CN111218488B - 一种利用大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3用于生产2’‑岩藻糖基乳糖的用途，所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3的保藏号为CCTCC 2018200。本发明利用高产可拉酸的大肠杆菌菌种Escherichia coli S17‑3以乳糖作为唯一底物从头合成2’‑岩藻糖基乳糖，没有外源表达GDP‑L‑岩藻糖的合成途径。本发明生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的发酵方法，将其发酵产量提高了10倍以上，最高产量达到617.0mg/L，产量大大提高。

Description

一种利用大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术

近年来，许多研究表明母乳寡糖(HMOs)通过抵御胃肠道病原微生物感染和维持胃肠 道微生态平衡，对婴儿的健康成长具有若干积极方面的作用。与其他哺乳动物乳相比，人 乳有很多独特的低聚糖，可为人类健康提供各种生物活性，如益生元效应，预防病原体感 染和免疫系统调节。据文献报道，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是参与如上所述生物功能的主 要人乳寡糖之一，这使得该功能性寡糖在营养保健和药物用途方面受到极大关注。

最简单的HMO是三糖或短链乳寡糖。2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL；Fuc-α1,2-Gal-β1,4-Glc)是母 乳中最丰富的单岩藻糖基乳糖衍生物。研究显示，HMOs对婴儿的几种有益作用，包括选 择性增强双歧杆菌生长，对病原体的抗粘附作用和对肠上皮细胞的糖组变化作用。此外， 婴儿的营养中含有2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)与较低的腹泻率相关，如果能以足够的量和合 理的价格获得，则使2’-FL成为潜在的营养补充剂和治疗剂。

鉴于寡糖的重要生物功能和生理活性,为阐明其作用机制,需要制备大量结构均一的该 类化合物，然而从天然产物中分离提取所得到的量很少，远不及研究的需要，因此通过人 工合成的方法获得该类化合物就成为最佳选择。目前寡糖的合成策略主要包括：酶法合成(化 学酶法)以及单细胞发酵合成。

酶法合成中，利用糖苷酶催化合成寡糖有两种模式：其一是逆水解反应，是单糖与醇 的缩合反应，水是离去基团，这一过程是以游离糖为底物，称为“直接糖基化”或“逆水解”过程，但这一过程得到的产物通常收率比较低。所以目前应用较多的是第二种模式： 转糖基反应(transglycosylation),离去基团通常是特定活化的苷元或糖基。

近年来不断有文献报道实现了在微生物体内合成2’-FL。

等利用乳糖和甘 油作为底物，将来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)的岩藻糖基化酶(FutC) 整合至大肠杆菌JM109的基因组，首次实现了大肠杆菌无抗生素筛选生产2’-FL，最终补料 分批发酵培养的浓度为20.28g/L；Lee等只利用乳糖作为底物，通过过表达内源GDP-L-fucose合成酶以及异源岩藻糖基转移酶，在分批补料发酵实验中，得到2’-FL的最大终浓度为1.23g/L；Christoph等克隆并过表达来自H.pylori的α-1，2-fucosyltransferase (FucT2)，以酶合成的GDP-L-fucose和乳糖为底物合成2’-FL，使用阴离子交换色谱和凝 胶过滤得到2’-FL的分离产率为65％；Chin等在工程化改造的大肠杆菌BL21中，通过修 饰乳糖操纵子为lacZΔM15，同时在异源表达FucT2的N端添加三个天冬氨酸盐分子，最 终分批补料发酵获得的2’-FL终浓度为6.4g/L；Huang等在大肠杆菌中，通过筛选高效的 岩藻糖基转移酶和宿主菌株，提升供体GDP-L-fucose和受体乳糖的活性，并提升辅因子 NADPH的含量，最终得到的2’-FL和3’-FL终浓度分别为9.12g/L和12.43g/L。

在现有的研究结果中，大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖的生物合成依赖T7表达系统，而 通常T7表达系统需要添加诱导剂，以IPTG诱导为例，其因为具有毒性而不能被用于食品类物质的生物合成。同时这些合成通路需要过表达GDP-L-岩藻糖的合成途径或者表达其补偿途径，通常底物之一为较为昂贵的岩藻糖。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种埃希氏菌属大肠杆 菌种Escherichia coli S17-3生产2’-岩藻糖基乳糖的方法。旨在解决现有大肠杆菌种分泌2’- 岩藻糖基乳糖效率低的问题。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3用于生产2’- 岩藻糖基乳糖的用途。

所述大肠杆菌种为实验室保藏的模式大肠杆菌菌种Escherichia coli S17-1的突变菌株， 菌株S17-3已于2018年4月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC 2018200。

本发明分离的埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3，此菌为两端钝圆的短杆 菌，大小约0.5–3.0um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐。

具体的，采用埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3生产2’-岩藻糖基乳糖时，包 括步骤：将埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3作为生产菌种，进行培养，并收集 分泌物，分离获得2’-岩藻糖基乳糖。

所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3中，SEQ ID NO.7所示的序列被敲除。

进一步地，能够表达α-1,2岩藻糖基转移酶的质粒转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli，将重 组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli用于生产2’-岩藻糖基乳糖。

可选的，α-1,2岩藻糖基转移酶的序列如SEQ ID NO.1所示。该序列为人工合成序列， 编码的蛋白质氨基酸由黄笛等人报道于Metabolic Engineering 41(2017)23–38,“Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 2’-fucosyllactose and 3-fucosyllactose through modular pathway enhancement”,具体为：

