CN101248174A

CN101248174A - 减毒的sars以及作为疫苗的用途

Info

Publication number: CN101248174A
Application number: CNA2006800311146A
Authority: CN
Inventors: L·恩朱阿尼斯桑切斯; M·洛佩茨德迪戈; E·阿尔瓦雷茨戈梅茨; F·阿尔马詹托拉尔
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2008-08-20
Also published as: EP1893752A2; EP1736539A1; WO2006136448A2; WO2006136448A3

Abstract

本发明涉及编码减毒的SARS－CoV病毒的核酸，所述SARS－CoV病毒能在细胞培养物中产生最大病毒滴度，当与相同细胞培养物中野生型SARS－CoV病毒的最大病毒滴度相比时，所述最大病毒滴度降低至少2的因数。根据本发明的进一步的方面，所述编码减毒的SARS－CoV病毒的核酸可通过包括步骤的方法获得，其中其中通过修改编码SARS－CoV E蛋白的基因的序列来修饰所述SARS－CoV病毒的基因组，从而所述核酸不表达功能性的E蛋白。本发明进一步涉及由这些核酸编码的病毒以及所述核酸和所述病毒的医药用途。

Description

减毒的SARS以及作为疫苗的用途

本发明涉及编码减毒的SARS-CoV病毒的核酸，当与相同细胞培养物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比时，所述减毒的SARS-CoV病毒能够在细胞培养物中产生的最大病毒滴度降低。

技术背景

涉及功能基因向细胞中的插入以实现治疗效果的治疗方法也被称为基因治疗方法，因为基因充当药物。基因治疗是一种主要用于矫正对疾病发展负责的缺陷基因的技术。

也称为载体的运载分子被用于递送治疗基因到患者的目标细胞。当前，最常见的载体是病毒，其已经被遗传地改变来携带人类或动物基因。在以病原性方式将它们的基因封装并递送到人类和动物细胞方面，病毒是天然地进化的。然而，与此同时科学家利用了这种能力并操作病毒基因组来除去致病基因并插入治疗基因。

用病毒载体感染目标细胞例如患者的肝脏或肺细胞。然后载体将它含有治疗基因的遗传物质卸载到目标细胞内。来自治疗基因的功能性蛋白产物的产生使目标细胞恢复到标准状态。

在可选择的方法中，这些病毒载体被用于表达异源基因，所述异源基因在接受该载体的受试者中引起免疫原性反应并因而免疫该受试者。在这种情况下，病毒载体充当疫苗。

自从引起SARS的致病病原体被鉴定为新的冠状病毒以来(SARS-CoV；参见Drosten et al.，2003；Holmes and Enjuanes，2003；Marra et al.，2003；Rota et al.，2003)，冠状病毒分子生物学的研究已经被给予了非常高的优先级，以开发预防和控制冠状病毒感染的有效策略。

冠状病毒是ssRNA(+)病毒，其具有迄今为止在RNA病毒中中发现的最大基因组，长度在25和31千碱基之间(kb，参见Siddell S.G.，1995，The Coronaviridae)。当冠状病毒感染细胞时，基因组RNA(gRNA)在细胞质中复制，产生正极性和负极性的一组亚基因组RNA(sgRNA)(Sethna et al.，1989；Sawicki & Sawicki，1990；Van der Most & Spaan，1995；和Enjuanes，2005)。

由于冠状病毒在细胞质中复制的事实，暗示了冠状病毒作为载体用于基因治疗和疫苗接种的用途。特别地，可以产生冠状病毒的缺陷性干扰(DI)基因组。这些DI基因组是缺失突变，其需要补充病毒或辅助病毒的存在用于复制和/或转录(参见Chang et al.，1994；WO97/34008；西班牙专利申请P9600620；Izeta et al.，1999；和Sánchezet al，1999)。

本领域使用各种系统来在接受组合物的动物中产生免疫反应，所述组合物含有DI基因组，所述基因组除其他之外含有编码异源报告基因或来自不同传染原的基因的序列(猪生殖和呼吸道疾病病毒，PRRSV；参见，Alonso et al.，2002a，2002b)。

冠状病毒全长cDNA克隆的构建(Almazán et al.，2000；Casais etal.，2001；Thiel et al.，2001；Yount et al.，2000；Yount et al.，2002；Yountet al.，2003)提供了基因操作冠状病毒基因组来研究基本病毒过程和开发表达载体的机会。

虽然SARS-CoV仅在2002年才出现，SARS-CoV分离物的基因组序列近来已经公开，并提供了关于SARS-CoV基因组的结构、系统发育和变异性的重要信息(Marra et al.，2003；Rota et al.，2003)。29.7-kbUrbani株基因组的约三分之二编码复制酶基因，其包含开放阅读框Rep1a和Rep 1b，后一个通过核糖体的移码来表达(Thiel et al.，2003)。两个ORF的翻译引起两个大的聚合蛋白的合成，其由病毒蛋白酶加工来产生复制酶-转录酶复合物(Ziebuhr et al.，2000)。

另三分之一基因组包括编码结构和非结构蛋白的基因组，顺序是5’-S-3a-3b-E-M-6-7a-7b-8a-8b-9b-N-3’。这些蛋白由不连续的转录过程来表达，其最可能在负链的合成期间发生，引起亚基因组mRNA的3′共末端嵌套集的产生，每一个mRNA在其5′末端具有来自基因组5′端的脱帽的前导序列(Sawicki and Sawicki，1998；

et al.，2004)。亚基因组反义RNA物质的合成由转录调节序列(TRS)来调节，转录调节序列包括在每个基因之前以及在前导序列的3′末端发现的高度保守的核心序列(Thiel et al.，2003)。

早先已经描述了SARS-CoV Urbani株的全长cDNA的制备(Yountet al.，2003)，其中它显示了重组病毒复制与野生型病毒一样有效。还描述了在杆状病毒系统中通过病毒结构蛋白质M、E和S的表达，SARS-CoV样粒子的产生(Mortola & Roy，2004)。显示的是，S、E和M由单个重组病毒的高水平表达容许病毒颗粒样粒子(VLP)的组装和释放。

在SARS-CoV病毒颗粒包膜中，四种结构蛋白质，S、E、M和3a被包埋到膜中。M和E蛋白是病毒组装和发芽的关键因素(Fischer et al.，1998)。实际上，这些蛋白在细胞系中的表达引起病毒样粒子的产生(Baudoux et al.，1998；Ho et al.，2004；Huang et al.，2004；Mortola &Roy，2004；Vennema et al.，1996)。

早先已经研究了在不同的冠状病毒中删除群特定基因的效果。使用鼠肝炎病毒(MHV)作为模型的报告显示了，ORF 4、5a、2a和HE的删除在天然宿主中是减毒性的(de Haan et al.，2002)。类似地，删除TGEV的ORF 7(Ortego et al.，2002)以及猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的ORF 3abc和7ab(Haijema et al.，2004)的研究引起病毒减毒。然而，其中一次一个地删除ORF 3a、3b、6、7a和7b的其他SARS-CoV缺失突变株不显示体外复制(在组织培养中滴度不降低)和小鼠模型中的体内复制(没有病毒的减毒)效力的显著改变(Yount et al.，2005)。这些缺失突变株还没有在其他动物模型中关于减毒表型的存在进行评估。

KUO ET AL.(2003)报道了，缺乏整个基因4、5a和E的4小鼠肝炎病毒(MHV)的E基因突变能够组装冠状病毒样粒子。然而，突变体中病毒颗粒组装以比野生型中的病毒颗粒组装数量级上更低的效率发生，结论是这种病毒突变体不是作为疫苗有用的。另一个团队，Huang et al.(2004)，通过检查仅由少数SARS-CoV病毒基因但没有遗传物质构成的非传染性VLP的形成，检查了特定SARS-CoV基因对于病毒组装的作用。根据他们的实验，作者断定，只要存在M和N蛋白，基因E对于VLP形成不是必需的。

WO04/092360公开了来自SARS冠状病毒的核酸和蛋白，其可以用于疫苗制剂、诊断试剂和试剂盒的设备和制造。

SARS-CoV在2002年晚期在人类中爆发，并在数月内从其在广东(中国)的起源传播到超过30个国家。快速传播和高死亡率使得SARS-CoV成为全球性威胁，对于它没有有效的治疗。因而本发明的难题在于提供具有良好安全性和免疫原性的用于保护对抗SARS-CoV的疫苗。

发明概述

这个难题现在通过编码减毒SARS-CoV病毒的核酸解决了。根据本发明的一个方面，当与相同细胞培养物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比时，所述减毒病毒能够在细胞培养物中产生的最大病毒滴度降低至少2的因数(reduced at least by a factor of 2)。

根据本发明的进一步的方面涉及编码SARS-CoV病毒的核酸，其是通过包括步骤的方法可获得的，其中SARS-CoV病毒的基因组通过修改编码SARS-CoV E蛋白的基因的序列来修饰，使得该核酸不能表达功能性E蛋白。在本发明的上下文中，功能性E蛋白是一种蛋白，其：

-由SEQ ID NO：6编码，或由与SEQ ID NO：6的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的基因编码；和

-能够与其他SARS-CoV蛋白缔合进入病毒包膜中。

编码如上所述修饰的E蛋白的核酸将产生在其包膜中不含有E蛋白的病毒颗粒。

本发明进一步涉及编码SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸不编码如上所述的SARS-CoV病毒的功能性蛋白E的序列。根据这个实施方式，所述核酸可以编码减毒的SARS-CoV病毒，并包含编码病毒蛋白复制酶和S和M和N的序列。所述核酸可以含有其他SARS衍生的蛋白，例如3a蛋白。

