CN113999823B

CN113999823B - D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途

Info

Publication number: CN113999823B
Application number: CN202111639691.6A
Authority: CN
Inventors: 安祺; 田大勇; 解丽霞; 朱凤才
Original assignee: Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd; Shanghai Qingsai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN113999823A

Abstract

本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途，本发明提供的一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株，以麻疹病毒减毒株为骨架，将所述麻疹病毒减毒株中的融合蛋白编码基因F和血凝素蛋白编码基因H替换为包含D8基因型麻疹病毒的融合蛋白编码基因F和血凝素蛋白编码基因H的核苷酸序列；本发明通过以现有的麻疹疫苗减毒株（如Schwarz）为骨架，分别将其免疫原性蛋白F，H替换为D8基因型相关蛋白F，H，构建的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH（D8），对D8基因型麻疹病毒有更优的保护效果。

Description

D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途

技术领域

本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途。

背景技术

麻疹是一种由麻疹病毒（measles virus，MV）引起的以发热、呼吸道卡他症状和全身斑丘疹为特征的急性病毒性传染病，冬春季高发，严重危害儿童健康，随着麻疹减毒活疫苗的广泛使用，其发病率、死亡率大为下降。但据世界卫生组织(World HealthOrganization, WHO)报道，麻疹仍是严重威胁儿童健康的公共卫生问题之一。麻疹病毒只有一个血清型，却分8个基因组(A-H)，24个基因型，这些基因型都曾在世界范围内流行。

现在国内外的麻腮风联合减毒活疫苗中麻疹疫苗为A基因型麻疹病毒。Schwarz免疫后对A基因型麻疹保护效价显著高于对D8基因型麻疹病毒的保护效价。然而D8基因型麻疹是目前国外主要流行的基因型，因此，本发明提供一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途，对D8基因型麻疹病毒有更好的保护效果。

发明内容

因此，本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途，对D8基因型麻疹病毒有更好的保护效果。

本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种麻腮风联合减毒疫苗，将传统的麻腮风联合减毒活疫苗中的Schwarz麻疹疫苗替换为本发明的针对国内流行的D8基因型麻疹病毒的rMV/FH（D8），从而实现对D8基因型麻疹病毒更好的保护，可刺激机体产生抗麻疹病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒的免疫力。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株，以麻疹病毒减毒株为骨架，将所述麻疹病毒减毒株中的融合蛋白编码基因F和血凝素蛋白编码基因H替换为包含D8基因型麻疹病毒的融合蛋白编码基因F和血凝素蛋白编码基因H的核苷酸序列，包含D8基因型麻疹病毒的融合蛋白编码基因F和血凝素蛋白编码基因H的cDNA核苷酸序列具有如下（a）-（c）中的任意一种：

（a）具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其互补链；或

（b）在（a）中的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个或几个的核苷酸得到的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株，且可诱发哺乳动物对D8基因型麻疹病毒的免疫反应；或

（c）具有与（a）中的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列同源性为≥85％（较佳地≥90％，更佳地≥95％，例如，≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥ 90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％）的核苷酸序列，得到的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株，且可诱发哺乳动物对D8基因型麻疹病毒的免疫反应。

可选的，所述麻疹病毒减毒株为麻疹疫苗减毒株Schwarz，Shanghai-191，Moratern，或Rubeovax。

可选的，所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株命名为麻疹病毒rMV/FH（D8），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，保藏编号为CCTCC NO.V202185，保藏日期为2021年11月14日。

本发明提供了生物材料，包括如下1）-7）中的任意一种：

1）编码所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的重组DNA分子；或

2）含有所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或1）中所述的重组DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；或

3）含有所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的重组病毒；或

4）含有所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒或3）中所述的重组病毒或其传代培养病毒的疫苗；或

5）含有所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒或3）中所述的重组病毒或其传代培养病毒的疫苗组合物；或

6）含有所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒或3）中所述的重组病毒或其传代培养病毒的联合疫苗；或

7）含有所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒或3）中所述的重组病毒或其传代培养病毒的免疫原性制剂。

可选的，所述疫苗为减毒活疫苗或病毒样颗粒。

可选的，所述疫苗组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明提供了一种所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的制备方法，包括如下步骤：

构建所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的全长cDNA的质粒；

所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的拯救。

可选的，所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的拯救步骤包括如下步骤：

将所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的全长cDNA的质粒与麻疹相关辅助质粒共转染至宿主细胞中；

培养所述宿主细胞，然后洗涤，换液，继续培养，将细胞进行传代的同时加入新的细胞，继续培养，直至细胞出现融合病变，收集细胞培养上清。

可选的，所述麻疹相关辅助质粒为分别包含麻疹病毒中的N基因、P基因和L基因的质粒；

可选的，所述麻疹相关辅助质粒为pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L。

可选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述新的细胞为哺乳动物细胞。

可选的，所述宿主细胞为BSR-T7/5细胞，所述新的细胞为Vero-Slam细胞。

本发明提供了一种麻腮风联合减毒活疫苗，包括：

所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株；或

所述的生物材料；或

所述的制备方法制备得到的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株。

可选的，还包括腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒；和风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒；

