CN112618711B - 一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂及其制备方法与应用。所述纳米复合佐剂按质量百分数计,由50~70%聚合物、20~30%多金属氧酸盐和10~25%抗原组成。该纳米复合佐剂中的多金属氧酸盐和聚合物的协同作用能够促进肠淋巴细胞M细胞对疫苗纳米复合佐剂的摄取,促进M细胞将抗原传递给M细胞内测树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞,更高效地启动免疫应答并将抗原持续性释放出来,实现对抗原的识别、加工,提高分泌性IgA在免疫防御中的作用,呈递给T淋巴细胞,并且活化的淋巴细胞还可通过淋巴循环迁移至机体其它免疫组织和器官,使猪群形成更稳定持久的免疫记忆。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域,具体涉及一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂及其制备方法与应用。
背景技术
动物的免疫途径主要有肌肉途径、腹腔途径、皮下途径以及多种黏膜途径。前几种途径都需要使用注射工具,在给猪、牛等大型家畜注射疫苗时可能由于动物的不配合而刺伤医务人员。在设施不齐全、饲养条件不完备的养殖场,注射器可能会被反复使用而带来感染威胁,存在安全隐患。相对于注射免疫,黏膜免疫是一种最易于实施的免疫途径,在现代化养殖产业中最简单易行,在常规免疫接种中发挥越来越大的作用。黏膜免疫系统具有特殊的生理结构。肠道黏膜表面分布有微褶皱细胞(Microfold cells,M细胞),具备对抗原的摄取和转运功能,与黏膜中巨噬细胞和树突状细胞对抗原的识别和捕获密切相关。
游离状态的蛋白质或肽抗原在胃肠道内经常被迅速清除,因而动物只能产生非常短暂而微弱的免疫应答,需要运用佐剂来包载抗原、保护抗原免受降解,增强免疫细胞对抗原的捕获。影响免疫系统对疫苗的识别和处理主要受到疫苗结构和组成成分等因素的影响。同样的,佐剂的结构和成分也会影响抗原物质免疫原性的发挥。大多数佐剂都具有非特异性刺激免疫系统激活固有免疫应答的作用,进而促进免疫细胞对抗原的识别和呈递。应用最早、最广泛的佐剂是铝佐剂。然而现在常用的佐剂如铝佐剂等,只能有效激活体液免疫而无法活化细胞免疫应答。由于铝佐剂是以胶体形式分散于液体中,因此不能采用膜过滤法来除菌,也不可冷冻,因此不能冻干保存。借助于纳米技术的发展,现已发现病原体粒径的尺寸影响抗原提呈细胞与粒径之间的相互作用。免疫系统能够有效识别的抗原粒径介于纳米尺度范围内。纳米毒理学的研究结果表明,粒径较小的颗粒更易于刺激机体产生T细胞。同理,佐剂的粒径也会影响免疫系统对其的作用效果。脂质体或乳剂由脂质体配制而成形成水包油乳滴,粒径在100~1000 nm范围,在临床试验中表现出较好的免疫应答水平和保护力。然而,这类脂质体乳剂存在载药量较低、药物快速泄露等缺点。聚合物纳米佐剂具有良好的灵活性和多样性。目前常用的聚合物佐剂如聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物等,但这些聚合物对亲水性药物的载药量低,因而产生的免疫应答较弱。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂。
本发明的另一目的在于提供上述一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂在生物医药领域中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂,按质量百分数计,由50~70%聚合物、20~30%多金属氧酸盐和10~25%抗原组成;所述各组成质量百分数之和为100%;
所述聚合物为聚2-乙烯基吡啶或聚4-乙烯基吡啶;
所述抗原为猪回肠炎活疫苗、猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗、猪支原体肺炎灭活疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗、猪口蹄疫灭活疫苗、猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗、猪链球菌双价灭活疫苗和副猪嗜血杆菌病灭活疫苗中的至少一种。
优选地,所述聚2-乙烯基吡啶的分子量为20~80 kDa,更优选为50~60 kDa;所述聚4-乙烯基吡啶的分子量为27~80 kDa,更优选为50~65 kDa。所述分子量均指重均分子量,其中1kDa=1000g/mol。
优选地,所述多金属氧酸盐为多钨酸盐或多钼酸盐中的至少一种,更优选为磷钨酸钠和/或磷钼酸钠。