ATGGCTTTCAAAGTTGTTCAGATCTGCGGTGGTCTGGGTAACCAGATGTTCCAGTA CGCTTTCGCTAAATCTCTGCAGAAACACTCTAACACCCCGGTTCTGCTGGACATCACCT CTTTCGACTGGTCTGACCGTAAAATGCAGCTGGAACTGTTCCCGATCGACCTGCCGTAC GCTTCTGCTAAAGAAATCGCTATCGCTAAAATGCAGCACCTGCCGAAACTGGTTCGTGA CGCTCTGAAATGCATGGGTTTCGACCGTGTTTCTCAGGAAATCGTTTTCGAATACGAACCGAAACTGCTGAAACCGTCTCGTCTGACCTACTTCTTCGGTTACTTCCAGGACCCGCGT TACTTCGACGCTATCTCTCCGCTGATCAAACAGACCTTCACCCTGCCGCCGCCGCCGGA AAACAACAAAAACAACAACAAAAAAGAAGAAGAATACCAGTGCAAACTGTCTCTGAT CCTGGCTGCTAAAAACTCTGTTTTCGTTCACATCCGTCGTGGTGACTACGTTGGTATCG GTTGCCAGCTGGGTATCGACTACCAGAAAAAAGCTCTGGAATACATGGCTAAACGTGT TCCGAACATGGAGCTCTTCGTGTTCTGCGAGGACCTGGAATTTACCCAGAACCTGGAC CTGGGTTACCCGTTCATGGACATGACCACCCGTGACAAAGAAGAAGAAGCGTACTGGG ACATGCTGCTGATGCAGTCTTGCCAGCACGGTATCATCGCTAACTCTACCTACTCTTGGT GGGCTGCTTACCTGATCGAAAACCCGGAAAAAATCATCATCGGTCCGAAACACTGGCT GTTCGGTCACGAAAACATCCTGTGCAAAGAATGGGTTAAAATCGAATCTCACTTCGAAGTTAAATCTCAGAAATACAACGCTTAA。(SEQ ID NO 1)