在本发明的一个方面，如上定义的核酸不含有任何其他SARS衍生的蛋白。所述核酸优选地不能表达蛋白，所述蛋白由以下的编码：

-SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19的任一个；或

-与SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的任何序列。

在可选择的实施方式中，所述核酸优选的不能表达蛋白，所述蛋白由以下的编码：

-SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18、19的任一个；或

-与SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18、19的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的任何序列。

根据本发明的这个方面，在一个优选的实施方式中，所述核酸仅编码病毒蛋白复制酶和S和M和N。

根据进一步的方面，本发明的核酸编码SARS-CoV病毒，其中所述核酸包含病毒蛋白复制酶和S和M和N和/或E的序列。再一次，所述核酸可以含有其他SARS衍生的蛋白，例如，病毒蛋白3a的序列，但是优选的不含有以上定义的任何其他SARS衍生的蛋白。

在本发明的优选的实施方式中，所述SARS-CoV病毒的核酸不编码病毒蛋白6、7a、7b、8a、8b和9b。

所述核酸可以是RNA或DNA。

本发明进一步涉及包含上述核酸之一的宿主细胞和SARS-CoV病毒颗粒。例如，SARS-CoV病毒颗粒可以通过将上述核酸之一导入宿主细胞中来获得。

本发明进一步涉及疫苗，所述疫苗包含相应的SARS-CoV病毒颗粒或相应的核酸或相应的宿主细胞。在所述疫苗中，所述病毒颗粒可以以减毒的形式存在，即，复制感受态的和传染性的形式，但也可以以钝化的形式存在。根据病毒钝化的公知方法使用热或化学物质钝化减毒病毒将进一步提高疫苗使用的安全性。所述疫苗可以进一步包含药学上可接受的佐剂、载体或赋形剂。所述疫苗优选的用于接种哺乳动物，优选的人类，并产生免疫反应，所述免疫反应降低或消除由SARS-CoV病毒感染引起的疾病症状。

在本发明的另一个方面中涉及制备SARS-CoV疫苗的方法，包括通过修改编码SARS-CoV蛋白的核酸来修饰包含SARS-CoV病毒基因组的核酸。

在优选的实施方式中，所述制备SARS-CoV疫苗的方法，包括通过修改编码SARS-CoV E蛋白的基因的序列使得该基因不表达功能性E蛋白来修饰包含SARS-CoV病毒基因组的核酸。

在进一步优选的实施方式中，所述方法进一步包括修改SARS-CoV基因组的序列，使得所述核酸表达病毒蛋白复制酶、S、M和N，并进一步表达或不表达编码蛋白3a的序列。

在另一个优选的实施方式中，所述方法进一步包括修改SARS-CoV基因组的序列，使得所述核酸不能表达与SARS-CoV基因E、6、7a、7b、8a、8b和9b(相应于SEQ ID NO：6、14到19)编码的蛋白质具有至少80％的同源性、优选的至少90％的同源性或至少95％的同源性的蛋白质。

在本发明的又一个实施方式中，所述方法进一步包括修改SARS-CoV基因组的序列，使得所述核酸不能表达与SARS-CoV基因3a、3b、6、7a、7b、8a和8b(相应于SEQ ID NO：12到19)编码的蛋白质具有至少80％的同源性、优选的至少90％的同源性或至少95％的同源性的蛋白质。

在另一个优选的实施方式中，所述方法进一步包括修改SARS-CoV基因组的序列，使得所述核酸表达病毒蛋白复制酶、S、M、N和E，并进一步表达或不表达编码蛋白3a的序列。

根据另一个优选的实施方式，所述方法进一步包括修改SARS-CoV基因组的序列，使得所述核酸不能表达与SARS-CoV基因6、7a、7b、8a、8b和9b(相应于SEQ ID NO：14到19)编码的蛋白质具有至少80％的同源性、优选的至少90％的同源性或至少95％的同源性的蛋白质。

在又一个实施方式中，所述方法进一步包括修改SARS-CoV的基因组的序列，使得所述核酸不能表达除了复制酶S、M、N和/或E以外的任何SARS-CoV衍生的蛋白质编码序列，并且进一步表达或不表达编码蛋白3a的序列。

对于制备SARS-CoV疫苗，所述方法进一步包括向宿主细胞中导入所述修饰的核酸，并分离编码所述修改的基因组的核酸或包含所述修饰的核酸的SARS-CoV病毒颗粒。

所述制备SARS-CoV疫苗的方法进一步包括与药学上可接受的佐剂、载体或赋形剂混合所述核酸的混合物或所述SARS-CoV病毒颗粒的混合物

在以下的详细说明中，在实施例中和在权利要求中描述了本发明的进一步优选的实施方式。

发明的详细说明

本发明涉及编码减毒的SARS-CoV病毒的核酸和相应的病毒以及它们的医学用途。所述减毒病毒优选的能够在细胞培养物中产生最大病毒滴度，当与相同细胞培养物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比时，所述最大病毒滴度降低至少2的因数。

在优选的实施方式中，所述减毒病毒能够在细胞培养物中产生最大病毒滴度，所述最大病毒滴度降低至少5的因数、优选的至少10或20的因数。

在进一步的实施方式中，所述减毒的SARS-CoV病毒能够在细胞培养物中产生最大病毒滴度，所述最大病毒滴度优选的降低2到100之间的因数、更优选的5到50之间的因数、以及最优选的10到25之间的因数。

根据本发明的最优选的实施方式，所述核酸不编码SARS-CoV病毒的功能性蛋白E的序列。所述核酸例如可通过包括步骤的方法获得，其中SARS-CoV病毒的基因组通过修改编码SARS-CoV E蛋白的基因的序列来修饰，使得该核酸不能表达功能性E蛋白。所述修饰可以包括编码序列的删除和/或替换，或调节序列的删除和/或替换。例如可能的是，但非必需的是除去E蛋白的整个编码序列。

术语“修改序列”被用于指出使用本领域公知的技术修饰核酸序列。当“修改序列”时，通过应用包括但不限于核苷酸或序列删除、核苷酸替换或核苷酸添加的技术，所述序列被修饰，使得它不同于野生型序列。Sambrook & Russel(2001)描述了这些和进一步的技术。

术语“E-”或“ΔE”将在本申请中可互换地使用，来指代(至少)缺少基因E的减毒的SARS-CoV病毒，或指代编码(至少)缺少基因E的减毒的SARS-CoV病毒的核酸等等。

根据本发明的优选的方面，E基因的修饰包括在BAC中SARS-CoV复制子或SARS-CoV的全长cDNA克隆的制备和随后该BAC的修饰。这具有特别的益处，SARS-CoV基因组的修饰可以非常方便地进行。

本发明人令人惊讶地发现，包含本发明的核酸的疫苗是安全的，并且可以启动对抗SARS-CoV病毒的免疫反应。所述疫苗包括核酸或减毒病毒颗粒，其含有感染人类或动物细胞必需的所有元件并且其可以是钝化或非钝化的。

使用减毒病毒作为疫苗，细胞的感染将导致病毒的复制和进一步的传染性病毒颗粒的产生。然而，与野生型SARS病毒相比，减毒病毒的滴度将显著更低。换句话说，所述疫苗菌株将仅能在接种的宿主中生长到降低的最大滴度。宿主的免疫系统将产生针对病毒的免疫反应，其降低或消除了由野生型SARS-CoV感染引起的疾病症状。

已经产生了能够在培养的细胞中和在体内复制和增殖的、基于SARS-CoV缺陷性病毒的许多重组疫苗。核酸编码SARS-CoV复制酶和某些、但不是全部的结构和非结构蛋白质。SARS-CoV工程化疫苗病毒的一个主要特征是它们在体内是传染性的但是高度减毒的。

在可选择的实施方式中，通过表达本发明的核酸以及随后使用病毒钝化的公知方法例如化学或热处理来钝化，获得减毒的病毒。这个实施方式具有特别的益处，病毒被解除武装两次，并因而比本领域中早先提示的疫苗更安全。

在本申请中，术语“减毒的”被用于指代复制感受态的和传染性的病毒，在哺乳动物或在细胞培养物中，与在相同条件下在哺乳动物中或在相同细胞的培养物中野生型SARS-CoV病毒产生的最大病毒滴度相比，所述病毒产生降低的最大病毒滴度。因而这种评估步骤可以基于细胞培养物或非人类哺乳动物，优选的鸟类或仓鼠(例如，实施例15中使用的Golden Syrian仓鼠)。

在减毒病毒在细胞培养物中的生长速度太低的情况下，细胞培养物中减毒的SARS-CoV病毒用于疫苗生产的用途是受限的或甚至不可能的。然而，通过使病毒与培养基适应，减毒的SARS-CoV病毒在细胞培养物中的生长速度可以被改善直到比该培养物中野生型病毒达到的最大滴度甚至更高的最大病毒滴度。由于病毒能够适应改变的环境，病毒重复传代的长期培养将改善减毒病毒在细胞培养物中的生长速度。然而，这种方法是非常费时的。

改善减毒病毒的体外生长的另一种方法是使用用于感染的宿主细胞，其反过来提供了不由减毒的SARS-CoV的核酸编码的必需SARS-CoV蛋白。进一步的，在反过来提供这种因子的稍微不同的方法中，宿主细胞可以被减毒的SARS-CoV病毒和辅助病毒感染、或表达必需的SARS-CoV蛋白的其他核酸。

明显地，这方法可以产生能在细胞培养物中生长到最大病毒滴度的SARS-CoV病毒，其超过相同培养物中野生型病毒的最大病毒滴度，但仍然是在体内以最大滴度生长的减毒病毒，该最大滴度与野生型SARS相比显著降低，但仍足以诱导针对SARS-CoV的全身性免疫反应和粘液性免疫反应。

