CN101502649B - 一种脂质体流感疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物预防医药领域，具体涉及一种包裹生物药物的用于流感防治的脂质体疫苗。本发明是一种脂质体流感疫苗，所述脂质体的膜带有电荷，所述流感疫苗的抗原组分包裹于脂质体内或镶嵌于脂质体膜中或由于电荷而吸附于膜上。本发明脂质体流感疫苗的制备方法，包括冻干水化法和逆相蒸发法。本发明的有益效果是：使用了带有电荷的脂质体膜，使脂质体包封抗原的包封率增大，脂质体的稳定性更好；本发明的脂质体疫苗同时可包裹流感疫苗的三种抗原，即H1N1、H3N2、B，使得该疫苗的保护范围更广；不仅能同时增强机体对三种抗原的免疫应答，而且能快速的提升机体内抗体水平，并能持久的对机体产生保护作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物预防医药领域，具体涉及一种包裹生物药物的用于流感防治的脂质体疫苗。
背景技术
普通的流感疫苗只能激发机体的体液免疫，而无法激发机体的细胞免疫。目前用于临床的流感疫苗中有效抗原的含量较高，限制了流感疫苗的生产能力。有专家预测，新一轮流感大流行即将到来，对流感疫苗的潜在需求量远远超过目前人类的生产能力，因此如何使流感疫苗可在减少抗原使用量的情况下，提高流感疫苗的免疫水平，特别是加强流感疫苗刺激机体产生的细胞免疫能力，更加提高了集体对流感病毒的抵抗力。因此，加快流感疫苗佐剂的研究具有十分重要的意义。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明提出一种新型的免疫性脂质体，它包含流感疫苗所含病毒的主要抗原组分(蛋白或糖蛋白)，也可以包括或不包括免疫调节组分，它既能在减少免疫剂量的条件下达到明显的免疫效果，又能延长疫苗的免疫保护时间。
本发明提供一种脂质体流感疫苗，所述脂质体的膜带有电荷，所述流感疫苗的抗原组分包裹于脂质体内或镶嵌于脂质体膜中或由于电荷而吸附与膜上。
本发明中的流感疫苗包括全病毒灭活流感疫苗，流感裂解型疫苗和流感亚单位疫苗，流感疫苗抗原组分包括流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。所述血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)包括H1N1、H3N2和/或B。
其中，脂质体流感疫苗单位剂量中含流感疫苗HA/NA组分的量是5ug-100ug；优选量是10ug-50ug。
本发明流感疫苗还包含免疫调节剂或附加剂。免疫调节剂为细胞因子类蛋白，包括干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)，白介素(IL-1、IL-2、IL-4、IL14、IL16)、胸腺肽α1、免疫核糖核酸。附加剂为抗氧化剂，如维生素E等，并可加入正或负电荷磷脂，防止脂质体凝聚、融合，改变剂型，制备冻干剂，避免渗漏，延长脂质体保存时间。
本发明脂质体为小单层和大多层脂质体共存的脂质体。其中，脂质体球径为50～5000nm，本发明较优选的脂质体粒径范围是为100～1500nm，平均粒径在300～800nm之间。
脂质体为一种生物膜双分子层囊性微球，由水相中脂质双层疏水区的脂肪链通过疏水键相互聚集自行收缩排列而形成，在其形成过程中可包裹水溶性成分获得颗粒形态，被包裹的内容物可以受到脂质体膜的保护。水溶性抗原包被于脂质体中可借助脂质体的传递被直接送达抗原提呈细胞的胞质中，脂质体膜基质及附加的修饰成分还可以直接活化免疫细胞的信号传递系统。在脂质体膜的保护下，抗原分子可以不受体液成分的破坏，脂质体类疫苗可用于多种黏膜途径的免疫接种。通过选择脂质体膜基质组分及对脂质体膜加以修饰，还可以选择所诱导的免疫反应的类型。淋巴结树突状细胞和组织巨噬细胞都能够吞噬脂质体，在这些细胞内抗原经过加I表达于I型主要组织相容性分子(MHC功，激发免疫反应，诱导特异性T细胞和细胞毒性T细胞免疫。脂质体是用作疫苗的传递载体和免疫佐剂的很好选择。