可选的，所述能够表达α-1,2岩藻糖基转移酶的质粒为pMK4-pxylA-FutC。

所述质粒pMK4-pxylA-FutC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体为：

GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCT GGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGA GTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC AAGCTTGGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCTAGAATCTAATATTATAACTAAATTTTCTAAAAAAAACATTGGAATAGACATTTATTTTGTATATGATGAAATAAAGTTAGTTTA TTGGATAAACAAACTAACTTTATTAAGGTAGTTGATGGATAAACTTGTTCACTTAAATCA ACCCGGGAACAAGGAGGAATAAAAAATGGCTTTCAAAGTTGTTCAGATCTGCGGTGGT CTGGGTAACCAGATGTTCCAGTACGCTTTCGCTAAATCTCTGCAGAAACACTCTAACAC CCCGGTTCTGCTGGACATCACCTCTTTCGACTGGTCTGACCGTAAAATGCAGCTGGAAC TGTTCCCGATCGACCTGCCGTACGCTTCTGCTAAAGAAATCGCTATCGCTAAAATGCAG CACCTGCCGAAACTGGTTCGTGACGCTCTGAAATGCATGGGTTTCGACCGTGTTTCTCA GGAAATCGTTTTCGAATACGAACCGAAACTGCTGAAACCGTCTCGTCTGACCTACTTCT TCGGTTACTTCCAGGACCCGCGTTACTTCGACGCTATCTCTCCGCTGATCAAACAGACC TTCACCCTGCCGCCGCCGCCGGAAAACAACAAAAACAACAACAAAAAAGAAGAAGA ATACCAGTGCAAACTGTCTCTGATCCTGGCTGCTAAAAACTCTGTTTTCGTTCACATCC GTCGTGGTGACTACGTTGGTATCGGTTGCCAGCTGGGTATCGACTACCAGAAAAAAGC TCTGGAATACATGGCTAAACGTGTTCCGAACATGGAGCTCTTCGTGTTCTGCGAGGACC TGGAATTTACCCAGAACCTGGACCTGGGTTACCCGTTCATGGACATGACCACCCGTGACAAAGAAGAAGAAGCGTACTGGGACATGCTGCTGATGCAGTCTTGCCAGCACGGTATCA TCGCTAACTCTACCTACTCTTGGTGGGCTGCTTACCTGATCGAAAACCCGGAAAAAATC ATCATCGGTCCGAAACACTGGCTGTTCGGTCACGAAAACATCCTGTGCAAAGAATGGG TTAAAATCGAATCTCACTTCGAAGTTAAATCTCAGAAATACAACGCTTAAATGAATTCA CTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCG CCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGAT CGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCT CCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTC TGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGA CGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCT GCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGT GATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGC ACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAAT ATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTT CCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGG GTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTT TCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGG TATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAG AATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTT CTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATC ATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGA GCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGC GAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGT TGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTG GAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA GACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTT TACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGA AGATCCATATCCTTCTTTTTCTGAACCGACTTCTCCTTTTTCGCTTCTTTATTCCAATTGC TTTATTGACGTTGAGCCTCGGAACCCTTAACAATCCCAAAACTTGTCGAATGGTCGGCT TAATAGCTCACGCTATGCCGACATTCGTCTGCAAGTTTAGTTAAGGGTTCTTCTCAACGCACAATAAATTTTCTCGGCATAAATGCGTGGTCTAATTTTTATTTTTAATAACCTTGATAGC AAAAAATGCCATTCCAATACAAAACCACATACCTATAATCGATAACCACATAACAGTCAT AAAACCACTCCTTTTTAACAAACTTTATCACAAGAAATATTTAAATTTTAAATGCCTTTA TTTTGAATTTTAAGGGGCATTTTAAAGATTTAGGGGTAAATCATATAGTTTTATGCCTAAA AACCTACAGAAGCTTTTAAAAAGCAAATATGAGCCAAATAAATATATTCTAATTCTACAA ACAAAAATTTGAGCAAATTCAGTGTCGATTTTTTAAGACACTGCCCAGTTACATGCAAA TTAAAATTTTCATGATTTTTTATAGTTCCTAACAGGGTTAAAATTTGTATAACGAAAGTAT AATGTTTATATAACGTTAGTATAATAAAGCATTTTAACATTATACTTTTGATAATCGTTTAT CGTCGTCATCACAATAACTTTTAAAATACTCGTGCATAATTCAACAGCTGACCTCCCAAT AACTACATGGTGTTATCGGGAGGTCAGCTGTTAGCACTTATATTTTGTTATTGTTCTTCCT CGATTTCGTCTATCATTTTGTGATTAATTTCTCTTTTTTCTTGTTCTGTTAAGTCATAAAGT TCACTAGCTAAATACTCTTTTTGTTTCCAAATATAAAAAATTTGATAGATATATTCGGTTG GATCAATTTCTTTTAAGTAATCTAAATCCCCATTTTTTAATTTCTTTTTAGCCTCTTTAAAT AATCCTGAATAAACTAATACCTGTTTACCTTTAAGTGATTTATAAAATGCATCAAAGACT TTTTGATTTATTAAATAATCACTATCTTTACCAGAATACTTAGCCATTTCATATAATTCTTT ATTATTATTTTGTCTTATTTTTTGAACTTGAACTTGTGTTATTTCTGAAATGCCCGTTACATCACGCCATAAATCTAACCATTCTTGTTGGCTAATATAATATCTTTTATCTGTGAAATACGA TTTATTTACTGCAATTAACACATGAAAATGAGGATTATAATCATCTCTTTTTTTATTATATG TAATCTCTAACTTACGAACATATCCCTTTATAACACTACCTACTTTTTTTCTCTTTATAAGT TTTCTAAAAGAATTATTATAACGTTTTATTTCATTTTCTAATTCATCACTCATTACATTAGG TGTAGTCAAAGTTAAAAAGATAAACTCCTTTTTCTCTTGCTGCTTAATATATTGCATCATC AAAGATAAACCCAATGCATCTTTTCTAGCTTTTCTCCAAGCACAGACAGGACAAAATCG ATTTTTACAAGAATTAGCTTTATATAATTTCTGTTTTTCTAAAGTTTTATCAGCTACAAAA GACAGAAATGTATTGCAATCTTCAACTAAATCCATTTGATTCTCTCCAATATGACGTTTA ATAAATTTCTGAAATACTTGATTTCTTTGTTTTTTCTCAGTATACTTTTCCATGTTATAACA CATAAAAACAACTTAGTTTTCACAAACTATGACAATAAAAAAAGTTGCTTTTTCCCCTT TCTATGTATGTTTTTTACTAGTCATTTAAAACGATACATTAATAGGTACGAAAAAGCAAC TTTTTTTGCGCTTAAAACCAGTCATACCAATAACTTAAGGGTAACTAGCCTCGCCGGCA ATAGTTACCCTTATTATCAAGATAAGAAAGAAAAGGATTTTTCGCTACGCTCAAATCCTT TAAAAAAACACAAAAGACCACATTTTTTAATGTGGTCTTTTATTCTTCAACTAAAGCAC CCATTAGTTCAACAAACGAAAATTGGATAAAGTGGGATATTTTTAAAATATATATTTATGT TACAGTAATATTGACTTTTAAAAAAGGATTGATTCTAATGAAGAAAGCAGACAAGTAAG CCTCCTAAATTCACTTTAGATAAAAATTTAGGAGGCATATCAAATGAACTTTAATAAAAT TGATTTAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATATTTAATCATTATTTGAACCAACAAACGA CTTTTAGTATAACCACAGAAATTGATATTAGTGTTTTATACCGAAACATAAAACAAGAAG GATATAAATTTTACCCTGCATTTATTTTCTTAGTGACAAGGGTGATAAACTCAAATACAG CTTTTAGAACTGGTTACAATAGCGACGGAGAGTTAGGTTATTGGGATAAGTTAGAGCCA CTTTATACAATTTTTGATGGTGTATCTAAAACATTCTCTGGTATTTGGACTCCTGTAAAGA ATGACTTCAAAGAGTTTTATGATTTATACCTTTCTGATGTAGAGAAATATAATGGTTCGG GGAAATTGTTTCCCAAAACACCTATACCTGAAAATGCTTTTTCTCTTTCTATTATTCCATG GACTTCATTTACTGGGTTTAACTTAAATATCAATAATAATAGTAATTACCTTCTACCCATTA TTACAGCAGGAAAATTCATTAATAAAGGTAATTCAATATATTTACCGCTATCTTTACAGGTACATCATTCTGTTTGTGATGGTTATCATGCAGGATTGTTTATGAACTCTATTCAGGAATTG TCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAATATGAGATAATGCCGACTGTACTTTTTACA GTCGGTTTTCTAATGTCACTAACCTGCCCCGTTAGTTGAAGAAGGTTTTTATATTACAGC TCCAGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGT TTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGT TTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAG CGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAAC TCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGT GGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGC AGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCT ACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGG GAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGA GGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACG CCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCT TTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATA CCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAA GA(SEQ ID NO 2)。

本发明的第二方面提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括步骤：采用 埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分 离获得2’-岩藻糖基乳糖。

所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3中，SEQ ID NO.7所示的序列被敲除。

进一步地，所述方法包括步骤：将能够表达α-1,2岩藻糖基转移酶的质粒转染至埃希氏 菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种 Escherichia coli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli用于生产2’-岩藻糖基乳糖。

可选的，α-1,2岩藻糖基转移酶的序列如SEQ ID NO.1所示。

可选的，所述能够表达α-1,2岩藻糖基转移酶的质粒为pMK4-pxylA-FutC。

所述质粒pMK4-pxylA-FutC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

培养所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的培养基包括乳糖和甘油。

可选的，培养所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基础培养基可以为LB培养基。 所述基础培养基是指能够维持大肠杆菌种Escherichia coli S17-3活性的培养基。甘油和乳糖 是在基础培养基的基础上，额外加入培养基的。

进一步地，所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3采用摇床培养。

更进一步地，所述摇床培养转数为150-300rpm。经过试验发现，当摇床培养转数为150-300rpm均可以实现与实施例中所列举的摇床培养转数相同的效果。

进一步地，所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3培养的温度为37℃。摇瓶培养时不控 氧容量，生物反应器控制培养时设置氧容量为30％或以上。

