CN101323857A - 改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆及感染性病毒的制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆，是对长－47株麻疹病毒全长cDNA克隆进行中国现有主要流行株(H1基因型，代表株为China93－7)主要表面抗原基因(H基因)的替换改造获得。本发明运用RNA病毒反向遗传技术在cDNA水平上进行改造型长－47病毒拯救，获得有感染性的改造病毒，从而极大的方便了新型病毒株的复制、增殖以及包装的研究，而且，生产出的新型感染性病毒具备流行株的血凝素抗原，具有更适合的麻疹减毒活疫苗的应用价值。

Description

改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆及感染性病毒的制备

技术领域

本发明属于病毒学和分子生物学领域，涉及一株利用我国成功研制的麻疹减毒活疫苗毒株基因组进行野毒株血凝素基因片段替换后并构建感染性克隆的制备方法、克隆编码区序列替换方法以及它们在疫苗研究中的应用。

背景技术

麻疹病毒(Measles Virus，MV)是副粘病毒科麻疹病毒属(morbillivirus)成员，是一种不分节段的单股负链RNA病毒，也是在全世界引起高度传染性疾病的病毒之一，通过呼吸道飞沫小滴，或者接触感染。易感人群对麻疹的发病率几乎达到100％，大部分感染者能完全恢复，但少数能引起严重的呼吸道或中枢神经系统并发症。

长-47(CC-47)疫苗株为我国自主研制的疫苗株，起源于1957年分离的Leningrad-4株麻疹病毒，经人肾细胞传26代、人羊膜细胞传47代以及鸡胚成纤维细胞传若干代后逐渐适应减毒而成(Rota，J.S.，Wang，Z.D.，Rota，P.A.，and Bellini，W.J.1994.Comparision ofsequences of the H，F and N coding genes of measles virus vaccine strains.Virus Research 31：317-330)。麻疹疫苗的有效性和安全性已经得到明确的肯定，然而世界卫生组织全球消灭麻疹的努力仍然一直没有停止，对于其主要原因业内比较一致的认识：一是麻疹免疫计划没有得到严格的贯彻执行，二是麻疹病毒新流行株的基因变异也在部分影响疫苗的免疫效果。

在1998年之前，从来没有一个标准的命名方法来描述野生型麻疹病毒基因的变异特征。1998年的春天，WHO(世界卫生组织)举行的一个会议上阐述了这个问题，该建议在2001年的会议上进一步得到完善。目前已采纳了一个统一的基因分型命名标准，以便在不同的实验室进行比较。麻疹病毒N蛋白羧基末端450个核苷酸和HA蛋白核苷酸序列变异程度最高，可用来鉴定基因型别。依据WHO麻疹病毒基因分型标准，相近毒株间HA蛋白基因序列差异＜2％，N蛋白基因羧基端450nt序列差异＜2.5％，可以列为同一基因型(WHO.Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild type measlesviruses(update)part I.WER，2001，76：249-2511)。WHO当前已认可了麻疹病毒8个进化分支，命名为A、B、C、D、E、F、G和H。在这些分支中目前已有20个确认的基因型和2个建议的新的基因型(g3和d9)。这些基因型是：A，B1，B2，C1，C2，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，E，F，G1，G2，H1和H2。除F基因型外，其它每个基因型均有一个参比株代表最早的病毒分离物，这些参比株序列可以在GeneBank或WHOStrain Bank中获得，近期分离的病毒株序列便可与WHO的这些参比株序列进行比对以确定其基因型。

当前所有国内外使用的麻疹疫苗株病毒均为A基因型，也包括中国使用的长-47疫苗株。尽管中国长-47麻疹疫苗和美国麻疹、流行性腮腺炎、风疹联合疫苗(MMR)人群免疫后血清能中和中国现流行的麻疹H1基因型，说明现有麻疹疫苗对中国现流行的麻疹病毒能起到保护作用，但也应注意到这些疫苗免疫血清中和中国株的滴度低于中和Edm和Chi21株滴度的2～5倍(World Health Organization.Nomenclature for describing the geneticcharacteristics of wild-type measles viruses(update)Part II.Wkly Epidemiol Rec，2001，76：249-251)。因此，麻疹病毒减毒与其基因变异密切相关，有必要从分子病毒学上深入研究这种变化，确定疫苗株减毒的分子病毒学特征，筛选免疫保护好的毒株制备麻疹疫苗。并且，主要在中国流行的H1基因型麻疹病毒的型内基因变异还在继续，也可能还有未发现的H1亚组病毒还在流行。

许文波等通过对中国4个省流行的麻疹病毒基因型进行监测研究，发现了2个在中国流行的新基因型，即H1、H2基因型，其中中国绝对优势基因型为H1基因型，H2基因型由越南输入。H1基因型被划分为3个亚型：H1a、H1b、H1c。近年来中国麻疹病毒基因型的流行特征H1a为绝对优势基因亚型；H1b处于弱势，2005年只在河北省发现；H1c几近消失(张燕，许文波，朱贞等，中国2003年流行的麻疹野病毒分子流行病学分析，中国计划免疫，2005，11(3)：1-101)。1998年WHO将China93-7确定为H基因型代表株，2001年WHO又将H基因型中的12株命名为H1基因型(China93-7为代表株)，1株命名为H2基因型(China94-1为代表株)。