本发明所涉及的脂质体是由磷脂、非磷脂、固醇类及它们的衍生物和膜材组成。
用于制备脂质体的有卵磷脂、豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰-DL-a磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六烷基醚和四氧乙烯十二烷基醚等。
本发明所涉及的脂质体膜材包括但不限于胆固醇、十八胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸等。胆固醇可以调节双分子层流动性、通透性等，十八胺、磷脂酸等可以改变脂质体表面电荷性质。
脂质体制备的基本原理都是将油性材料与水性材料经过适当处理后形成油包水的制剂，常规的脂质体制备方法，包括薄膜法、逆相蒸发法、加压挤出法、熔融法及冻干水化法。
本发明脂质体流感疫苗的优选的制备工艺是逆相蒸发法、冻干水化法。本发明最优选的脂质体的制备工艺是冻干水化法。
本发明脂质体流感疫苗的制备方法，冻干水化法，包括如下步骤：
1、将脂质体、膜材及附加剂或免疫调节剂以摩尔比(5~10)∶(1~5)∶(1~3)溶于溶媒中，置于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；
2、加入缓冲液，40~60℃，超声10~20分钟，形成脂质体悬液；
3、将脂质体悬液与流感疫苗抗原溶液混合，脂质体粉碎均匀，加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；
4、灭菌，得到冻干粉剂；加无菌水、震荡、再水化融合；得到脂质体流感疫苗。
本发明脂质体流感疫苗的制备方法，逆相蒸发法，包括如下步骤：
1、将脂质体、膜材和附加剂或免疫调节剂以摩尔比(5-10)∶(1~5)∶(1~2)溶于溶媒中，加入流感疫苗抗原溶液，35~60℃，超声处理10~20分钟，得到稳定的油包水乳液；
2、在40~60℃下减压蒸发，得到胶态物质；
3、加入缓冲液，40~60℃旋转蒸发，减压蒸发10~20分钟，除去微量有机溶媒，得到脂质体水性混悬液，放置20~40分钟，透析，除去游离的未包入脂质体的流感抗原；
4、灭菌；得到脂质体流感疫苗。
在脂质体流感疫苗的制备方法中，步骤1)中的溶媒为；步骤2)中的缓冲液为pH值为5.4-7.8范围内的磷酸缓冲液，Tri-HCl缓冲液，碳酸钠缓冲液或NaCl溶液。
本发明脂质体流感疫苗可以在注射部位形成抗原储库，使抗原缓慢释放，引起注射部位的炎性反应，增加细胞的穿透能力，提高了注射部位的抗原递呈细胞浓度，使抗原易被抗原递呈细胞吞噬，诱导产生细胞因子如IL-2，IL-4，IL-12，IL-6，TNF-a，IFN-a，IL-10和IFN等，更重要的是脂质体作为佐剂，能同时激活机体产生细胞免疫(B、T细胞免疫，主要为T细胞免疫)和体液免疫，通过诱导抗原递呈细胞产生协同刺激因子，增加主要组织相容性抗原的表达，使抗原递呈细胞成熟，增强抗原的递呈作用。
本发明的有益效果是：由于本发明的脂质体膜是使用了带有电荷的脂质体膜，使脂质体包封抗原的包封率增大，脂质体的稳定性更好，在4°放置下，其粒径稳定期限可以长达8个月，而普通的脂质体不超过1个月；本发明的脂质体可以诱导免疫系统，主要刺激T淋巴细胞产生特异性的血清IgG抗体和粘膜IgA抗体，特别适用于作疫苗佐剂或者免疫复合物；本发明的脂质体体系是小单层脂质体与多层脂质体共存的一种脂质体溶液体系，脂质体的平均粒径分布在50nm~1000nm，为粒径呈正态分布的球形或椭球形脂质体；本发明的脂质体疫苗同时可包裹流感疫苗的三种抗原，即H1N1、H3N2、B，使得该疫苗的保护范围更广；不仅能同时增强机体对三种抗原的免疫应答，而且能快速的提升机体内抗体水平，并能持久的对机体产生保护作用。
