CN112336855A - 一种阳离子脂质体禽流感疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开一种阳离子脂质体禽流感疫苗的制备方法。该方法基于荷载十八胺阳离子脂质体制备出的疫苗，可明显提高抗原提呈细胞对抗原的提呈能力,能引发CD4+与CD8+T细胞反应，诱导产生强炎症反应，提高记忆T细胞的感应并增加其维持能力，疫苗的粒径约450nm，疫苗的包封率均在50％以上，在某些抗原浓度抗原下，包封率均超过70％,随着抗原浓度的提高,包封率逐步提高。

Description

一种阳离子脂质体禽流感疫苗及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体的涉及一种荷载十八胺的阳离子脂质体禽流感疫苗及其制备方法。
背景技术
佐剂是指能增强机体抗原免疫应答或改变免疫应答类型的物质，其主要作用是为了增强机体免疫系统的反应强度和持久性。现有疫苗佐剂多为油佐剂或铝胶佐剂，存在局部刺激大、不良反应多、疫苗稳定性差、效力不高等问题。国内白油佐剂工艺不高，质量不稳定，目前我国疫苗企业使用的佐剂主要依赖进口，造成疫苗制剂的生产成本大幅度提高和产品价格上涨。因此，研制新型疫苗佐剂是提高疫苗安全、效力的重要途径，也是打破国外行业垄断的必由之路。此外，现有疫苗佐剂产生免疫保护率低、免疫期短，同时油乳剂不易被机体吸收并有刺激性，容易导致注射部位红肿或溃烂等副作用，影响动物产品的品质。随着人们对食品安全的高度关注，开发高效、安全、绿色的新型纳米佐剂具有广阔的应用前景。
禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种以禽类为主要感染群体的呼吸道疾病,该病危害养禽及相关产业持续发展的同时,也威胁着人类的健康。H9N2亚型禽流感病毒从20世纪90年代开始在世界范围内流行,一般情况下不能引起禽严重的临床症状,但易引起其他病原继发感染,增加禽死亡率。近年来,对我国部分活禽市场及发生呼吸道感染的蛋鸡、肉鸡开展H9N2亚型禽流感病原检测,发现H9N2亚型的阳性率高达60％以上,说明H9N2亚型禽流感在我国广泛存在。目前，H9N2亚型禽流感灭活疫苗主要是由灭活的H9N2亚型禽流感病毒液后的半成品与油佐剂以适当比例混合配置而成，但油佐剂不良反应严重，皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿，并且油类物质长期潴留于组织中不易代谢，造成禽类肉制品的食品安全问题。因此，开发高效低毒的新型禽流感纳米疫苗佐剂就显得十分迫切和必要。
发明内容
为克服上述缺陷，本申请的目的在于：提出一种基于荷载十八胺的阳离子脂质体佐剂的禽流感疫苗及其制备方法。该佐剂通过荷载十八胺制备的阳离子纳米脂质体，该脂质体兼具佐剂和递送系统的功能，作为递送系统可荷载禽流感疫苗抗原，可明显提高抗原提呈细胞对抗原的提呈能力。
为了达到以上目的，本申请如下技术方案：
一种阳离子脂质体禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，
所述制备方法包含如下步骤：
S1、将大豆磷脂、胆固醇、PEG500-DSPE及十八胺按照一定的比例溶解于有机溶剂中,以制备荷载十八胺的阳离子脂质体，
S2、将H9N2型流感病毒裂解疫苗原液加入到制备的荷载十八胺的阳离子脂质体中并进行充分混合，以制成脂质体禽流感疫苗。
在一较佳的实施方式中，该步骤S1中，还包括在真空度介于0.05～0.15MPa及转速150r/min条件下，真空旋转蒸发混合液第一预预设时间。
在一较佳的实施方式中，该步骤S1中大豆磷脂、胆固醇、PEG500-DSPE及十八胺的微摩尔比例为54：23：4：2.5。
在一较佳的实施方式中，该步骤S2中包括：在30-40℃的环境温度下充分搅拌混合,使得充分搅拌后无有机溶剂残留。
在一较佳的实施方式中，该步骤S2之后还包括，充分混合后制备的脂质体禽流感疫苗通过碳酸纤维膜筛选粒径。
在一较佳的实施方式中，依次通过孔径1000nm、800nm及500nm的滤膜筛选。依次通过孔径1000nm、800nm及500nm的滤膜的好处在于可将粒径过大的脂质体依次挤压成粒径在500nm左右或以下粒径的脂质体，达到控制脂质体粒径和使粒径更加均匀的目的。
本申请实施例提供一种利用上述制备方法制备的阳离子脂质体禽流感疫苗备，其特征在于，所述脂质体的包封率50％以上。
