상기 프로모터는 일반적을 벡터에 포함된 알려진 프로모터, lacI, lacZ, T3, T7, 람다 P _R , P _L , trp, CMV immediate early, HSV 티미딘 키나제, 초기발현 및 후기 발현 SV40, 레트로바이러스의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-1을 포함한다. 적절한 프로모터의 선택은 본 기술분야의 전문가에게 잘 알려져 있다.

상기 인핸서는 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는 약 10 내지 1000 bp 의 DNA 의 cis-작용 요소이다. 인핸서의 예로는 복제기원 bp 100 내지 270의 마지막 쪽에 있는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 초기발현 프로모터 인핸서, 복제기원의 마지막 부분, 및 아데노바이러스의 인핸서들을 포함한다.

상기 발현 구조체는 추가로 다수-클로닝 자리, 선별마커, 복제기원 및 숙주세포의 형질전환 유무의 선별마커를 포함하며, 예를 들면, 암피실린 저항성 유전자, 바람직한 특성을 부여하는 N-말단 동정 펩타이드, 예를 들면 안정화 서열, 또는 발현되 재조합 단백질의 간단한 정제를 위한 서열, 리보솜 결합자리, 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 상기 발현 구조체는 일반적인 벡터일 수 있으며, 예를 들면, 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터일 수 있다. 다수의 적절한 벡터가 본 기술분야의 전문가에게 알려져 있으며, 상업적으로 구입가능하다. 하기 벡터가 예로서 제시된다: pRSET, pTrcHis, pBAD, pTOPO, pTrxFus, pThioHis (Invitrogen), pET-19, 21, 24, 32, 43 (Novagen), pQE-30,-31,-32, pQE-40, -41,-42, pQE-50, -51, -52, pQE-16, -17, -18, pQE-60, pQE-70, pQE-9, -10, -11 (Qiagen), pBluscript II (Stratagene), pTrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Amersham-Pharmacia), pXT1, pSG5 (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLS40 (Amersham-Pharmacia), pBR322 (ATCC37017); pKK223-3 (Amersham-Pharmacia, Sweden), 및 pGEM1 (Promega, USA). 그러나, 다른 플라스미드 또는 벡터도 숙주에서 복제가능한 사용할 수 있다.

재조합 단백질을 생산하는 적합한 숙주는 원핵생물, 진핵생물 또는바이러스이다. 진핵생물은 효모, 곤충, 동물, 식물, 사람 및 이들 유래 세포로 이루어지는 군에서 선택할 수 있다. 상기 원핵생물은 E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, 및 곰팡이를 포함하는 미생물이다. 곤충세포의 예로는 Drosophila S2 및 Spodoptera Sf9이고, 포유동물 발현 시스템의 예로는 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주( Gluzman, Cell, 23:175, 1981), 및 적합한 벡터가 발현가능한 다른 세포주, 예컨대 C127, 3T3, CHO, HeLa, 및 BHK 세포주를 포함한다.

(2) 형질전환체 제조

*숙주세포 유형에 따른 형질전환체의 제조방법은 알려져 있으며, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 형질전환, DEAE-덱스트란 매개 형질전환, 전기천공(electrophoration) (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986), 및 Agrobacterium tumefaciens-매개 DNA 전달 등을 포함한다.

본 발명의 일예에서, 산염 탈수효소 유전자를 포함하는 pGNH 벡터를 제조하여 Excherichia coli BL21(DE3)에 도입하고, 형질전환체를 선택하였다. 상기 형질전환체는 Excherichia coli BL21(DE3)/pGNH로 명명하고, 대한민국, 대전시에 소재하는 한국 유전자 은행에 2004년 4월 9일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC 10619BP을 수여받았다.

pGNH 벡터는 BamHI 및 HindIII 제한효소 절단자리 사이에 Ss 글루코네이트 탈수효소 코딩 영역, 및 코딩영역의 5' 및 3' 말단에 조절 서열을 포함한다. pGNH의 서열은 SEQ ID NO:3에 나타냈고, 각 성분의 좌위는 표 1 및 도 2에 나타냈다.

[표 1]

pGNH 벡터

성분	명칭	좌위
프로모터	T7 promoter	20-39
외래유전자	gluD (글루코네이트 탈수효소 코딩 유전자)	208-1396
선별 마커	Ap (암피실린 저항성 유전자)	2149-2963
His-tag 융합 영역	6xHis 융합 영역	100-207

(3) 재조합 글루코네이트 탈수효소의 생산

알려진 방법에 따라 재조합 글루코네이트 탈수효소를 발현하는 조건에서 형질전환체를 배양한다. 단백질을 발현하는 배양된 세포를 냉동-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파쇄, 또는 용해제의 사용과 같은 종래의 방법으로 파쇄하고, 상기 방법은 본 기술분야의 전문가에서 알려져 있다. 일반적으로 세포를 원심분리하여 수확하고, 물리적 또는 화학적 방법으로 파쇄하고, 얻어진 조추출물을 추가로 정제한다.

Excherichia coli BL21(DE3)/pGNH을 사용하는 경우, 재조합 Ss 글루코네이트 탈수효소를 발현하는 바람직한 조건은 다음과 같다.

- 배지: Luria-bertani 배지, M9 배지, SOB (SOC) 배지, 과량의 배양액

- 온도: 20 - 40 ℃

- 배양시간: 6 -42 시간

(4) 재조합 단백질의 회수

암모늄 설페이트 침전, 아세톤 침전, 산추출, 음이온 교환 크로마토그래피수행, 양이온 교환 크로마토그래피 수행, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 또는 렉틴 크로마토그래피 등과 같은 종래의 방법으로 재조합 글루코네이트 탈수효소를 회수하고 정제한다. 필요한 경우 성숙 단백질의 안전한 3차원 형태를 위해서 단백질 재접힘 단계를 수행한다. 마지막으로, HPLC를 사용하여 최종 정제단계를 수행한다.

재조합 단백질 생산과정에 사용된 숙주에 따라서, 본 발명의 재조합 Ss 글루코네이트 탈수`효소는 당화, 인상화, 및 아세틸화와 같은 번역후 변형을 거칠 수도 있다. 본 발명의 효소는 또한 첫 번째 메티오닌을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.

본 발명의 구체예에서, 니켈 친화성 크로마토그래피를 수행하여 재조합 Ss 글루코네이트 탈수효소 대장군 BL21(DE3)/pGNH 로부터 재조합 Ss 글루코네이트 탈수효소를 정제할 수 있다.