对病毒基因组的研究是在70年代分子生物学技术发展并得到广泛应用之后才兴起的。到19世纪80年代为止，单股负链RNA病毒家族不少成员的基因序列得以测定，从而促使了利用负链RNA病毒cDNA进行病毒拯救的反向遗传学研究的兴起，也导致了利用其研究病毒致病机制、持续性感染、疫苗减毒机制以及研制新型疫苗和构建病毒表达载体等。尤其是病毒的非编码区序列(基因组末端及结构基因间非编码区)具有顺式调节元件功能，能指导下游基因的转录和复制，对于构建病毒感染性克隆及表达载体具有非同寻常的意义。李德新等在完成CC-47麻疹疫苗株非编码区序列测定的基础上(胡孔新，李德新等，麻疹病毒CC-47株非编码区核苷酸序列测定与比较，中华实验与临床病毒学杂志，2001，15(4)：327-331)，又利用该病毒全基因组构建了长-47麻疹病毒感染性克隆(胡孔新，李德新等，麻疹病毒全长正链cDNA的构建及感染性研究，病毒学报，2004，3：210-212)。

发明内容

为了构建新一代符合现有麻疹疫苗流行株的疫苗病毒，本发明基于中国现有麻疹疫苗株及流行株基因型现状分析以及我们已经建立的麻疹病毒感染性克隆技术平台，在已经构建的我国的长-47减毒活疫苗株感染性克隆和掌握的病毒拯救技术基础上，利用该疫苗病毒全基因组全长cDNA克隆进行中国现有主要流行株(H1基因型，代表株为China93-7)主要表面抗原基因(H基因)的替换改造，获得新的组合型麻疹病毒全长cDNA克隆，并通过一系列病毒拯救技术获得感染性病毒颗粒。

本发明的一个目的在于构建一种麻疹病毒全基因组克隆，其含有编码一种改造型长-47株麻疹病毒的全长反基因组正链RNA的核苷酸序列(以下简称为“改造型麻疹病毒cDNA序列”)，即该克隆中包含有麻疹病毒长-47株全基因组主要cDNA，其特征是，其全基因组cDNA中，H蛋白编码基因被麻疹野毒株或流行株病毒的H基因替换，以提供一种含有以H1基因型麻疹病毒流行株H蛋白基因替换的改造型长-47株麻疹病毒全基因克隆，替换的基因片段优选为流行株麻疹病毒H1基因型(代表野毒株：China93-7)H蛋白基因编码区。

从NCBI可查询到麻疹病毒长-47株全基因序列(ACCESSION：EF033071)以及中国流行株H1基因型代表株的H基因序列(ACCESSION：AF045201)。经China93-7毒株H蛋白基因编码区替换后的改造型麻疹病毒全基因cDNA序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

进一步的，本发明的麻疹病毒全基因组cDNA克隆还含有与上述改造型麻疹病毒cDNA序列操作性相连的异源表达控制序列，在该异源表达控制序列的控制下，从所述cDNA转录出麻疹病毒的全长反基因组正链RNA。这样的异源表达控制序列主要指位于所述cDNA序列的5’末端的RNA聚合酶启动子，优选T7启动子(T7promoter)。

进一步的，为使转录出来的RNA具有精确的3’和5’末端，所述麻疹病毒全基因组cDNA克隆还包含一个与改造型麻疹病毒cDNA序列3’末端最后一个核苷酸紧邻的丁型肝炎病毒核酶序列；在丁型肝炎病毒核酶序列之后往往还包含T7RNA聚合酶终止子(简称T7终止子，T7terminator)。

本发明的另一个目的在于提供一种对重组的改造病毒进行拯救，制备感染性麻疹病毒颗粒的方法，以应用于麻疹病毒疫苗的制备或病毒检测。

本发明的制备感染性麻疹病毒颗粒的方法，包括以下步骤：

1)用带有异源表达控制序列的上述改造型麻疹病毒全基因组cDNA克隆导入带辅助系统的宿主细胞中，所述辅助系统能表达麻疹病毒反基因组正链RNA转录、复制和包壳所需的蛋白质；

2)培养并回收所表达的病毒颗粒。

根据这种方法的一特定实施方案，其包括：

1)构建改造型麻疹病毒cDNA克隆，含有编码麻疹病毒全长反基因组正链RNA的核苷酸序列，以及与该核苷酸序列操作性相连的RNA聚合酶启动子；

2)构建一个或多个支持克隆，含有麻疹病毒的N、P和L蛋白的编码序列及与这些序列操作性相连的RNA聚合酶启动子，编码N、P和L蛋白的序列可以在同一个支持克隆中或在不同的支持克隆中；

3)用步骤1)和2)构建的克隆共转染宿主细胞，所述宿主细胞含有对应于改造型麻疹病毒cDNA克隆和支持克隆中的RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶；

4)培养转染的宿主细胞，并回收改造型麻疹病毒颗粒。

在一个较佳的实施方式中，在用改造型麻疹病毒cDNA克隆和支持克隆转染宿主细胞之前用表达RNA聚合酶的重组痘苗病毒感染宿主细胞，更佳的是利用T7启动子和表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒(例如重组痘苗病毒VTF7-3)。

本文所用的术语“克隆”指可以导入细胞并表达的双链DNA。克隆可以是病毒载体形式，优选质粒形式。

本发明提供了一种生产改造型麻疹病毒的系统，在于通过基因重组技术改造，以一种安全、有效、广泛使用的预防麻疹的麻疹病毒减毒活疫苗株长-47株的全基因克隆质粒为基础，对该质粒中的H基因片段进行替换，替换的基因片段优选为流行株麻疹病毒H1基因型(代表野毒株：China93-7)H蛋白基因编码区。本发明可直接运用已经公开的RNA病毒反向遗传技术在cDNA水平上进行改造型长-47病毒拯救，并获得有感染性的改造病毒，从而极大的方便了新型病毒株的复制、增殖以及包装的研究，并导致新型麻疹减毒活疫苗的出现。该改造优选但并不限于使用中国流行株麻疹病毒H1基因型的代表株China93-7，生产出的新型感染性病毒具备流行株的血凝素抗原，具有更适合的麻疹减毒活疫苗的应用价值。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

①在本发明提供的改造克隆的基础上，可以通过基因操作技术，替换其他基因型的流行株(不限于H1基因型)的H基因片段，以通过病毒拯救，开发出适应不同抗原变异需要的候选麻疹病毒疫苗株；