本申请实施例提供一种利用上述制备方法制备阳离子脂质体禽流感疫苗备，其特征在于，所述脂质体的粒径介于400-500nm。较佳的，该脂质体的粒径介于422-463nm。
有益效果
本申请提出的荷载十八胺的阳离子脂质体禽流感疫苗佐剂制备方法，该方法通过荷载十八胺制备的阳离子纳米脂质体，该脂质体兼具佐剂和递送系统的功能，作为递送系统可荷载禽流感疫苗抗原，作为新型纳米佐剂，可明显提高抗原提呈细胞对抗原的提呈能力,能引发CD4+与CD8+T细胞反应，诱导产生强炎症反应，提高记忆T细胞的感应并增加其维持能力，作为一种疫苗佐剂既可以增强免疫应答的强度,又降低了免疫的不良反应。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1为本申请实施例的制备的疫苗在不同实验组脾脏淋巴细胞IL-2分泌水平比较；
图2为本申请实施例的制备的疫苗在不同实验组脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平比较；
图3为本申请实施例的制备的疫苗不同实验组脾脏淋巴细胞IL-4分泌水平比较示意图；
图4为本申请实施例的制备的疫苗免疫后各组SPF鸡体内特异性抗体增长曲线示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本申请而不限于限制本申请的范围。实施例中采用的实施条件可以如具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
纳米科技是近年来发展极其迅速的前沿技术学科，特别是利用纳米材料与技术改善农业投入品的功能与效率，已经成为纳米科技与农业科学交叉领域的研究热点。大量研究表明，在纳米尺度智能化递释系统(Smart Delivery System)，通过纳米材料的其小尺寸、大比表面与界面效应等特殊属性，可显著增强免疫功能物质的生物活性，实现靶向传递和智能化释放，提高有效利用率，降低农产品残留。根据纳米颗粒的组成、大小、形状及表面特性等，利用纳米技术制备成不同的纳米颗粒已在医学领域广泛应用。纳米颗粒不仅具有免疫佐剂活性，有助于抗原在细胞内加工，与主要组织相容性复合体分子特异性结合、运输并递呈给效应细胞，增强机体产生天然免疫应答，而且还能够通过多种途径到达抗原提呈细胞，调节免疫应答。在预防性和治疗性疫苗中，纳米颗粒被用作运输系统增加抗原提呈或作为免疫佐剂激活和增强机体产生免疫应答。
脂质体是由磷脂双层膜围绕亲水空腔组成的可生物降解的纳米粒，可分为阳离子、中性离子和阴离子脂质体。脂质体不仅具有抗原提呈、保护抗原防止其在体内降解的作用，而且能诱导树突状细胞(DC)成熟，增强免疫反应。脂质体的佐剂功能与它们的物理性质密切相关，表面电荷对脂质体的佐剂效应有着重要的影响。脂质体表面正电荷是延长疫苗在注射部位停留、增加抗原提呈、延长刺激体内细胞免疫时间的重要因。脂质体就是一种对疫苗有很强增效作用的纳米佐剂，脂质体是目前应用最广泛的纳米疫苗佐剂，也是最有希望成为理想疫苗佐剂的物质之一，由磷脂双分子层构成，结构类似于细胞膜，研究发现脂质体的佐剂功能与它的表面电荷密切相关。一般来说，抗原提呈细胞对正电荷脂质体的吞噬作用要强于负电荷和中性脂质体，阳离子脂质体不仅具有疫苗佐剂功能因表面正电荷能促进细胞摄取、增加抗原提呈、延长刺激细胞免疫，同时因其具有靶向性、缓释性、低毒性及提高稳定性等特点，也是一种非常理想的疫苗纳米递送载体，因此阳离子脂质体成为一种疫苗的理想佐剂兼递送载体功能。
本申请揭示一种以荷载十八胺阳离子纳米脂质体作为佐剂，同时作为递送系统包裹禽流感H9N2疫苗抗原，制备阳离子脂质体疫苗，该疫苗的免疫活性明显提高，同时可降低免疫后的不良反应。本申请制备方法制备的阳离子H9N2脂质体疫苗呈乳白色透明溶液,粒径分布均匀,脂质体带正电荷。包裹不同质量浓度的H9N2型流感，抗原包封率均在50％以上,随着抗原浓度的提高,包封率逐步提高。这是荷载十八胺的脂质体形成带正电荷的双层脂质球状结构,带负电荷的抗原分子包裹在其亲水内核中或吸附镶嵌在其表面。
本申请的疫苗制备方法，即基于纳米阳离子脂质体制备流感裂解疫苗，H9N2型禽流感裂解疫苗原液参照中国兽药药典2015版中疫苗生产工艺的方法制备而成。疫苗制备方法包含如下步骤：
S1、制备荷载十八胺的阳离子脂质体，
S2、将H9N2型流感病毒裂解疫苗原液加入到制备的荷载十八胺的阳离子脂质体中并进行充分混合。