附图说明
图1是样品组3与对照组免疫效果比较图；
图2是样品组4与对照组免疫效果比较图；
图3是样品组5与对照组免疫效果比较图；
图4是样品组6与对照组免疫效果比较图；
图5是样品组7与对照组免疫效果比较图；
图6是样品组8与对照组免疫效果比较图；
图7是6组样品与对照组免疫效果-时间图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案和有益效果，下面结合具体的实验及实验结果对本发明做进一步阐述。
通过实验观察几种制备工艺对抗原物质活性的影响，尤其是监测其免疫诱导活性。实验结果证明应选择制备过程相对柔和、无剧烈的理化条件改变的方法。
以小鼠注射疫苗后血清中抗体的浓度判断免疫反应强度的指标，抗体浓度用血凝抑制法进行检测(以滴度大于1∶40者判为阳性)，阳性对照抗体为不含脂质体的疫苗免疫一周后再用相同剂量进行加强免疫。阴性对照抗血清为免疫前从SPF Balb/c小鼠直接抽取血清。样品组小鼠只进行一次性免疫。实验结果见表1。
表1制备工艺对脂质体流感疫苗免疫小鼠后抗体产生的影响
| 制备方法 | 试验组例数(♀♂各半) | 血清抗体倍数 |
| 薄膜法 | 30 | 640±20 |
| 逆相蒸发法 | 30 | 1280±40 |
| 高压匀浆法 | 30 | 640±40 |
| 冻干水化法 | 30 | 1280±20 |
| 阳性对照 | 30 | 320±10 |
| 阴性对照 | 30 | ＜10 |
我们在实验中采用几种不同的流感疫苗，給小鼠注射不同的疫苗后，用目前药典规定的血凝抑制方法检测免疫后小鼠(SPF Balb/c小鼠)血清中抗体的滴度，作为判断免疫反应强度的指标(以大过1∶40作为阳性)，用不含脂质体的疫苗，免疫小鼠一周后再用相同剂量进行加强免疫，一周后采血作为阳性对照组血清。免疫前从小鼠直接采血清作为阴性对照组血清。而对于各样品组，只给小鼠分别进行一次性免疫，在 免疫后各隔两周采血，一直到第10周。各样品组所含的抗原量都一样，最后用血凝抑制实验测定抗体滴度，并进行结果统计，
实施例1按照文献的方法制备脂质体流感疫苗
按照文献Ilan Babai等(1999)的方法，并用其最优的实施例方法制备脂质体，取卵磷脂4g，旋转蒸发后，加入40ml的双蒸水中，在40-45°溶解后，用匀浆机均质到50nm的粒径，然后加入的H1N1抗原含血凝素为7.5IU/ml，混合。作为样品1。
实施例2本发明方法制备脂质体流感疫苗
取卵磷脂、胆固醇、硬脂胺按照摩尔比(7∶1∶1)，溶于二氯甲烷溶液；旋转蒸发，除去有机溶媒，形成磷脂膜层；加入适量磷酸缓冲液(pH7.4)水化脂质体膜，将脂质体混悬液与流感抗原溶液混合，均质形成脂质体混悬液，过0.45um的滤膜；即为脂质体流感疫苗，标志为样品组2，其中加入的H1N1抗原含血凝素为7.5IU/ml。
对照组样品为流感亚单位疫苗，含7.5IU/ml的血凝素，不加任何辅助成分。
将上述三个样品，分别免疫16-18g的SPF Balb/c小鼠，雌雄各半，每隔2周采血。每个样品每次采取10个小鼠血清，然后进行HI测定抗体的滴度。结果见表2。
表2、文献方法制备的和本发明的脂质体作为佐剂的免疫后抗体滴度比较(n＝10)
| 组别 | 第14天 | 第28天 | 第42天 | 第56天 | 第70天 |
| 对照组 | 50±23 | 210±34 | 320±45 | 160±27 | 100±24 |
| 样品1 | 180±20* | 430±35* | 540±43* | 450±20* | 370±12* |
| 样品2 | 350±14** | 840±46** | 800±24** | 740±18** | 500±20** |