术语“复制感受态病毒核酸(replication competent viral nucleicacid)”被用于指代一种核酸，其包含编码病毒复制酶的序列和代表复制起点的序列，即，触发复制酶的核酸复制的序列。

术语“传染性”被用于指代一种病毒，其能够通过感染细胞、复制病毒核酸、表病毒蛋白、将病毒核酸与病毒蛋白组装成病毒颗粒并通过新产生的病毒颗粒感染进一步的细胞来生长。

术语“编码减毒的病毒的核酸”被用于指代编码减毒病毒的所有序列的核酸。相应的核酸可以用于通过转染细胞培养物获得病毒颗粒，其将引起减毒病毒在所述培养物中的生长。所述核酸也可以用作疫苗。

SARS-CoV外壳蛋白是一些蛋白，例如SARS-CoV E、M或S(刺突)蛋白。这些蛋白可以具有SARS-CoV分离物中观察到的序列，或可以通过本领域已知的方法衍生自这些序列。使用重组表达方法，例如可能的是，通过添加、删除或替换一个或几个氨基酸来修饰蛋白序列。因而本发明覆盖了包含或编码外壳蛋白的病毒，所述外壳蛋白与野生型SARS-CoV蛋白具有至少60％、优选的至少75％、最优选的至少95％的序列同源性。

在所包括的序列表和附图中，提供了一些SARS-CoV的序列：

SARS-CoV Rep1a： SEQ ID NO：1

SARS-CoV Rep1b： SEQ ID NO：2

SARS-CoV N： SEQ ID NO：3

SARS-CoV S： SEQ ID NO：4

SARS-CoV M： SEQ ID NO：5

SARS-CoV E： SEQ ID NO：6

SARS-CoV全长克隆：

SEQ ID NO：11 Fig.18

SARS-CoV ORF 3a： SEQ ID NO：12 Fig.19

基因3b的ORF： SEQ ID NO：13 Fig.20

基因6的ORF： SEQ ID NO：14 Fig.21

基因7a的ORF： SEQ ID NO：15 Fig.22

基因7b的ORF： SEQ ID NO：16 Fig.23

基因8a的ORF： SEQ ID NO：17 Fig.24

基因8b的ORF： SEQ ID NO：18 Fig.25

基因9b的ORF： SEQ ID NO：19 Fig.26

N蛋白的序列也称为序列9a。9b序列通过读码框移动被包括在9a序列中。应当优选地进行9b序列的任何修该，从而9a的序列基本上不被修改，即，以仍然容许功能性9a或N蛋白的表达的方式。

SARS-CoV序列可以基于Urbani株基因组(Genebank，登记号码AY278741)。在全长cDNA中，在位置10338(C＞T)和11163(T＞A)引入两个沉默遗传标志。以上列出的基因的命名不同于GeneBank中保藏的序列中使用的命名。对等物是：

基因3a等同于X1

基因3b等同于X2

基因6等同于X3

基因7a等同于X4

基因8b等同于X5

SARS基因的序列和SARS-CoV的特征：

5′UTR 1-264

ORF 1a(Rep 1a)264-13413

ORF 1b(Rep 1b)13398-21485

S(刺突蛋白)21492-25259

3a 25268-26092

3b 25689-26153

E(包膜蛋白)26117-26347

M(膜蛋白)26398-27063

627074-27265

7a 27273-27641

7b 27638-27772

8a 27779-27898

8b 27864-28118

9b 28130-28426

N(核蛋白)28120-29388

3′UTR 29389-29727；

其中UTR是指“非翻译序列”。

为了当前应用的目的，除非另有说明，使用可从欧洲生物信息学学会(EBI)获得的Clustal计算机程序确定序列同源性。

在本发明的进一步的实施方式中，由SARS-CoV是上述序列编码的以下蛋白特征在于功能性特征。Rep 1a和1b序列编码病毒复制酶，其特征在于它容许病毒RNA的复制。M蛋白是膜蛋白，特征在于它与其他蛋白缔合到病毒颗粒的包膜上。N蛋白是核壳蛋白，特征在于它与病毒RNA缔合到病毒颗粒的核壳上。S或刺突蛋白特征在于它与细胞受体结合。3a的蛋白特征在于它也在病毒膜上存在。

在本发明进一步可选择的实施方式中，编码减毒的SARS-CoV的核酸可以进一步包括不来自SARS-CoV的核酸序列，例如外源基因所述外源基因可以是任何来源的。例如，本发明的核酸可以用作载体用于其他病原微生物，例如病毒、细菌、支原体等等的外源基因的表达。具有由此编码的相应核酸或SARS-CoV的疫苗接种因而可以提供针对SARS-CoV和进一步的病原微生物的保护。

本发明的疫苗中的病毒颗粒优选的从SARS-CoV复制子开始制备。制备本发明的核酸和病毒颗粒的方法可以包括在细菌人工染色体(BAC)中SARS-CoV衍生的复制子的制备。基于这种含SARS病毒复制子的BAC，SARS-CoV核酸的基因组序列的全长拷贝可以如实施例中描述的制备。然后全长克隆可以用于引入点突变、删除或替换，其将钝化某些结构或非结构基因。做为选择，人们也可以从保藏的复制子开始，通过引入希望在核酸中具有的那些序列并删除不应被包括的序列来相同地修改。换句话说，不必制备全长克隆来作为制备编码减毒病毒的核酸的中间产物。

根据本发明，提供了疫苗，其优选的能够诱导针对SARS-CoV的全身性免疫反应和粘液性免疫反应。

与其他冠状病毒类似，病毒的刺突蛋白与细胞受体相互作用并介导膜融合以容许病毒进入易感的目标细胞。因而，刺突蛋白在病毒感染周期中起到重要作用，并且是中和抗体的主要目标。

在本发明的另一个实施方式中，所述核酸进一步编码共刺激分子，例如CD80或CD86或免疫刺激性细胞因子，例如TNF-α、IFN-γ、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-2(IL-2)、IL-12或IL-18。

本发明的疫苗可以施用给哺乳动物以获得免疫反应，所述免疫反应降低或消除由SARS-CoV病毒的感染引起的疾病症状。所述疫苗优选的用于接种哺乳动物，特别是人类、环尾猫熊(a civet cat)、浣熊或白鼬(a ferret)。所有这些动物已知充当了SARS-CoV的宿主。

疫苗可以根据本领域中通常使用的方法来施用。特别地，疫苗可以通过口服、肌肉内、静脉内、皮下或鼻内的施用来施用。口服施用是特别优选的。

所述疫苗也可以包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或佐剂。

适合于经由粘膜途径施用遗传疫苗和免疫原的佐剂和载体是本领域已知的。例如在Kiyono et al.，1996中综述了常规的载体和佐剂。用于条件免疫反应的趋化因子的添加也被本发明涵盖。在Toka et al.，2004中综述了相应的化合物和它们的医学用途。特别有益的是使用粒细胞/巨噬细胞集集落刺激因子、白细胞介素-2(IL-2)、IL-12、IL-18之一。也可以应用利用几种细胞因子和趋化因子的组合方法。此外，随着关于T细胞的记忆发育的需求发现更多，涉及关键细胞因子例如IL-15和IL-23的激发剂可能证明有益于记忆库的长期维持。

使用跨越基因组的非翻译的5′和3′末端、整个复制酶基因和核蛋白(N)基因的一组重叠cDNA，可以产生复制子。

构建SARS-CoV复制子作为细菌人工染色体(BAC)的策略可以如下概述：

(i)鉴定复制子的工程化中要使用的病毒基因组中的合适的限制性位点。

(ii)产生中间质粒作为构建SARS-CoV复制子的基础。

(iii)通过RT-PCR产生叠盖SARS-CoV cDNA亚克隆，使用选择的限制性位点的复制子组装。

SARS-CoV复制子cDNA的构建在实施例1中更多细节地说明。

制备本发明的疫苗中使用的病毒颗粒的方法可以使用以上描述的复制子。根据本发明的优选的方面，这些方法基于质粒pBAC-SARS-CoV-REP的使用。含有这种质粒的细菌于2004年9月1日保藏于Colección

de Cultivos(Tipo，CECT in Valencia，Spain)。保藏物被给予了临时登记号码7020。

质粒pBAC-SARS-CoV-REP包含编码SARS-CoV复制酶和SARS-CoV N蛋白的复制感受态的、非传染性SARS-CoV基因组的序列。这种载体提供了稳定的、安全的和易于操作的基础，用于产生本发明的病毒颗粒和疫苗。通过克隆至少一个进一步的SARS-CoV基因到复制子中，可以产生病毒颗粒和疫苗。

基因组病毒RNA可以用作起始材料来获得编码进一步的SARS-CoV蛋白质的序列。SARS-CoV Urbani株的基因组RNA可以从美国亚特兰大的疾病控制中心获得。根据本领域已知的方法从病毒RNA制备cDNA库。可以从cDNA库重建全长基因。这些基因然后可以与转录调节序列(TRS)和/或翻译调节序列(例如，内部核糖体进入位点，IRES)组合，并可以插入到复制子的克隆位点中。如在实施例中所示，按这种方式，可以制备编码SARS-CoV的基因组核酸的全长拷贝的全长克隆，可以随后修改来产生编码减毒病毒的核酸。