所述腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒包括JL，S79或QS-F-SH2；

所述风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒包括BRD-II或RA27/3。

可选的，所述麻腮风联合减毒活疫苗每剂量中，所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒，腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒，和风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒的含量为：

D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒的活病毒不低于3.0 lgCCID₅₀；

腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒的活病毒不低于3.7 lgCCID₅₀；

风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒的活病毒不低于3.0 lgCCID₅₀。

可选的，所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒，腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒，和风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒的活病毒比例为1：20：1，比例关系为CCID₅₀：CCID₅₀：CCID₅₀。

可选的，还包括药学上可接受的载体和/或佐剂。

本发明提供了如下（1）-（4）任一项在制备疫苗制剂中的用途：

（1）所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株；或

（2）所述的生物材料；或

（3）所述的制备方法制备得到的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株；或

（4）所述的麻腮风联合减毒活疫苗。

可选的，所述用途为制备预防麻疹病毒的疫苗制剂中的用途。

可选的，所述麻疹病毒包括D8基因型麻疹病毒和/或A基因型麻疹病毒。

可选的，所述用途为制备经肌肉施用的疫苗制剂。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株，以麻疹病毒减毒株为骨架，将D8基因型麻疹病毒的融合蛋白的编码基因F和血凝素蛋白的编码基因H替换麻疹病毒减毒株的融合蛋白的编码基因F和血凝素蛋白的编码基因H；本发明通过以现有的麻疹疫苗株（如Schwarz）为骨架，分别将其免疫原性蛋白F,H蛋白替换为D8基因型相关蛋白F,H，构建的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH（D8），对D8基因型麻疹病毒有更好的保护效果。

2. 本发明提供的一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株，可以在鸡胚成纤维细胞中生长，解决了麻疹疫苗需在鸡胚成纤维细胞基质中进行生产，而D8基因型麻疹病毒不能适应鸡胚细胞的问题。

3. 本发明提供了一种麻腮风联合减毒疫苗，将传统的麻腮风联合减毒活疫苗中的A基因型麻疹疫苗替换为针对国内流行的D8基因型麻疹病毒的rMV/FH（D8），从而实现对D8基因型麻疹病毒更好的保护，可刺激机体产生抗麻疹病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒的免疫力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)的嵌合麻疹病毒骨架图；

图2是本发明目的质粒pMV/FH(D8)、pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L酶切鉴定结果；

图3是本发明实施例3中D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)鉴定结果；

图4是本发明实验例1中D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)及rMV病毒在体外的生长特性；

图5是本发明实验例2中D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)体外的免疫原性评价结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本发明的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株命名为麻疹病毒rMV/FH（D8），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，保藏编号为CCTCCNO.V202185，保藏日期为2021年11月14日。

下述实施例中的DMEM培养基是Gibco公司成品的DMEM培养基，货号：8121419。

下述实施例中涉及的嵌合病毒扩增及检测相关引物的序列见下表1，表1中的引物均由南京金斯瑞公司合成。表1中序列如序列表中SEQ ID NO.3- SEQ ID NO.32所示。

表1 嵌合病毒扩增及检测相关引物

下述实施例中的质粒pMV为以NCBI公布的Schwarz序列（GenBank:AF266291.1）为目标序列构建重组质粒pMV。由南京金斯瑞生物将Schwarz序列分为4段（1-4933bp为pSC-1，4917-9581bp为pSC-2，9560-13737bp为pSC-3，13720-15894bp为pSC-4），分别连接至pUC57载体的多克隆位点区。

以pAC载体（由华中农业大学提供，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示），用表1中的引物PAC-F和PAC-R使用诺唯赞生物公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase酶（货号：P505-d1）采用PCR的方法扩增获得片段PAC。

分别以pSC-1，pSC-2，pSC-3，pSC-4为模板，用表1中的引物SC-1-F，SC-1-R；SC-2-F，SC-2-R；SC-3-F，SC-3-R；SC-4-F，SC-4-R；使用诺唯赞生物公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase酶（货号：P505-d1）采用PCR的方法扩增获得片段SC-1，片段SC-2，片段SC-3，片段SC-4。

随后使用诺唯赞生物的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（货号：C115-01）试剂盒，将片段SC-1，SC-2，SC-3，SC-4及PAC同源重组获得全长质粒pMV。

下述实施例中使用的辅助质粒由如下方法制备：

以市售的质粒pcDNA3.1（＋）为模板，用表1中的引物pcDNA3.1-F和pcDNA3.1-R使用诺唯赞生物公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase酶（货号：P505-d1）采用PCR的方法扩增获得片段pcDNA3.1。

以pMV为模板，用表1中特异性引物对（MV-N-F，MV-N-R）、（MV-P-F，MV-P-R）、（MV-L-1-F，MV-L-1-R）、（MV-L-2-F，MV-L-2-R）使用诺唯赞生物公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase酶（货号：P505-d1）采用PCR的方法扩增获得片段N，片段P，片段L1，片段L2。