*与对照组比较t＝5.569 P＜0.0001
**与对照组比较t＝4.714 P＜0.0001**与样品1比较t＝5.482 P＜0.0001
将上述两种脂质体样品分别测定包封率测定分别为17.3％、32.4％，同时，进行电镜检测和观测脂质体的粒径稳定性，样品1的平均粒径为47.83nm，跨距为1.87，样品2的平均粒径为482.24nm，跨距为2.91。
实施例3制备小单层免疫性脂质体流感疫苗
取卵磷脂及胆固醇、硬脂酸按照摩尔比(7∶1∶1)，溶于二氯甲烷溶液；旋转蒸发，除去有机溶媒，形成磷脂膜层；加入适量磷酸缓冲液(pH7.0)，将脂质体混悬液与流感抗原溶液混合，形成小单层脂质体混悬液；即为脂质体流感疫苗。标志为样品组3， 加入的H1N1抗原含血凝素为7.5IU/ml，同时加入20万IU/ml的IFN-alpha；对照组样品为流感亚单位疫苗，不加任何辅助成分。
实施例4制备大多层免疫性脂质体流感疫苗
取磷脂酰丝氨酸及胆固醇、硬脂酸胺摩尔比(7∶5∶3)，溶于氯仿溶液；旋转蒸发，除去有机溶媒，形成磷脂膜层；加入适量磷酸缓冲液(0.1M，PH7.4)，将脂质体混悬液与流感抗原溶液混合，形成大多层脂质体混悬液，即为免疫胜脂质体流感疫苗。流感抗原含H1N1、B两种组分，加入5万IU/ml的IL-14，标志为样品组4；对照组样品为流感亚单位疫苗，两种型别的抗原分别含血凝素为10IU/ml，不加任何辅助成分。
实施例5冻干水化法制备制备大多层免疫性脂质体流感疫苗
取二肉豆蔻卵磷脂及胆固醇、硬脂酰胺按照摩尔比(7∶1∶1)，溶于氯仿溶液；旋转蒸发，除去有机溶媒，形成磷脂膜层；加入适量Tris-HCl缓冲液(0.1M，PH5.4)，将脂质体混悬液与流感抗原溶液混合，形成大多层脂质体混悬液；再加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；再加入无菌水，用震荡器震荡5分钟，重新水化形成大单层或多层脂质体混悬液，即为免疫性脂质体流感疫苗。样品的免疫组分为H1N1，H3N2，B三种型别的抗原，标志为样品组5；对照组样品为流感亚单位疫苗，含血凝素为15IU/ml，不加任何辅助成分。
实施例6冻干水化法制备免疫性脂质体流感疫苗
取卵磷脂及胆固醇、硬脂酸按照设定的摩尔比，溶于氯仿溶液；旋转蒸发，除去有机溶媒，形成磷脂膜层；加入适量磷酸缓冲液(0.1M，PH8.0)，将脂质体混悬液与流感抗原溶液混合，形成大多层脂质体混悬液；再加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；再加入含有50万IU的干扰素α2b的无菌水，用震荡器震荡5分钟，重新水化形成大单层或多层脂质体混悬液，即为免疫胜脂质体流感疫苗。样品组的免疫原组分含H1N1，H3N2，B分别含血凝素为15IU/ml，标志为样品组6，对照组样品为流感亚单位疫苗，不加任何辅助成分。
实施例7冻干水化法制备免疫性脂质体流感疫苗
取卵磷脂及胆固醇、硬脂酸按照设定的摩尔比，溶于氯仿溶液；旋转蒸发，除去有机溶媒，形成磷脂膜层；加入适量磷酸缓冲液(0.1M，PH7.4)，将脂质体混悬液与流 感抗原溶液混合，形成大多层脂质体混悬液；再加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；再加入含有50万IU的白介素-2的无菌水若干，用震荡器震荡5分钟，重新水化形成大单层或多层脂质体混悬液，即为免疫性脂质体流感疫苗。样品组的抗原为H1N1(含血凝素为15IU/ml)，同时含有40万IU/ml的IL-2，标志为样品组7，对照组样品为流感亚单位疫苗，不加任何辅助成分。
实施例8核酸复合物佐剂流感疫苗