上述一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂的制备方法,包括以下步骤:
将聚合物乙醇溶液、多金属氧酸盐水溶液和抗原水溶液混合均匀,在4~40℃下孵育0.5~12h,去除溶剂,得到猪口服疫苗纳米复合佐剂。
优选地,所述聚合物乙醇溶液的浓度为0.005~0.05g/mL,优选为0.005~0.02g/mL;所述多金属氧酸盐水溶液的浓度为3~100mg/mL,优选为3~30mg/mL;所述抗原水溶液的浓度为0.5~10mg/mL。
优选地,所述混合均匀的方式为:将抗原水溶液平均分成两份,在搅拌条件下,先将第一份抗原水溶液以恒定流速加入到聚合物乙醇溶液中,得到混合液,再将多金属氧酸盐水溶液和第二份抗原水溶液同时以恒定流速加入到混合液,所述恒定流速均为0.2~6mL/min。
优选地,所述混合均匀和孵育可通过微流控技术同时进行,通过微流控技术控制流速,在混合过程中孵育,在微流控芯片上利用微液滴形成技术,连续生产尺寸均一、单分散性好的纳米复合物;所述流速为10~60μL/h。
优选地,所述混合均匀和孵育同时进行的方式为:采用三进样口蛇形通道的微流控芯片作为聚合物、多金属氧酸盐及抗原自组装形成纳米复合物的场所,利用微流控技术控制聚合物乙醇溶液和抗原水溶液及多金属氧酸盐水溶液的流速,连续生产尺寸均一、单分散的纳米复合物。
优选地,所述去除溶剂指去除乙醇和水,由于制得的猪口服疫苗纳米复合佐剂可分散在水中,因此可不用全部去除水;所述去除溶剂的方法为:将产物混合液经0.45μm滤膜过滤,收集滤液,通过高效液相层析纯化并收集纳米胶束,-40~5℃冷冻干燥6~24小时,即得猪口服疫苗纳米复合佐剂。
优选地,所述猪口服疫苗纳米复合佐剂可以干粉形态保存,也可以保存于水中,即分散在水中进行保存。
上述一种猪口服接种疫苗纳米复合佐剂在制备生物医药材料领域中的应用。
所述应用为:在药物制备中的应用,优选在制备猪口服接种疫苗药物中的应用。
本发明的技术原理是:所采用的聚2-乙烯基吡啶或聚4-乙烯基吡啶在作为疫苗佐剂的骨架,吡啶基中的N原子与多金属氧酸盐在水溶液中形成氢键,由于氢键的桥连作用,聚2-乙烯基吡啶或聚4-乙烯基吡啶聚合物分子链折叠形成交错的聚合物网络;在聚合物网络的空隙内,抗原可以通过静电作用和氢键作用被包载于聚合物网络中。聚合物、多金属氧酸盐及抗原逐级自组装并最终形成纳米复合物。该纳米复合物作为疫苗佐剂在免疫过程中可以限制抗原同抗原提呈细胞接触,使抗原呈递加工的过程被延长,促进抗原与抗原提呈细胞形成持久稳定的相互作用。多金属氧酸盐一方面促使聚2-乙烯基吡啶或聚4-乙烯基吡啶形成稳定的聚合物网络,另一方面可激活免疫系统,进一步增强疫苗的免疫效果。因此,聚合物、多金属氧酸盐及抗原三者协同作用提高猪口服免疫的效果。
与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果:
本发明所述的猪群猪用口服接种疫苗纳米复合佐剂融合了聚合物聚2-乙烯基吡啶或聚4-乙烯基吡啶和多金属氧酸盐的增益作用,多金属氧酸盐与抗原蛋白混合制备疫苗能够很好的增强疫苗的免疫效果。多金属氧酸盐具有对免疫系统的激活作用,能促进刺激巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞分泌多种趋化因子,从而诱导白细胞聚集和抗原呈递,增强淋巴结迁移并诱导适应性免疫反应。多金属氧酸盐与抗原合用后,动物抗体水平有明显升高,多种细胞因子水平均有明显增高。另外,聚合物聚2-乙烯基吡啶或聚4-乙烯基吡啶的缓释作用使得免疫动物的T细胞活性提高,并可持续至少四个月之久。本发明所提供的纳米复合佐剂经黏膜免疫后可诱导强有力的系统黏膜抗原特异性免疫应答反应,并且可以诱导平衡的免疫应答反应,保护动物免受细菌或病毒的攻击。
附图说明
图1为本发明所述猪口服接种疫苗纳米复合佐剂的组成结构示意图。
图2为实施例1中聚4-乙烯基吡啶和磷钨酸钠负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗后形成纳米复合物的粒径分布图。
图3为实施例2中聚2-乙烯基吡啶和磷钼酸钠共同负载猪链球菌双价灭活疫苗后形成纳米复合物的粒径分布图。
图4为实施例3中采用微流控技术制备的聚2-乙烯基吡啶与磷钨酸钠共同负载猪嗜血杆菌灭活疫苗形成纳米复合物的粒径分布图。
图5为实施例5中Balb/c鼠在免疫第0天和第14天后,肠道、气管分泌型sIgA及血清IgG效价变化图,其中图5(a)为肠道中分泌型sIgA,图5(b)为气管中分泌型sIgA,图5(c)为血清IgG。
图6为实施例5中Balb/c鼠在免疫第0天和第14天后血清细胞因子浓度变化图,其中,图6(a)为IL-2的浓度变化,图6(b)为IL-4的浓度变化,图6(c)为IL-10的浓度变化,图6(d)为IFN-γ的浓度变化。