然后所述核酸可以用于转染辅助细胞系。如果使用复制子，需要使用表达不由所述核酸编码的必需SARS-CoV蛋白的细胞系(例如，包装细胞系)。做为选择，宿主细胞可以使用如上所述的复制子核酸和辅助病毒、或表达必需的SARS-CoV蛋白的其他核酸转染。按这种方式，编码SARS-CoV复制酶、SARS-CoV N蛋白和至少一种进一步的SARS-CoV蛋白的核酸(即，复制子)与进一步的必需的SARS-CoV蛋白缔合来形成本发明的疫苗的病毒颗粒。

通过产生以上列出的病毒颗粒，并将它配制到疫苗中，例如，通过混合病毒颗粒与载体、佐剂和/或赋形剂，可以获得疫苗。

疫苗的测试优选的包括按顺序的几个步骤。例如，减毒的SARS-CoV的免疫原性可以通过在Vero E6细胞的组织培养物中产生它们来测试。获得的抗原可以通过包括离心的常规过程来部分纯化，可以测试这些抗原是否在小鼠和兔中诱导SARS-CoV中和抗体。

选择的疫苗可以进一步测试动物系统，例如BALB/c小鼠、白鼬和恒河猴中的保护(使用例如在Enserink，2003；Yang et al.，2004；terMeulen et al.，2004；Martina et al.，2003；and Kuiken et al.，2004中描述的方便的方法)。

动物模型系统可以连续地用于疫苗效力测试和初步安全性测试。首先，疫苗候选物可以在小鼠模型中测试，然后在白鼬SARS-CoV模型中测试(Martina et al.，2003)。进一步的判断可以基于针对SARS-CoV攻击的保护，选择的疫苗候选物然后可以在恒河猴中测试。为了实现这个目标，病毒储库可以在青年食蟹猴中滴定。在首先的实验中，这种病毒储库的提高的对数稀释物(10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵和10⁶TCID₅₀)用于气管内地感染恒河猴(每个稀释度n＝2)。根据早先已经建立的方案，从这些SARS-CoV感染的动物中系统性地收集临床的、病毒学的、gross病理学和免疫学的(中和抗体、血浆中的细胞因子分布型以及通过mRNA分析细胞)数据(Kuiken et al.，2004).

附图的简要说明

附图1显示了SARS-CoV Urbani株的遗传结构。方框内的字母和数字代表病毒基因。L，前导序列；UTR，非翻译区。标明了相关的限制性位点。

附图2显示了中间质粒pBAC-SARS-CoV 5’3’的构建。含有SARS-CoV Urbani株的基因组5′末端678nt和3′末端973nt的PCR片段，其左侧末端侧翼是巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子，右侧末端侧翼是poly(A)尾部和随后的肝炎Δ病毒核酶(Rz)和牛生长激素(BGH)终止子和多聚腺苷酸序列，克隆到BAC中。为了便于SARS-CoV复制子的组装，含有限制性位点ClaI、MluI、PmeI和BamHI的单克隆位点克隆到5′末端病毒序列的下游。

附图3显示了SARS-CoV衍生的复制子pBAC-SARS-CoV-REP的产生。说明了构建SARS-CoV复制子的策略。通过连续克隆由RT-PCR产生的亚基因组叠盖cDNA片段到附图2的质粒pBAC-SARS-CoV 5’3’中，组装SARS-CoV复制子。在底部显示了SARS-CoV复制子的遗传图谱。说明了克隆步骤中使用的相关的限制性位点。Rep 1a、Rep 1b和N代表病毒基因。CMV，CMV即时早期启动子；TRS N，N基因的天然TRS；pA，25个A残基的尾部；Rz，肝炎Δ病毒核酶；BGH，牛生长激素终止子和多聚腺苷酸序列。

附图4显示了附图3的SARS-CoV衍生的复制子的功能分析。在顶部说明了SARS-CoV复制子的遗传结构。标明了N基因TRS、核心序列(斜体字字母)和相关的限制性位点。L，前导序列；UTR，非翻译区。BHK-21和人类293T细胞用SARS-CoV复制子(SARS-CoV-REP)或非复制性cDNA克隆(GFP-NR)利用Lipofectamine 2000模拟转染(MOCK)或转染。在24hpt分离总RNA，用特定寡核苷酸通过RT-PCR分析来检测基因N mRNA。平行扩增的双份RT-PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳来分辨。

附图5显示了从SARS-CoV复制子的SARS-CoV全长cDNA克隆的构建。从克隆在BAC中的SARS-CoV复制子(参见上文附图3)开始，通过在两个步骤中导入剩余的SARS-CoV序列来组装全长克隆。在第一个步骤中，BamHI-NheI片段插入到包括以下基因的复制子中：3a的部分、3b、E、M、7a、7b、8a、8b和N的部分。在第二个步骤中，通过克隆包括Rep 1b的3′末端、基因S和3a的5′末端的PmeI-BamHI片段到前述质粒中，来完成全长cDNA克隆。标明了克隆步骤中使用的相关的限制性位点。使用以下缩写：CMV，巨细胞病毒即时早期启动子；pA，25个A残基的尾部；Rz，肝炎Δ病毒核酶；BGH，牛生长激素终止子和多聚腺苷酸序列。

附图6显示了用于产生编码SARS-CoV-E-的cDNA的策略。显示了核心序列和基因E开放阅读框。以粗体和斜体显示了改变初始ATG到GTG的点突变。在方框中显示了基因E核心序列(CS，在TRS中部的高度保守的序列)。以斜体字显示了导入基因E CS中的两个点突变(ACGAAC到ACCAAT)。基因E ORF内删除的序列是下划线的。

附图7显示了在用rSARS-CoV-ΔE或重组野生型病毒以0.5的moi感染的Vero E6(A)、Huh-7(B)和CaCo-2(C)细胞中SARS-CoV和SARS-CoV-ΔE病毒产生的动力学。在感染后的不同时间，通过在Vero E6细胞上的斑块分析来测定病毒滴度。误差柱代表三个实验的平均值的标准偏差。这个附图显示了E衍生物在它的生长方面降低并因而被减毒。

附图8显示了(A)在感染后24小时在Vero E6细胞中缺陷的和亲本病毒产生的细胞病变效应(上部的正方形)；和(B)在感染后72小时在Vero E6细胞上标明的病毒的斑块形态(中间的圆圈)；(C)使用SARS-CoV特异性多价抗体的标明的病毒的免疫荧光显微(底部正方形)。附图的左半边显示了使用SARS-CoV野生型的感染，右边部分显示了SARS-CoV-ΔE。亲本和E-两种病毒产生了Vero E6细胞中显著的细胞病变效应(附图8A)。较早使用全长病毒观察到效果，SARS-CoV-ΔE病毒斑块也小于野生型病毒产生的斑块(附图8B)。重组E-病毒的援救的其他演示是使用SARS-CoV特异性抗体在免疫荧光中对感染的细胞染色(附图8C)。

附图9显示了受感染细胞的RT-PCR分析。使用在病毒前导序列中杂交的病毒正向引物和分别在基因S、E、M和N的开放阅读框中杂交的反向引物进行RT-PCR。M，模拟感染的细胞；ΔE，SARS-CoV-ΔE；FL，SARS-CoV野生型。

附图10显示了在用SARS-CoV(FL)或SARS-CoV-ΔE(ΔE)感染后在Vero E6细胞中SARS-CoV蛋白表达的分析。S，N和E病毒蛋白；M，模拟感染的细胞。

附图11显示了温度和pH值变化对rSARS-CoV-ΔE病毒传染性的影响。含有重组SARS-CoV和SARS-CoV-ΔE病毒的上清液在标明的温度(附图11A)或pH(附图11B)下孵育30分钟，通过在Vero E6细胞上培养物上清液的滴定来评估病毒传染性。误差柱代表三个实验的平均值的标准偏差。

附图12显示了感染后24小时rSARS-CoV-ΔE感染的Vero E6细胞在电子显微镜超薄切片处理之后的超结构分析。(A)充满病毒颗粒的受感染细胞的细胞质。(B)核壳进入肿胀的高尔基体的腔的发芽位置。在SARS-CoV-ΔE感染的细胞的细胞质中致密材料用箭头表示。在表现为大的空泡的肿胀高尔基体中发现的成熟病毒颗粒。表现rSARS-CoV感染的细胞或rSARS-CoV-ΔE感染的细胞的突变分别在左侧和右侧显示。条形，画面A中2μm，画面B和C中200nm。

附图13显示了从感染的Vero E6细胞释放的rSARS-CoV-ΔE病毒颗粒的形态。(A)显示细胞表面内层的细胞外病毒的超薄切片的电子显微照片。(B)rSARS-CoV和rSARS-CoV-ΔE感染的细胞的上清液在空气离心机中浓缩，在用磷钨酸钠负染色之后通过电子显微镜检查来分析。左侧的图片代表rSARS-CoV感染的细胞，而右侧的代表rSARS-CoV-ΔE感染的细胞。条形，画面A中200nm，画面B中100nm。

附图14显示了在用10³TCID₅₀的rSARS-CoV或rSARS-CoV-ΔE接种后在仓鼠中缺陷性病毒的体内生长动力学。肺(A)和鼻甲(B)中的病毒滴度在Vero E6细胞单层上测定。非参数的Mann-Whitney U统计方法被用于确定观察的差异的显著性。统计显著性由*(p值＜0.05)表明。点线表明检测的下限。

附图15显示了用10³TCID₅₀的rSARS-CoV或rSARS-CoV-ΔE接种之后在仓鼠中rSARS-CoV-ΔE的病理。(A)感染后2天的肺的免疫组织学染色的切片。(B)感染后2天的肺的苏木色素&伊红染色的切片。(C)感染后5天的肺的免疫组织学染色的切片。(D)感染后5天的肺的苏木色素&伊红染色的切片。左侧图片代表rSARS-CoV感染的肺，而右侧图片代表rSARS-CoV-ΔE感染的肺。条形，所有画面中100nm。