随后使用诺唯赞生物的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（货号：C115-01）试剂盒，将片段N和P分别与片段pcDNA3.1片段同源重组获得辅助质粒pcDNA3.1-N，pcDNA3.1-P。使用诺唯赞生物的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（货号：C115-01）试剂盒将片段L1、L2与片段pcDNA3.1三片段同源重组获得辅助质粒pcDNA3.1-L。通过酶切鉴定确定辅助质粒pcDNA3.1-N，pcDNA3.1-P，pcDNA3.1-L构建成功，如图2所示。

实施例1 D8基因型嵌合麻疹病毒全长cDNA的质粒的构建

本实施例提供了D8基因型嵌合麻疹病毒全长cDNA的质粒的构建方法，包括如下步骤：

（1）、以包含D8基因型麻疹病毒的融合蛋白的编码基因F和血凝素蛋白的编码基因H的核苷酸序列（该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，简称FH基因，由南京金斯瑞公司合成）为模板，利用表1中的特异性引物pSC-D-1-F和pSC-D-1-R，使用诺唯赞生物公司的PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase酶（货号：P505-d1）采用PCR的方法扩增FH基因。

（2）、以质粒pMV为模板，分别用表1中的特异性引物对（pSC-2-F，pSC-2-R）、（pSC-3-F，pSC-3-R）、（pSC-4-F，pSC-4-R）或（pSC-5-F，pSC-D-5-R），使用诺唯赞生物公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase酶（货号：P505-d1）进行PCR扩增，各自的PCR扩增体系如下表2。

表2、PCR扩增方法

反应程序：95℃3 min→（95℃15 s→58℃15 s→72℃）36个循环→72℃ 5 min→4℃。反应结束后，收集扩增产物。

（3）使用诺唯赞生物的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（货号：C115-01）试剂盒，将步骤（1）中的扩增得到的基因序列片段以及步骤（2）中扩增的基因序列片段同源重组，获得目的质粒pMV/FH(D8)，如图1所示的嵌合麻疹病毒骨架图。通过酶切鉴定确定目的质粒pMV/FH(D8)构建成功，酶切鉴定结果如图2所示。

实施例2 嵌合病毒拯救

大量提取pMV、pMV/FH(D8)和辅助质粒，共转染到细胞中进行病毒拯救。具体过程如下：

（1）、将BSR-T7/5细胞接种于六孔板中过夜培养，培养条件37℃、5％CO₂培养，培养基为DMEM培养基（含体积百分比10％Gibco的FBS血清和体积百分比1％硫酸庆大霉素），选择细胞汇合度80-90%的细胞孔用于病毒拯救；

（2）、将全长质粒pMV/FH(D8)(4μg)（或pMV(4μg)）、pcDNA3.1-N(1.5 μg)、pcDNA3.1-P(0.2 μg)、pcDNA3.1-L(1.0 μg)与LipofectamineTM 2000 转染试剂（Invitrogen公司的，货号：11668019）(12 μL)混合于500 μL DMEM培养基中，37℃孵育20min，得到质粒转染试剂混合物；

（3）、选择步骤（1）中细胞汇合度80-90%的细胞孔，用PBS洗涤细胞3次，而后将步骤（2）中的质粒转染试剂混合物加入洗涤后的细胞中，37℃、5％CO₂孵育6h。孵育后，用PBS洗涤3次，更换为含体积百分比2%胎牛血清，体积百分比1%硫酸庆大霉素的DMEM培养基（Gibco），37℃、5％CO₂继续培养3-4天后，将细胞按1:3进行传代，同时加入等数量的Vero-Slam细胞，继续培养，直至细胞出现融合病变，收集细胞培养上清，测序鉴定结果表明病毒拯救成功，D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)的鉴定结果见图3，分别获得D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)病毒液及rMV病毒液。所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)命名为麻疹病毒rMV/FH（D8），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，保藏编号为CCTCC NO.V202185，保藏日期为2021年11月14日。

实施例3 麻腮风联合减毒活疫苗

本实施例提供了一种麻腮风联合减毒活疫苗，每剂量中，包括：

实施例2中的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)，活病毒不低于3.0lgCCID₅₀；

腮腺炎病毒减毒株QS-F-SH2（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo:V201950，记载于中国专利文献CN111019910A中），活病毒不低于3.7lgCCID₅₀；

风疹病毒的减毒株RuV（购自ATCC，编号VR-1359），活病毒不低于3.0lgCCID₅₀。

上述麻腮风联合减毒活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

将实施例2中获得的rMV/FH(D8)病毒液、RuV病毒（购自ATCC，编号VR-1359）原液以及QS-F-SH2（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于中国专利文献CN111019910A）制成活病毒比例为1：20：1的冻干粉，（比例关系为CCID₅₀：CCID₅₀：CCID₅₀），然后采用注射水稀释至如下的滴度，每剂量中，包括：

腮腺炎病毒减毒株QS-F-SH2（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo:V201950，记载于中国专利文献CN111019910A中）活病毒不低于3.7lgCCID₅₀；