图7为实施例5中Balb/c鼠在免疫第0天和第14天后,外周血CD4+、CD8+T细胞数量变化图,其中,图7(a)为外周血CD4+T细胞数量变化图,图7(b)为外周血CD8+T细胞数量变化图。
图8为对比例4中Balb/c鼠在免疫第0天和第14天后,外周血CD4+、CD8+T细胞数量变化图,其中,图8(a)为外周血CD4+T细胞数量变化图,图8(b)为外周血CD8+T细胞数量变化图。
图9为对比例7中Balb/c鼠在免疫第0天和第14天后,肠道、气管分泌型sIgA及血清IgG效价变化图,其中图9(a)为肠道中分泌型sIgA,图9(b)为气管中分泌型sIgA,图9(c)为血清IgG。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
本申请实施例中所述实验方法如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂、材料等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本申请实施例和对比例中所述市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗和市售的猪链球菌双价灭活疫苗购买于勃林格殷格翰;所述副猪嗜血杆菌病灭活疫苗和猪链球菌双价灭活疫苗(即实施例和对比例中制备原料)购买于西班牙海博莱生物大药厂;所述分子量均指重均分子量,其中1kDa=1000g/mol。
实施例 1
称取平均分子量为60 kDa的聚4-乙烯基吡啶0.01 g,充分溶解于1.0 mL无水乙醇中,制成浓度为0.01g/mL的聚合物乙醇溶液。称取磷钨酸钠5 mg,充分溶解于0.5 mL去离子水中制成浓度为10mg/mL的磷钨酸钠水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗分散于无菌水中制成浓度为1 mg/mL的抗原水溶液。在4℃持续搅拌状态下使用注射泵以3 mL/min的流速向1.0mL的聚合物乙醇溶液中滴加4 mL抗原水溶液。在抗原水溶液滴加体积达到50%(即滴加了2mL)时,向混合溶液中以0.5mL/min的流速滴加磷钨酸钠水溶液0.5 mL,同时继续以3mL/min的流速滴加剩余的50%抗原水溶液,然后在4℃下恒温振荡孵育6小时。使用0.45μm滤膜过滤产物混合液,收集滤液,再经高效液相层析纯化滤液,收集纳米复合物。-20 ℃低温冷冻干燥14小时,完全除去溶剂,得到所述负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂干粉,即为猪口服接种疫苗纳米复合佐剂。
本实施例所述聚4-乙烯基吡啶、磷钨酸钠和副猪嗜血杆菌病灭活疫苗在乙醇/水混合溶剂中自组装形成纳米复合物的结果如附图2所示,聚4-乙烯基吡啶在磷钨酸钠的作用下形成网络结构,并将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗束缚在网络结构中(如图1所示)。所制备的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂在2~8℃干燥冷藏一年后,在37℃放置一周未见明显变化。纳米复合佐剂干粉用无菌水重新分散后,经3000 rpm离心5min未见明显沉淀或分层,说明该猪口服接种疫苗纳米复合佐剂稳定性良好。将制备好的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂接种于胰酪胨大豆肉汤(TSB)培养基,37℃下观察24 h,未见胰酪胨大豆肉汤培养基中出现浑浊,镜检未发现细菌,说明该猪口服接种疫苗纳米复合佐剂无细菌污染。
实施例 2
称取平均分子量约为55 kDa的聚2-乙烯基吡啶0.01 g,充分溶解于0.5 mL无水乙醇中,制成浓度为0.02g/mL的聚合物乙醇溶液。称取磷钼酸钠15mg,充分溶解于0.5 mL去离子水中制成浓度为30mg/mL的磷钼酸钠水溶液。将猪链球菌双价灭活疫苗分散于无菌水中制成浓度为1mg/mL的抗原水溶液。在4℃持续搅拌状态下使用注射泵以4.5 mL/min的流速向0.5mL的聚合物乙醇溶液中滴加6 mL的抗原水溶液。在抗原水溶液滴加体积达到50%(即滴加了3mL)时,向混合溶液中以0.5mL/min的流速滴加磷钼酸钠水溶液0.1 mL,同时继续以3 mL/min的流速滴加剩余的50%抗原水溶液,然后在4℃下恒温振荡孵育4小时。使用0.45μm滤膜过滤反应液,收集滤液,再经高效液相层析纯化滤液,收集纳米复合物。-20 ℃低温冷冻干燥14小时,完全除去溶剂,得到所述负载猪链球菌双价灭活疫苗的聚2-乙烯基吡啶-磷钼酸钠纳米复合佐剂干粉,即为猪口服接种疫苗纳米复合佐剂。
