CN1301572A - 用于疫苗的佐剂组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的用于预防性和治疗性疫苗的佐剂组合物,其中包含脂质体和CpG ODN。本发明佐剂组合物诱导的Th1型和Th2型应答都很强,具有明显的协同效应。而且,采用该佐剂的疫苗除常规的皮下、肌内给药外,经鼻粘膜给药也能被吸收从而诱导全身免疫性应答,包括体液免疫和细胞免疫。
Description
本发明主要涉及用于预防性和治疗性疫苗的新的佐剂组合物。具体地说，本发明涉及一种基本无毒且辅佐效果优良的新的佐剂，它与抗原联合制成疫苗制剂后，可以通过皮肤、肌肉、粘膜给药，诱导机体产生强而均匀的免疫应答反应，达到预防和治疗疾病的目的。
现代免疫学已经发现，辅助性T淋巴细胞(TH细胞)在诱导机体产生体液和细胞免疫，即产生特异性抗体和细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答中起着重要作用。由Th0细胞分化而成的Th1细胞和Th2细胞构成了两大功能性亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFNr、TNF，促进Mφ活化，增强CTL应答，介导细胞免疫，并刺激B细胞产生高亲和力能激活补体的IgG抗体(小鼠IgG2a，人IgG1)。Th2细胞主要分泌IL-4、5、6、10、13，促进B细胞活化产生非补体激活性抗体(小鼠IgG1，人IgG2、3)和IgE抗体，介导体液免疫。在机体的免疫应答中，Th1和Th2两种类型兼而有之，但是相对强度不同，所以可分为以Th1型为主的应答和以Th2型为主的应答。对于抗胞内微生物感染或抗肿瘤感染免疫而言，以Th1型为主的应答显然对机体更有利。Th1和Th2这两种细胞之间存在互相拮抗和互相抑制的关系，保持着某种动态平衡。但是这种平衡会因某些影响而偏移，机体的免疫状态和疾病状态随之改变。防病治病的目的就是要增加和调控这种应答和平衡，使之有利于机体。
影响所述平衡的因素包括：机体原先的免疫状态、感染、药物和疫苗接种等。就疫苗而言，其中的抗原、载体和佐剂，尤其是佐剂对所述平衡有着重要影响(余传霖等，现代医学免疫学，上海医科大学出版社，1998，第一版)。
为了提高疫苗的效力即免疫原性，和开发新的疫苗，除了优化抗原和载体之外还需要改进佐剂，尤其需要辅助免疫原诱导更强、更持久免疫应答的无毒的人用佐剂。“佐剂”指与抗原同时使用或分开使用时能增强机体免疫应答的物质。“佐剂组合物”指一种以上具有佐剂活性的物质的联用，或指佐剂与免疫调节剂和运载体(将抗原从注入部位传送到淋巴系统的物质，不同于载体)的联用。它们的使用都是为了辅助疫苗抗原诱导较优的免疫应答。当前，为了获得理想的免疫应答，几乎所有疫苗都使用佐剂。(余传霖等，同上)
佐剂的种类很多。根据结构，佐剂可分为颗粒性佐剂和非颗粒性佐剂。非颗粒性佐剂通常为具有免疫调节作用的化合物或细胞因子等。其实例可参见(谢建云，刘庆良，疫苗佐剂的分类和作用方式，预防、诊断治疗用生物制品分册，1997,20:253)。而颗粒性佐剂在显微镜下呈颗粒状，免疫原掺人在颗粒中，或与颗粒连接而起作用。其实例可参见(谢建云，刘庆良，同上)。通常，非颗粒性佐剂是单纯的化合物，而颗粒佐剂则是由一种以上化合物组成的组合物。实际上效果较好的主要是佐剂组合物，例如目前功能最强的佐剂-弗氏完全(FCA)佐剂、以及RiBi佐剂、ISCOM、r菊粉、SBAS佐剂PLG共聚微球及脂质体等，它们都是由两种以上物质或掺入各种免疫调节剂而组成，以便诱导更理想、更全面的免疫应答。(谢建云，刘庆良，同上)。
在本发明中后文中，“佐剂”包涵“佐剂组合物”。
此外，根据功能即所诱导的主要免疫应答类型，佐剂可分为Th1型和Th2型。参见(谢建云，刘庆良，同上)。不同的疫苗根据所预防或治疗对象的不同可选择不同的佐剂。但是，大多数疫苗选用Th1型/Th2型兼顾的佐剂组合物可能更适宜。(Shearea,G.N.,疫苗策略：选择性诱导体液免疫还是细胞免疫，TrendsBiotechno1.,1997:15(3),106)。
但是，迄今用于人类的疫苗佐剂只有铝盐一种，因为它无毒性，副作用极少，安全性高，所以一直以来被广泛用于人类疫苗。然而，与动物疫苗用的有一定毒性的诸如FCA、ISCOM、Ribi、SBAS等其它佐剂相比，它作用不强，是仅诱导体液免疫的Th2型佐剂。
所以，人们一直在不断寻找对人无毒，且作用能够与FCA相比的新的佐剂，用于人类疫苗。最近的成果包括脂质体和CpG。尤其是脂质体，已经有一种脂质体疫苗产品上市，并另有6种已进入Ⅰ-Ⅲ期临床考核(刘庆良：脂质体在医学领域的新应用，国外医学预防诊断治疗用生物制品分册，1999:22(3):121)。