用免疫核糖核酸复合物(含200-500bp的iRNA)在的0.5-100ug/ml范围内，和流感疫苗抗原组分进行充分混合，标志为样品组8，对照组样品为流感亚单位疫苗，含血凝素为15IU/ml，不加任何辅助成分。
表3：不同疫苗组不同时间的抗体滴度结果(实施例3-8结果，n＝10)
根据实施例3-8所述的方法制备的脂质体流感疫苗免疫效果-时间图如下：
□与对照组比较，P＜0.001，与样品8组比较，P＜0.001
△与对照组比较，P＜0.001，与样品8组比较，P＜0.001
◇与对照组比较，P＜0.01，与样品8组比较，P＜0.001
○与对照组比较，P＜0.05，与样品8组比较，P＜0.05
☆与对照组比较，P＞0.05，
实施例10本发明脂质体流感疫苗的冻干水化法制备工艺包括如下步骤：
1、将脂质体、膜材及附加剂或免疫调节剂以摩尔比7∶(1~5)∶(1~3)溶于溶媒中，置于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；
2、加入磷酸缓冲液，40~60℃，超声10~20分钟，形成脂质体悬液；
3、将脂质体悬液与各疫苗抗原溶液混合，脂质体粉碎均匀达到所需要的粒径，加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；
4、采用湿热法或钻照射等方法灭菌，得到冻干粉剂；加无菌水、震荡、再水化融合；得到脂质体疫苗。
实施例11本发明脂质体流感亚单位疫苗的逆相蒸发法制备工艺包括如下步骤：
1、将脂质体、膜材和附加剂或免疫调节剂以摩尔比7∶(1~5)∶(1~2)溶于溶媒中，加入流感抗原溶液，35~60℃，超声处理10~20分钟，得到稳定的油包水乳液；
2、在40~60℃下减压蒸发，得到胶态物质；
3、加入磷酸缓冲液，40~60℃旋转蒸发，减压蒸发10~20分钟，除去微量有机溶媒，得到脂质体水性混悬液，放置20~40分钟，透析20~30小时，除去游离的未包入脂质体的流感抗原；
4、采用湿热法或钴照射等方法灭菌；
5、得到免疫性脂质体流感亚单位疫苗。
本发明制备的免疫性脂质体流感亚单位可以采用肌肉注射或皮下给药。本发明的优点是本发明的脂质体流感亚单位，它既能对Influenza virus起到良好的预防作用，这种疫苗既能激发机体体液免疫反应，产生保护性抗体，清除血循环中的病毒，又能激发T与B细胞免疫反应，消灭病毒，从而达到彻底清除病毒。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种脂质体流感疫苗，其特征在于：所述脂质体的膜带有电荷，所述流感疫苗的抗原组分包裹于脂质体内或镶嵌于脂质体膜中或由于电荷而吸附于膜上；所述流感疫苗包括全病毒灭活流感疫苗，流感裂解型疫苗和流感亚单位疫苗；所述流感疫苗抗原组分包括流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；所述血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)包括H1N1。
2.根据权利要求1所述的脂质体流感疫苗，其特征在于：所述血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)还包括H3N2、B中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的脂质体流感疫苗，其特征在于：所述脂质体流感疫苗单位剂量中含流感疫苗HA及NA组分的量是5ug-100ug。
4.根据权利要求3中所述的脂质体流感疫苗，其特征在于：所述流感疫苗还包含免疫调节剂或附加剂。
5.根据权利要求4中所述的脂质体流感疫苗，其特征在于：所述免疫调节剂为细胞因子类蛋白，包括干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)，白介素(IL-1、IL-2、IL-4、IL14、IL16)、胸腺肽α1、免疫核糖核酸。