进一步地，所述转染可以采用现有技术中的转染方法，例如电转染的方法。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用高产可拉酸的大肠杆菌菌种Escherichia coli S17-3以乳糖作为唯一底物 从头合成2’-岩藻糖基乳糖，没有外源表达GDP-L-岩藻糖的合成途径。

本发明生产2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的发酵方法，将其发酵产量提高了10 倍以上，最高产量达到617.0mg/L，产量大大提高。

本发明菌株保藏信息如下：

菌株名称：Escherichia coli S17-3

保藏号为：CCTCC 2018200；

保藏日期：2018年4月16日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院；

分类命名：大肠杆菌S17-3Escherichia coli S17-3。

附图说明

图1为表达质粒pMK4-pxylA-FutC的示意图；

图2高效液相色谱检测2’-岩藻糖基乳糖的出峰位置；

图3为重组大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖随发酵时间变化的示意图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特 定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施 方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通 常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域 常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1

1.敲除方法

通过NCBI基因组的数据库，获取大肠杆菌可拉酸的操作子序列，设计PCR引物，以大肠杆菌S17-3的菌液为模板，通过PCR反应，将SEQ ID NO.7所示wcaJ基因的上下游 序列各扩增300bp，得到wcaJ的相邻同源臂DNA。扩增上游同源片断时的引物分别为：

Ant-F:AGCGGTGAGATCAACAGCAAACTGG(SEQ ID NO.8)，以及

Ant-R:TAGGAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACACAATCGCTCCGTTGTTCCTGTTATTAGCCCCTTACCCG(SEQ ID NO.9)，由引物对Ant-F，Ant-R扩增上游同源臂片段 的PCR反应体系如下：

PCR程序如下：

1)95℃，3min；

2)95℃，15sec；

3)56℃，15sec；

4)72℃，2.5min；

5)循环从2)到4)，30次；

6)72℃，5min；

7)4℃，保存。

同样地，按照相同的PCR反应体系和PCR程序扩增后同源臂片段和抗性片段，扩增引 物为：

Pos-F:

AGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCTATGAGCTTACGTGAAAAAACCATCAGCGGC，(SEQ ID NO.10)

Pos-R:TCACTCAACAAAAACACCGCCACGC(SEQ ID NO.11)

中间含有卡那霉素抗性的DNA片断的扩增是通过引物对Fkan-F以及Fkan-R完成的

Fkan-F:GAGCGATTGTGTAGGCTGGAGCTG(SEQ ID NO.12)

Fkan-R:GAATTAGCCATGGTCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCC(SEQ ID NO.13)

PCR产物经回收纯化后,再利用overlap PCR连接三段PCR产物，overlap PCR反应体 系如下：

PCR程序如下：

1)95℃，3min；

2)95℃，15sec；

3)56℃，15sec；

4)72℃，2.5min；

5)循环从2)到4)，30次；

6)72℃，5min；

7)4℃，保存。

经PCR得到的PCR产物经Axygen PCR纯化后，转入大肠杆菌S17-3，转化子为抗卡那霉素阳性菌株。并

经验证，与保藏号为CCTCC 2018200的埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coliS17-3 相比，编码岩藻糖基转移酶WcaJ的DNA片断进行了原位基因敲除，敲除的DNA序列如SEQ ID NO.7所示。具体为：

atgacaaatctaaaaaagcgcgagcgagcgaaaaccaatgcatcgttaatctctatggtgcaacgcttttcagatatcaccatcatgttt gccggactatggctggtttgcgaagtcagcggactgtcattcctctacatgcacctgttggtggcgctgattacgctggtggtgttccagatgct gggcggcatcaccgatttttatcgctcatggcgcggtgttcgggcagcgacagaatttgccctgttgctacaaaactggaccttaagcgtgattt tcagcgccggactggtggcgttcaacaatgatttcgacacgcaactgaaaatctggctggcgtggtatgcgctgaccagcatcggactggtg gtttgccgttcgtgtattcgcattggggcgggctggctgcgtaatcatggctataacaagcgcatggtcgcggtggcgggggatttagccgcc gggcaaatgctgatggagagcttccgtaaccagccgtggttagggtttgaagtggtgggcgtttaccacgacccgaaaccgggcggcgtttc taacgactgggcgggtaacctgcaacagctggtcgaggacgcgaaagcgggcaagattcataacgtctatatcgcgatgcaaatgtgcgac ggcgcgcgagtgaaaaaactggtccatcaactggcggacaccacctgttcggtgctgctgatccccgacgtctttaccttcaacattctccatt cacgcctcgaagagatgaacggcgtaccggtggtgccgctttacgacacgccgctttccggggttaaccgcctgctcaaacgtgcggaaga cattgtgctggcgacgcttattctgctgctgatctccccggtgctgtgctgtattgcgctggcggtgaaactcagttcaccagggccggttatttt ccgccagactcgctacggcatggatggcaagccgatcaaagtgtggaagttccgttccatgaaagtgatggagaacgacaaagtggtgacc caggcgacgcagaacgatccgcgcgtcaccaaagtggggaactttctgcgccgtacctcgctggatgaattgccgcagtttatcaatgtgct gaccggggggatgtcgattgtcggtccacgtccgcacgcagtagcgcataacgaacagtatcgacagctcattgaaggctacatgctgcgc cataaggtgaaaccgggcattaccggctgggcgcagattaacggctggcgcggcgaaaccgacacgctggagaaaatggaaaaacgcgt cgagttcgaccttgagtacatccgcgaatggagcgtctggttcgatatcaaaatcgttttcctgacggtgttcaaaggtttcgttaacaaagcgg catattga