实验例1 嵌合病毒在体外的生长特性

为了评估嵌合病毒在体外的生长特性，在鸡胚成纤维细胞（CEF细胞）中研究嵌合病毒与其亲本病毒的多步生长曲线。具体过程如下：

制作CEF细胞悬液，细胞浓度在1.0×10⁵~5.0×10⁵个之间，将细胞按2×10⁵个/孔接种12孔板中，培养基为病毒生长液（购自Gibco公司的货号为259962的Bacto^TM TC 乳清蛋白水解物），培养条件35℃，5％CO₂。第二天待细胞长满90％左右，用PBS清洗细胞，以0.01MOI接种1ml病毒液（实施例2中获得的D8基因型嵌合麻疹病毒rMV/FH(D8)液或rMV病毒液），37℃、5％CO₂孵育1h，弃掉病毒液，用PBS润洗2遍，换维持液（购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199+）继续培养。随后每隔24小时进行取样，连续取5天。随后用微量细胞病变法检测病毒滴度。结果如图4所示，D8基因型嵌合麻疹病毒rMV/FH(D8)及rMV病毒在CEF细胞的生长曲线无显著性差异，说明本发明的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)可以在鸡胚成纤维细胞（CEF细胞）中生长，克服了D8基因型麻疹病毒不能适应鸡胚成纤维细胞缺陷。

实验例2嵌合病毒在体外的免疫原性评价

为了评估D8基因型嵌合麻疹病毒rMV/FH(D8)与腮腺炎，风疹病毒联合免疫的效果，在BALB/c小鼠模型上进行了评价。

实验方法：

将5周龄雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只，按表3中分组进行免疫。各组的一免病毒和二免病毒相同。各组的免疫病毒如下：

MMR1组：将实施例2中获得的rMV/FH(D8)病毒液及RuV病毒（购自ATCC，编号VR-1359）分别使用DMEM培养基稀释至3×10⁵CCID₅₀/ml，得到rMV/FH(D8)病毒稀释液和RuV病毒稀释液；将QS-F-SH2（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于中国专利文献CN111019910A中）使用DMEM培养基稀释至6×10⁶CCID₅₀/ml，得到QS-F-SH2病毒稀释液；随后分别取500μL上述的rMV/FH(D8)病毒稀释液，500μL上述的RuV病毒稀释液，500μL上述的QS-F-SH2病毒稀释液进行混合，获得1.5ml的病毒混合液，每次免疫取100μL所述病毒混合液用于实验；

MMR2组：将Schwarz病毒及RuV（购自ATCC，编号VR-1359）病毒分别使用DMEM培养基稀释至3×10⁵CCID₅₀/ml，得到Schwarz病毒稀释液和RuV病毒稀释液；将QS-F-SH2（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于中国专利文献CN111019910A中）使用DMEM培养基稀释至6×10⁶CCID₅₀/ml，得到QS-F-SH2病毒稀释液。上述Schwarz病毒为从美国佐治亚大学购买获得。随后分别取500μL上述的Schwarz病毒稀释液，500μL上述的RuV病毒稀释液，500μL上述的QS-F-SH2病毒稀释液进行混合，获得1.5ml的病毒混合液，每次免疫取100μL所述病毒混合液用于实验；

MUV组：为QS-F-SH2（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于中国专利文献CN111019910A中）使用DMEM培养基稀释至每100微升中活病毒含量为2×10⁵CCID₅₀；

rMV/FH(D8)组：为实施例2中的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株rMV/FH(D8)病毒液使用DMEM培养基稀释至每100微升中活病毒含量为1×10⁴CCID₅₀；

RuV组：为风疹病毒的减毒株RuV（购自ATCC，编号VR-1359）使用DMEM培养基稀释至每100微升中活病毒含量为1×10⁴CCID₅₀。

每组分别于一免后21天进行二次免疫，二免后14天进行眼眶采血，将采集的血液4℃过夜，于3000rpm离心10分钟，取血清。56℃灭活血清30分钟。每组血清进行检测，分别用MV-D8(由江苏省疾病预防控制中心（CDC）提供)，Schwarz(A基因型MV病毒，从美国佐治亚大学购买获得)，7#（F基因型腮腺炎（MUV）病毒，由江苏省疾病预防控制中心（CDC）提供），RA27/3(风疹（RuV）病毒，ATCC购买，编号：VR-1359)使用DMEM培养基稀释至选定滴度进行中和实验。

表3MMR免疫实验方案

腮腺炎病毒中和抗体测定方法：在96孔板中加入50 μL的样稀（Gibco的DMEM基础培养基）；使用96孔板进行稀释（2倍稀释），平行4孔，按照50 μL样稀和50 μL待检血清混合进行稀释，稀释比例为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024，1:2048混匀；稀释比例为1：2048的待检血清作为待检血清阴性对照（50μL），加入50μL样稀代替病毒，混匀。将不同稀释比例的待检血清（50μL）作为试验组，每孔加入50μL的1000CCID₅₀/mL腮腺炎病毒7#（F基因型MuV病毒），从高浓度到低浓度加样，混匀。制备Vero细胞悬液，细胞浓度为2.0×10⁵个/ml，按照100 μL /孔加于混有待测血清和腮腺炎病毒JL的96孔板中，然后培养，培养条件为37℃、5%CO₂，第7天观察细胞病变，并记录，第10天终判使用Reed/Muench法计算ED50。