6.根据权利要求5中所述的脂质体流感疫苗，其特征在于：所述脂质体为小单层和大多层脂质体共存的脂质体。
7.根据权利要求6所述的脂质体流感疫苗，其特征在于：所述脂质体球径为50～5000nm。
8.根据上述1-7中任意一个权利要求所述的脂质体流感疫苗的制备方法，其特征在于：采用冻干水化法，包括如下步骤：
1)将脂质体膜材及附加剂，免疫调节剂以摩尔比(5-10)∶(1-7)∶(1-5)溶于溶媒中，置于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；
2)加入缓冲液，40-60℃，超声10-20分钟，形成脂质体悬液；
3)将脂质体悬液与流感疫苗抗原溶液混合，脂质体粉碎均匀，加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；
4)灭菌：得到冻干粉剂；加无菌水、震荡、再水化融合；得到脂质体流感疫苗。
9.根据权利要求8所述的脂质体流感疫苗的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)中的溶媒为二氯甲烷溶液或氯仿溶液；
所述步骤2)中的缓冲液为pH值为5.4-7.8范围内的磷酸缓冲液、Tri-HCl缓冲液、碳酸钠缓冲液或NaCl溶液。
10.根据上述1-7中任意一个权利要求所述的脂质体流感疫苗的制备方法，其特征在于：采用逆相蒸发法，包括如下步骤：
1)将脂质体膜材和附加剂，免疫调节剂以摩尔比(5-10)∶(1-7)∶(1-5)溶于溶媒中，加入流感疫苗抗原溶液，35-60℃，超声处理10-20分钟，得到稳定的油包水乳液；
2)在40-60℃下减压蒸发，得到胶态物质；
3)加入缓冲液，40-60℃旋转蒸发，减压蒸发10-20分钟，除去微量有机溶媒，得到脂质体水性混悬液，放置20-40分钟，透析，除去游离的未包入脂质体的流感抗原；
4)灭菌；得到脂质体流感疫苗。
11.根据权利要求10所述的脂质体流感疫苗的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)中的溶媒为二氯甲烷溶液或氯仿溶液；
所述步骤2)中的缓冲液为pH值为5.4-7.8范围内的磷酸缓冲液、Tri-HCl缓冲液、碳酸钠缓冲液或NaCl溶液。
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| CN1925870A (zh) * | 2003-05-15 | 2007-03-07 | 俄克拉荷马州大学评议会 | 表达马－2型流感病毒ha1的dna疫苗 |
-
2008
- 2008-06-23 CN CN2008100679002A patent/CN101502649B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1925870A (zh) * | 2003-05-15 | 2007-03-07 | 俄克拉荷马州大学评议会 | 表达马－2型流感病毒ha1的dna疫苗 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 郝淑美.脂质体流感疫苗制备及体液免疫应答的研究.《中国免疫学杂志》.2007,第23卷(第3期),263-266. * |
| 陈吉祥 等.禽流感病毒HA基因核酸疫苗与阳离子脂质体相互作用的电子自旋共振研究.《中兽医医药杂志》.1999,(第5期),3-6. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101502649A (zh) | 2009-08-12 |
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