附图16显示了被导入以消除9b基因的表达的突变。显示了基因9b ORF的前96个核苷酸。三个ATG密码子突变成ACG，以粗体字符显示。以粗体和斜体字显示了突变的C。引入的终止密码子TAA以粗体显示。

附图17显示了被导入以消除3b基因的表达的突变。显示了基因3b ORF的前75个核苷酸。同相地突变成ACG的三个密码子ATG以粗体显示，突变的C以粗体和斜体显示。通过改变密码子TCA到TAA引入的终止密码子以粗体显示。

附图18到26显示了全长SARS-CoV Urbanis菌株的序列和其选择的基因的序列。

以下实施例说明、但不限制本发明的实施方式。

实施例

使用以下的细胞、病毒、质粒和细菌菌株：

细胞。非洲绿猴肾脏衍生的Vero E6细胞由Eric Snijder(MedicalCenter，University of Leiden，The Netherlands)好意地提供。人类结肠癌衍生的CaCo-2细胞从欧洲细胞培养物保藏所获得。人类肝脏衍生的Huh-7细胞由R.Bartenschlager(Dept.of Molecular Virology，Universityof Heidelberg，Germany)好意地提供，Gillim-Ross et al.，2003；Hattermann et al.，2005；Mossel et al.，2005中提及。婴儿仓鼠肾脏细胞(BHK-21)和人类293T细胞购自美国细胞培养物保藏所(ATCC)。所有细胞在37℃在CO₂孵化器中维持在补充有25mM HEPES和10％胎儿牛血清和抗生素的DMEM中。

病毒。Urbani株的基因组RNA在材料转移协议的签署之后从美国乔治亚州亚特兰大的疾病控制和预防(CDC)中心获得。

质粒和细菌菌株。质粒pBeloBAC11(Wang et al.，1997)由H.Shizuya和M.Simon(California Institute of Technology，Pasadena，Ca)好意地提供。Escherichia coli DH10B菌株从GIBCO/BRL获得。通过根据厂家的说明书在25μF、2.5kV和200Ω使用Gene Pulser单元(Bio-Rad)电穿孔来转化DH10B细胞。根据厂家的说明使用Qiagen(Chatsworth，CA)Large Construct Kit分离质粒DNA。

实施例1

SARS-CoV复制子cDNA的构建

含有Urbani基因组的非翻译5′和3′末端以及复制酶和N基因的cDNA被克隆作为BAC处在CMV启动子的控制下。

另外，含有独特的限制性位点PacI、AscI和BamHI的多克隆位点被克隆到复制酶基因的下游以允许异源基因的克隆(附图3)。这种方法使用两步扩增系统，其联结了核中从CMV启动子的复制子RNA转录与细胞质中由病毒聚合酶驱动的第二扩增步骤。如通过限制性内切酶分析所测定的，在DH10B细胞中的增殖期间，编码SARS-CoV复制子的质粒pBAC-SARS-CoV-REP至少180代是稳定的。

在第一步中，鉴定了可以用于工程化SARS-CoV的复制子和全长cDNA克隆的病毒基因组中合适的限制性位点(附图1)。

在第二步中，产生中间质粒pBAC-SARS-CoV 5’3’作为构建SARS-CoV复制子以及全长cDNA构建体的基础(附图2)。这个质粒含有处在巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子的控制下的Urbani株基因组的5′末端的前678nt，和基因组的后973nt，随后是25-bp合成的poly(A)、肝炎Δ病毒核酶、和牛生长激素终止子和多聚腺苷酸序列以产生精确的3′末端。另外，含有第一步骤中选择的限制性位点ClaI、MluI、PmeI和BamHI的多克隆位点被克隆到SARS-CoV序列之间以容许SARS-CoV复制子的组装。

在第三个步骤中，通过RT-PCR产生叠盖SARS-CoV cDNA亚克隆，使用选择的限制性位点组装复制子。使用pBAC-SARS-CoV 5’3’作为起始点，根据附图3中描述的策略工程化SARS-CoV复制子。质粒pBAC-SARS-CoV-REP含有Urbani基因组的非翻译5’和3’末端、复制酶基因，随后是含有独特限制性位点PacI、AscI和BamHI的多克隆位点，以容许异源基因的克隆和表达，以及处在其天然TRS的控制下的核蛋白(N)基因。

实施例2

克隆的dDNA稳定性的分析

通过研究不同传代下的限制性内切酶图型，分析克隆到pBeloBAC 11中的病毒序列的稳定性。用重组质粒转化的细菌在37℃在含有12.5μg/ml氯霉素的10ml LB中生长。来自这些原代培养物(考虑传代0)的细胞通过每天稀释10⁶倍来连续增殖。每个传代被认为代表约20代。

实施例3

序列分析

使用荧光染料标记的双脱氧核苷酸和温度抗性DNA聚合酶(Perkin Elmer)利用自动373DNA测序仪(Applied Biosystem)来对DNA测序。

实施例4

SARS-CoV复制子cDNA的转染

BHK-21和293T细胞在35mm直径平板上生长到95％汇合，并根据厂家说明书使用6μg Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用5μgSARS-CoV复制子转染。

实施例5

RNA分离和RT-PCR分析

在转染后24h(hpt)用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取总细胞内RNA，用作基因N mRNA转录的RT-PCR分析的模板。用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(Ambion)和与基因N的核苷酸510到531互补的反义引物URB-28630RS(5’-TGCTTCCCTCTGCGTAGAAGCC-3’)(SEQ ID NO：7)进行RT反应。使用反向引物URB-28630RS和跨越Urbani前导序列的核苷酸29到50的正向引物URB-29VS(5’-GCCAACCAACCTCGATCTCTTG-3’)(SEQ ID NO：8)来.扩增产生的cDNA。对于通过基因N mRNA的实时RT-PCR的定量分析，使用Primer Express软件(Applied Biosystems)设计用于RT(URB-28163RS，5’-TGGGTCCACCAAATGTAATGC-3’(SEQ IDNO：9)，与基因N的核苷酸43到63互补)和PCR(反向引物URB-28163RS和正向引物URB-27VS，5’-AAGCCAACCAACCTCGATCTC-3’(SEQ ID NO：10)，跨越Urbani前导序列的核苷酸27到47)的引物。根据厂家的说明(AppliedBiosystems)将SYBR Green PCR主混合物用于PCR步骤中。

实施例6

SARS-CoV衍生的复制子的分析

SARS-CoV衍生的复制子在几个细胞系中是功能性的。基因NmRNA的表达被用于通过RT-PCR分析研究复制子活性。用SARS-CoV复制子或非复制型cDNA克隆使用Lipofectamine 2000转染BHK-21和人类293T细胞。在24hpt提取总细胞内RNA，用作使用特定寡核苷酸的基因N mRNA转录RT-PCR分析的模板。在用SARS-CoV复制子转染的BHK-21和293T细胞中都检测到高水平的基因N mRNA，显示了复制子在这些细胞系中是活性的。在转染的293T和BHK-21细胞中基因N mRNA的定量分析使用实施例5中描述的引物通过实时RT-PCR进行。在293T细胞中SARS-CoV复制子活性是在BHK-21细胞中的8倍高。这种活性提高可以通过在人类293T细胞中SARS-CoV复制子的更高复制水平来解释，或仅仅由于293T细胞的转染效率两倍高于BHK-21细胞的。

分析了N蛋白在SARS-CoV复制子活性中的作用。为了实现这个目标，构建缺少N基因的SARS-CoV复制子，与表达N基因的复制子比较复制子活性。检测缺少N基因的复制子的基础活性，但当存在N蛋白时，复制子活性提高超过100倍。这些数据表明，N蛋白起到了冠状病毒复制子活性的增强子的重要作用。

含有质粒pBAC-SARS-CoV-REP的细菌于2004年9月1日保藏在Colección

de Cultivos(Tipo，CECT in Valencia，Spain)，所述质粒pBAC-SARS-CoV-REP包含编码SARS-CoV复制酶和SARS-CoVN蛋白的复制感受态的、非传染性的SARS-CoV基因组。保藏物被给予了临时登记号码7020。

实施例7

制备全长克隆

根据附图5中列出的克隆策略来制备SARS-CoV全长cDNA克隆(pBAC-SARS-CoV^FL)。

从克隆到BAC中的SARS-CoV复制子开始(上述附图3；和实施例1到6)，通过在两个步骤中添加其余基因来组装全长克隆。在第一个步骤中，包括以下基因的BamHI-NheI片段被插入到含有复制子的BAC中：3a的一部分、3b、E、M、7a、7b、8a、8b和N的一部分。在第二个步骤中，通过克隆包括Rep 1b的3′末端、基因S和3a的5′末端的PmeI-BamHI片段到前述质粒中，来完成全长cDNA克隆。

通过获自亚特兰大的疾病控制中心的RNA片段的RT-PCR克隆，获得这两个片段的cDNA。该RNA相应于SARS-CoV的Urbani株的基因组序列。

克隆步骤中使用的基因和相关的限制性位点在附图5中示出。产生的全长cDNA克隆的功能分析显示，当在E.coli中增殖时该克隆是完全稳定的。

在Vero细胞的转染之后，从cDNA克隆回收传染性的病毒，就噬菌斑形态学、生长动力学以及mRNA和蛋白图谱来说，发现与亲本病毒是相同的。

实施例8

制备含有除了编码结构蛋白蛋白E的基因以外的所有

SARS-CoV基因的减毒病毒

蛋白E被认为是冠状病毒必需的。为了消除基因E表达，将三种不同的修饰导入实施例7的SARS-CoV全长cDNA克隆中，来获得作为BAC的编码SARS-CoV的cDNA，其中E基因被删除(SARS-CoV-ΔE)。