麻疹病毒中和抗体测定方法：在96孔板中加入50 μL的样稀（Gibco的DMEM基础培养基）；使用96孔板进行稀释（2倍稀释），平行4孔，按照50 μL样稀和50 μL待检血清混合进行稀释，稀释比例为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256,1:512,1:1024,1:2048混匀；稀释比例为1：2048的待检血清作为待检血清阴性对照（50μL），加入50μL样稀代替病毒，混匀。将不同稀释比例的待检血清（50μL）作为试验组，每孔加入50μL的1000CCID₅₀/mL的A基因型麻疹病毒Schwarz或50μL的1000CCID₅₀/mL的D8基因型麻疹病毒MV-D8，从高浓度到低浓度加样，混匀。制备Vero-SLAM细胞悬液，细胞浓度为2.0×10⁵/ml，100 μL/孔加于混有待测血清和病毒的96孔板中，然后培养，培养条件为37℃、5%CO₂，第7天观察细胞病变，并记录，第10天终判使用Reed/Muench法计算ED50。

风疹病毒中和抗体测定方法：在96孔板中加入50 μL的样稀（Gibco的DMEM基础培养基）；使用96孔板进行稀释（2倍稀释），平行4孔，按照50 μL样稀和50 μL待检血清混合进行稀释，稀释比例为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256,1:512,1:1024,1:2048混匀；稀释比例为1：2048的待检血清稀释至2048作为待检血清阴性对照（50μL），加入50μL样稀代替病毒，混匀。将不同稀释比例的待检血清（50μL）作为试验组，每孔加入50μL的500CCID₅₀/mL风疹病毒RA27/3，从高浓度到低浓度加样，混匀。制备RK-13细胞悬液，细胞浓度为2.0×10⁵/ml，按照100 μL/孔加于混有待测血清和病毒的96孔板中，然后培养，培养条件为37℃、5%CO₂，第7天观察细胞病变，并记录，第10天终判使用Reed/Muench法计算ED50。

实验结果：

结果如图5所示，定量结果如表4所示。

表4、免疫原性评价结果

由图5和上表4可以看出，两次免疫rMV/FH(D8)(rMV/FH(D8)组)，对D8基因型麻疹病毒的中和滴度显著高于对A基因型麻疹病毒的中和滴度。联合免疫腮腺炎风疹时，Schwarz联合免疫腮腺炎风疹时（MMR2组）对A基因型麻疹病毒的中和滴度显著高于对D8基因型麻疹病毒的中和滴度，而本发明的rMV/FH(D8)联合免疫腮腺炎风疹时（MMR1组），不仅表现为对D8基因型麻疹病毒具有更显著的中和作用，同时对A基因型麻疹病毒的中和滴度显著高于MMR2组的对A基因型麻疹病毒的中和滴度。对腮腺炎病毒（F基因型）和风疹病毒的中和作用，同单独的腮腺炎病毒减毒株免疫（MuV组）比较，采用本发明的rMV/FH(D8)联合免疫腮腺炎风疹时对腮腺炎病毒的中和滴度相当，同单独的风疹病毒减毒株免疫（RuV组）比较，采用本发明的rMV/FH(D8)联合免疫腮腺炎风疹时对风疹病毒的中和滴度相当，由此可得出，本发明的rMV/FH(D8)联合免疫腮腺炎风疹对D8基因型麻疹、A基因型麻疹、风疹和腮腺炎均具有优良的免疫效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 北京赛尔富森生物科技有限公司

<120> D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggccaagga acatacacac tcgacagaac ccggaccccg gcccacgacg ccgcgccccc 60