②本发明提供的基因替换操作方法，还适用于对该克隆中麻疹病毒其它编码区基因进行基因替换操作，如N蛋白基因、F蛋白基因以及P/M蛋白基因等，以研究麻疹病毒不同基因的表达能力，及其对于新病毒生成的影响，新生病毒具有应用于病毒诊断试剂的开发价值，也具有新型疫苗应用的价值。

③本发明提供的基因替换操作方法，通过不同基因型麻疹病毒基因的多片段替换，以及生成的新病毒具有适合多基因型麻疹病毒流行的通用疫苗价值。

④鉴于负链RNA病毒载体的优点，及其可以为进一步的研究如致病机理、减毒机理提供研究平台的前景，广泛使用的麻疹病毒减毒疫苗株所具有其无可比拟的优势。

本发明还可以直接指导构建仅有以病毒非编码区序列替换为主导的病毒拯救技术，对于阐明麻疹病毒调控序列作为顺式调节元件控制外源基因转录、表达以及复制和包装系统的评价具有重要的应用价值。

⑤将长-47减毒活疫苗株病毒的所有非编码区序列，P、M编码区序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列与国外野毒株、疫苗株病毒基因组相应位置进行比较，从基因和蛋白水平来阐明长-47减毒活疫苗株与国外野毒株及疫苗株之间的异同和相应的功能改变，可以研究疫苗的减毒机制，细胞培养适应机理以及寻找强弱毒株间的分子标记，从而为麻疹病毒的分子流行病学调查提供参考。

附图说明

图1质粒pRZ-mvfull-reH的结构示意图。

图2质粒pRZ-mvfull-reH插入结构的序列示意图。

具体实施方式

长-47感染性克隆构建及病毒拯救技术参见文献(胡孔新，李德新等.麻疹病毒全长正链cDNA的构建及感染性研究.病毒学报，2004，3：210-212)，本发明内容部分涉及的质粒、引物名称及序列可以参照该文献。简述如下：首先通过酶切分析和克隆策略优化，通过用RT-PCR方法分段扩增长-47疫苗株的全基因，并分别克隆到质粒载体中并进行DNA序列分析和鉴定，然后通过一定梯次的克隆步骤得到含有该病毒所有非编码区序列以及编码区的全基因序列。

对于克隆的改造，关键在于对中间质粒pMVfull-2S的下一步克隆过程进行，另外提供一个含有H1基因型野毒株麻疹病毒H蛋白基因的片段的克隆质粒，然后通过酶切替换并进行方向鉴定和序列分析获得。

实施例1麻疹病毒长-47全长cDNA克隆的构建

根据文献“胡孔新，李德新等.麻疹病毒全长正链cDNA的构建及感染性研究.病毒学报，2004，3：210-212”记载的方法构建含有麻疹病毒长-47株全基因的中间质粒pMVfull-2S，具体是：

经传统生物学方法研制的麻疹病毒长-47疫苗株为鸡胚成纤维原代细胞培养生产(由长春生物制品研究所提供，为商品疫苗，批号为9812445)。从该疫苗病毒感染的细胞提取全细胞RNA，以随机引物逆转录成cDNA，并以此为模板，用DNA多聚酶链式反应(DNAPolymerase Chain Reaction，PCR)扩增长-47病毒基因组cDNA。然后克隆、拼接麻疹病毒疫苗株CC-47的全长正链cDNA序列，并精确的置于T7启动子控制下和丁型肝炎病毒核酶序列及T7终止子序列之前并进行序列测定鉴定，获得中间克隆质粒pMVfull-2S。

具体克隆策略及过程参见文献，所涉及的基础插入载体为pBlueScriptSKII(+)(购自德国默克公司)。首先对pBlueScriptSKII(+)进行质粒改造，主要是以引入核酶序列以及T7终止子序列为目的：以质粒为pT7Ribo(中国疾病预防控制中心病毒病毒病预防控制所保存，含有核酶序列和T7终止子序列)为PCR扩增模板，以引物5’-AGC TGC GCG CAC GCGTCA GCT ATG ACC ATG ATT ACG-3’和5’-AGC TGC GCG CTC GAC TCT AGA GGA TCC CCA-3’扩增核酶序列和T7终止子序列，并通过引物设计在5’和3’端各引入一个BssHII限制性酶切位点，扩增产物BssHII酶切后直接克隆到同样酶切的质粒pBlueScriptSKII中，形成质粒pRZ。核酶序列和T7终止子序列的来源并不局限于pT7Ribo质粒，任何含有该片段的质粒、DNA片段都可以作为PCR扩增的模板，或者直接通过基因合成等本领域中熟知的分子克隆方法获取该片段，插入载体的该片段完整序列参见图2。

然后按照文献(胡孔新，李德新等，病毒学报，2004，3：210-212)所公开的引物对麻疹病毒长-47进行分段PCR，并按照步骤逐步插入pRZ中，最终获得含有两个BssHII酶切插入位点的中间克隆质粒pMVfull-2S。

实施例2麻疹病毒China93-7野毒株H基因片段的获得

野毒株麻疹病毒China93-7以B95a细胞(购自美国ATCC)培养并收获病毒感染细胞，以TRizol(购自美国Invitrogen公司)从感染细胞提取全细胞RNA，随机引物合成cDNA，并以引物5’-GGT TGA TAG GGA TCC CCG CT-3’和引物5’-CGG CCG AAC GGG GAACCA CTT GGA CC-3’组合进行PCR扩增，PCR产物含有病毒China93-7病毒H基因的克隆片段。扩增产物直接克隆到pGEM-T载体(购自美国Promega公司)中，再分别以BamHI(插入麻疹病毒片段中的位点)和NotI(载体上的酶切位点)酶切，并回收插入的小片段，该片段主要为H基因片段。