充分混合后的溶液通过碳酸纤维膜挤压制备，本实施步骤中，充分混合后的溶液分别通过孔径1000nm、800nm及500nm的滤膜筛选。利用马尔文粒度分析仪检测脂质体的粒径和Zeta电位。制备后对疫苗包封率的检测即纳米阳离子脂质体流感裂解疫苗包封率的检测：基于离心装置以60000×g的离心力超速离心,将脂质体完全沉淀,用BCA法检测上清中游离抗原的蛋白含量,从而计算脂质体包封率的检测方法。包封率的计算公式为:包封率＝[1-(上清中抗原含量×溶液体积)/(抗原给药含量×给药体积)]×100％。
纳米阳离子脂质体流感裂解疫苗的包封率、粒径和Zeta电位(n＝S3
Figure BDA0002604638700000061
表1
从表1中看出抗原包封率均在50％以上(在某些抗原浓度抗原下，包封率均超过70％),随着抗原浓度的提高,包封率逐步提高。本实施方式中基于荷载十八胺制备的阳离子纳米脂质体兼具佐剂和递送系统的功能，作为递送系统可荷载禽流感疫苗抗原，可明显提高抗原提呈细胞对抗原的提呈能力,能诱导产生强炎症反应，提高记忆T细胞的感应并增加其维持能力。
在一实施方式中，步骤S1中、将大豆磷脂、胆固醇、PEG500-DSPE及十八胺按照一定的比例溶解于一定量的(如25ml)的氯仿溶剂中,本实施步骤中，大豆磷脂、胆固醇、PEG-DSPE聚合物及十八胺分别按照微摩尔比54：23：4：2.5。并真空旋转蒸发预设的第一时间(如1h后，也可为其他的时间，经过该第一时间蒸发后以实现完全蒸),在其他的实施方式，可将大豆磷脂、胆固醇、PEG500-DSPE及十八胺按照微摩尔比54：23：4：2.5溶剂于乙醇或丙酮等有机溶剂中。本实施方式中，在真空度介于0.05～0.15MPa(如，0.1MPa)及转速150r/min条件下，真空旋转蒸发。
在一实施方式中，步骤S2中、加入一定含量的H9N2型流感病毒裂解疫苗原液,进行充分混合。该充分混合包含，在30-35℃的环境温度下充分混合1h。也可为其他的时间，经过充分混合后以实现完全蒸发液体)。
通过上述制备方法制备的阳离子脂质体禽流感疫苗，脂质体的粒径小于等于500nm大于等于400nm。较佳的，粒径介于422-463nm，具体的脂质体的粒径介于422.35-463.58nm的阳离子脂质体疫苗。较佳的，粒径约为450nm。疫苗的免疫活性明显提高，同时可降低免疫后的不良反应。
下面通过试验检验上述制备方法制备的疫苗，阳离子H9N2脂质体疫苗组、ISA71H9N2疫苗组、H9N2灭活疫苗组及阴性对照组(阴性对照组以PBS为水相制备的疫苗免疫)。试验条件:将80只SPF鸡(无菌鸡)随机分成4组，每组20只，分别用阳离子H9N2脂质体疫苗组、ISA71H9N2疫苗组、H9N2灭活疫苗组及阴性对照组(阴性对照组以PBS为水相制备的疫苗免疫)。疫苗组鸡血凝素(HA)免疫剂量为10μg/只，各组均采用颈部皮下注射方式免疫。检测疫苗组鸡体内的细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ水平，免疫后第56天，无菌剖取SPF鸡脾脏,剪碎后研磨,并用100目的尼龙网过滤,将细胞悬液置于5ml淋巴细胞分离液上层,1500r/min离心20min,取中间层单个核细胞,PBS离心清洗2次,细胞计数,用10％小牛血RPMI-1640培养基将细胞悬液稀释到活细胞数为2×106个/ml后,加入96孔细胞培养板,100μL/孔,补加RPMI-1640培养基100μL,同时加入H9N2流感裂解疫苗原液，37℃,5％CO2培养72h,收集上清,用细胞因子ELISA检测试剂盒对培养上清中IL-2、IL-4、IFN-γ水平进行检测,检测方法按试剂盒说明书要求进行。非特异性免疫水平测定：试验鸡免疫后第0、14、28天各组随机抽取1ml鸡血液，分离血清，按溶菌酶测试盒说明书测定各组试验鸡溶菌酶含量。
图1：不同实验组脾脏淋巴细胞IL-2分泌水平比较，图2：不同实验组脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平比较，图3：不同实验组脾脏淋巴细胞IL-4分泌水平比较。图1-图3中。1：阳离子H9N2脂质体疫苗组，2：ISA71 H9N2疫苗组，3：H9N2灭活疫苗组，4：阴性对照组。从试验的结果图中看出阳离子脂质体佐剂与其它佐剂相比，分泌高水平细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-4。表明阳离子脂质体佐剂可通过刺激抗原提呈细胞促进释放不同类型的细胞因子，诱导Th细胞分化为Th1或Th2型细胞,Th1细胞通过释放Th1型细胞因子IFN-γ等诱导细胞免疫应答。Th2型细胞通过释放Th2型细胞因子IL-4等诱导体液免疫应答。阳离子脂质体佐剂诱导分泌高水平的IL-2,表明脾脏淋巴细胞经抗原刺激后均已活化,并分泌细胞因子。