E. 글루코네이트 탈수효소의 용도

글루코네이트 탈수효소는 필요로 하거나 바람직한 목적에 사용될 수 있다. 바람직한 일예에서, 상기 효소는 알돈산 탈수 반응을 촉매할 수 있다. 알돈산의 탈 수반응은 제약, 농업 및 다른 화학제품에 사용되는 탄화수소 중간체를 제조하기 위해 사용된다.

글루코네이트 탈수효소, 이의 단편, 유도체 또는 동족체, 또는 재조합 글루코네이트 탈수효소를 면역원(immunogen)으로 사용하여 이에 대한 항체를 제조할 수 있다. 이들 항체는 예컨데 다클론 또는 단클론 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러러의 산물일 뿐만 아니라, 키메릭, 단일사슬, 및 사람화된(humanized) 항체일 수 있다. 본 기술분야에서 알려진 여러 가지 방법을 사용하여 상기 항체 또는 단편을 제조할 수 있다.

효소를 직접 동물, 바람직하게는 사람이외의 동물에 주입하거나 투입함으로써 글루코네이트 탈수효소에 대한 항체를 제조할 수 있다. 그런 후 얻어진 항체는 글루코네이트 탈수효소 자체에 결합한다. 이러한 방식으로, 글루코네이트 탈수효소의 단편만을 코딩하는 서열을 사용하여 항체를 제조할 수 있고 글루코네이트 탈수효소를 발현하는 세포로부터 효소를 분리할 수도 있다.

단클론 항체를 제조하기 위해서, 연속적인 세포주 배양을 얻어진 항체를 제공하는 어떠한 기술이라도 사용될 수 있다. 상기 예로는 하이브리도마 기술 (Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975), 트리오마(trioma) 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., Immunology Today, 4:72, 1983), 및 사람 단클론 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., In Monoclonal Antibodies 및 Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96, 1985)을 포함한다.

단일 사슬 항체를 생산하는 기술 (미국특허 제4,946,778)를 적용하여 본 발 명의 면역원성 효소산물에 대한 단일사슬 항체를 제조할 수 있다. 또한 형질전환 마우스를 사용하여 본 발명의 면역원성 효소산물에 대한 사람화된 항체를 발현할 수 있다.

본 발명의 글루코네이트 탈수효소에 대한 항체는 다른 생명체 또는 시료에서 유사한 효소를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 또한, 항체는 교차반응을 확인하기 위하여, 생명체로부터 생성된 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.

F. 알돈산으로부터 2- 케토 -3- 데옥시 알돈산의 제조

글루코네이트 탈수효소는 알돈산을 탈수시켜 2-케토-3-데옥시 알돈산을 제조한다. 따라서 본 발명의 글루코네이트 탈수효소는 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 알돈산을 제조하는 공정에 사용될 수 있다.

본 발명은 0℃ 내지 120℃ 온도 및 pH 1.5 내지 12인 조건하에 물 또는 수성 용매에서 알돈산에 글루코네이트 탈수효소를 접촉시키는 단계를 포함하며, 알돈산에 대한 글루코네이트 탈수효소의 혼합비가 1 ug : 0.01 내지 1 mol인 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 알돈산을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 글루코네이트 탈수효소는 분리된 천연 글루코네이트 탈수효소, 화학적으로 합성된 글루코네이트 탈수효소, 재조합 글루코네이트 탈수효소, 및 이의 유사체로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

상기 알돈산은 D-글루코네이트, D-갈락토네이트, D-갈락토헵토네이트, D-아라보네이트, D-글루쿠로네이트, L-굴로네이트 , D-타타레이트, D-글루카레이트, L- 이소발레레이트, L-쓰레오네이트, D-리보네이트, L-타타레이트, D-굴로네이트 , 및 D-갈락타레이트을 포함한다.

알돈산의 탈수는 0℃ 내지 120℃, 바람직하게는 20℃ 내지 100℃, 가장 바람직하게는 30℃ 내지 90℃온도에서 수행할 수 있다.

상기 효소 반응에 영향을 미치는 적절한 PH는 1.5 내지 12, 바람직하게는 1.5 내지 10, 가장 바람직하게는 4.0 내지 9.0이다.

반응 혼합물에서 기질 농도 및 알돈산 농도는 1 내지 700 g/L, 바람직하게는 10 내지 500 g/L, 가장 바람직하게는 50 내지 200 g/L이다.

알돈산 탈수반응의 최적 조건은 글루코네이트 탈수효소 농도 0.1 - 1 mg/mL, 기질 농도 100-200 mM, 반응시간은 6 시간 이하, 70-95 ℃온도, 및 pH 7.0-8.0이다..

상기 탈수반응은 물 또는 유기용매중에서 수행할 수 있다. 유기용매는 알코올, 0.01 내지 100 %의 알코올 수용액 및 수 가지의 알코올 혼합물, 방향족 탄화수소, 및 지방족 탄화수소일 수 있다. 상기 알코올은 바람직하게는 C_{1 -6}-알칸올, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, 또는 tert- 부탄올일 수 있다. 상기 지방족 탄화수소는 바람직하게는 헵탄 또는 이소옥탄이고, 상기 방향족 탄화수소는 바람직하게는 벤젠 또는 톨루엔일 수 있다. 경제적 및 환경적인 측면에서, 유기 용매를 가능한 한 적게 사용할 필요가 있다.

생성된 2-케토-3-데옥시산 동족체의 분해를 방지하기 위해서, 탈수반응은 항 산화제, 예컨데 2-머캅토에탄올, 디티오쓰레톨, 또는 시스테인을 첨가한 조건에서 수행된다.

글루코네이트 탈수효소에 대한 대안으로서, 반응 혼합물이 글루코네이트 탈수효소 활성을갖는 생명체를 포함할 수도 있다.

반응용으로 모든 형태의 글루코네이트 탈수효소 효소가 사용될 수 있으며, 특히 효소 용액, 고정화 효소, 글루코네이트 탈수효소 활성을 갖는 완전한 세포, 및 글루코네이트 탈수효소 활성을 갖는 고정화 세포일 수 있다.

본 발명은 신규한 글루코네이트 탈수효소 및 이의 제조 또는 정제 방법을 제공하며, 글루코네이트 탈수효소를 이용하여 효율적으로 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 알돈산을 제조하는 방법을 제공한다.

하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 제한되는 지는 않는다.