本实施例所述聚2-乙烯基吡啶、磷钼酸钠和猪链球菌双价灭活疫苗在乙醇/水混合溶剂中自组装形成纳米复合物的结果如附图3所示,聚2-乙烯基吡啶在磷钼酸钠的作用下形成网络结构,并将猪链球菌双价灭活疫苗束缚在网络结构中(如图1所示)。所制备的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂在2~8℃干燥冷藏一年后,在37℃放置一周未见明显变化。猪口服接种疫苗纳米复合佐剂干粉用无菌水重新分散后,经3000 rpm离心5min未见明显沉淀或分层,说明该猪口服接种疫苗纳米复合佐剂稳定性良好。将制备好的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂接种于胰酪胨大豆肉汤(TSB)培养基,37℃下观察24 h,未见胰酪胨大豆肉汤培养基中出现浑浊,镜检未发现细菌,说明该猪口服接种疫苗纳米复合佐剂无细菌污染。
实施例 3
称取平均分子量约为60 kDa的聚4-乙烯基吡啶5 mg,充分溶解于1.0 mL无水乙醇中,制成浓度为0.005g/mL的聚合物乙醇溶液。称取磷钨酸钠3 mg,充分溶解于1.0 mL去离子水中制成浓度为3mg/mL的磷钨酸钠水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗分散于无菌水中制成浓度为1 mg/mL的抗原水溶液。在4℃下,使用三进样口蛇形通道的微流控芯片作为微反应器,使用微流控系统分别控制1mL的聚合物乙醇溶液、1mL的磷钨酸钠水溶液和2mL的抗原水溶液的流速为10μL/h、10μL/h和20μL/h,聚合物乙醇溶液、磷钨酸钠水溶液和抗原水溶液在通道汇合位点混合形成微液滴。流出液使用0.45μm滤膜过滤,收集滤液,再经高效液相层析纯化滤液,收集纳米复合物。-20 ℃低温冷冻干燥14小时,完全除去溶剂,得到所述负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂干粉,即为猪口服接种疫苗纳米复合佐剂。
本实施例所述聚4-乙烯基吡啶在多金属氧酸盐的作用下形成网络结构,并将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗束缚在网络结构中的结果如图4所示,所制备的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂在2~8℃干燥冷藏一年后,在37℃放置一周未见明显变化。猪口服接种疫苗纳米复合佐剂干粉用无菌水重新分散后,经3000 rpm离心5min未见明显沉淀或分层,说明该猪口服接种疫苗纳米复合佐剂稳定性良好。将制备好的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂接种于胰酪胨大豆肉汤(TSB)培养基,37℃下观察24 h,未见胰酪胨大豆肉汤培养基中出现浑浊,镜检未发现细菌,说明该猪口服接种疫苗纳米复合佐剂无细菌污染。
实施例 4 猪口服接种疫苗纳米复合佐剂的安全性
以实施例1~3制备得到的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂为例进行说明。将6~8周龄雌性Balb/c鼠测定其体温后,随机分为五组,每组10只,分别对每只Balb/c鼠进行免疫处理,具体如下:实施例1~3制备得到的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂免疫组为实验组,将该纳米复合佐剂分散于水中制成浓度为10 mg/mL的水溶液,每只Balb/c鼠经口服给药接种上述水溶液20μL;市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗免疫组为对照组,每只Balb/c鼠经背部皮下注射上述市售灭活疫苗20μL;生理盐水组为空白组,每只仔猪经口服给药生理盐水20μL。连续观察四周,实验结果表明所有Balb/c鼠均存活(如表1所示),且无任何临床表现。
表1 Balb/c鼠在免疫接种后的存活结果
以实施例1制备得到的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂为例进行具体阐明其安全性。将6~8周龄雌性Balb/c鼠测定其体温后,随机分为三组,每组5只,分别对每只Balb/c鼠进行免疫处理,具体如下:实施例1制备得到的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂免疫组为实验组,将该纳米复合佐剂分散于水中制成浓度为10 mg/mL的水溶液,每只Balb/c鼠经口服给药接种上述水溶液20μL;市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗免疫组为对照组,每只Balb/c鼠经背部皮下注射上述市售灭活疫苗20μL;生理盐水组为空白组,每只仔猪经口服给药生理盐水20μL。