图4为特异性抗体检测(免疫后各组SPF鸡体内特异性抗体增长曲线)，抗体的检测:免疫后0、3、7天以及每隔大约1-2周，采集各疫苗组及对照组鸡的血液0.3-0.4ml，分离血清，通过血凝抑制试验检测特异性抗体效价。从图中看出使用阳离子脂质体佐剂后，长达3个月时间的检测结果表明，与其它各实验组相比，给予H9N2免疫后在SPF鸡体内可产生更高水平的抗体，保护时间更长。表明阳离子脂质体佐剂对于诱导体液免疫和细胞免疫，均具有明显的增强作用。疫苗的免疫活性明显提高，同时可降低免疫后的不良反应。
实验各组溶菌酶的含量(μg/ml)
Figure BDA0002604638700000091
表2
从表2中看出疫苗免疫前各组鸡的溶菌酶含量无显著差异，在免疫试验阶段，溶菌酶的含量随着鸡日龄的增大而增高，其非特异性免疫能力越强。免疫后第14天和28天，阳离子H9N2脂质体疫苗组溶菌酶含量均高于其他各组，并存在显著差异。结果表明：与其他疫苗佐剂相比，阳离子脂质体佐剂可引起试验鸡更强的非特异性免疫。
本公开制备了一种以荷载十八胺阳离子纳米脂质体作为佐剂，该佐剂同时作为递送系统包裹禽流感H9N2疫苗抗原，制备粒径介于422-463nm的阳离子脂质体疫苗，疫苗的免疫活性明显提高，同时可降低免疫后的不良反应。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的实施描述，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。本公开无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种阳离子脂质体禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，
所述制备方法包含如下步骤：
S1、将大豆磷脂、胆固醇、PEG500-DSPE及十八胺按照一定的比例溶解于有机溶剂中,以制备荷载十八胺的阳离子脂质体，
S2、将H9N2型流感病毒裂解疫苗原液加入到制备的荷载十八胺的阳离子脂质体中并进行充分混合，以制成脂质体禽流感疫苗。
2.如权利要求1所述的阳离子脂质体禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，还包括在真空度介于0.05～0.15MPa及转速150r/min条件下，真空旋转蒸发混合液第一预预设时间。
3.如权利要求1所述的阳离子脂质体禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1中大豆磷脂、胆固醇、PEG500-DSPE及十八胺的微摩尔比例为54：23：4：2.5。
4.如权利要求1所述的阳离子脂质体禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2中包括：在30-40℃的环境温度下充分搅拌混合,使得充分搅拌后无有机溶剂残留。
5.如权利要求1所述的阳离子脂质体禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2之后还包括，充分混合后的脂质体禽流感疫苗通过滤膜筛选。
6.如权利要求5所述的阳离子脂质体禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，依次通过孔径1000nm、800nm及500nm的碳酸纤维膜筛选。
7.一种利用如权利要求1-6中任一项所述制备方法制备的阳离子脂质体禽流感疫苗，其特征在于，
所述脂质体的包封率50％以上。
8.如权利要求7所述的阳离子脂质体禽流感疫苗，其特征在于，所述脂质体的粒径介于400-500nm。
9.如权利要求8所述的阳离子脂质体禽流感疫苗，其特征在于，所述脂质体的粒径介于422-463nm。
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