atcccccgac aaccagaggg agcccccaac caaccccgcc ggctcccccg gcgcccacag 120

gcaggcacac caacccccga acagacccgg cacccagcca ccgacagtcc aagacggggg 180

gcccccccca aaaaaaggcc cccaggggcc gacagccagc accgcaagga agcccaccca 240

ccccacacac gaccacggca accgaaccag aatccagacc accctgggcc accagctccc 300

agattcggcc accaccccgc agaaaggaaa ggccacaatc cgcacacccc agccccgatc 360

cggcggacag ccacccaacc cgaaccagca cccaagagca atccctgaag gacccccgaa 420

ccgcaaacga catcagcatc ccacagcctc cccaagtccc cccatctcct cctcttcttg 480

aagagaccaa aagatcaatc caccacaccc gacgacactc atttccccac ccctaaagga 540

gacaccgaga atcccagaat caagactcat ccagtgtcca tcatgggtct caaggtgaac 600

gtctctgtca tagtcatggc agtactgtta actcttcaaa cacccaccgg tcaaatccat 660

tggggcaatc tctctaagat aggggtggta gggataggaa gtgcaagcta caaagttatg 720

actcgttcca gccatcaatc attagtcata aagttaatgc ccaatataac tctcctcaac 780

aactgcacga gggtagagat tgcagaatac aggagactac tgagaacagt tctggaacca 840

attagagatg cacttaatgc aatgactcag aatataagac cggttcagag tgtagcttca 900

agtaggagac acaagagatt tgcgggagtt gttctggcag gtgcggccct aggcgttgcc 960

acagctgctc agataacagc cggtattgca cttcaccagt ccatgctgaa ctctcaagcc 1020

atcgacaatc tgagagcgag cctggaaact accaatcagg caattgaggc aatcaggcaa 1080

gcagggcagg agatgatatt ggctgttcag ggtgtccaag actacatcaa taatgagctg 1140

ataccgtcta tgaaccaact atcttgtgat ttaatcggcc agaagctagg gctcaaattg 1200

ctcagatact atacagaaat cctgtcatta tttggcccca gcttacggga ccccatatct 1260

gcggagatat ctatccaggc tttgagctat gcgcttggag gagatatcaa taaggtgttg 1320

gaaaagctcg gatacagtgg aggtgatcta ctgggcatct tagagagcag aggaataaag 1380

gcccggataa ctcacgtcga cacagaggcc tacttcattg tactcagtat agcctatccg 1440

acgctgtccg agattaaagg ggtgattgtc caccggctag agggggtctc gtacaacata 1500

ggctctcaag agtggtatac cactgtgccc aagtatgttg caacccaagg gtaccttatc 1560

tcgaattttg atgagtcatc gtgcactttc atgccagagg ggactgtgtg cagccaaaat 1620

gccttgtacc cgatgagtcc tctgctccaa gaatgcctcc gggggtccac caagtcttgt 1680

gctcgtacac tcgtatccgg gtccttcggg aaccggttca ttttatcaca ggggaaccta 1740

atagccaatt gtgcatcaat cctttgcaag tgttacacaa caggaacgat cattaatcaa 1800

gaccctgaca agatcctaac gtacattgct gccgatcact gcccggtggt tgaagtgaat 1860

ggtgtgacca tccaagtcgg gagcaggagg tatccagacg ctgtgtactt gcacaggatt 1920

gacctcggtc ctcccatatc attggagagg ttggacgtag ggacaaatct ggggaatgca 1980

attgctaagt tggaggatgc caaggaattg ttggagtcat cggaccagat attgaggagt 2040

atgaaaggct tatcaagcac tagtatagtt tacatcctga ttgcagtgtg tcttggagga 2100

ttgataggga tccccgcttt aatatgttgc tgcagggggc gttgtaacaa gaagggagaa 2160

caagttggta tgtcaagacc aggcctaaag cctgatctta caggaacatc aaaatcctat 2220

gtaaggtcac tctgatcctc tacaactctt ggaacacaaa tgtcccacaa gtcccctctt 2280

cgtcatcaaa caaccaccgg agccagcatc aagcccatct gaaattgtct ccggcttccc 2340

tctggccgaa caatattggt agttaataaa aacttagggt gcaagatcat ccacaatgtc 2400

accacaacga gaccggataa atgccttcta caaagacaac ccccatccta agggaagtag 2460

gatagttatt aacagagaac atcttatgat tgatagacct tatgtcttgc tggctgttct 2520

attcgtcatg tttctgagct tgatcgggtt gctagccatt gcaggcatta gacttcatcg 2580

ggcagccatc tacaccgcag agatccataa aagcctcagc accaatctag atgtaactaa 2640

ctcaatcgag catcaggtta aggacgtgct gacaccactc ttcaagatca tcggtgacga 2700

agtgggcttg aggacacctc agagattcac tgacctagtg aaattcatct ctgacaagat 2760

taaattcctt aatccggata gggagtacga cttcagagat ctcacttggt gtatcaaccc 2820

gccagagaga atcaaattgg attatgatca atactgtgca gatgtggctg ctgaagaact 2880

catgaatgca ctggtgaact caactctact ggaggccagg gcaaccaatc agttcctagc 2940

tgtctcaaag ggaaactgct cagggcccac tacaatcaga ggtcaattct caaacatgtc 3000

gctgtccctg ttggacctgt atttaagtcg aggttacaat gtgtcatcta tagtcactat 3060

gacatcccag ggaatgtacg ggggaactta cctagttgaa aagcctaatc tgagcagcaa 3120

agagtcagag ttgtcacaac tgagcatgca ccgagtgttt gaagtaggtg ttatcagaaa 3180

tccgggtttg ggggctccgg tattccatat gacaaactat tttgagcaac cagtcagtaa 3240

tgacttcagc aactgcatgg tggctttggg ggagctcaag ttcgcagccc tctgtcacag 3300

ggaagattct atcacaattc cctatcaggg atcagggaaa ggtgtcagct tccagcttgt 3360

caagctaggt gtctggaaat ccccaaccga catgcaatcc tgggtccccc tatcaacgga 3420

tgatccagtg atagacaggc tttacctctc atctcacaga ggcgttatcg ctgacaatca 3480

agcaaaatgg gctgtcccga caacacggac agatgacaag ttgcgaatgg agacatgctt 3540

ccagcaggcg tgtaagggta aaatccaagc actctgcgag aatcccgagt ggacaccatt 3600

gaaggataac aggattcctt catacggggt cttgtctgtt gatctgagtc tgacagttga 3660

gcttaaaatc aaaattgctt caggattcgg gccattgatc acacacggtt cagggatgga 3720

cctatacaaa tccaaccaca acaatatgta ttggctgact atcccgccaa tgaagaacct 3780

ggccttaggt gtaatcaaca cattggagtg gataccgaga ttcaaggtta gtcccaacct 3840

cttcactgtt ccaattaagg aagcaggcga ggactgccat gccccaacat acctgcctgc 3900

ggaggtggat ggtgatgtca aactcagttc caatctggtg attttacctg gtcaagatct 3960

ccaatatgtt ttggcaacct atgatacttc cagagttgaa catgctgtag tttattacgt 4020

ttacagccca agccgctcat tttcttactt ttatcctttt aggttgccta taaaaggggt 4080

ccccattgaa ttacaagtag aatgcttcac atgggaccaa aaactctggt gtcgtcactt 4140

ctgtgtgctt gcggactcgg aatctggtgg acatatcact cactctggga tggtgggcat 4200

gggagtcagc tgcacagcca ctcgggaaga tggaaccaac cgcagatagg gctgccagtg 4260

agccaatcac atgatgtcac tcagacatca ggcatcccca ctagtgtgga atagacatca 4320