实验组(实施例1制备得到的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂)免疫处理后,每隔30分钟使用动物测温计监测Balb/c鼠体温1次,在持续监控4小时内,Balb/c鼠在给与实施例1制备得到的纳米复合佐剂后体温变化在0.5℃以内(见表2)。随后连续观察四周,监测是否出现临床反应。在经口途径接种后的四周内,Balb/c鼠未见发热等副反应,未见异常症状,所有的Balb/c鼠均健康存活,说明实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂不会引起动物免疫后的强烈免疫应激反应,安全性良好。
表2 Balb/c鼠在免疫接种后体温监测结果
a口服免疫负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂
b注射免疫市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗
实施例 5 猪口服接种疫苗纳米复合佐剂的免疫效果
以实施例1制备得到的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂为例进行具体阐明。将实施例1中制备的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶疫苗纳米复合佐剂进行体内免疫效果试验。将6~8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为三组,每组5只,分别对每只Balb/c鼠进行免疫处理,具体如下:实施例1~3制备得到的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂免疫组为实验组,将该纳米复合佐剂分散于水中制成浓度为10mg/mL的水溶液,每只Balb/c鼠经口服给药接种上述水溶液10μL;市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗免疫组为对照组,每只Balb/c鼠经背部皮下注射上述市售灭活疫苗10μL;生理盐水组为空白组,每只仔猪经口服给药生理盐水10μL。接种后,每周采集Balb/c鼠血液,分离血清,使用间接ELISA法监测血清中副猪嗜血杆菌抗体效价,测定血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的浓度,CD4+和CD8+T淋巴细胞数。采血之后,将上述Balb/c鼠每组选取3只处死,剪取小肠和气管部分除去内容物,用灌洗液(PBS缓冲液,含0.05 mg/mL EDTA(乙二胺四乙酸)、0.35 mg/mL PMSF(苯甲基磺酰氟)、0.05%吐温20)冲洗肠道和气管粘膜,具体是将小肠和气管浸入灌洗液中并于4 ℃下孵育2 h,然后在4 ℃下,18000 rpm离心30 min,收集上清液,加入牛血清白蛋白BSA至终浓度为0.1%,使用间接ELISA方法检测肠道SIgA、气管SIgA及血清IgG效价。
在给药实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶疫苗纳米复合佐剂一周后即可检测出抗体,随后抗体含量逐渐上升,2~3个月期间处于抗体水平高峰,在之后的六个月内,Balb/c鼠所产生抗体水平都在1:16以上(见表3),从接种一周后持续至监测结束。另外,实验组平均抗体效价基本与对照组相当,而且在监测的最后两个月内,抗体水平始终维持较高水平,并且明显高于对照组。
表3 Balb/c鼠在免疫接种后血清中副猪嗜血杆菌抗体效价
a口服免疫负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶疫苗纳米复合佐剂
b注射免疫市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗
在接种实施例1制得的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂后,Balb/c鼠黏膜抗体增强免疫结果如图5所示,在接种14天后,实验组Balb/c鼠的肠道和气管中分泌型sIgA水平明显高于空白组和对照组(如图5(a)和5(b)图所示)。在对血清样品分析的结果表明,实验组Balb/c鼠血清抗体IgG明显高于空白组和对照组(如图5(c)所示)。