实施例3改造型麻疹病毒全长cDNA克隆质粒的构建

以引物D1(5’-ACG CGT ATC TGG CGC CCT ACA GCT CAA CTT ACC TGC-3’)和C2(5’-CGG CCG AAC GGG GAA CCA CTT GGA CC-3’)PCR扩增长-47病毒cDNA，产物直接克隆到pGEM-T载体(Promege公司)中，获得质粒pGEM-cc47-SpeI，分别以BamHI(插入片段中的位点)和NotI(载体上的酶切位点)酶切质粒，回收载体大片段，并将实施例2中最后获得的酶切片段回收产物克隆至质粒pGEM-cc47-SpeI的BamHI和NotI酶切载体中，获得新的含有China93-7 H基因片段以及麻疹长-47部分基因的重组质粒pGEM-cc47-937H-SpeI，以SpeI直接酶切pGEM-cc47-937H-SpeI，回收插入片段(大片段，约5.8kb)，再克隆到同样以SpeI酶切pMVfull-2S后回收的载体大片段中，最终获得的质粒pRZ-mvfull-reH，含有完整的改造替换H蛋白基因的CC-47株cDNA序列，并在T7启动子控制下(参见图1和图2)。对pRZ-mvfull-reH所有酶切接头部位进行序列测定分析，确保正确，并将重组的克隆菌种(含pRZ-mvfull-reH的DH5α)保存于-70℃。

实施例4改造型麻疹病毒颗粒的获得

实施例3获得的pRZ-mvfull-reH质粒可以在麻疹病毒CC-47株结构蛋白N、P、L编码区瞬时表达质粒以及表达T7RNA聚合酶的辅助重组痘苗病毒VTF7-3的作用下，通过病毒反向遗传学拯救技术获得同一细胞中四质粒RNA的转录、表达，并最终获得了具有感染性的麻疹病毒。以构建pRZ-mvfull-reH质粒进行病毒拯救的过程，转染入B95a细胞用常规的脂质体介导的转染法，具体可采用lipofectAMINE^TM2000试剂盒(购自Invitrogen公司)进行转染：

1)麻疹病毒N、P、L蛋白瞬时表达质粒的构建：参见文献“胡孔新，李德新等.麻疹病毒全长正链cDNA的构建及感染性研究.病毒学报，2004，3：210-212.”构建并制备pcDNA-N、pcDNA-P、p3Z-L质粒DNA。以上三个质粒中病毒蛋白N、P和L的基因均在T7启动子控制下。

2)在转染前一天，用无抗生素DMEM培养基将B95a细胞传代到6孔板，细胞密度达到90-95％单层(约16-24小时)，进行转染。

3)转染前1h，取重组痘苗病毒VTF7-3(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所保存，该病毒为已公开的整合有T7RNA聚合酶基因并在病毒感染时可以于感染细胞胞浆内表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒)，感染细胞(moi＝10)吸附1h，期间轻柔摇动几次，使液体漫过细胞面。

4)在毒种管内进行配液操作：将0.8-1μg混合质粒DNA(pcDNA-N、pcDNA-P、p3Z-L和pRZ-mvfull-reH质粒)加入50μl OPTIMEMI(购自Invirtogenl公司)中，然后将2-3μl lipofectAMINE试剂加入50μl OPTIMEMI中，5min后两者混合均匀，室温放置20min。

5)用无血清和抗生素的DMEM培养基清洗培养板中的B95a细胞2次，每孔0.5ml无血清和无抗生素的DMEM培养基。

6)将第4)步中混合好的含目的质粒及lipofectAMINE的混合液轻轻加入到细胞清洗过的，无血清和无抗生素的DMEM培养基中。

7)轻轻混匀后37℃，CO₂培养箱中培养6小时后，加入含10％小牛血清的DMEM完全培养基。

8)细胞37℃培养16小时后封好细胞培养板，42℃热休克1小时。

9)换含100μg/ml阿糖胞苷的完全培养液抑制痘苗病毒增殖，继续37℃培养48-72h。

10)冻融细胞收获毒种后准备继续感染细胞，该细胞裂解物种含有重组的改造病毒。

尽管为说明目的公开了本发明的具体实施例和附图，其目的在于帮助理解本发明的内容并据以实施，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆及感染性病毒的制备

<130>JSP080224

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15894

<212>DNA

<213>麻疹病毒(morbillivirus)

<400>1

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ctaaagccga tcgggaaaaa gatgagctca gccgtcgggt ttgttcctga caccggccct    3180