gaattaagaa aaa 4333

<210> 2

<211> 2631

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg 60

agctctgtac atgtccgcgg tcgcgacgta cgcgtatcga tggcgccagc tgcaggcggc 120

cgcgtaatac gactcactat agggggtcgg catggcatct ccacctcctc gcggtccgac 180

ctgggcatcc gaaggaggac gcacgtccac tcggatggct aagggagggg cactccgcgg 240

tcactgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac 300

tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg gagctgtcga 360

cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 420

tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 480

gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 540

cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 600

atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 660

agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg 720

gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 780

ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 840

cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 900

ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 960

atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 1020

gtgacaccac gatgcctgca gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcaaac 1080

tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 1140

gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 1200

gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 1260

tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 1320

ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 1380

tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 1440

ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 1500

ccttaataag atgatcttct tgagatcgtt ttggtctgcg cgtaatctct tgctctgaaa 1560

acgaaaaaac cgccttgcag ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc aactctttga 1620

accgaggtaa ctggcttgga ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca gtttagcctt 1680

aaccggcgca tgacttcaag actaactcct ctaaatcaat taccagtggc tgctgccagt 1740

ggtgcttttg catgtctttc cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 1800

cggtcggact gaacgggggg ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac tgcctacccg 1860

gaactgagtg tcaggcgtgg aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa tgacaccggt 1920

aaaccgaaag gcaggaacag gagagcgcac gagggagccg ccaggggaaa cgcctggtat 1980

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccaccac tgatttgagc gtcagatttc gtgatgcttg 2040

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacggc tttgccgcgg ccctctcact tccctgttaa 2100

gtatcttcct ggcatcttcc aggaaatctc cgccccgttc gtaagccatt tccgctcgcc 2160

gcagtcgaac gaccgagcgt agcgagtcag tgagcgagga agcggaatat atcctgtatc 2220

acatattctg ctgacgcacc ggtgcagcct tttttctcct gccacatgaa gcacttcact 2280

gacaccctca tcagtgccaa catagtaagc cagtatacac tccgctagcg ctgaggtctg 2340

cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc atccagccag 2400

aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt ggtgattttg 2460

aacttttgct ttgccacgga acggtcggcg ttgtcgggaa gatgcgtgat ctgatccttc 2520

aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccacgttg tgtctcaaaa tctctgatgt 2580

tacattgcac aagataaaaa gagagcatca tgaacaataa aactgtctgc t 2631

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列PAC-F(Artificial Sequence PAC-F)

<400> 3

gtccgacctg ggcatccgaa ggagga 26

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列PAC-R(Artificial Sequence PAC-R)

<400> 4

cctatagtga gtcgtattag cgg 23

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列SC-1-F(Artificial Sequence SC-1-F)

<400> 5

ccgctaatac gactcactat agggaccaaa caaagttggg taagga 46

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列SC-1-R(Artificial Sequence SC-1-R)

<400> 6

ttctgttggg tgtgtatgtt ccttg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列SC-2-F(Artificial Sequence SC-2-F)

<400> 7

caaggaacat acacacccaa cagaa 25

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列SC-2-R(Artificial Sequence SC-2-R)

<400> 8

cagcgaattc ccctttttga ggagtt 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列SC-3-F(Artificial Sequence SC-3-F)

<400> 9

aactcctcaa aaaggggaat tcgctg 26

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列SC-3-R(Artificial Sequence SC-3-R)

<400> 10

tgataatgta catcaaatgc ccaa 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列SC-4-F(Artificial Sequence SC-4-F)

<400> 11

ttgggcattt gatgtacatt atca 24

<210> 12

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列SC-4-R(Artificial Sequence SC-4-R)

<400> 12

tcctccttcg gatgcccagg tcggaccgcg aggaggtgga gatgccatgc cga 53

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-D-1-F(Artificial Sequence pSC-D-1-F)

<400> 13

cctctctccc cggcaaacta aacaaaactt a 31

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-D-1-R(Artificial Sequence pSC-D-1-R)

<400> 14

ctatcgggct atctaggtga acttcagggt a 31

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-2-F(Artificial Sequence pSC-2-F)

<400> 15

taccctgaag ttcacctaga tagcccgata g 31

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-2-R(Artificial Sequence pSC-2-R)