实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶疫苗纳米复合佐剂诱导的机体细胞免疫应答效果,可通过检测血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ浓度水平变化来实现。在接种14天后,实验组Balb/c鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ浓度水平明显高于空白组和对照组,只有IL-10浓度无显著差异(如图6所示)。
血清CD4+和CD8+T淋巴细胞数直接反映动物的免疫应答功能。实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶疫苗纳米复合佐剂诱导产生的CD4+和CD8+T淋巴细胞数与市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗相当,均明显高于空白组,其中实验组CD8+T淋巴细胞数还略高于对照组。以上结果表明,实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶疫苗纳米复合佐剂可有效提高Balb/c鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞数量(如图7所示)。
对比例1
称取平均分子量为60 kDa的聚4-乙烯基吡啶0.01 g,充分溶解于1.0 mL无水乙醇中,制成浓度为0.01g/mL的聚合物乙醇溶液。称取牛血清白蛋白(BSA) 5 mg,充分溶解于0.5 mL去离子水中制成浓度为10mg/mL的BSA水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗分散于无菌水中制成浓度为1 mg/mL的抗原水溶液。在4℃持续搅拌状态下使用注射泵以3mL/min的流速向1.0mL的聚合物乙醇溶液中滴加4 mL抗原水溶液。在抗原水溶液滴加体积达到50%(即滴加了2mL)时,向混合溶液中以0.5 mL/min的流速滴加牛血清白蛋白(BSA)水溶液0.5mL,同时继续以3 mL/min的流速滴加剩余的50%抗原水溶液,然后在4℃下恒温振荡孵育6小时。使用0.45μm滤膜过滤产物混合液,收集滤液,再经高效液相层析纯化滤液,收集纳米复合物。-20 ℃低温冷冻干燥14小时,完全除去溶剂,得到所述负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-BSA纳米复合佐剂,标记为疫苗纳米复合佐剂A。
对比例2
称取平均分子量约为55 kDa的聚2-乙烯基吡啶0.01 g,充分溶解于0.5 mL无水乙醇中,制成浓度为0.02g/mL的聚合物乙醇溶液。称取BSA 15mg,充分溶解于0.5 mL去离子水中制成浓度为30mg/mL的BSA水溶液。将猪链球菌双价灭活疫苗分散于无菌水中制成浓度为1mg/mL的抗原水溶液。在4℃持续搅拌状态下使用注射泵以4.5 mL/min的流速向0.5mL的聚合物乙醇溶液中滴加6 mL的抗原水溶液。在抗原水溶液滴加体积达到50%(即滴加了3mL)时,向混合溶液中以0.5mL/min的流速滴加BSA水溶液0.5 mL,同时继续以3 mL/min的流速滴加剩余的50%抗原水溶液,然后在4℃下恒温振荡孵育4小时。使用0.45μm滤膜过滤反应液,收集滤液,再经高效液相层析纯化滤液,收集纳米复合物。-20 ℃低温冷冻干燥14小时,完全除去溶剂,得到所述负载猪链球菌双价灭活疫苗的聚2-乙烯基吡啶-BSA纳米复合佐剂,标记为疫苗纳米复合佐剂B。
对比例3
称取平均分子量约为60 kDa的聚4-乙烯基吡啶5 mg,充分溶解于1.0 mL无水乙醇中,制成浓度为0.005g/mL的聚合物乙醇溶液。称取BSA 3 mg,充分溶解于1.0 mL去离子水中制成浓度为3mg/mL的BSA水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗分散于无菌水中制成浓度为1mg/mL的抗原水溶液。在4℃下,使用三进样口蛇形通道的微流控芯片作为微反应器,使用微流控系统分别控制1mL的聚合物乙醇溶液、1mL的BSA水溶液和2mL的抗原水溶液的流速为10μL/h、10μL/h和20μL/h。聚合物乙醇溶液、BSA水溶液和抗原水溶液在通道汇合位点形成微液滴。流出液使用0.45μm滤膜过滤,收集滤液,再经高效液相层析纯化滤液,收集纳米复合物。-20 ℃低温冷冻干燥14小时,完全除去溶剂,得到所述负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-BSA纳米复合佐剂,标记为疫苗纳米复合佐剂C。
对比例4