실시예 1

술포로버스 솔파타리쿠스의 배양 및 Ss 세포 제조

대규모 단백질 정제를 위해서 충분한 양의 세포를 얻고자, 초호열성 원신균인 술포로버스 솔파타리쿠스가 3.7 리터의 발효기에서 배양하는 것을 기술한다.

배양을 유지하기 위해서, 100 ml 부피에서 폐쇄 진탕배양으로 75-85℃에서 S. solfataricus P2 (DSM1617) 을 배양하였다. 상기 미생물을 배지 (단위 리터당, 3.0 g glucose, 3.0 g yeast extract, 1.3 g (NH₄)₂SO₄, 0.28 g KH₂PO₄, 0.25 g MgSO_{4 ㆍ}7H₂O, 0.07 g CaCl_{2 ㆍ}H₂O)에 1ml 미량 금속용액 (20 mg FeCl_{3 ㆍ}H₂O, 4.5 mg Na₂B₄O_{7 ㆍ}H₂O, 1.8 mg MnCl_{2 ㆍ}H₂O, 0.05 mg ZnSO_{4 ㆍ}H₂O, 0.05 mg CuCl_{2 ㆍ}H₂O, 0.04 mg VOSO_{4 ㆍ}H₂O, 0.03 mg Na₂MoO_{4 ㆍ}H₂O, 0.01 mg CoSO_{4 ㆍ}H₂O)이 첨가된 배지 배양하였다. 1 M H₂SO₄를 사용하여 최종 pH 를 pH 3.0으로 맞추었다. 호기 조건하에서 3.7-L 발효기(KLF 2000, Bioengineering AG, Switzerland)를 사용하여 78℃, 400 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 540nm 파장에서 분광기를 사용하여 성장을 모니터링하였다.

실시예 2.

술포로버스 솔파타리쿠스 로부터 글루코네이트 탈수효소를 정제

S. solfataricus 세포 (냉동 습윤세포 중량 35 g)를 원심분리(5000 x g, 30 분, 4℃)하여 수확하고, 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)로 2회 세척하였다. 세포 펠렛을 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)에 재현탁하고, 50% 수율에서 1시간 동안 초음파처리하여 세포를 파쇄하였다. 조추출물을 90 ℃에서 20분 동안 가열하고, 열-변성된 단백질 및 세포 파쇄물을 원심분리하여(50000 x g, 1 시간, 4℃) 제거하였다. 상등액에 고형(NH₄)₂SO₄ 을 40% 포화되도록 첨가하여 글루코네이트 탈수효소 활성을 갖는 분획을 회수하였다. 원심분리(50000 x g, 1시간, 4℃)후에, 수용성 분획을 50 mM Tris- HCl (pH 7.2)으로 투석하였다. 균질액을 이전에 50 mM Tris-HCl, pH 7.2으로 평형화시킨 DEAE-세파로스 칼럼 (2.5 x 16 cm)에 로딩하고, 키고, 선형 농도구배 0.0 - 1.0 M NaCl의 3배 부피의 동일한 완충액으로 용출시켰다. 분획(각 5 ml) 1 ml/min의 유속으로 수집하였다. 글루코네이트 탈수효소활성을 갖는 분획을 Vivaspin^TM concentrator membrane (Vivascience, Lincoln, UK)상에서 한외여과하고, 1.0 M NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl, pH 7.2으로 평형화시킨 페닐-세파로스 칼럼 (1.0 x 10 cm)에 로딩하였다. 동일한 완충액으로 세척하고, 감소하는 농도구배의 1.0 내지 0.0 M NaCl 칼럼 완충액으로 상기 효소를 용출시켰다. 활성 분획을 0.5 ml/min 유속에서 수집하고, 한외여과로 농축하고, l50 mM Tris-HCl, pH 7.2로 평형화시킨 Mono Q HR 5/5 칼럼 (0.5 x 5 cm)에 로딩하였다. 상기 효소를 선형 농도구배 0.0 - 1.0 M NaCl의 칼럼 완충액으로 용출시켰다. 얻어진 활성분획을 0.5 ml/min 유속에서 수집하고, 한외여과막으로 농축하고, HiTrap^TM desalting (Pharmacia, Sweden)으로 탈염처리하여 효소 분획에 남아있는 NaCl를 제거하였다.

얻어진 산물을 Ss 글루코네이트 탈수효소로 명명하였다. 상기 Ss 글루코네이트 탈수효소를 SDS-PAGE로 분석하여 95% 동질성을 결정하였다.

실시예 3.

글루코네이트 탈수효소의 분석

세미카르비지드 방법 또는 TBA (thiobarbituric acid)분석법으로 Ss 글루코 네이트 탈수효소의 활성을 측정하였다.

상기 세미카르비지드 방법은 다음과 같이 수행하였다: 전체 부피 400㎕의 효소반응을 78℃에서 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0조건에서 10 mM 글루코네이트 및 효소용액과 함께 수행하였다. 30분 후에, 100 ㎕의 2.0 M HCl을 첨가하여 효소반응을 종결시켰다. 상기 용액에, 300 ㎕의 세미카르비지드 용액 (증류수에 1.0 % (w/v) 세미카르비지드 하이드로클로라이드 및 1.5 % (w/v) 소디움 아세테이트를 용해한 용액)을 첨가하고, 30 ℃에서 15분간 반응시켰다. 최종 반응 500 ㎕의 증류수로 희석하고 250 nm에서 흡광도를 측정하였다. 2-케토-3-데옥시 글루코네이트 (KDG)에 대한 세미카르보존의 흡광계수를 0.571 x 10³ M^-1cm^-1로 정했다.

TBA 분석은 다음과 같이 수행하였다: 50 ㎕의 반응혼합물을 실온에서 20분간 0.25 M H₂SO₄ 중 125 ㎕의 25 mM 과요오드산으로 산화시켰다. 산화반응을 종결시키고자, 0.5 M HCl 에 용해된 2 % (w/v) 소디움 아르세네이트(sodium arsenate) 250 ㎕를 상기 반응액에 첨가하였다. 마지막으로, 상기 반응액에 1 ml의 0.3 % TBA 을 첨가하고, 반응혼합물을 100 ℃에서 10 분간 가열하였다. 동량의 DMSO를 첨가한 후에, 생성된 붉은색 크로모포어(chromophore)을 549 nm에서 모니터하였다. KDG에 대한 TBA 발색단의 흡광계수는 0.347 x 10³ M^-1cm^-1로 추정되었다. 글루코네이트 탈수효소 1 유니트는 분석조건하에서 단위시간당 1 μmol의 2-케토-3-데옥시 글루코네이트를 생산하는 효소의 양이다. 효소 활성은 세번 측정하였다.