本发明中，利用敲除SEQ ID NO.7后的菌种进行后续2’-岩藻糖基乳糖的生产。

实施例2：重组质粒pMK4-pxylA-FutC的构建

首先通过PCR扩增从实验室储存的质粒pMK4-pxylA-GFP获得载体的表达元件，扩增 引物为：

pMK4-F:ATGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAAC(SEQ ID NO.3)

pMK4-R:TTTTTATTCCTCCTTGTTCCCGGGTTGATT(SEQ ID NO.4)

由引物对pMK4-F，pMK4-R扩增片段pMK4表达元件的PCR反应体系如下：

PCR程序如下：

1)95℃，3min；

2)95℃，15sec；

3)56℃，15sec；

4)72℃，2.5min；

5)循环从2)到4)，30次；

6)72℃，5min；

7)4℃，保存。

用于表达岩藻糖基转移酶FutC相关的核苷酸序列由金唯智生物技术公司利用DNA化 学合成法生成基因片段并构建至克隆载体pUC19。

同样地，按照相同的PCR反应体系和PCR程序扩增futC片段，其中模板为pUC19-FutC,扩 增引物为：

FutC-F:AAGGAGGAATAAAAAATGGCTTTCAAAGTTGTTCAGATCTGCG(SEQ ID NO.5) FutC-R:GGCCAGTGAATTCATTTAAGCGTTGTATTTCTGAGATTTAACTTCGAAGTG(SEQ ID NO.6)

PCR反应体系和程序与pMK4扩增相同。

PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化后，以ClonExpress II One StepCloning Kit连接，连接液转入大肠杆菌DH5α，从大肠杆菌中分离得到重组质粒pMK4-pxylA-FutC， 重组质粒的结构如图1所示。

实施例3：重组大肠杆菌在初始低pH值条件下发酵生产2’-岩藻糖基乳糖

以上述重组大肠杆菌为生产菌种，做摇瓶发酵：用接种环挑取重组大肠杆菌接种到装3 ml LB的试管，37℃，200r/min摇床过夜培养。将过夜培养的大肠杆菌以1％的接种量接 种到装有50mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中加10g/L的乳糖、20g/L的甘 油以及50ul的100ug/ml的氨苄抗生素，同样在37℃、200r/min摇床中进行发酵培养。培 养基初始pH使用3M的盐酸控制在pH 4.5。连续摇瓶发酵96h，以12h为时间间隔取样测 定2’-FL产量。

实施例4：2’-岩藻糖基乳糖的鉴定方法

本发明中大肠杆菌发酵产物中的2’-岩藻糖基乳糖是用高效液相色谱来定量检测的。发 酵液中的物质主要包括2’-岩藻糖基乳糖，乳糖，葡萄糖，甘油，乙酸等。本实验室所用仪 器是RID-10A/SPD-20A。具体检测方法如下：

标准曲线的制作方法为：各种标准品配制成10个梯度浓度，然后按低浓度到高浓度进 行液相分析，以各个浓度的标准品吸收峰的峰面积为横坐标，对应的配制浓度为纵坐标， 绘制曲线。发酵液中样品按照相对应的标准曲线计算浓度。

样品的制备：将发酵结束后得到的发酵液经12,000×g高速离心，10min，去掉菌体留 下上清液，上清液用娃哈哈超纯水进行稀释，稀释倍数由发酵液的不同进行适量调整。稀 释好的样品经0.22μm的水相滤膜过滤后取200μL置于液相衬管内，再置于液相小瓶中。样品分析条件：选用Aminex HPX-87H色谱柱(安捷伦公司)，检测器为RID-10A折光示差 检测器(日本岛津公司)。分析方法中，色谱柱温箱温度65℃，选用的流动相为0.005moL/L 的H₂SO4，流速为0.6mL/min，进样体积为20μL，单个样品的检测时间为25min。

样品分析方法：本研究课题中定量分析发酵液各种成分采用的是外标法。根据之前绘制好 的标准品峰面积与浓度关系的标准曲线，通过分析样品的出峰面积计算出对应的浓度。

经鉴定，本发明获得的蛋白的氨基酸序列为

MTNLKKRERAKTNASLISMVQRFSDITIMFAGLWLVCEVSGLSFLYMHLLVALITLVVFQ MLGGITDFYRSWRGVRAATEFALLLQNWTLSVIFSAGLVAFNNDFDTQLKIWLAWYALTS IGLVVCRSCIRIGAGWLRNHGYNKRMVAVAGDLAAGQMLMESFRNQPWLGFEVVGVYH DPKPGGVSNDWAGNLQQLVEDAKAGKIHNVYIAMQMCDGARVKKLVHQLADTTCSVL LIPDVFTFNILHSRLEEMNGVPVVPLYDTPLSGVNRLLKRAEDIVLATLILLLISPVLCCIAL AVKLSSPGPVIFRQTRYGMDGKPIKVWKFRSMKVMENDKVVTQATQNDPRVTKVGNFL RRTSLDELPQFINVLTGGMSIVGPRPHAVAHNEQYRQLIEGYMLRHKVKPGITGWAQING WRGETDTLEKMEKRVEFDLEYIREWSVWFDIKIVFLTVFKGFVNKAAY(SEQ ID NO.14)。 证实为功能完全的α-1,2岩藻糖基转移酶。如图2和图3所示，实验数据表明，2’-岩藻糖基 乳糖的出峰位置为7.5min,在上述的发酵条件下，最终获得的2’-FL产量为0.617g/L。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干 改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不 脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修 饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实 施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种利用大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctttca aagttgttca gatctgcggt ggtctgggta accagatgtt ccagtacgct 60