将6~8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为三组,每组10只,分别对每只Balb/c鼠进行免疫处理,具体如下:对比例1~3制备得到的疫苗纳米复合佐剂A、疫苗纳米复合佐剂B、疫苗纳米复合佐剂C为实验组,分别将对应的纳米复合佐剂分散于水中制成浓度为10mg/mL的水溶液,每只Balb/c鼠经口服给药分别接种上述水溶液10μL;实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂为对照组,每只Balb/c鼠经口服给药接种上述水溶液10μL;生理盐水组为空白组,每只仔猪经口服给药生理盐水10μL。接种后,每周采集Balb/c鼠血液,分离血清,测定血清CD4+和CD8+T淋巴细胞数。
血清CD4+和CD8+T淋巴细胞数可反映动物的细胞免疫应答结果。实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂诱导产生的CD4+和CD8+T淋巴细胞数与市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗相当,均明显高于空白组,其中所诱导产生的CD8+T淋巴细胞数还略高于市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(如图7所示)。而对比例1~3制备得到的疫苗纳米复合佐剂A-C中,多金属氧酸盐皆被BSA所替换,其所诱导产生的CD4+和CD8+T淋巴细胞数虽然略高于空白组,但均明显低于实施例1制得的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂(如图8所示)。以上结果表明,实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂由于多金属氧酸盐的作用,促进T淋巴细胞的增殖和分化,从而有效提高Balb/c鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞数量。
对比例5(与实施例1相比,磷钨酸钠用量过多)
称取平均分子量为60 kDa的聚4-乙烯基吡啶0.01 g,充分溶解于1.0 mL无水乙醇中,制成浓度为0.01g/mL的聚合物乙醇溶液。称取磷钨酸钠10 mg,充分溶解于1 mL去离子水中制成浓度为10mg/mL的磷钨酸钠水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗分散于无菌水中制成浓度为1 mg/mL的抗原水溶液。在4℃持续搅拌状态下使用注射泵以3 mL/min的流速向1.0mL的聚合物乙醇溶液中滴加4 mL抗原水溶液。在抗原水溶液滴加体积达到50%(即滴加了2mL)时,向混合溶液中以0.8 mL/min的流速滴加磷钨酸钠水溶液0.8mL,同时继续以3mL/min的流速滴加剩余的50%抗原水溶液,然后在4℃下恒温振荡孵育6小时。使用0.45μm滤膜过滤产物混合液,收集滤液,再经高效液相层析纯化滤液,收集纳米复合物。-20 ℃低温冷冻干燥14小时,完全除去溶剂,得到所述负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂,标记为疫苗纳米复合佐剂D,其中磷钨酸钠的质量含量经计算为36.4%。
对比例6(与实施例1相比,磷钨酸钠用量过少)
称取平均分子量为60 kDa的聚4-乙烯基吡啶0.01 g,充分溶解于1.0 mL无水乙醇中,制成浓度为0.01g/mL的聚合物乙醇溶液。称取磷钨酸钠5 mg,充分溶解于0.5 mL去离子水中制成浓度为10mg/mL的磷钨酸钠水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗分散于无菌水中制成浓度为1 mg/mL的抗原水溶液。在4℃持续搅拌状态下使用注射泵以3 mL/min的流速向1.0mL的聚合物乙醇溶液中滴加4 mL抗原水溶液。在抗原水溶液滴加体积达到50%(即滴加了2mL)时,向混合溶液中以0.2mL/min的流速滴加磷钨酸钠水溶液0.2 mL,同时继续以3mL/min的流速滴加剩余的50%抗原水溶液,然后在4℃下恒温振荡孵育6小时。使用0.45μm滤膜过滤产物混合液,收集滤液,再经高效液相层析纯化滤液,收集纳米复合物。-20 ℃低温冷冻干燥14小时,完全除去溶剂,得到所述负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂,标记为疫苗纳米复合佐剂E,其中磷钨酸钠的质量含量经计算为12.5%。
对比例7