실시예 4.

N-말단 서열결정을 통한 글루코네이트 탈수효소의 코딩 유전자 동정

N-말단 서열결정을 위하여, 정제된 단백질을 SDS-PAGE에 로딩하고, PVDF 멤브레인상에 블랏하고 절단하였다. S. solfataricus 유래된 정제 글루코네이트 탈수효소의 N-말단 서열분석은 Edman 분해법으로 수행하여 MRIREIEPIV임을 확인하였다. 글루코네이트 탈수효소의 유추된 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2)은 S. solfaricus P2 게놈 데이터베이스에서 45-kDa 단백질를 코딩하는 SSO3198와 일치하였다. 게놈 데이터베이스의 예측된 단백질 크기는 변성겔에서 정제 효소의 단일 밴드에 상응하였다. 따라서, 상기 정제된 단백질은 글루코네이트 탈수효소이고, SSO3198에 의한 ORF가 유전자이며, S. solfataricus에서 글루코네이트 탈수효소를 암호화하는 gnh유전자로 명명하였다.

실시예 5.

Ss 글루코네이트 탈수효소의 특성분석

5-1. 기질 특이성

글루코네이트 탈수효소의 기질특성을 분석하고자, C₄ to C₇ 의 탄소사슬을 함유한 알돈산 각각 10 mM 용액을 40 ㎕/mL의 정제 효소단백질과 반응시켰다. 생성된 산물의 양을 세미카르바지드 방법에 의해 측정한 결과, 표준조건하에서 반응시킨 후에 100% D-글루코네이트로 전환되었다. 당관련 유기산(sugar acid)에 대한 글루코네이트 탈수효소의 기질특성을 알돈산으로부터 2-케토-3-데옥시 동족체의 수율을 측정하여 결정하였다. 시험대상 유기산을 다음과 같다: D-글루코네이트, D-갈락토 네이트, D-갈락토헵토네이트, D,L-아라보네이트, D-글루쿠로네이트, D,L-굴로네이트 , D,L-타타레이트, D-글루카레이트, D,L-이소발레레이트, L-쓰레오네이트, D-리보네이트, D-갈락타레이트, D-자일로네이트, D-갈락투로네이트, D-글루시톨, D-만노에이트, 및 D,L-글리세레이트. 글루코네이트 탈수효소의 속도론적 파라미터 분석은 D-글루코네이트로(0.1 내지 40 mM) 수행하였다. 모든 실험은 3회 수행하였다.

알돈산에 대한 Ss 글루코네이트 탈수효소 활성을 표 2에 나타냈다. Ss 글루코네이트 탈수효소는 다른 알돈산 기질에 비해 D-글루코네이트에 대해 높은 특이성을 나타냈다. D-갈락토네이트 및 D-갈락토헵토네이트도 효소의 기질로 사용될 수 있다. 무시할만하나 탐지되는 활성 (D-글루코네이트에 대한 활성이 1%이하인 경우) 이 다음 기질에 대해서 확인되었다: D-글루쿠로네이트, L-굴로네이트, D-타타레이트, D-글루카레이트, D, L-이소발레레이트, L-쓰레오네이트, D-리보네이트, L-타타레이트, D-굴로네이트 , 및 D-갈락타레이트. 따라서, 상기 효소는 D-글루코네이트에 대한 우선성이 있는 것으로 나타났다.

[표 2]

기질	상대 활성 (%)	탈수산물의 구조
D-글루코네이트	100.0	2-케토-3-데옥시-D-글루코네이트
D-갈락토네이트	2.8	2-케토-3-데옥시-D-갈락토네이트
D-갈락토헵토네이트	1.6	2-케토-3-데옥시 -D-갈락토헵토네이트
D-아라보네이트	0.7	2-케토-4, 5-디히드록시-D-발레산

*(참고) 표 2에서,

* 1% 미만의 활성을 보이는 기질: D-글루쿠로네이트 (0.65), L-굴로네이트 (0.41), D-타타레이트 (0.41), D-글루카레이트 (0.32) D, L-이소발레레이트 (0.25), L-쓰레오네이트 (0.16), D-리보네이트 (0.16), L-타타레이트 (0.16), D-굴로네이트 (0.16), 및 D-갈락타레이트 (0.10).

* 반응이 없는 기질: L-아라보네이트, D-자일로네이트, D-갈락투로네이트, D-글루시톨, D-만노에이트, 및 D, L-글리세레이트.

* 상기 상대적인 효소 활성은 세미카르바지드 방법을 사용하여, 50 mM Tri-HCl 완충액 (pH 7.0)중 1 mM CoCl₂을 함유하는 각각 알돈산 10mM을 30분간 78℃ 반응하여 생성되는 2-케토-3-데옥시 동족체를 측정함으로써 분석하였다.

효소의 생화학적 및 파라미터는 표준조건하에서 상기 기술한 분석방법으로 결정하였다.

5-2. 동역학 파라미터

V _max 및 K _m 는 라인위버 벌크 플랏(Lineweaver bulk plots)으로 결정하였다. 기질 농도에 따른 비율은 Michaelis-Meten kinetics로 분석하였다. D-글루코네이트를 기질로 사용한 경우, Lineweaver-Burk plots으로부터, K _m 및 V _m 값이 16.7 mM 및 34.5 units/mg 이었다. 전환수 (k _cat)는 글루코네이트 탈수효소에 대해 333 s^-1, 및 k _cat/ K _m 는 19.9이었다.

5-3. 최적 온도

효소 활성의 온도 추이는 40 내지 100℃에서 결정하였다. . 도 3은 S. solfataricus 유래 글루코네이트 탈수효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 다. 정제된 글루코네이트 탈수효소는 최적 활성을 80 내지 90 ℃에서 나타내었다. 효소 60 ℃이하의 온도에서는 효소활성을 측정하지 않았다.