(a)已经在基因E核心序列(CS)(图6)中引入了两个点突变。这个部分是调节基因转录的序列(TRS)的中心，突变的引入将阻止基因E的表达。原始的TRS序列ACGAAC被ACCAAT替代。

(b)在E基因开放阅读框的起始密码子中引入了点突变。起始密码子ATG变为GTG。

(c)引入了ORF基因E内的142个核苷酸删除。

通过在E基因的编码序列的起始密码子内引入点突变，取消了E蛋白的表达。引入的突变对于部分地与E基因重叠的基因3b是沉默的。此外，为了避免重组病毒的基因回复的可能性，删除覆盖大部分E基因的142nt。为了维持M基因的野生型转录水平，不改变E基因的3′末端的M基因的公开的转录调节序列(TRS)的上游48nt(Thiel et al.，2003)。

使用含有SARS-CoV全长cDNA的实施例7的质粒pBAC-SARS-CoV^FL，通过重叠延伸PCR引入E基因删除。寡核苷酸SARS-16501-VS(5′-GGCTCATGTGGTTTATCATTAGTATTGTACAAATGGCACC-3′)和SARS-16973-ΔE-RS

(5′-CCTTCAGAAGAGTTCAGATTTTTAACACGCTTAACGTACCTGTTT-CTTCCGAAACGAATGAGTACACAATGGTACTCACTTTCTTGTGCTTAC-3′)被用于从SARS-CoV基因组的nt 25170和26326产生PCR产物，所述SARS-16973-ΔE-RS包括SARS-CoV基因组的核苷酸(nt)26153和26295之间的删除、E基因的核心序列(CS)中的两个点突变和取消这个基因的起始ATG密码子的一个点突变。寡核苷酸SARS-16943-VS(5′-GCGTGTTAAAAATCTGAACCTCTGAA-GG-3′)和SARS-N733-RS(5′-GGCCTTGTTGTTGTTGGCC-3′)被用于产生跨越SARS-CoV基因组的nt26296到28852的PCR产物。两个叠盖产物都被用作使用引物SARS-16501-VS和SARS-N733-RS的PCR扩增的模板。用酶BamHI和NheI消化最终的PCR产物，克隆到中间质粒pBAC-SARS-5’-3’-DN中来产生质粒pBAC-SARS-5’-3’-DN-ΔE。质粒pBAC-SARS-5’-3’-DN和pBAC-SARS-5’-3’-DN-ΔE都含有巨细胞病毒(CMV)启动子之下的SARS-CoV基因组的前7452nt，和最后的3683nt，随后是25-bp合成的poly A、肝炎Δ病毒核酶(Rz)和牛生长激素(BGH)终止子和多聚腺苷酸序列以产生精确的3’末端。最后，含有SARS-CoV全长cDNA的pBAC-SARS-CoV^FL的BamHI-RsrII片段，相应于nt 26045到29783，通过质粒pBAC-SARS-5’-3’-DN-ΔE的BamHI-RsrII片段来交换，以产生缺少E基因的质粒pBAC-SARS-CoV-ΔE。

为了援救工程化的病毒，在12.5cm²烧瓶中生长到90％汇合的VeroE6细胞使用12μg Lipofectamine 2000(Invitrogen)根据厂家的说明书用6μg质粒pBAC-SARS-CoV-ΔE或用亲本质粒pBAC-SARS-CoV^FL作为对照来转染。在37℃6h的温育期之后，替换转染培养基，在37℃孵育72小时。收获细胞上清液，在新鲜的Vero E6细胞上传代两次，从两种质粒收获的增殖感受态病毒(propagation-competent viruses)(rSARS-CoV-ΔE和重组野生型rSARS-CoV)通过三轮的斑块纯化来克隆。援救了ΔE病毒，表明基因E不是病毒周期所必需的。缺陷性病毒rSARS-CoV-ΔE的滴度是亲本病毒(重组野生型rSARS-CoV)的滴度20到50分之一。病毒滴度是亲本病毒约5×10⁷pfu/ml和缺陷性病毒3×10⁶pfu/ml，如Vero E6细胞上的斑块分析中测定的(附图7A)。

两种病毒，亲本(SARS-CoV)和E-(SARS-CoV-ΔE)在Vero E6细胞中产生了显著的细胞病变效应(附图8A)，然而对于亲本病毒，这种效果比E-病毒更早观察到。SARS-CoV-ΔE病毒斑块(plaques)小于野生型病毒产生的斑块(附图8B)。重组E-病毒的援救的其他证明是使用SARS-CoV特异性抗体在免疫荧光中对感染的细胞染色(附图8C)。

实施例9

pBAC-SARS-CoV-ΔE的RNA分离和RT-PCR分析

来自Vero E6感染的细胞的总RNA根据厂家的说明书使用QiagenRNeasy试剂盒提取，用于S、E和N基因mRNA转录产物的RT-PCR分析。使用莫洛尼氏白血病毒逆转录酶(Ambion)和与S基因的nt 594到613互补的反义引物SARS-S613-RS(5′-CTACTATAGGTTGATAGCCC-3′)；与E基因的nt208到231互补的SARS-E231-(5′-TTAGACCAGAAGATCAGGAACTCC-3′)和与N基因的nt 511到532互补的URB-28630-RS(5′-TGCTTCCCTCTGCGTAGAAGCC-3′)在42℃进行反应1h。使用跨越SARS-CoV前导序列的核苷酸29到50的病毒有义引物URB-29-VS(5′-GCCAACCAACCTCGATCTCTTG-3′)和对RT反应所描述的反向引物通过PCR扩增cDNA。RT-PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中通过电泳来分辨。

E病毒的身份通过使用RT-PCR分析来分析病毒sg mRNAs的合成来确认(附图9)。如预计的，来自E基因sg mRNA的250bp PCR产物在rSARS-CoV-ΔE感染的细胞中没有检测到。结果显示，虽然基因E mRNA由亲本病毒产生，这种mRNA在E-病毒中没有观察到。此外，鉴定了在rSARS-CoV-ΔE病毒的情况下1050bp的PCR产物以及在重组野生型病毒的情况下的1200bp产物。这些PCR产物的序列匹配在基因3的TRS开始的sg mRNA的序列，确认了rSARS-CoV-ΔE病毒维持了被导入以防止E基因表达的突变和删除。相比之下，来自编码S和N蛋白的mRNA的PCR产物中没有检测到差异。

实施例10

Western印迹分析

通过使用E特异性抗体的Western印迹分析，与在用亲本病毒感染的细胞中E蛋白的存在相对比，由E基因表达的破坏引起的E蛋白产生的缺乏，在用E-病毒感染的细胞中进一步显示。

通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析细胞溶胞产物。在含有20％甲醇的25mM Tris-192mM甘氨酸缓冲液pH8.3中，使用Bio-Rad mini protean II电印迹设备在150mA 2h，将蛋白转移到硝化纤维素膜上。使用TBS(20mM Tris-HCl，pH7.5，150mMNaCl)中的5％脱脂奶粉封闭膜1h，用特异于N、S(Imgenex；1∶500稀释)和E蛋白(由Shen Shuo，Institute of Molecular and Cellular Biology，Singapore好意地提供，1∶2000稀释)的多克隆抗体孵育。使用辣根过氧化酶结合的山羊抗兔抗体(Cappel)和ECL检测系统(AmershamPharmacia Biotech)检测结合的抗体。

用rSARS-CoV-ΔE病毒感染的Vero E6细胞的蛋白提取物含有S和N蛋白，但没有E蛋白。使用针对S和N蛋白的抗体的western分析分别揭示了170kDa条带和大约46kDa的双带。相比之下，使用特异性E蛋白抗体的Western印迹分析未能检测到大约10kDa的条带，相应于rSARS-CoV感染的Vero E6细胞提取物的Western印迹分析中观察到的E蛋白(附图10)。

实施例11

rSARS-CoV-ΔE的生长动力学

Vero E6、Huh-7和CaCo-2细胞的亚汇合单层(90％汇合)以0.5的感染复数(moi)用病毒rSARS-CoV-ΔE和rSARS-CoV感染。在感染后不同时间收集培养物上清液，使用密闭烧瓶或密封平板根据标准方法测定病毒滴度。

rSARS-CoV-ΔE和重组野生型病毒在Vero E6细胞中的生长动力学显示了相似的分布(附图7A)。在感染后24h检测Vero E6细胞中的细胞病变效应。相比之下，在Huh-7和CaCo-2细胞中，没有检测到细胞病变效应，即使在感染后72h。在Vero E6感染的细胞中，在感染后24-48h达到最大病毒滴度(重组野生型病毒的峰值滴度是～8×10⁶pfu/ml)。rSARS-CoV-ΔE病毒的滴度是重组野生型病毒的～20分之一。在Huh-7细胞中，感染后48小时达到最大滴度(对于重组野生型病毒～5×10⁵pfu/ml)(附图7B)，而在CaCo-2细胞中，感染后～72小时达到最大滴度(对于重组野生型病毒～4×10⁵pfu/ml)。在Huh-7和CaCo-2细胞系中，rSARS-CoV-ΔE病毒生长到重组野生型病毒～200分之一的滴度。这些数据表明，E蛋白对于SARS-CoV生长有重要作用，它对于细胞培养物中的SARS-CoV复制不是关键的。在貂(mink)肺细胞系MvlLu中确认了相同结果。