gcatcacgca gtgtaatccg ctccattata aaatccagcc ggctagagga ggatcggaag    3240

cgttacctga tgactctcct tgatgatatc aaaggagcca atgatcttgc caagttccac    3300

cagatgctga tgaagataat aatgaagtag ctacagctca acttacctgc caaccccatg    3360

ccagtcgacc caactagtac aacctaaatc cattataaaa aacttaggag caaagtgatt    3420

gcctcccaag ttccacaatg acagagatct acgacttcga caagtcggca tgggacatca    3480

aagggtcgat cgctccgata caacccacca cctacagtga tggcaggctg gtgccccagg    3540

tcagagtcat agatcctggt ctaggcgaca ggaaggatga atgctttatg tacatgtttc    3600

tgctgggggt tgttgaggac agcgatcccc tagggcctcc aatcgggcga gcatttgggt    3660

ccctgccctt aggtgttggc agatccacag caaagcccga aaaactcctc aaagaggcca    3720

ctgagcttga catagttgtt agacgtacag cagggctcaa tgaaaaactg gtgttctaca    3780

acaacacccc actaactctc ctcacacctt ggagaaaggt cctaacaaca gggagtgtct    3840

tcaacgcaaa ccaagtgtgc aatgcggcta atctgatacc gctcgataac ccgcagaggt    3900

tccgtgttgt ttatatgagc atcacccgtc tttcggataa cgggtattac accgttccta    3960

gaagaatgct ggaattcaga tcggtcaatg cagtggcctt caacctgctg gtaaccctta    4020

ggattgacaa ggcgataggc cctgggaaga tcatcgacaa tacagagcaa cttcctgagg    4080

caacatttat ggtccacatc gggaacttca ggagaaagaa gagtgaagtc tactctgccg    4140

attattgcaa aatgaaaatc gaaaagatgg gcctggtttt tgcacttggt gggatagggg    4200

gcaccagtct tcacattaga agcacaggca aaatgagcaa gactctccat gcacaactcg    4260

ggttcaagaa gaccttatgt tacccgctga tggatatcaa tgaagacctt aatcgattac    4320

tctggaggag cagatgcaag atagtaagaa tccaggcagt tttgcagcca tcagttcctc    4380

aagaattccg catttacgac gacgtgatca taaatgatga ccaaggacta ttcaaagttc    4440

tgtagaccgt agtgcccagc aatgcccgaa aacgaccccc ctcacaatga cagccagaag    4500

gcccggacaa aaaaaccccc tccgaaagac tccacggacc aagcgagagg ccagccagca    4560

gccgacggca agcgcgaaca ccaggcggcc ccagcacaga acagccccga cacaaggcca    4620

ccaccagcca ccccaatctg catcctcctc gtgggacccc cgaggaccaa cccccaaggc    4680

tgcccccgat ccaaaccacc aaccgcatcc ccaccacccc cgggaaagaa acccccagca    4740

actggaaggc ccctccccct ctccctcaac acaagaactc cacaaccgaa ccgcacaagc    4800

gaccgaggtg acccaaccgc aggcatccga ctccctagac agatcctctc tccccggcaa    4860

actaaacaaa acttagggcc aaggaacata cacacccaac agaacccaga ccccggccca    4920

cggctccgcg cccccaaccc ccgacaacca gagggagccc ccaaccaatc ccgccggctc    4980

ccccggtgcc cacaggcagg gacaccaacc cccgaacaga cccagcaccc aaccatcgac    5040

aatccaagac gggggggccc ccccaaaaaa aggcccccag gggccgacag ccagcaccgc    5100

gaggaagccc acccacccca cacacgacca cggcaaccaa accagaaccc agaccaccct    5160

gggccaccag ctcccagact cggccatcac cccgcagaaa ggaaaggcca caacccgcgc    5220

accccagccc cgatccggcg gggagccacc caacccgaac cagcacccaa gagcgatccc    5280

cgaaggaccc ccgaaccgca aaggacatca gtatcccaca gcctctccaa gtcccccggt    5340

ctcctcctct tctcgaaggg accaaaagat caatccacca cacccgacga cactcaactc    5400

cccaccccta aaggagacac cgggaatccc agaatcaaga ctcatccaat gtccatcatg    5460

ggtctcaagg tgaacgtctc tgccatattc atggcagtac tgttaactct ccaaacaccc    5520

accggtcaaa tccattgggg caatctctct aagatagggg tggtaggaat aggaagtgca    5580

agctacaaag ttatgactcg ttccagccat caatcattag tcataaaatt aatgcccaat    5640

ataactctcc tcaataactg cacgagggta gagattgcag aatacaggag actactgaga    5700

acagttttgg aaccaattag agatgcactt aatgcaatga cccagaatat aagaccggtt    5760

cagagtgtag cttcaagtag gagacacaag agatttgcgg gagtagtcct ggcaggtgcg    5820

gccctaggcg ttgccacagc tgctcagata acagccggca ttgcacttca ccagtccatg    5880

ctgaactctc aagccatcga caatctgaga gcgagcctgg aaactactaa tcaggcaatt    5940

gaggcaatca gacaatcagg gcaggagatg atattggctg ttcagggtgt ccaagactac    6000

atcaataatg agctgatacc gtctatgaac caactatctt gtgatttaat cggccagaag    6060

ctcgggctca aattgctcag atactataca gaaatcctgt cattatttgg ccccagctta    6120

cgggacccca tatctgcgga gatatctatc caggctttga gctatgcgct tggaggagac    6180

atcaataagg tgttagaaaa gctcggatac agtggaggtg atttactggg catcttagag    6240

agcagaggaa taaaggcccg gataactcac gtcgacacag agtcctactt cattgtcctc    6300