脂质体是以卵磷脂、胆固醇为主要原料，加上油酸、鲨烯等少量辅料等制成的双层单室或多室性小体，直径约20毫微米至5微米不等，内可包裹抗原和载体蛋白以及其它免疫调节剂。还有一种非磷脂脂质体，又称Novasome(WallachDFH美国专利4855090(1989)；沈诚诚等，疫苗用新型非磷脂脂质体的发展现状，国外医学领域预防诊断治疗用生物制品分册，1997:20(4):160)，早年仅用于涂料和化妆品，近来开始用于疫苗佐剂的研究(Gupta RK等，Vaccine 199614:219)，并已有两种兽用疫苗产品上市。它以表面活性剂聚氧乙烯脂肪醚代替卵磷脂，降低了原材料费用，制成的脂质体包裹率高、稳定性好。上述两种脂质体兼具佐剂、运载体和贮存库等作用，且均无毒性或基本上无毒性，可用于人类。但是各种研究显示：单用脂质体的疫苗以诱导Th2型应答为主，其强度虽强于铝盐，但是仍无法与FCA或IFA相比，诱导Th1型应答较差。((沈诚诚等，破伤风类毒素非磷脂脂质体疫苗的实验研究))。
CpG则是近年来研究核酸疫苗中的新进展。它是含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序的DNA片段。也可以人工合成含CpG基序的寡核苷酸(CpG ODN)。它能激活B细胞、NK、DC树突状等细胞，诱导释放IL-12、IFNr，从而诱导强Th1型应答和细胞免疫。目前主要用于DNA疫苗，也已开始与蛋白抗原联用，但据报道，诱导Th1型应答的强度不及FCA。(姚军：新型免疫佐剂CpG DNA的性能和初步应用；国外医学预防诊断治疗用生物制品分册1998:21(16):251。Moldoveanu,Z.等:Vaccine 1998:16(11/12),1216)。并已证明CpG ODN对机体无毒性。
但是，迄今尚未发现脂质体与CpG ODN联用的报道，尤其是联合应用于蛋白、多糖抗原的疫苗中。
为了克服现有技术中的不足，基于以上背景技术，本发明提供了一种的新的、效果更佳的疫苗佐剂组合物，它基本无毒，可用于人类疫苗，尤其是蛋白、多肽、多糖抗原的疫苗。
为了实现以上目的，本发明提供了一种用于预防性和治疗性疫苗的新的佐剂组合物，它包含脂质体和CpG ODN。所述的CpG ODN与疫苗所用的抗原物质一起被脂质体所包裹，所形成的单位剂量疫苗中含CpG ODN 10μg-500μg，含脂质体20mg-300mg。
本发明的脂质体可以是常规磷脂脂质体，也可以是非磷脂脂质体又称Novasome。本发明更推荐Novasome，因为它的原料成本低，制备容易，稳定性好，包裹率高。
常规磷脂脂质体的原料，主要是卵磷脂(及其衍生物)和胆固醇。这些是人体正常组织成分，还可添加一些改善膜流动性的油酸、鲨烯，这些也是无毒性材料。卵磷脂是好几种物质的不均一混合物，含有较多不稳定性的不饱和键，易氧化，故用其制备的脂质体稳定性差，易破裂。最好采用其衍生物，如二硬脂酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰甘油。二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等代替天然卵磷脂。
用作疫苗的磷脂脂质体的制备方法虽有多种，但较佳的方法是脱水-复水法(见下文实施例)，此法对抗原蛋白活性的损伤小，有利于疫苗效能的保存。在制备过程中，所用的CpG ODN加入抗原溶液组分中、再与脂质成分混合制成脂质体疫苗。脂质体的制备方法是本领域一般技术人员周知的，或可参照Gregoriadis.G编写的两本书：Liposome Techmology CRC Press 1993第二版。Boca Raton.和Liposomes as tools in Basic Research and industry.CRC Press 1995.Boca Raton.中的有关内容来制备。
Novasome的原料用聚氧乙烯脂肪醚类表面活性剂代替卵磷脂外，其余与磷脂脂质体相同。聚氧乙烯脂肪醚类中，应用较多效果较好的是二氧乙烯十六烷基醚[C16H33(OCH2CH2)2OH]。此材料基本无毒，能被机体Mφ肝细胞等，以及肠道和环境微生物降解。分子均一，无不饱和键，因而制备的Novasome包裹体积大、粒径较为均匀(0.1～0.5nm)。稳定性良好。40℃放置11天仍有70％保持完整。性能优于磷脂脂质体(沈诚诚等，同上)。
用于疫苗的Novasome制备方法，主要采用反复压力喷雾，以喷孔孔径控制所制备的粒径。制备中不用有机溶剂，也无制备磷脂脂质体时超声波或旋涡振荡产生的剪切力。对抗原蛋白的活性影响更小(沈诚诚等，同上)。Novasome疫苗的制备见Wallach DFH公开的专利(Wallach,DFH,1989,同上)和下文实施例。