实施例12

间接免疫荧光显微镜检查

在9cm²载玻片烧瓶中生长的亚汇合Vero E6细胞以1的moi(感染复数)感染。在24hpi(感染后小时数)，细胞在冰冷的PBS中洗涤，在室温下用8％多聚甲醛固定30分钟。细胞然后用0.2％皂角苷在封闭溶液(磷酸盐缓冲盐水[PBS]，pH7.4，含有10％胎儿牛血清[FBS])中在室温下预渗透1h，在室温下与Anlong Xu(Zhongshan Uninersity，Guangzhou，China)好意地提供的多克隆SARS-CoV特异性抗体孵育90分钟。然后用PBS洗涤细胞三次，与在封闭溶液中1∶200稀释的Cy5结合的抗人免疫球蛋白G(Jackson Immunoresearch)在室温下孵育30分钟，并用PBS洗涤五次。移除载玻片，装上玻璃盖玻片，用ZeissAxiophot荧光显微镜分析。

在两种情况下，免疫荧光的图形对于两种病毒是类似的，细胞膜和细胞质囊泡被显著地染色(附图8C)。

实施例13

rSARS-CoV-ΔE的稳定性

为了分析E蛋白是否影响SARS-CoV的稳定性，分析了温度和pH值对于病毒传染性的影响(附图11)。为此，在从4℃到80℃的温度范围内孵育重组野生型病毒和rSARS-CoV-ΔE病毒30分钟。两种病毒都显示了相似的钝化分布型，在60℃下孵育后10³倍的降低。80℃或更高温度的热度引起残余的病毒感染性(附图11A)。

重组野生型病毒和rSARS-CoV-ΔE病毒在不同的pH值孵育30分钟显示了两种病毒从pH 5到9都是稳定的(附图11B)。这些结果表明，在测试的不同温度和pH值下，E蛋白对于病毒颗粒的稳定性有很少的影响。

实施例14

电子显微镜检查

E蛋白已经与病毒形态发生相联系(Fischer et al.，1998；Kuo andMasters，2003)。因此，通过电子显微镜检查研究了rSARS-CoV和rSARS-CoV-ΔE病毒的组装(附图12)。

对于常规的电子显微镜检查，以1的moi用rSARS-CoV和rSARS-CoV-ΔE病毒感染Vero E6细胞单层。用磷酸盐Na/K缓冲液(pH7.4)中的2％戊二醛在20hpi原位固定细胞在室温下1h。在固定液中从平皿上移除细胞，转移到eppendorf管中。在离心之后，在磷酸盐Na/K缓冲液(pH7.4)中洗涤细胞三次，根据标准步骤处理包膜入Epoxy，TAAB 812树脂(TAAB Laboratories，Berkshire，England)中。在4℃使用蒸馏水中的1％四氧化锇和0.8％铁氰化钾的混合物进行细胞的后固定1h。在用蒸馏水洗涤五次之后，用水中的2％醋酸铀孵育样品1h，洗涤三次，在室温下用提高浓度的丙酮(50、70、90和100％)脱水两次各10分钟。在提高浓度的丙酮/环氧树脂(3∶1、1∶1、1∶3和100％环氧树脂)中进行树脂的浸润。浸润的样品的聚合化在2天期间在60℃进行。用饱和的醋酸铀和柠檬酸铅染色样品的超薄切片，在JeolJEM-1010(Tokyo，Japan)电子显微镜中在80kV检查。

对于负染色电子显微镜检查，感染20h的Vero E6细胞的上清液用10％甲醛固定，使用Electron Microscopy Rotor(EM-90，Beckman)以21psi在Beckman airfuge中浓缩物到碳包被的电离铜网上。筛网用2％磷钨酸pH7染色1分钟。在Jeol JEM-1010(Tokyo，Japan)电子显微镜中检查样品。

在使用rSARS-CoV-ΔE感染的细胞中，细胞质中存在的细胞内成熟病毒的数量低于用重组野生型病毒感染的细胞中的数量(附图12A)。这种观察与缺陷性病毒的更低的病毒滴度一致。冠状病毒通过出芽到高尔基复合体的腔中来组装(Ng et al.，2003)。因而，分析了高尔基复合体的腔内核壳内陷的位置。在rSARS-CoV-ΔE的情况下，在这些位置上成熟病毒的数目低于重组野生型病毒感染的细胞中的，在rSARS-CoV-ΔE病毒感染的细胞的细胞质中观察到致密材料的增加，可能相应于异常的病毒颗粒(附图12B)。在泡囊中作为单个颗粒(数据未显示)或作为扩大的泡囊中病毒的群组见到病毒颗粒(附图12C)。在这种情况下，在rSARS-CoV感染的细胞中成熟病毒的数量显著地高于rSARS-CoV-ΔE感染的细胞中的。此外，在rSARS-CoV-ΔE感染的细胞中观察到的泡囊含有散布在病毒颗粒之间的致密的、粒状材料，其可能相应于取消的病毒组装过程。总的说来，这些数据表明，E蛋白在病毒运输和组装中具有重要作用。

通过感染细胞的超薄切片以及浓缩的负染色病毒的电子显微镜评估，研究了E蛋白删除对SARS-CoV病毒颗粒形态的潜在影响。

对于负染色电子显微镜检查，感染20h的Vero E6细胞的上清液用10％甲醛固定，使用Electron Microscopy Rotor(EM-90，Beckman)以21psi在Beckman airfuge中浓缩物到碳包被的电离铜网上。筛网用2％磷钨酸pH 7染色1分钟。在Jeol JEM-1010(Tokyo，Japan)电子显微镜中在80kV检查样品(附图13)。

通过电子显微镜检查在超薄切片中观察到的细胞外的病毒颗粒形态对于rSARS-CoV-ΔE和重组野生型病毒是类似的，没有见到异常结构(附图13A)。

纯化的重组野生型病毒和rSARS-CoV-ΔE病毒的负染色显示了由棒状突出物围绕的颗粒，表明E蛋白表达表面上对病毒颗粒形态具有很小的影响(附图13B)。尽管如此，与野生型病毒相比，纯化的rSARS-CoV-ΔE病毒显示了高频率的病毒聚集和无定形结构，表明缺陷性病毒对机械剪切力更敏感。

实施例15

仓鼠中的病毒复制

通过感染Golden Syrian仓鼠来测定rSARS-CoV和rSARS-CoV-ΔE病毒的体内生长(Roberts et al，2005)。

这个实施例中采用的动物方案由过敏和传染疾病国家协会动物照料和使用委员会批准。雄性Golden Syrian仓鼠LVG(SYR)从CharlesRiver Laboratories(Wilmington，MA)获得，在单独的通风的微隔离啮齿动物笼中配对居住。在开始以下实验前仓鼠休息至少3天。

Golden Syrian仓鼠(44天龄)通过异氟烷(USP-Baxter Healthcare，Deerfield，IL)吸入来轻轻地麻痹，用100μl总体积中的10³TCID₅₀的rSARS-CoV或rSARS-CoV-ΔE鼻内地接种。病毒接种后两天、五天和八天处死仓鼠(4只仓鼠/组/天)，获取肺和鼻甲，并冷冻保存。对于病毒滴度测定，解冻组织样品，称重，匀化成具有庆大霉素(Invitrogen)和两性霉素B(Quality Biological，Gaithersburg，MD)的Leibovitz’s L-15培养基(Invitrogen，Grand Island，NY)中的最终10％(w/v)悬浮液，其分别以0.1mg/L和5mg/L的终浓度添加到组织培养基中。通过低速离心来澄清组织匀浆，如早先Subbarao et al.，2004描述的在24和96孔板中在Vero细胞单层中测定病毒滴度。病毒滴度表示为组织的TCID₅₀/g，检测下限是10^1.5TCID₅₀/g。测定了三个噬斑形成单位(pfu)相当于一个TCID₅₀。

用rSARS-CoV-ΔE病毒感染的仓鼠的鼻甲和肺中病毒滴度是重组野生型病毒的100和1000分之一，表明rSARS-CoV-ΔE病毒在这个物种中的生长是减毒的(附图14)。在感染后八天，在用重组野生型病毒感染的动物的肺和鼻甲中检测到传染性的病毒，而在这个时点缺陷性病毒已经被清除(附图14)。

实施例16

仓鼠的肺的病理组织学检查

在Golden Syrian仓鼠中比较与重组野生型病毒和rSARS-CoV-ΔE病毒的复制相关的肺部病理(附图15)。

异氟烷麻痹的Golden Syrian仓鼠(40天龄)用100μl总体积的10³TCID₅₀rSARS-CoV(一只仓鼠/天)或rSARS-CoV-ΔE(两只仓鼠/天)鼻内地接种。感染后两天(附图15A和15B)和五天(附图15C和15D)处死仓鼠，肺充气并保存在10％福尔马林中并处理用于组织病理学检查(附图15A和15C)和免疫组织化学(附图15B和15D)。肺在10％中性缓冲的福尔马林中固定三天，常规处理，随后石蜡包埋。使用苏木素伊红染色的切片组织病理学地研究肺。

与病毒滴度(参见上文实施例15)一致，免疫组织学分析揭示了在rSARS-CoV感染的动物的肺中比rSARS-CoV-ΔE感染的动物中更高的抗原浓度。与用rSARS-CoV-ΔE病毒感染的相比，用重组野生型病毒感染的动物显示了更多的肺部疾病(更多的细支气管炎和间隙性肺炎)(附图15)。这表明，在仓鼠模型中在生长和伴随的病理方面，rSARS-CoV-ΔE病毒是减毒的。