agtatagcct atccgacgct gtccgagatt aagggggtga ttgtccaccg gctagagggg    6360

gtctcgtaca acataggctc tcaagagtgg tataccactg tgcccaagta tgttgcaacc    6420

caagggtacc ttatctcgaa ttttgatgag tcatcgtgta ctttcatgcc agagaggact    6480

gtgtgcagcc aaaatgcctt gtacccgatg agtcctctgc tccaagaatg cctccggggg    6540

tccaccaagt cctgtgctcg tacactcgta tccgggtctt ttgggaaccg gttcatttta    6600

tcacaaggga acctaatagc caattgtgca tcaatccttt gcaagtgtta cacaacagga    6660

acgatcatta atcaagaccc tgacaagatc ctaacataca ttgctgccga tcactgcccg    6720

gtagtcgagg tgaacggcgt gaccatccaa gtcgggagca ggaggtatcc agacgctgtg    6780

tacttgcaca gaattgacct cggtcctccc atatcattgg agaggttgga cgtagggaca    6840

aatctgggga atgcaattgc taagttggag gatgccaagg aattgttgga gtcatcggac    6900

cagatattga ggagtatgaa aggtttatcg agcactagca tagtctacat cctgattgca    6960

gtgtgtcttg gagggttgat agggatcccc gctttaatat gttgctgcag ggggcgttgt    7020

aacaaaaagg gagaacaagt tggtatgtca agaccaggcc taaagcctga tcttacggga    7080

acatcaaaat cctatgtaag gtcgctctga tcctctacaa ctcttgaaac acaaatgtcc    7140

cacaagtctc ctcttcgtca tcaagcaacc accgcaccca gcatcaagcc cacctgaaat    7200

tatctccggc ttccctctgg ccgaacaata tcggtagtta attaaaactt agggtgcaag    7260

atcatccaca atgtcaccac aacgagaccg gataaatgcc ttctacaaag ataaccccca    7320

tcccaaggga agtaggatag tcattaacag agaacatctt atgattgata gaccttatgt    7380

tttgctggct gttctgtttg tcatgtttct gagcttgatc gggttgctag ccattgcagg    7440

cattagactt catcgggcag ccatctacac cgcagagatc cataaaagcc tcagcaccaa    7500

tctagatgta actaactcaa tcgagcatca ggtcaaggac gtgttgacac cactcttcaa    7560

aatcatcggt gatgaagtgg gcctgaggac acctcagaga ttcactgacc tagtgaaatt    7620

catctctgac aagattaaat tccttaatcc ggatagggag tacgacttaa gagatctcac    7680

ttggtgtatc aacccgccag agagaatcaa attggattat gatcaatact gtgcagatgt    7740

ggctgctgaa gagctcatga atgcattggt gaactcaact ctactggaga ccagaacaac    7800

caatcagttc ctagctgtct caaagggaaa ctgctcaggg cccactacaa tcagaggtca    7860

attctcaaac atgtcgctgt ccctgttaga cttgtattta ggtcgaggtt acaatgtgtc    7920

atctatagtc actatgacat cccagggaat gtatggggga acttacctag tggaaaagcc    7980

taatctgagc agcaaaaggt cagagttgtc acaactgagc atgtaccgag tgtttgaagt    8040

aggtgttatc agaaatccgg gtttgggggc tccggtgttc catatgacaa actatcttga    8100

gcaaccagtc agtaatgatc tcagcaactg tatggtggct ttgggggagc tcaaactcgc    8160

agccctttgt cacggggaag attctatcac aattccctat cagggatcag ggaaaggtgt    8220

cagcttccag ctcgtcaagc taggtgtctg gaaatcccca accgacatgc aatcctgggt    8280

ccccttatca acggatgatc cagtgataga caggctttac ctctcatctc acagaggtgt    8340

tatcgctgac aatcaagcaa aatgggctgt cccgacaaca cgaacagatg acaagttgcg    8400

aatggagaca tgcttccaac aggcgtgtaa gggtaaaatc caagcactct gcgagaatcc    8460

cgagtgggca ccattgaagg ataacaggat tccttcatac ggggtcttgt ctgttgatct    8520

gagtctgaca gttgagctta aaatcaaaat tgcttcggga ttcgggccat tgatcacaca    8580

cggttcaggg atggacctat acaaatccaa ccacaacaat gtgtattggc tgactatccc    8640

gccaatgaag aacctagcct taggtgtaat caacacattg gagtggatac cgagattcaa    8700

ggttagtccc tacctcttca atgtcccaat taaggaagca ggcgaagact gccatgcccc    8760

aacataccta cctgcggagg tggatggtga tgtcaaactc agttccaatc tggtgattct    8820

acctggtcaa gatctccaat atgttttggc aacctacgat acttccaggg ttgaacatgc    8880

tgtggtttat tacgtttaca gcccaagccg ctcatttgct tacttttatc cttttaggtt    8940

gcctataaag ggggtcccca tcgaattaca agtggaatgc ttcacatggg accaaaaact    9000

ctggtgccgt cacttctgtg tgcttgcgga ctcagaatct ggtggacata tcactcactc    9060

tgggatggtg ggcatgggag tcagctgcac agtcacccgg gaagatggaa ccaatcgcag    9120

atagggctgc tagtgaacca atctcatgat gtcacccaga catcaggcat acccactagt    9180

gtgaaataga catcagaatt aagaaaaacg tagggtccaa gtggttcccc gttatggact    9240

cgctatctgt caaccagatc ttataccctg aagttcacct agatagcccg atagttacca    9300

ataagatagt agccatcctg gagtatgctc gagtccctca cgcttacagc ctggaggacc    9360

ctacactgtg tcagaacatc aagcaccgcc taaaaaacgg attttccaac caaatgatta    9420