ttcgctaaat ctctgcagaa acactctaac accccggttc tgctggacat cacctctttc 120

gactggtctg accgtaaaat gcagctggaa ctgttcccga tcgacctgcc gtacgcttct 180

gctaaagaaa tcgctatcgc taaaatgcag cacctgccga aactggttcg tgacgctctg 240

aaatgcatgg gtttcgaccg tgtttctcag gaaatcgttt tcgaatacga accgaaactg 300

ctgaaaccgt ctcgtctgac ctacttcttc ggttacttcc aggacccgcg ttacttcgac 360

gctatctctc cgctgatcaa acagaccttc accctgccgc cgccgccgga aaacaacaaa 420

aacaacaaca aaaaagaaga agaataccag tgcaaactgt ctctgatcct ggctgctaaa 480

aactctgttt tcgttcacat ccgtcgtggt gactacgttg gtatcggttg ccagctgggt 540

atcgactacc agaaaaaagc tctggaatac atggctaaac gtgttccgaa catggagctc 600

ttcgtgttct gcgaggacct ggaatttacc cagaacctgg acctgggtta cccgttcatg 660

gacatgacca cccgtgacaa agaagaagaa gcgtactggg acatgctgct gatgcagtct 720

tgccagcacg gtatcatcgc taactctacc tactcttggt gggctgctta cctgatcgaa 780

aacccggaaa aaatcatcat cggtccgaaa cactggctgt tcggtcacga aaacatcctg 840

tgcaaagaat gggttaaaat cgaatctcac ttcgaagtta aatctcagaa atacaacgct 900

taa 903

<210> 2

<211> 6666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgg 240

ctgcaggtcg acggatcccc gggaattcta gaatctaata ttataactaa attttctaaa 300

aaaaacattg gaatagacat ttattttgta tatgatgaaa taaagttagt ttattggata 360

aacaaactaa ctttattaag gtagttgatg gataaacttg ttcacttaaa tcaacccggg 420

aacaaggagg aataaaaaat ggctttcaaa gttgttcaga tctgcggtgg tctgggtaac 480

cagatgttcc agtacgcttt cgctaaatct ctgcagaaac actctaacac cccggttctg 540

ctggacatca cctctttcga ctggtctgac cgtaaaatgc agctggaact gttcccgatc 600

gacctgccgt acgcttctgc taaagaaatc gctatcgcta aaatgcagca cctgccgaaa 660

ctggttcgtg acgctctgaa atgcatgggt ttcgaccgtg tttctcagga aatcgttttc 720

gaatacgaac cgaaactgct gaaaccgtct cgtctgacct acttcttcgg ttacttccag 780

gacccgcgtt acttcgacgc tatctctccg ctgatcaaac agaccttcac cctgccgccg 840

ccgccggaaa acaacaaaaa caacaacaaa aaagaagaag aataccagtg caaactgtct 900

ctgatcctgg ctgctaaaaa ctctgttttc gttcacatcc gtcgtggtga ctacgttggt 960

atcggttgcc agctgggtat cgactaccag aaaaaagctc tggaatacat ggctaaacgt 1020

gttccgaaca tggagctctt cgtgttctgc gaggacctgg aatttaccca gaacctggac 1080

ctgggttacc cgttcatgga catgaccacc cgtgacaaag aagaagaagc gtactgggac 1140

atgctgctga tgcagtcttg ccagcacggt atcatcgcta actctaccta ctcttggtgg 1200

gctgcttacc tgatcgaaaa cccggaaaaa atcatcatcg gtccgaaaca ctggctgttc 1260

ggtcacgaaa acatcctgtg caaagaatgg gttaaaatcg aatctcactt cgaagttaaa 1320

tctcagaaat acaacgctta aatgaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 1380

gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 1440

cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 1500

gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 1560

tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg 1620

ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 1680

gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 1740

gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 1800

gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 1860

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 1920

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 1980

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 2040

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 2100

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 2160

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 2220

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 2280

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 2340

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 2400

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 2460

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 2520

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 2580

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 2640

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 2700

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 2760

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 2820

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 2880

aagatccata tccttctttt tctgaaccga cttctccttt ttcgcttctt tattccaatt 2940

gctttattga cgttgagcct cggaaccctt aacaatccca aaacttgtcg aatggtcggc 3000

ttaatagctc acgctatgcc gacattcgtc tgcaagttta gttaagggtt cttctcaacg 3060

cacaataaat tttctcggca taaatgcgtg gtctaatttt tatttttaat aaccttgata 3120

gcaaaaaatg ccattccaat acaaaaccac atacctataa tcgataacca cataacagtc 3180

ataaaaccac tcctttttaa caaactttat cacaagaaat atttaaattt taaatgcctt 3240

tattttgaat tttaaggggc attttaaaga tttaggggta aatcatatag ttttatgcct 3300

aaaaacctac agaagctttt aaaaagcaaa tatgagccaa ataaatatat tctaattcta 3360

caaacaaaaa tttgagcaaa ttcagtgtcg attttttaag acactgccca gttacatgca 3420

aattaaaatt ttcatgattt tttatagttc ctaacagggt taaaatttgt ataacgaaag 3480

tataatgttt atataacgtt agtataataa agcattttaa cattatactt ttgataatcg 3540

tttatcgtcg tcatcacaat aacttttaaa atactcgtgc ataattcaac agctgacctc 3600

ccaataacta catggtgtta tcgggaggtc agctgttagc acttatattt tgttattgtt 3660

cttcctcgat ttcgtctatc attttgtgat taatttctct tttttcttgt tctgttaagt 3720

cataaagttc actagctaaa tactcttttt gtttccaaat ataaaaaatt tgatagatat 3780

attcggttgg atcaatttct tttaagtaat ctaaatcccc attttttaat ttctttttag 3840

cctctttaaa taatcctgaa taaactaata cctgtttacc tttaagtgat ttataaaatg 3900

catcaaagac tttttgattt attaaataat cactatcttt accagaatac ttagccattt 3960

catataattc tttattatta ttttgtctta ttttttgaac ttgaacttgt gttatttctg 4020

aaatgcccgt tacatcacgc cataaatcta accattcttg ttggctaata taatatcttt 4080

tatctgtgaa atacgattta tttactgcaa ttaacacatg aaaatgagga ttataatcat 4140

ctcttttttt attatatgta atctctaact tacgaacata tccctttata acactaccta 4200

ctttttttct ctttataagt tttctaaaag aattattata acgttttatt tcattttcta 4260

attcatcact cattacatta ggtgtagtca aagttaaaaa gataaactcc tttttctctt 4320

gctgcttaat atattgcatc atcaaagata aacccaatgc atcttttcta gcttttctcc 4380

aagcacagac aggacaaaat cgatttttac aagaattagc tttatataat ttctgttttt 4440

ctaaagtttt atcagctaca aaagacagaa atgtattgca atcttcaact aaatccattt 4500

gattctctcc aatatgacgt ttaataaatt tctgaaatac ttgatttctt tgttttttct 4560

cagtatactt ttccatgtta taacacataa aaacaactta gttttcacaa actatgacaa 4620

taaaaaaagt tgctttttcc cctttctatg tatgtttttt actagtcatt taaaacgata 4680

cattaatagg tacgaaaaag caactttttt tgcgcttaaa accagtcata ccaataactt 4740

aagggtaact agcctcgccg gcaatagtta cccttattat caagataaga aagaaaagga 4800

tttttcgcta cgctcaaatc ctttaaaaaa acacaaaaga ccacattttt taatgtggtc 4860

ttttattctt caactaaagc acccattagt tcaacaaacg aaaattggat aaagtgggat 4920

atttttaaaa tatatattta tgttacagta atattgactt ttaaaaaagg attgattcta 4980

atgaagaaag cagacaagta agcctcctaa attcacttta gataaaaatt taggaggcat 5040

atcaaatgaa ctttaataaa attgatttag acaattggaa gagaaaagag atatttaatc 5100

attatttgaa ccaacaaacg acttttagta taaccacaga aattgatatt agtgttttat 5160

accgaaacat aaaacaagaa ggatataaat tttaccctgc atttattttc ttagtgacaa 5220

gggtgataaa ctcaaataca gcttttagaa ctggttacaa tagcgacgga gagttaggtt 5280

attgggataa gttagagcca ctttatacaa tttttgatgg tgtatctaaa acattctctg 5340

gtatttggac tcctgtaaag aatgacttca aagagtttta tgatttatac ctttctgatg 5400

tagagaaata taatggttcg gggaaattgt ttcccaaaac acctatacct gaaaatgctt 5460

tttctctttc tattattcca tggacttcat ttactgggtt taacttaaat atcaataata 5520

atagtaatta ccttctaccc attattacag caggaaaatt cattaataaa ggtaattcaa 5580

tatatttacc gctatcttta caggtacatc attctgtttg tgatggttat catgcaggat 5640

tgtttatgaa ctctattcag gaattgtcag ataggcctaa tgactggctt ttataatatg 5700

agataatgcc gactgtactt tttacagtcg gttttctaat gtcactaacc tgccccgtta 5760

gttgaagaag gtttttatat tacagctcca gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 5820

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 5880

gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 5940

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 6000

gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 6060

gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 6120

gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 6180

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 6240

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 6300

cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 6360

agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 6420

tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 6480

gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 6540

catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 6600

agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 6660

ggaaga 6666

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaattcac tggccgtcgt tttacaac 28

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttttattcc tccttgttcc cgggttgatt 30

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaggaggaat aaaaaatggc tttcaaagtt gttcagatct gcg 43

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggccagtgaa ttcatttaag cgttgtattt ctgagattta acttcgaagt g 51

<210> 7

<211> 1395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgacaaatc taaaaaagcg cgagcgagcg aaaaccaatg catcgttaat ctctatggtg 60

caacgctttt cagatatcac catcatgttt gccggactat ggctggtttg cgaagtcagc 120

ggactgtcat tcctctacat gcacctgttg gtggcgctga ttacgctggt ggtgttccag 180

atgctgggcg gcatcaccga tttttatcgc tcatggcgcg gtgttcgggc agcgacagaa 240

tttgccctgt tgctacaaaa ctggacctta agcgtgattt tcagcgccgg actggtggcg 300

ttcaacaatg atttcgacac gcaactgaaa atctggctgg cgtggtatgc gctgaccagc 360

atcggactgg tggtttgccg ttcgtgtatt cgcattgggg cgggctggct gcgtaatcat 420

ggctataaca agcgcatggt cgcggtggcg ggggatttag ccgccgggca aatgctgatg 480

gagagcttcc gtaaccagcc gtggttaggg tttgaagtgg tgggcgttta ccacgacccg 540

aaaccgggcg gcgtttctaa cgactgggcg ggtaacctgc aacagctggt cgaggacgcg 600

aaagcgggca agattcataa cgtctatatc gcgatgcaaa tgtgcgacgg cgcgcgagtg 660

aaaaaactgg tccatcaact ggcggacacc acctgttcgg tgctgctgat ccccgacgtc 720

tttaccttca acattctcca ttcacgcctc gaagagatga acggcgtacc ggtggtgccg 780

ctttacgaca cgccgctttc cggggttaac cgcctgctca aacgtgcgga agacattgtg 840

ctggcgacgc ttattctgct gctgatctcc ccggtgctgt gctgtattgc gctggcggtg 900

aaactcagtt caccagggcc ggttattttc cgccagactc gctacggcat ggatggcaag 960

ccgatcaaag tgtggaagtt ccgttccatg aaagtgatgg agaacgacaa agtggtgacc 1020

caggcgacgc agaacgatcc gcgcgtcacc aaagtgggga actttctgcg ccgtacctcg 1080

ctggatgaat tgccgcagtt tatcaatgtg ctgaccgggg ggatgtcgat tgtcggtcca 1140

cgtccgcacg cagtagcgca taacgaacag tatcgacagc tcattgaagg ctacatgctg 1200

cgccataagg tgaaaccggg cattaccggc tgggcgcaga ttaacggctg gcgcggcgaa 1260

accgacacgc tggagaaaat ggaaaaacgc gtcgagttcg accttgagta catccgcgaa 1320

tggagcgtct ggttcgatat caaaatcgtt ttcctgacgg tgttcaaagg tttcgttaac 1380

aaagcggcat attga 1395

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcggtgaga tcaacagcaa actgg 25