<400> 16

cgacgtgaag atgtaatacc gtgttagatg 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-3-F(Artificial Sequence pSC-3-F)

<400> 17

catctaacac ggtattacat cttcacgtcg 30

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-3-R(Artificial Sequence pSC-3-R)

<400> 18

ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatg 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-4-F(Artificial Sequence pSC-4-F)

<400> 19

catcagtgcc aacatagtaa gccagtatac actcc 35

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-4-R(Artificial Sequence pSC-4-R)

<400> 20

caccatcaag gcctgattga accatgatag ag 32

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-5-F(Artificial Sequence pSC-5-F)

<400> 21

ctctatcatg gttcaatcag gccttgatgg tg 32

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列pSC-D-5-R(Artificial Sequence pSC-D-5-R)

<400> 22

gtcgagtgtg tatgttcctt ggccctaagt tttgtttagt ttgccgggga gagagg 56

<210> 23

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列MV-N-F(Artificial Sequence MV-N-F)

<400> 23

ggctagcgtt taaacttaag cttggtacca tggccacact tttaaggagc ttagca 56

<210> 24

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列MV-N-R(Artificial Sequence MV-N-R)

<400> 24

accacactgg actagtggat ccgagctccc tagtctagaa gatttctgtc attgtg 56

<210> 25

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列MV-P-F(Artificial Sequence MV-P-F)

<400> 25

ggctagcgtt taaacttaag cttggtacca tggcagaaga gcaggcacgc catgtca 57

<210> 26

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列MV- P-R(Artificial Sequence MV- P-R)

<400> 26

accacactgg actagtggat ccgagctcct acttcattat tatcttcatc agcatc 56

<210> 27

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列MV-L-1-F(Artificial Sequence MV-L-1-F)

<400> 27

ggctagcgtt taaacttaag cttggtacca tggactcgct atctgtcaac cagatc 56

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列MV-L-1-R(Artificial Sequence MV-L-1-R)

<400> 28

ttgctgagta agggtcgcta gcccagt 27

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列MV-L-2-F(Artificial Sequence MV-L-2-F)

<400> 29

actgggctag cgacccttac tcagcaa 27

<210> 30

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列MV-L-2-R(Artificial Sequence MV-L-2-R)

<400> 30

accacactgg actagtggat ccgagctctt agtccttaat cagggcactg tatccg 56

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列pcDNA3.1-R (Artificial Sequence pcDNA3.1-R)

<400> 31

ggtaccaagc ttaagtttaa acgctagcc 29

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列 pcDNA3.1-F(Artificial Sequence pcDNA3.1-F)

<400> 32

gagctcggat ccactagtcc agtgtggt 28

Claims

1.一种D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株，其特征在于，以麻疹病毒减毒株Schwarz为骨架，将所述麻疹病毒减毒株中的融合蛋白编码基因F和血凝素蛋白编码基因H替换为包含D8基因型麻疹病毒的融合蛋白编码基因F和血凝素蛋白编码基因H的核苷酸序列，所述的包含D8基因型麻疹病毒的融合蛋白编码基因F和血凝素蛋白编码基因H的cDNA核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株，其特征在于，所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株命名为麻疹病毒rMV/FH（D8），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.V202185。

3.生物材料，其特征在于，包括如下1）-7）中的任意一种：

1）编码权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的重组DNA分子；或

2）含有权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或1）中所述的重组DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；或

3）含有权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的重组病毒；或

4）含有权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒或3）中所述的重组病毒或其传代培养病毒的疫苗；或

5）含有权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒或3）中所述的重组病毒或其传代培养病毒的疫苗组合物；或

6）含有权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒或3）中所述的重组病毒或其传代培养病毒的联合疫苗；或

7）含有权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒或3）中所述的重组病毒或其传代培养病毒的免疫原性制剂。

4.一种如权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的全长cDNA的质粒；

所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株的拯救。

5.一种麻腮风联合减毒活疫苗，其特征在于，包括：

权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株；或

权利要求3所述的生物材料；或

权利要求4所述的制备方法制备得到的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株。

6.根据权利要求5所述的麻腮风联合减毒活疫苗，其特征在于，还包括腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒；和风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒；

所述风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒包括BRD-II或RA27/3。

7.根据权利要求6所述的麻腮风联合减毒活疫苗，其特征在于，所述麻腮风联合减毒活疫苗每剂量中，所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒、腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒，和风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒的含量为：

腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒的活病毒不低于3.7lgCCID₅₀；

风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒的活病毒不低于3.0lgCCID₅₀。

8.根据权利要求6或7所述的麻腮风联合减毒活疫苗，其特征在于，所述D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株或其传代培养病毒，腮腺炎病毒减毒株或其传代培养病毒，和风疹病毒的减毒株或其传代培养病毒的活病毒比例为1：20：1，比例关系为CCID₅₀：CCID₅₀：CCID₅₀。

9.如下（1）-（4）任一项在制备疫苗制剂中的用途：

（1）权利要求1-2任一项所述的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株；或

（2）权利要求3所述的生物材料；或

（3）权利要求4所述的制备方法制备得到的D8基因型嵌合麻疹病毒减毒株；或

（4）权利要求5-8任一项所述的麻腮风联合减毒活疫苗。