5-4. 열안정성

효소의 열안정성은 80, 90, 및 100℃에서 50 mM Tri-HCl (pH 7.2)중에서 효소용액(50 ㎕/ml)을 반응시켜 결정하였다. 적절한 시간에 시료를 취하고 얼음상에서 완전히 냉각시켜 표준조건에서 잔류 활성을 측정하였다,. 정제된 글루코네이트 탈수효소의 열안정성을 80, 90, 및 100 ℃에서 측정하였다. 80 ℃에서 최적 성장 활성을 S. solfataricus P2가 나타냈고, 글루코네이트 탈수효소는 2시간 동안 매우 안정하였다. 90 ℃에서, 효소 활성은 반응 2시간 경과후에 50% 만큼 감소하였다. 그러나, 100 ℃에서는 효소의 반감기가 40분 이하였다.

5-5. 최적 pH

글루코네이트 탈수효소 활성에 대한 pH 의 영향을 구연산-NaOH 완충액 (pH 2.7-5.0), 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 5.8-8.0), 및 50 mM 글리신-NaOH 완충액 (pH 8.5-10.5)에서 78℃에서 결정하였다.

도 4는 글루코네이트 탈수효소 활성에 미치는 pH의 영향을 나타내며; 50mM 구연산 -NaOH (■), 50 mM Tris-HCl (●), 및 50 mM 글리신-NaOH 완충액(○). 도 4에서, pH 2.7 내지 pH 10.5 범위에서, 정제된 효소의 활성은 pH 7.0 내지 8.0에서 최적활성을 나타냈다.

실시예 6.

천연 글루코네이트 탈수효소의 분자량 결정

실시예 2에 얻어진, 순수 Ss 글루코네이트 탈수효소(100 ㎕)에 대해, 겔 여과 평형키트 (gel filtration calibration kit, Pharmacia Biotech, Sweden)를 이용한 세파크릴 S-200 칼럼을(1.0 x 89 cm)를 통해 크로마토그래피를 수행하였다. 칼럼 평형화 및 용출 완충액은 150 mM NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)이고, 유속은 0.5 ml/min이었다. 사용한 분자량 마커는 씨로글로불린(thyroglobulin) (669 kDa), 페리틴 (440 kDa), 카탈라제 (232 kDa), 알돌라제 (158 kDa), BSA (67 kDa), 오발부민 (43 kDa), 키모트립신 (25 kDa), 및 리보뉴클레아제 A (13.7 kDa)이었다. 280nm에서 단백질을 탐지하였고, 글루코네이트 탈수효소 활성을 표준방법으로 측정하였다. 글루코네이트 탈수효소의 분자량은 추천 방법에 따라 K_av 수치에 대한 log 분자량 도표를 보간법으로 계산하였다.

천연형 정제 효소의 분자량은 표준 분자량 마커를 포함하는 세파릴 S-200 칼럼으로 측정하여 357±42 kDa이었다. SDS-PAGE로부터 변성된 글루코네이트 탈수효소의 분자량은 약 44 kDa이었다. 이러한 결과에 의하면, S. solfataricus 유래 글루코네이트 탈수효소는 천형 형태에서 8개의 동일한 서브유니트로 구성되는 옥타머임을 나타냈다.

실시예 7.

술포로버스 솔파타리쿠스로부터

글루코네이트 탈수효소 코딩 유전자의 클로닝

7-1. 클로닝

초호열성 원시균인 술포로버스 솔파타리쿠스 (Ss)로부터 열안정성 글루코네이트 탈수효소을 코딩하는 유전자를 클로닝하였다.

N-말단 단백질의 부분 서열분석(microsequencing)은 실시예 2에서 얻은 균질한 천연형 Ss 글루코네이트 탈수효소 100 picomoles (pmol) 에 대해 Korea Basic Science Institute (KBSI) (대한민국, 대전)에 의해 N-말단 단백질의 마이크로 시컨싱(microsequencing) 수행하였다. 10 N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과, 1번 잔기 내지 10번 잔기가 SEQ ID NO 4의 유추 아미노산 잔기와 정확하게 대응되었다.

BamHI 제한효소자리 및 HindIII 제한효소자리를 포함하는 SEQ ID NO:5 및 6으로 이루어지는 프라이머 세트를 사용한 PCT 기술로 술포로버스 솔파타리쿠스의 게놈 DNA부터 처음으로 본 발명에 따른 Ss 글루코네이트 탈수효소 코딩 DNA (SEQ ID NO 1)가 증폭되었다. 상기 증폭 단편을 pGEM-T easy (Promega, USA)의 BamHI 및 HindIII 자리로 삽입하였고, 얻어진 벡터를 각각 BamHI 및 HindIII 제한효소로 절단하였다. 항생제 저항성(Amp^r), 박테리아성 복제기원 (ori), 및 PTG-조절 프로모터 오퍼레이트 (P/O), 리보솜 결합 자리 (RBS), 6-His tag, 및 제한효소 자리를 포함하는 pRSET 벡터 (Invitrogen, USA)의 BamHI 및 HindIII자리로 1,188 bp 단편을 연결하였고, 얻어진 벡터를 pGNH로 명명하였다. 상기 pGNH 벡터는 BamHI 및 HindIII가 단편의 각 말단을 둘러싼, 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 완전한 3,993 bp 단편을 포함한다.

프로테아제에 대해 발현된 단백질이 절단되는 것을 방지하기 위해서 프로테 아제-결핍 변이인 E. coli BL21(DE3)를 상기 pGNH 벡터로 형질전환시켰다. 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 배양하여 형질전환체를 선별하고, 수확하여 제한효소 분석을 통해 gnh 유전자가 도입되어 있는지를 확인하였다

7-2. 발현

Amp (100 ㎕/ml)이 첨가된 LB 배지에서 하룻밤 동안 형질전환체를 액체배양하였다. 상기 배양물을 1:100 내지 1:250의 비율로 대량배양을 위해 접종하였다. OD₆₀₀값이 0.4 내지 0.6이 될 때까지 세포를 배양하였다. 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)을 최종 농도 1mM가 되도록 첨가하였다. IPTG 는 lac 리프레서를 불활성화시켜 P/O로 하여금 유전자 발현을 증가시키게 하여 유도한다. 세포를 추가로 4 내지 6 시간동안 배양하고, 원심분리하여 수확하였다.

실시예 8.

재조합 Ss 글루코네이트 탈수효소의 정제

재조합 Ss 글루코네이트 탈수효소를 실시예 7에 기술된 플라스미드 pGNH을 포함하는 대장균으로부터 분리하였다.