taaacaatgt ggaagttggg aatgtcatca agtccaagct taggagttat ccggcccact    9480

ctcatattcc atatccaaat tgtaatcagg atttatttaa catagaagac aaagagtcaa    9540

cgaggaagat ccgtgaactc ctcaaaaagg ggaattcgct gtactccaaa gtcagtgata    9600

aggttttcca atgcttaagg gacactaact cacggcttgg cctaggctcc gaattgaggg    9660

aggacatcaa ggagaaagtt attaacttgg gagtttacat gcacagctcc cagtggtttg    9720

agccctttct gttttggttt acagtcaaga ctgagatgag gtcagtgatt aaatcacaaa    9780

cccatacttg ccataggagg agacacacac ctgtattctt cactggtagt tcagttgagt    9840

tgctaatctc tcgtgacctt gttgctataa tcagtaaaga gtctcaacat gtatattacc    9900

tgacatttga actggttttg atgtattgtg atgtcataga ggggaggtta atgacagaga    9960

ccgctatgac tattgatgct aggtatacag agcttctagg aagagtcaga tacatgtgga    10020

aactgataga tggtttcttc cctgcactcg ggaatccaac ttatcaaatt gtagccatgc    10080

tggagcctct ttcacttgct tacctgcagc tgagggatat aacagtagaa ctcagaggtg    10140

ctttccttaa ccactgcttt actgaaatac atgatgttct tgaccaaaac gggttttctg    10200

atgaaggtac ttatcatgag ttaattgaag ctctagatta cattttcata actgatgaca    10260

tacatctgac aggggagatt ttctcatttt tcagaagttt cggccacccc agacttgaag    10320

cagtaacggc tgctgaaaat gttaggaaat acatgaatca gcctaaagtc attgtgtatg    10380

agactctgat gaaaggtcat gccatatttt gtggaatcat aatcaacggc tatcgtgaca    10440

ggcacggagg cagttggcca ccgctgaccc tccccctgca tgctgcagac acaatccgga    10500

atgctcaagc ttcaggtgaa gggttaacac atgagcagtg cgttgataac tggaaatctt    10560

ttgctggagt gaaatttggc tgctttatgc ctcttagcct ggatagtgat ctgacaatgt    10620

acctaaagga caaggcactt gctgctctcc aaagggaatg ggattcagtt tacccgaaag    10680

agttcctgcg ttacgaccct cccaagggaa ccgggtcacg gaggcttgta gatgttttcc    10740

ttaatgattc gagctttgac ccatatgatg cgataatgta tgttgtaagt ggagcttacc    10800

tccatgaccc tgagttcaac ctgtcttaca gcctgaaaga aaaggagatc aaggaaacag    10860

gtagactttt tgctaaaatg acttacaaaa tgagggcatg ccaagtgatt gctgaaaatc    10920

taatctcaaa cgggattggc aaatatttta aggacaatgg gatggccaag gatgagcacg    10980

atttgactaa ggcactccac actctagctg tctcaggagt ccccaaagat ctcaaagaaa    11040

gtcacagggg ggggccagtc ttaaaaacct actcccgaag cccagtccac acaagtacca    11100

ggaacgtgag agcagcaaaa gggtttatag ggttccctca agtaattcgg caggaccaag    11160

acactgatca tccggagaat atggaagctt acgagacagt cagtgcattt atcacgactg    11220

atctcaagaa gtactgcctt aattggagat atgagaccat cagcttgttt gcacagaggc    11280

taaatgagat ttacggattg ccctcctttt tccagtggct gcataagagg cttgagacct    11340

ctgtcctgta tgtaagtgac cctcattgcc cccccgacct tgacgcccat atcccgttat    11400

ataaagtccc caatgatcaa atcttcatta agtaccctat gggaggtata gaagggtatt    11460

gtcagaagct gtggaccatc agcaccattc cctatctata cctggctgct tatgagagcg    11520

gagtaaggat tgcttcgtta gtgcaagggg acaatcagac catagccgta acaaaaaggg    11580

tacccagcac atggccctac aaccttaaga aacgggaagc tgctagagta actagagatt    11640

actttgtaat tcttaggcaa aggctacatg atattggcca tcacctcaag gcaaatgaga    11700

caattgtttc atcacatttt tttgtctatt caaaaggaat atattatgat gggctacttg    11760

tgtcccaatc actcaagagc atcgcaagat gtgtattctg gtcagagact atagttgatg    11820

aaacaagggc agcatgcagt aatattgcta caacaatggc taaaagcatc gagagaggtt    11880

atgaccgtta ccttgcatat tccctgaacg tcctaaaagt gatacagcaa attctgatct    11940

ctcttggctt cacaatcaat tcaaccatga cccgggatgt agtcataccc ctcctcacaa    12000

acaacgacct cttaataagg atggcactgt tgcccgctcc tattgggggg atgaattatc    12060

tgaatatgag caggctgttt gtcagaaaca tcggtgatcc agtaacatca tcaattgctg    12120

atctcaagag aatgattctc gcctcactaa tgcctgaaga gaccctccat caagtaatga    12180

cacaacaacc gggggactct tcattcctag actgggctag cgacccttac tcagcaaatc    12240

ttgtatgtgt ccagagcatc actagactcc tcaagaacat aactgcaagg tttgtcctga    12300

tccatagccc aaacccaatg ttaaaaggat tattccatga tgacagtaaa gaagaggacg    12360

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tcctggatca tagtgtcaca ggggcaagag agtctattgc aggcatgctg gataccacaa    12480