实施例17

制备缺少一个或多个结构和非结构基因的减毒病毒

制备以下的进一步的突变体：

缺少SARS-CoV的全部非结构基因(基因3b、6、7a、7b、8a和8b)的病毒。

缺少全部非结构基因(基因3b、6、7a、7b、8a和a)和一个结构基因(基因E)的病毒。

缺少全部非结构基因(基因3b、6、7a、7b、8a、8b)和结构基因3a的病毒。

缺少全部非结构基因(基因3b、6、7a、7b、8a、8b)和两个结构基因3a和E的病毒。

缺少结构基因(E、3a，或两者，和非结构基因6、7a、7b、8a、8b和9b的任意组合，例如分别缺少基因6、7a、7b、8a、8b和9b的病毒，以及缺少基因6、7a、7b、8a、8b、9b和E的组合)的病毒。

基因9b删除。

为了消除基因9b的表达：

(a)在这个基因的起始密码子中引入点突变。

(b)亲本病毒中存在的ATG突变成ACG以防止相应蛋白的表达。

(c)在这个突变的ACG后引入终止密码子，ORF内的另两个同相的ATG被改变(参见附图16)。

基因9b与基因N完全重叠；因而所有引入了N基因的突变对于N基因的序列是沉默的(即，不引起氨基酸改变)。

基因3b删除

为了消除基因3b的表达，使用以下策略(附图17)：

在这个基因的起始密码子中引入点突变。亲本SARS-CoV中存在的起始密码子ATG突变成ACG。在基因中同相地存在的第二和第三个ATG用ACG替代。

设计所有这些突变来引入基因3a和E中的沉默改变，其与基因3b重叠。

基因3a和3b的同时删除。

为取消基因3a和3b的表达，我们采用了三种策略来工程化编码具有无功能的基因3a和3b的SARS-CoV的cDNA(附图17)：

(a)在控制基因3mRNA表达的TRS中存在的核心序列通过改变序列ACGAAC成ACCAAT来钝化。

(b)这些基因的部分通过在SARS-CoV序列的核苷酸25274和26015之间引入删除来部分地删除。

(c)基因3a的起始密码子ATG由ACG替代。此外，在靠近第一个的地方引入终止密码子。

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Claims

1.编码减毒的SARS-CoV病毒的核酸，当与相同细胞培养物中的野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比时，所述减毒的SARS-CoV病毒能够在细胞培养物中产生的最大病毒滴度降低至少2的因数。

2.编码SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸可通过包括步骤的方法获得，其中通过修改编码SARS-CoV E蛋白的基因的序列来修饰所述SARS-CoV病毒的基因组，从而所述核酸不能表达功能性的E蛋白。

3.编码SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸不编码SARS-CoV病毒的功能性蛋白E的序列。

4.编码SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸包含编码病毒蛋白复制酶、S、M和N的序列，并进一步包含或不包含编码蛋白3a的序列。

5.根据权利要求4的核酸，其中所述核酸不包含编码病毒蛋白E、6、7a、7b、8a、8b和9b的序列。

6.编码SARS-CoV病毒的核酸，其中所述核酸包含病毒蛋白复制酶、S、M、N和E的序列，并进一步包含或不包含编码蛋白3a的序列。

7.根据权利要求6的核酸，其中所述核酸不包含编码病毒蛋白6、7a、7b、8a、8b和9b的序列。

8.根据权利要求2到7的任一项的核酸，其中所述病毒在体内是减毒的，并且在体外可以是减毒的。

9.根据权利要求1到8之一的核酸，其中

(a)编码复制酶的核酸序列是SEQ ID NO：1和2，或与SEQ IDNO：1和2的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(b)编码N或9a蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：3，或与SEQ IDNO：3的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(c)编码S蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：4，或与SEQ ID NO：4的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(d)编码M蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：5，或与SEQ ID NO：5的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(e)编码E蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：6，或与SEQ ID NO：6的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(f)编码基因3a的蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：12，或与SEQID NO：4的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(g)编码基因6的蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：14，或与SEQID NO：14的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(h)编码基因7a的蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：15，或与SEQID NO：15的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(i)编码基因7b的蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：16，或与SEQID NO：16的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(j)编码基因8a的蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：17，或与SEQID NO：17的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(k)编码基因8b的蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：18，或与SEQID NO：18的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列；和/或

(l)编码基因9b的蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：19，或与SEQID NO：19的序列具有至少70％、优选的至少85％或至少95％的同源性的序列。

10.根据权利要求1到9之一的核酸，其中当与相同的细胞培养物中野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比时，所述减毒的SARS-CoV病毒能够在细胞培养物中产生的最大病毒滴度降低至少5的因数，优选的至少10或20的因数。

11.根据权利要求1到10之一的核酸，其中当与相同细胞培养物中野生型SARS-CoV病毒的最大病毒滴度相比时，所述减毒的SARS-CoV病毒能够在细胞培养物中产生的最大病毒滴度降低优选的2到100之间的因数、更优选的5到50之间的因数，以及最优选的10到25之间的因数。

12.根据权利要求1的核酸，其中所述细胞培养物是用所述核酸转染的Vero E6、CaCo-2或Huh7细胞的培养物。

13.根据权利要求1到12之一的核酸，其中所述核酸进一步包含不来自SARS-CoV的序列，优选的是外源基因。

14.根据权利要求1到13之一的核酸，其中所述核酸进一步编码共刺激分子，所述共刺激分子选自由CD80、CD86、免疫刺激细胞因子如TNF-α、IFN-γ、趋化因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-2(IL-2)、IL-12和IL-18构成的列表。

15.包含根据权利要求1到14的任何一项的核酸的宿主细胞。

16.包含权利要求1到14的任何一项的核酸的SARS-CoV病毒颗粒。

17.可通过用权利要求1到14的任何一项的核酸转染宿主细胞获得的SARS-CoV病毒颗粒。

18.疫苗，包含根据权利要求16或17的SARS-CoV病毒颗粒、或根据权利要求1到14的任何一项的钝化的SARS-CoV病毒颗粒或核酸、或根据权利要求15的宿主细胞，和药学上可接受的佐剂、载体或赋形剂。

19.根据权利要求18的疫苗，其中所述疫苗向哺乳动物的施用产生免疫反应，所述免疫反应降低或消除由SARS-CoV病毒感染引起的疾病症状。

20.根据权利要求18或19的疫苗，其中所述疫苗将施用给人类或动物，其中所述动物优选的是环尾猫熊、浣熊或白鼬。

21.根据权利要求18到20之一的疫苗，其中所述疫苗将口服地、肌内地、静脉内地、皮下地或鼻内地施用。

22.根据权利要求18到21的任一项的疫苗，其中所述佐剂选自由细胞因子、TNF-α、IFN-γ、趋化因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-2(IL-2)、IL-12、IL-18、IL-15和IL-23构成的列表。

23.根据权利要求16或17的病毒颗粒或根据权利要求1到14的核酸用于制备疫苗的用途，所述疫苗用于接种哺乳动物、特别是人类、环尾猫熊、浣熊或白鼬对抗SARS-CoV感染。

24.制备SARS-CoV疫苗的方法，包括通过修改根据权利要求2到9的核酸来修饰包含SARS-CoV病毒基因组的核酸。

25.根据权利要求24的制备SARS-CoV疫苗的方法，包括修改编码SARS-CoV E蛋白的基因的序列，从而所述基因不能表达功能性的E蛋白。

26.根据权利要求25的方法，其中所述方法进一步包括修改SARS-CoV的基因组的序列，从而所述核酸表达病毒蛋白复制酶、S、M和N，并且进一步表达或不表达编码蛋白3a的序列。

27.根据权利要求26的方法，其中所述方法进一步包括修改SARS-CoV的基因组的序列，从而所述核酸不能表达与SARS-CoV基因E、6、7a、7b、8a、8b和9b(相应于SEQ ID NO：6、14到19)编码的蛋白质具有至少80％的同源性、优选的至少90％的同源性或至少95％的同源性的蛋白。

28.根据权利要求27的方法，其中所述方法进一步包括修改SARS-CoV的基因组的序列，从而所述核酸不能表达与SARS-CoV基因3a、3b、6、7a、7b、8a、和8b(相应于SEQ ID NO：12到18)编码的蛋白质具有至少80％的同源性、优选的至少90％的同源性或至少95％的同源性的蛋白。

29.根据权利要求24的方法，其中所述方法进一步包括修改SARS-CoV的基因组的序列，从而所述核酸表达病毒蛋白复制酶、S、M、N和E，并且进一步表达或不表达编码蛋白3a的序列。

30.根据权利要求29的方法，其中所述方法进一步包括修改SARS-CoV的基因组的序列，从而所述核酸不能表达与SARS-CoV基因6、7a、7b、8a、8b和9b(相应于SEQ ID NO：14到19)编码的蛋白质具有至少80％的同源性、优选的至少90％的同源性或至少95％的同源性的蛋白。

31.根据权利要求24到30之一的方法，其中所述方法进一步包括修改SARS-CoV的基因组的序列，从而所述核酸不能表达除了复制酶S、M、N和/或E以外任何SARS-CoV衍生的蛋白编码序列，并进一步表达或不表达编码蛋白3a的序列。

32.根据权利要求24或权利要求31的方法，其中所述方法进一步包括向宿主细胞中导入所述修饰的核酸，并分离编码所述修改的基因组的核酸或包含所述修饰的核酸的SARS-CoV病毒颗粒。

33.根据权利要求24到32之一的方法，其中所述方法进一步包括与药学上可接受的佐剂、载体或赋形剂混合所述核酸或所述SARS-CoV病毒颗粒。