대장균 BL21(DE3)/pGNH 배양물을 이전에 기술된 방법으로 제조하고, 30 g의 배양세포를 분리하고, 120 ml의 용해 완충액(실시예 2에서 제조)과 혼합하고, 최대 전압으로 각각 6분씩 10회 초음파 처리를 수행하였다. 얻어진 세포 파쇄물을 30분간 7,000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리후 얻어진 상등액을 분리하고, 90℃ 수조에서 20분간 두었다. 열-변성 용액을 상기 설명한 대로 원심분리하고, 결과물은 분리하고, 실시예 2에 기재된 방법대로 50 mM Tris-HCl로 평형화시킨 IMAC®칼럼에 로딩하였다. 3배 칼럼 부피의 동일한 완충액으로 칼럼을 세척하고, 상기 동일 완충액중 농도구배 0 내지 0.2 M 이미다졸 용액으로 용출시켜, 농도구배 용출 분획을 수집하였다. 각각의 분획에 대해 글루코네이트 탈수효소의 활성 분석을 수행하였고, 최대 활성을 나타내는 분획을 모아서 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)에서 투석하였다.

그런 후에, 실시예 2에 기재된 대로 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)로 평형화시킨 Q-세파로스 칼럼에 투석물을 로딩하였다. 3배 칼럼 부피의 동일한 완충액으로 칼럼을 세척하고, 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)중 0 - 1.0 M NaCl 농도구배로 용출하였다. 최대 활성을 나타내는 분획을 모아서 분석하고, 활성 분획을 모아서 Vivaspin^TM 농축기 (Vivascience, Lincoln, UK)를 사용하여 10-20배 농축하였다. 농축물을 최종 투석 완충액으로 투석하여 정제된 재조합 Ss 글루코네이트 탈수효소를 얻었다.

재조합 Ss 글루코네이트 탈수효소의 활성을 실시예 3의 방법에 따라 결정하였다.

실시예 9.

재조합 글루코네이트 탈수효소에 의한 글루콘산의 탈수로

2- 케토 -3- 데옥시 글루코네이트 제조

S. solfaricus 유래의 재조합 글루코네이트 탈수효소를 사용하여 글루콘산을 탈수하여 2-케토-3-데옥시 글루코네이트를 제조하였다.

1, 5, 10, 50, 및 100 mM의 글루콘산 소디움염 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA)으로 이루어지는 반응 혼합물과 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)중 글루코네이트 탈수효소를 제조하였다. 상기 글루코네이트 탈수효소를 3.5 mg/ml농도로 첨가하고, 78 ℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 2-케토-3-데옥시 글루코네이트를 실시예 3의 표준방법으로 분석하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 2-Ss 글루코네이트 탈수효소가 케토-3-데옥시 글루코네이트를 생산하였다.

알돈산을 탈수하여 2-케토-3-데옥시 알돈산를 제조하기 위한 재조합 Ss 글루코네이트 탈수효소의 최적 조건을 다음과 같다:

효소 농도: 0.1 -1 mg/mL

기질 농도: 100-200 mM

반응 시간: 6 시간 이내

온도: 약 80℃

pH: 7.5 - 8.0

[서열 목록 텍스트]

SEQ ID NO:1-술포로버스 솔파타리쿠스 유래의 글루코네이트 탈수효소를 코딩하는 개방 해독틀.

SEQ ID NO:2-술포로버스 솔파타리쿠스 유래의 글루코네이트 탈수효소의 아미노산서열.

SEQ ID NO:3- pGNH 벡터의 핵산 서열.

SEQ ID NO:4-술포로버스 솔파타리쿠스 유래의 글루코네이트 탈수효소의 N-말 단 아미노산 서열.

SEQ ID NO:5-Bam H1 제한효소자리를 갖는 센스 프라이머의 핵산서열.

SEQ ID NO:6-Hind HIII 제한효소자리를 갖는 안티센스 프라이머의 핵산서열.

도 1은 비인산화 ED 대사경로이다.

도 2는 pGNH의 벡터 개열지도이다.

도 3은 S. solfataricus 유래 글루코네이트 탈수효소에 미치는 온도의 영향을 나타낸다.

도 4는 유래 글루코네이트 탈수효소에 미치는 pH 영향을 나타낸다.

도 5는 pH 8.0 및 온도 78℃에서 6 시간동안 S. solfataricus 유래 글루코네이트 탈수효소를 반응한 경우 글루콘산으로부터 2-케토-3-데옥시 글루코네이트로 전환된 결과를 나타내는 그래프이다.