<210> 9

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taggaacttc gaagcagctc cagcctacac aatcgctccg ttgttcctgt tattagcccc 60

ttacccg 67

<210> 10

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggaactaag gaggatattc atatggacca tggctaattc tatgagctta cgtgaaaaaa 60

ccatcagcgg c 71

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcactcaaca aaaacaccgc cacgc 25

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagcgattgt gtaggctgga gctg 24

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaattagcca tggtccatat gaatatcctc cttagttcc 39

<210> 14

<211> 464

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Thr Asn Leu Lys Lys Arg Glu Arg Ala Lys Thr Asn Ala Ser Leu

1 5 10 15

Ile Ser Met Val Gln Arg Phe Ser Asp Ile Thr Ile Met Phe Ala Gly

20 25 30

Leu Trp Leu Val Cys Glu Val Ser Gly Leu Ser Phe Leu Tyr Met His

35 40 45

Leu Leu Val Ala Leu Ile Thr Leu Val Val Phe Gln Met Leu Gly Gly

50 55 60

Ile Thr Asp Phe Tyr Arg Ser Trp Arg Gly Val Arg Ala Ala Thr Glu

65 70 75 80

Phe Ala Leu Leu Leu Gln Asn Trp Thr Leu Ser Val Ile Phe Ser Ala

85 90 95

Gly Leu Val Ala Phe Asn Asn Asp Phe Asp Thr Gln Leu Lys Ile Trp

100 105 110

Leu Ala Trp Tyr Ala Leu Thr Ser Ile Gly Leu Val Val Cys Arg Ser

115 120 125

Cys Ile Arg Ile Gly Ala Gly Trp Leu Arg Asn His Gly Tyr Asn Lys

130 135 140

Arg Met Val Ala Val Ala Gly Asp Leu Ala Ala Gly Gln Met Leu Met

145 150 155 160

Glu Ser Phe Arg Asn Gln Pro Trp Leu Gly Phe Glu Val Val Gly Val

165 170 175

Tyr His Asp Pro Lys Pro Gly Gly Val Ser Asn Asp Trp Ala Gly Asn

180 185 190

Leu Gln Gln Leu Val Glu Asp Ala Lys Ala Gly Lys Ile His Asn Val

195 200 205

Tyr Ile Ala Met Gln Met Cys Asp Gly Ala Arg Val Lys Lys Leu Val

210 215 220

His Gln Leu Ala Asp Thr Thr Cys Ser Val Leu Leu Ile Pro Asp Val

225 230 235 240

Phe Thr Phe Asn Ile Leu His Ser Arg Leu Glu Glu Met Asn Gly Val

245 250 255

Pro Val Val Pro Leu Tyr Asp Thr Pro Leu Ser Gly Val Asn Arg Leu

260 265 270

Leu Lys Arg Ala Glu Asp Ile Val Leu Ala Thr Leu Ile Leu Leu Leu

275 280 285

Ile Ser Pro Val Leu Cys Cys Ile Ala Leu Ala Val Lys Leu Ser Ser

290 295 300

Pro Gly Pro Val Ile Phe Arg Gln Thr Arg Tyr Gly Met Asp Gly Lys

305 310 315 320

Pro Ile Lys Val Trp Lys Phe Arg Ser Met Lys Val Met Glu Asn Asp

325 330 335

Lys Val Val Thr Gln Ala Thr Gln Asn Asp Pro Arg Val Thr Lys Val

340 345 350

Gly Asn Phe Leu Arg Arg Thr Ser Leu Asp Glu Leu Pro Gln Phe Ile

355 360 365

Asn Val Leu Thr Gly Gly Met Ser Ile Val Gly Pro Arg Pro His Ala

370 375 380

Val Ala His Asn Glu Gln Tyr Arg Gln Leu Ile Glu Gly Tyr Met Leu

385 390 395 400

Arg His Lys Val Lys Pro Gly Ile Thr Gly Trp Ala Gln Ile Asn Gly

405 410 415

Trp Arg Gly Glu Thr Asp Thr Leu Glu Lys Met Glu Lys Arg Val Glu

420 425 430

Phe Asp Leu Glu Tyr Ile Arg Glu Trp Ser Val Trp Phe Asp Ile Lys

435 440 445

Ile Val Phe Leu Thr Val Phe Lys Gly Phe Val Asn Lys Ala Ala Tyr

450 455 460

Claims (5)

1.一种重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3用于生产2’-岩藻糖基乳糖的用途，埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的保藏号为CCTCC NO：M2018200；

所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3中，如SEQ ID NO.7所示的序列被敲除；并将能够表达α-1,2岩藻糖基转移酶的质粒转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得所述重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3用于生产2’-岩藻糖基乳糖；

所述α-1,2岩藻糖基转移酶的序列如SEQ ID NO. 1所示；

所述能够表达α-1,2岩藻糖基转移酶的质粒为pMK4-pxylA-FutC。

2.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法至少包括以下步骤：采用重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得2’-岩藻糖基乳糖，埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的保藏号为：CCTCCNO：M2018200；所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3中，SEQ ID NO.7所示的序列被敲除；并将能够表达α-1,2岩藻糖基转移酶的质粒转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3用于生产2’-岩藻糖基乳糖；所述α-1,2岩藻糖基转移酶的序列如SEQ ID NO. 1所示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，培养所述重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的培养基中包括乳糖和甘油。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乳糖为用于合成2’-岩藻糖基乳糖的唯一底物。

5.一种发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌系统，其特征在于，所述系统包括生产菌种和表达质粒，所述生产菌种能够表达所述表达质粒，所述表达质粒能够表达α-1,2岩藻糖基转移酶，α-1,2岩藻糖基转移酶的序列如SEQ ID NO. 1所示；所述生产菌种还将埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3中SEQ ID NO.7所示的序列敲除，所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的保藏号为CCTCC NO：M2018200。

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