aaggcctgat tcgagccagc atgaggaagg gggggttaac atctcgagtg ataaccagat    12540

tgtccaatta tgactatgaa caattcagag cagggatggt gctattgaca ggaagaaaga    12600

gaaatgtcct cattgacaaa gagtcatgtt cagtgcagct ggcgagagct ctaagaagcc    12660

atatgtgggc gaggctagct cgaggacggc ctatttacgg ccttgaggtc cctgatgtac    12720

tagaatctat gcgaggccac cttattcggc gtcatgagac atgtgtcatc tgcgagtgtg    12780

gatcagtcaa ctacggatgg ttttttgtcc cctcgggttg ccaactggat gatattgaca    12840

aggaaacatc atccttgaga gtcccatata ttggttctac cactgatgag agaacagaca    12900

tgaagcttgc cttcgtaaga gccccaagtc gatccttgcg atctgctgtt agaatagcaa    12960

cagtgtactc atgggcttac ggtgatgatg atagctcttg gaacgaagcc tggttgttgg    13020

ctaggcaaag ggccaatgtg agcctggagg agctaagggt gatcactccc atctcaactt    13080

cgactaattt agcgcatagg ttgagggatc gtagcactca agtgaaatac tcaggtacat    13140

cccttgtccg agtggcgagg tataccacaa tctccaacga caatctctca tttgtcatat    13200

cagataagaa ggttgatact aactttatat accaacaagg aatgcttcta gggttgggtg    13260

ttttagaaac attgtttcga ctcgagaaag ataccggatc atctaacacg gtattacatc    13320

ttcacgtcga aacagattgt tgcgtgatcc cgatgataga tcatcccagg atacccagct    13380

cccgcaagct agagctgagg gcagagctat gtaccaaccc attgatatat gataatgcac    13440

ctttaattga cagagataca acaaggctat acacccagag ccataggagg caccttgtgg    13500

aatttgttac atggtccaca ccccaactat atcacatttt agctaagtcc acagcactat    13560

ctatgattga cctggtaaca aaatttgaga aggaccatat gaatgaaatt tcagctctca    13620

taggggatga cgatatcaat agtttcataa ctgagtttct gctcatagag ccaagattat    13680

tcactatcta cttgggccag tgtgcggcca tcaattgggc atttgatgta cattatcata    13740

gaccatcagg gaaatatcag atgggtgagc tgttgtcatc gttcctttct agaatgagca    13800

aaggagtgtt taaggtgctt gtcaatgctc taagccaccc aaagatctac aagaaattct    13860

ggcattgtgg tattatagag cctatccatg gtccttcact tgatgctcaa aacttgcaca    13920

caactgtgtg caacatggtt tacacatgct atatgaccta cctcgacctg ttgttgaatg    13980

aagagttaga agagttcaca tttctcttgt gtgaaagcga cgaggatgta gtaccggaca    14040

gattcgacaa catccaggca aaacacttat gtgttctggc agatttgtac tgtcaaccag    14100

ggacctgccc accaattcga ggtctaagac cggtagagaa atgtgcagtt ctaaccgacc    14160

atatcaaggc agaggctagg ttatctccag caggatcttc gtggaacata aatccaatta    14220

ttgtagacca ttactcatgc tctctgactt atctccggcg aggatcgatc aaacagataa    14280

gattgagagt tgatccagga ttcattttcg acgccctcgc tgaggtaaat gtcagtcagc    14340

caaagatcgg cagcaacaac atctcaaata tgagcatcaa ggctttcaga cccccacacg    14400

atgatgttgc aaaattgctc aaagatatca acacaagcaa gcacaatctt cccatttcag    14460

ggggcaatct cgccaattat gaaatccatg ctttccgcag aatcgggttg aactcatctg    14520

cttgctacaa agctgttgag atatcaacat taattaggag atgccttgag ccaggggagg    14580

acggcttgtt cttgggtgag ggatcgggtt ctatgttgat cacttataag gagatactta    14640

aactaaacaa gtgcttctat aatagtgggg tttccgccaa ttctagatct ggtcaaaggg    14700

aattagcacc ctatccctcc gaagttggcc ttgtcgaaca cagaatggga gtaggtaata    14760

ttgtcaaagt gctctttaac gggaggcccg aagtcacgtg ggtaggcagt gtagattgct    14820

tcaatttcat agttagtaat atccctacct ctagtgtggg gtttatccat tcagatatag    14880

agaccttgcc taacaaagat actatagaga agctagagga attggcagcc atcttatcga    14940

tggctctgct cctgggcaaa ataggatcaa tactggtgat taagcttatg cctttcagcg    15000

gggattttgt tcagggattt ataagttatg tagggtctca ttatagagaa gtgaaccttg    15060

tataccctag atacagcaac ttcatatcta ctgaatctta tttggttatg acagatctca    15120

aggctaaccg gctaatgaat cctgaaaaga ttaagcagca gataattgaa tcatctgtga    15180

ggacttcacc tggacttata ggtcacatcc tatccattaa gcaactaagc tgcatacaag    15240

caattgtggg agacgcagtt agtagaggtg atatcaatcc tactctgaaa aaacttacac    15300

ctatagagca ggtgctgatc aattgcgggt tggcaattaa cggacctaag ctgtgcaaag    15360

aattgatcca ccatgatgtt gcctcagggc aagatggatt gcttaattct atactcatcc    15420

tctacaggga gttggcaaga ttcaaagaca accaaagaag tcaacaaggg atgttccacg    15480

cttaccccgt attggtaagt agcaggcaac gagaacttat atctaggatc acccgcaaat    15540

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tatattaaag aaaactttga aaatacgaag tttctattcc cagctttgtc tggt          15894

Claims (10)

1.一种麻疹病毒全基因cDNA克隆，含有编码一种改造型长-47株麻疹病毒的全长反基因组正链RNA的核苷酸序列，所述改造型长-47株麻疹病毒是指长-47株麻疹病毒的H蛋白编码基因被H1基因型麻疹病毒流行株的H基因替换。

2.如权利要求1所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于：所述H1基因型麻疹病毒流行株是China93-7。

3.如权利要求2所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于：所述核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

4.如权利要求1所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于：该克隆还含有与所述核苷酸序列操作性相连的异源表达控制序列，所述异源表达控制序列包含位于所述核苷酸序列5’末端的RNA聚合酶启动子。

5.如权利要求4所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于：所述RNA聚合酶启动子是T7启动子。

6.如权利要求5所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于：该克隆还包含一个与所述核苷酸序列3’末端最后一个核苷酸紧邻的丁型肝炎病毒核酶序列。

7.如权利要求6所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于：该克隆在丁型肝炎病毒核酶序列下游具有T7终止子。

8.一种制备感染性麻疹病毒的方法，包括以下步骤：

1)用权利要求4～7中任一权利要求所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆导入带辅助系统的宿主细胞中，所述辅助系统能表达麻疹病毒反基因组正链RNA转录、复制和包壳所需的蛋白质；

2)培养并回收所表达的麻疹病毒颗粒。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括：

a)构建权利要求4～7中任一权利要求所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆；

b)构建一个或多个支持克隆，含有麻疹病毒的N、P和L蛋白的编码序列及与这些序列操作性相连的RNA聚合酶启动子，其中N、P和L蛋白的编码序列在同一个支持克隆中或在不同的支持克隆中；

c)用步骤a)和b)构建的克隆共转染宿主细胞，所述宿主细胞含有对应于麻疹病毒全基因cDNA克隆和支持克隆中的RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：在所述步骤c)之前用表达对应于所述RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶的重组痘苗病毒感染宿主细胞。

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