<110> POSTECH Foundation POSCO <120> NOVEN THERMOSTABLE GLUCONATE DEHYDRATASE AND USE THEREOF <130> DPP-2009-3492-KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1189 <212> DNA <213> Sulfolobus solfataricus <220> <221> CDS <222> (1)..(1185) <223> Open Reading Frame encoding gluconate dehydratase <400> 1 atg aga atc aga gaa ata gaa cca ata gta ctc acc tcg aaa gag aaa 48 Met Arg Ile Arg Glu Ile Glu Pro Ile Val Leu Thr Ser Lys Glu Lys 1 5 10 15 gga agt gca act tgg gca tct ata atg att gtc aca agg gtc att acg 96 Gly Ser Ala Thr Trp Ala Ser Ile Met Ile Val Thr Arg Val Ile Thr 20 25 30 gaa aat ggg gaa gta ggc tat ggt gag gca gta ccc aca cta aga gtt 144 Glu Asn Gly Glu Val Gly Tyr Gly Glu Ala Val Pro Thr Leu Arg Val 35 40 45 ata tct gta tat aac gca att aaa caa gtt agt aag gct tat ata ggg 192 Ile Ser Val Tyr Asn Ala Ile Lys Gln Val Ser Lys Ala Tyr Ile Gly 50 55 60 aaa gag gta gag gaa gtt gag aag aac tat cat gaa tgg tat aaa caa 240 Lys Glu Val Glu Glu Val Glu Lys Asn Tyr His Glu Trp Tyr Lys Gln 65 70 75 80 gat ttc tat tta gct agg tct ttt gaa tca gca act gca gta agt gca 288 Asp Phe Tyr Leu Ala Arg Ser Phe Glu Ser Ala Thr Ala Val Ser Ala 85 90 95 atc gat ata gcc tca tgg gat ata ata ggg aaa gag ctt gga gca cca 336 Ile Asp Ile Ala Ser Trp Asp Ile Ile Gly Lys Glu Leu Gly Ala Pro 100 105 110 att cat aaa tta tta gga gga aaa acc agg gat agg gta cca gtc tac 384 Ile His Lys Leu Leu Gly Gly Lys Thr Arg Asp Arg Val Pro Val Tyr 115 120 125 gca aac gga tgg tat cag gac tgc gta act cca gag gaa ttt gcg gaa 432 Ala Asn Gly Trp Tyr Gln Asp Cys Val Thr Pro Glu Glu Phe Ala Glu 130 135 140 aag gca aaa gac gtt gta aag atg gga tat aag gct tta aaa ttt gat 480 Lys Ala Lys Asp Val Val Lys Met Gly Tyr Lys Ala Leu Lys Phe Asp 145 150 155 160 ccg ttt ggt cca tat tac gat tgg ata gat gag aga ggt cta aga gaa 528 Pro Phe Gly Pro Tyr Tyr Asp Trp Ile Asp Glu Arg Gly Leu Arg Glu 165 170 175 gct gag gag aga gta aag gct gtt aga gag gca gtt gga gac aac gtg 576 Ala Glu Glu Arg Val Lys Ala Val Arg Glu Ala Val Gly Asp Asn Val 180 185 190 gat att tta ata gag cat cac ggt agg ttt aat gcg aat tcg gct att 624 Asp Ile Leu Ile Glu His His Gly Arg Phe Asn Ala Asn Ser Ala Ile 195 200 205 atg ata gcg aaa aga ttg gaa aaa tac aat ccg gga ttt atg gag gaa 672 Met Ile Ala Lys Arg Leu Glu Lys Tyr Asn Pro Gly Phe Met Glu Glu 210 215 220 ccg gta cat cat gag gac gta att ggt tta aga aag tat aaa gcc agt 720 Pro Val His His Glu Asp Val Ile Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Ala Ser 225 230 235 240 act cat tta agg gtt gca ttg gga gaa aga ctg ata agt gaa aag gaa 768 Thr His Leu Arg Val Ala Leu Gly Glu Arg Leu Ile Ser Glu Lys Glu 245 250 255 act gcg ttt tac gtt gag gaa ggt ctt gta aac ata ttg caa cca gat 816 Thr Ala Phe Tyr Val Glu Glu Gly Leu Val Asn Ile Leu Gln Pro Asp 260 265 270 tta act aat ata ggt ggt gta aca gta ggt agg agt gtt ata aaa ata 864 Leu Thr Asn Ile Gly Gly Val Thr Val Gly Arg Ser Val Ile Lys Ile 275 280 285 gct gaa gct aat gat gta gag gtg gct ttt cac aac gcc ttt ggt tca 912 Ala Glu Ala Asn Asp Val Glu Val Ala Phe His Asn Ala Phe Gly Ser 290 295 300 ata cag aat gca gtt gaa ata caa cta agt gca gtt aca cag aat ttg 960 Ile Gln Asn Ala Val Glu Ile Gln Leu Ser Ala Val Thr Gln Asn Leu 305 310 315 320 tat tta ctt gag aac ttc tat gat tgg ttc cct cag tgg aaa agg gat 1008 Tyr Leu Leu Glu Asn Phe Tyr Asp Trp Phe Pro Gln Trp Lys Arg Asp 325 330 335 tta gta tat aat gaa acg cca gtt gaa gga ggt cac gtt aag gtt cca 1056 Leu Val Tyr Asn Glu Thr Pro Val Glu Gly Gly His Val Lys Val Pro 340 345 350 tac aag cct gga cta ggt gtt tca att aat gaa aaa ata ata gaa cag 1104 Tyr Lys Pro Gly Leu Gly Val Ser Ile Asn Glu Lys Ile Ile Glu Gln 355 360 365 cta aga gct gaa cca ata cca tta gat gta att gaa gaa ccg gtt tgg 1152 Leu Arg Ala Glu Pro Ile Pro Leu Asp Val Ile Glu Glu Pro Val Trp 370 375 380 gtc gtc aag gga acc tgg aag aat tat ggt gtt tgaa 1189 Val Val Lys Gly Thr Trp Lys Asn Tyr Gly Val 385 390 395 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Sulfolobus solfataricus <400> 2 Met Arg Ile Arg Glu Ile Glu Pro Ile Val Leu Thr Ser Lys Glu Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ala Thr Trp Ala Ser Ile Met Ile Val Thr Arg Val Ile Thr 20 25 30 Glu Asn Gly Glu Val Gly Tyr Gly Glu Ala Val Pro Thr Leu Arg Val 35 40 45 Ile Ser Val Tyr Asn Ala Ile Lys Gln Val Ser Lys Ala Tyr Ile Gly 50 55 60 Lys Glu Val Glu Glu Val Glu Lys Asn Tyr His Glu Trp Tyr Lys Gln 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Leu Ala Arg Ser Phe Glu Ser Ala Thr Ala Val Ser Ala 85 90 95 Ile Asp Ile Ala Ser Trp Asp Ile Ile Gly Lys Glu Leu Gly Ala Pro 100 105 110 Ile His Lys Leu Leu Gly Gly Lys Thr Arg Asp Arg Val Pro Val Tyr 115 120 125 Ala Asn Gly Trp Tyr Gln Asp Cys Val Thr Pro Glu Glu Phe Ala Glu 130 135 140 Lys Ala Lys Asp Val Val Lys Met Gly Tyr Lys Ala Leu Lys Phe Asp 145 150 155 160 Pro Phe Gly Pro Tyr Tyr Asp Trp Ile Asp Glu Arg Gly Leu Arg Glu 165 170 175 Ala Glu Glu Arg Val Lys Ala Val Arg Glu Ala Val Gly Asp Asn Val 180 185 190 Asp Ile Leu Ile Glu His His Gly Arg Phe Asn Ala Asn Ser Ala Ile 195 200 205 Met Ile Ala Lys Arg Leu Glu Lys Tyr Asn Pro Gly Phe Met Glu Glu 210 215 220 Pro Val His His Glu Asp Val Ile Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Ala Ser 225 230 235 240 Thr His Leu Arg Val Ala Leu Gly Glu Arg Leu Ile Ser Glu Lys Glu 245 250 255 Thr Ala Phe Tyr Val Glu Glu Gly Leu Val Asn Ile Leu Gln Pro Asp 260 265 270 Leu Thr Asn Ile Gly Gly Val Thr Val Gly Arg Ser Val Ile Lys Ile 275 280 285 Ala Glu Ala Asn Asp Val Glu Val Ala Phe His Asn Ala Phe Gly Ser 290 295 300 Ile Gln Asn Ala Val Glu Ile Gln Leu Ser Ala Val Thr Gln Asn Leu 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Glu Asn Phe Tyr Asp Trp Phe Pro Gln Trp Lys Arg Asp 325 330 335 Leu Val Tyr Asn Glu Thr Pro Val Glu Gly Gly His Val Lys Val Pro 340 345 350 Tyr Lys Pro Gly Leu Gly Val Ser Ile Asn Glu Lys Ile Ile Glu Gln 355 360 365 Leu Arg Ala Glu Pro Ile Pro Leu Asp Val Ile Glu Glu Pro Val Trp 370 375 380 Val Val Lys Gly Thr Trp Lys Asn Tyr Gly Val 385 390 395 <210> 3 <211> 4050 <212> DNA <213> Sulfolobus solfataricus <220> <221> gene <222> (208)..(1396) <223> Open Reading Frame encoding gluconate dehydratase from Sulfolobus solfataricus <220> <221> promoter <222> (20)..(32) <223> T7 promoter <220> <221> gene <222> (100)..(207) <223> His-tag fusion region <220> <221> gene <222> (2149)..(2963) <223> Ampicillin resistance gene <400> 3 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccatg agaatcagag aaatagaacc aatagtactc 240 acctcgaaag agaaaggaag tgcaacttgg gcatctataa tgattgtcac aagggtcatt 300 acggaaaatg gggaagtagg ctatggtgag gcagtaccca cactaagagt tatatctgta 360 tataacgcaa ttaaacaagt tagtaaggct tatataggga aagaggtaga ggaagttgag 420 aagaactatc atgaatggta taaacaagat ttctatttag ctaggtcttt tgaatcagca 480 actgcagtaa gtgcaatcga tatagcctca tgggatataa tagggaaaga gcttggagca 540 ccaattcata aattattagg aggaaaaacc agggataggg taccagtcta cgcaaacgga 600 tggtatcagg actgcgtaac tccagaggaa tttgcggaaa aggcaaaaga cgttgtaaag 660 atgggatata aggctttaaa atttgatccg tttggtccat attacgattg gatagatgag 720 agaggtctaa gagaagctga ggagagagta aaggctgtta gagaggcagt tggagacaac 780 gtggatattt taatagagca tcacggtagg tttaatgcga attcggctat tatgatagcg 840 aaaagattgg aaaaatacaa tccgggattt atggaggaac cggtacatca tgaggacgta 900 attggtttaa gaaagtataa agccagtact catttaaggg ttgcattggg agaaagactg 960 ataagtgaaa aggaaactgc gttttacgtt gaggaaggtc ttgtaaacat attgcaacca 1020 gatttaacta atataggtgg tgtaacagta ggtaggagtg ttataaaaat agctgaagct 1080 aatgatgtag aggtggcttt tcacaacgcc tttggttcaa tacagaatgc agttgaaata 1140 caactaagtg cagttacaca gaatttgtat ttacttgaga acttctatga ttggttccct 1200 cagtggaaaa gggatttagt atataatgaa acgccagttg aaggaggtca cgttaaggtt 1260 ccatacaagc ctggactagg tgtttcaatt aatgaaaaaa taatagaaca gctaagagct 1320 gaaccaatac cattagatgt aattgaagaa ccggtttggg tcgtcaaggg aacctggaag 1380 aattatggtg tttgaaagct tgatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 1440 gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 1500 aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggatctg gcgtaatagc gaagaggccc 1560 gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgggac gcgccctgta 1620 gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 1680 gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 1740 ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 1800 acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 1860 agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 1920 aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 1980 cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2040 acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 2100 tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 2160 ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc 2220 ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt 2280 gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct 2340 caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac 2400 ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact 2460 cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa 2520 gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga 2580 taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt 2640 tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga 2700 agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg 2760 caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat 2820 ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat 2880 tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc 2940 agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga 3000 tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc 3060 agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag 3120 gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc 3180 gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt 3240 tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt 3300 gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat 3360 accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc 3420 accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa 3480 gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg 3540 ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag 3600 atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag 3660 gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa 3720 cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt 3780 gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg 3840 gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc 3900 tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac 3960 cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct 4020 ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 4050 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Sulfolobus solfataricus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> N-terminal amino acid sequence from the gluconate dehydratase purified from Sulfolobus solfataricus <400> 4 Met Arg Ile Arg Glu Ile Glu Pro Ile Val 1 5 10 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer with BamHI restriction site <400> 5 cgggatccat gagaatcaga gaaatagaac 30 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer with HindIII restriction site <400> 6 cccaagcttt caaacaccat aattacag 28