将6~8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为三组,每组10只,分别对每只Balb/c鼠进行免疫处理,具体如下:对比例5~6制备得到的疫苗纳米复合佐剂D、疫苗纳米复合佐剂E为实验组,分别将对应纳米复合佐剂分散于水中制成浓度为10mg/mL的水溶液,每只Balb/c鼠经口服给药分别接种上述水溶液10μL;实施例1制备得到的负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的聚4-乙烯基吡啶-磷钨酸钠纳米复合佐剂为对照组,每只Balb/c鼠经口服给药接种上述水溶液10μL;生理盐水组为空白组,每只仔猪经口服给药生理盐水10μL。接种后及接种14天后,将上述Balb/c鼠每组选取3只处死,剪取小肠和气管部分除去内容物,用灌洗液(PBS缓冲液,含0.05 mg/mL EDTA,0.35 mg/mL PMSF,0.05% 吐温20)冲洗肠道和气管粘膜,具体是将小肠和气管浸入灌洗液中并于4 ℃下孵育2 h,然后在4 ℃下,18000 rpm离心30 min,收集上清液,加入牛血清白蛋白BSA至终浓度为0.1%,使用间接ELISA方法检测肠道SIgA、气管SIgA及血清IgG效价。
在接种实施例1制得的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂后,Balb/c鼠黏膜抗体增强免疫结果如图5所示,在接种14天后,免疫了实施例1制得的猪口服接种疫苗纳米复合佐剂后Balb/c鼠的肠道和气管中分泌型sIgA水平明显高于生理盐水组(如图5(a)和5(b)图所示),血清抗体IgG明显高于生理盐水组(如图5(c)所示)。在接种对比例5~6制得的疫苗纳米复合佐剂D或疫苗纳米复合佐剂E后,Balb/c鼠黏膜抗体增强免疫结果如图9所示,在接种14天后,免疫了对比例5制得的疫苗纳米复合佐剂D后Balb/c鼠的肠道和气管中分泌型sIgA水平明显低于对照组(如图9(a)和9(b)图所示),免疫了对比例6制得的疫苗纳米复合佐剂E后Balb/c鼠的肠道中分泌型sIgA水平高于生理盐水组,但略低于对照组(如图9(a)所示),然而免疫了对比例6制得的疫苗纳米复合佐剂E后Balb/c鼠的气管中分泌型sIgA水平虽然高于生理盐水组,但明显低于对照组(如图9(b)所示)。类似的,在对血清样品分析的结果表明,实验组免疫了对比例5制得的疫苗纳米复合佐剂D后Balb/c鼠的血清抗体IgG明显低于对照组,实验组免疫了对比例6制得的疫苗纳米复合佐剂E后Balb/c鼠的血清抗体IgG高于生理盐水组,但略低于对照组(如图9(c)所示)。这些结果说明多金属氧酸盐的用量比超过35%会明显降低抗原的免疫效果,多金属氧酸盐的用量比低于15%也无法达到实施例1所示的免疫效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于猪口服接种疫苗,其特征在于,按质量百分数计,由50~70%聚合物、20~30%多金属氧酸盐和10~25%抗原组成;各组成质量百分数之和为100%;
所述聚合物为聚2-乙烯基吡啶或聚4-乙烯基吡啶;
所述抗原为副猪嗜血杆菌病灭活疫苗;
所述多金属氧酸盐为磷钨酸钠和/或磷钼酸钠;
所述聚2-乙烯基吡啶的分子量为20~80 kDa,所述聚4-乙烯基吡啶的分子量为27~80kDa。
2.根据权利要求1所述一种用于猪口服接种疫苗,其特征在于,所述聚2-乙烯基吡啶的分子量为50~60 kDa,所述聚4-乙烯基吡啶的分子量为50~65 kDa。
3.权利要求1~2任一项所述一种用于猪口服接种疫苗的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将聚合物乙醇溶液、多金属氧酸盐水溶液和抗原水溶液混合均匀,在4~40℃下孵育0.5~12h,去除溶剂,得到用于猪口服接种疫苗;
所述聚合物乙醇溶液的浓度为0.005~0.05g/mL,所述多金属氧酸盐水溶液的浓度为3~100mg/mL,所述抗原水溶液的浓度为0.5~10mg/mL;
所述混合均匀的方式为:将抗原水溶液平均分成两份,在搅拌条件下,先将第一份抗原水溶液以恒定流速加入到聚合物乙醇溶液中,得到混合液,再将多金属氧酸盐水溶液和第二份抗原水溶液同时以恒定流速加入到混合液,所述恒定流速均为0.2~6mL/min;
所述混合均匀和孵育通过微流控技术同时进行,通过微流控技术控制流速,在混合过程中孵育,在微流控芯片上利用微液滴形成技术,连续生产尺寸均一、单分散性好的纳米复合物;所述流速为10~60μL/h。
4.根据权利要求3所述一种用于猪口服接种疫苗的制备方法,其特征在于,所述混合均匀和孵育同时进行的方式为:采用三进样口蛇形通道的微流控芯片作为聚合物、多金属氧酸盐及抗原自组装形成纳米复合物的场所,利用微流控技术控制聚合物乙醇溶液和抗原水溶液及多金属氧酸盐水溶液的流速,连续生产尺寸均一、单分散的纳米复合物。
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