Claims (1)

1. 아미노에틸기, 디에틸아미노에틸기, 트리메틸아미노메틸기, 트리에틸아미노에틸기, 디메틸-2-히드록시에틸아미노메틸기, 디에틸-2-히드록시에틸아미노에틸기, 헥실, 옥틸, 페닐, 및 히드록시아파티트(hyroxylapatite)로 이루어지는 군에서 1종 이상 선택되는 기능기가 결합된 레진 매트릭스로 충진된 칼럼으로 글루코네이트 탈수효소를 생산하는 미생물의 배양용액 또는 미생물 세포를 통과시켜 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하고,

   상기 레진 매트릭스는 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 및폴리스티렌으로 이루어진 군에서 선택되는 것이며,

   상기 미생물은 술포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 술포로버스 액시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 술포로버스 쉬바테(Sulfolobus shibatae), 술포로버스 토코다이(Sulfolobus tokodaii), 술포로버스 메탈리쿠스(Sulfolobus metallicus), 술포로버스 하코넨시스(Sulfolobus hakonensis), 술포로버스 브리에르레이(Sulfolobus brierleyi), 술포로버스 이스라디쿠스(Sulfolobus islandicus), 술포로버스 텡총엔시스(Sulfolobus tengchongensis), 술포로버스 쑤리지엔시스(Sulfolobus thuringiensis), 술포로버스 양민젠시스(Sulfolobus yangmingensis), 술포로버스속 균주, 써모플라즈마 액시도필럼(Thermoplasma acidophilum), 써모플라즈 볼카니움(Thermoplasma volcanium), 및 페로플라즈마 액시도필럼(Ferroplasma acidophilum)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인,

   글루코네이트 탈수효소의 정제방법.

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