CpG ODN是含有非甲基化胞嘧啶乌嘌呤二核苷酸基序的20个碱基左右长短的寡核苷酸，可有多种序列，根据疫苗的要求不同来选择。
本发明所用的CpG ODN是20个碱基左右长短的寡核苷酸。有别于当前核酸疫苗研究中使用的含CpG基序的质粒载体。主要用化学合成法合成。虽然也可用基因工程方法制备，但成本相对较贵。本发明所用的CpG ODN主要为ArtharM.Krieg等人的研究发现，(参见Moldoveanu,Z.等,Vaccine,1998,21(16):1216；Aguado,T.等,Vaccine 1999 17(19)2321；Weiner,G.T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1997:94,10833；Jacob,T.等,J.Immunol.1998:161,3042；Klinman,D.M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996:93,2879；Ballas,Z.K.等,J.Immunol.1996:157.1840；Kovarik,J.等,J.Immunol.1999:162(3),1611)。这些CpG ODN的序列举例如下，但不限于以下序列：
表1
| 编号 | 核苷酸序列 |
| 1 | TCTCCCAGCGTGCGCCAT |
| 2 | ATAATCGACGTTCAAGCAAG |
| 3 | TCCATAGCGTTCATAGCGTT |
| 4 | TCCATGACGTTCCTGACGTT |
| 5 | ATCGACTCTCGAGCGTTCTC |
| 6 | GGGGTCAACGTTGAGGGGGG |
| 7 | TCCATGTCGTTCCTGATGCT |
| 8 | TCCATGACGTTCCTGATGCT |
| 9 | GGGGTCAACGTTGAGGGGGG |
| 10 | AAAATCAACGTTGAAAAAAA |
| 11 | TGACGTTAACGTTGAACGTTCGCGCTAGACGTTAGCGTGAGAACGTCGACCTTCCATTCAACGTT |
说明：CG即非甲基化胞嘧啶乌嘌呤二核苷酸(CpG)基序。
这些CpG ODN的核糖-磷酸酯链骨架可以全部硫代或部分硫代。硫代的目的是增加CpG ODN抵抗核酸酶水解的能力。使CpG ODN被摄入机体后可以存留较长时间发挥佐剂作用。但由于本发明的脂质体将CpG ODN包裹在其中，也有屏蔽防止CpG ODN接触体内核酸酶的作用。因而可采用硫代或部分硫代的CpGODN，主要是两端各2-5个核苷酸的硫代，从而降低CpG ODN生产成本。有时也可用无硫代的CpG ODN包裹于脂质体中仍有良好效果。以上CpG ODN只是举例，其它CpG ODN序列都可用于本发明，属于本发明范围。
CpG ODN硫代核糖磷酸酯链示意
B碱基S硫代
合成CpG ODN核糖-磷酸酯链骨架硫代的方法是本领域众所周知的，可参见金冬雁，金奇，侯方德编著的“核酸和蛋白质的化学合成与序列分析”，科学出版社；Gaituj编：Oligonucliotide Sythesis:A Practical Approach IRL RressOxford(1990)；Eckstein编：Oligonucliotide and Analogues:A Practical ApproachIRL Rress Oxford(1991)
本发明佐剂组合物中CpG ODN使用的剂量太少，达不到预期的效果，太多则因效果不再随之增加而形成浪费。所以，一般使用剂量范围为10μg-500μg/次，较佳的10μg-100μg/次，更佳的为20μg-50μg/次。
本发明脂质体疫苗中脂质的用量范围为20mg-300mg/次，较佳的为20mg-200mg/次，更佳的为20mg-50mg/次。
在用本发明佐剂组合物制备疫苗时，脂质体与所包裹的含CpG ODN及免疫原的水溶液的体积比约为1∶4至1∶5。
用本发明佐剂配方制备的疫苗，可用于人、哺乳动物、禽类的免疫接种，接种途径可采用皮下、肌肉或粘膜给药，如滴鼻、包入肠溶胶囊后口服等。
本发明的脂质体-CpG佐剂组合物诱导的Th1型和Th2型应答都很强，不单单是二者的叠加，而是明显协同效应，性能已基本上达到或接受FCA的水平。尤其需要指出的是，我们发现：利用脂质体-CpG佐剂组合物的疫苗经鼻粘膜给药能被吸收诱导全身抗体应答。诱导的血清抗体水平比铝佐剂疫苗皮下接种诱导的还高。
实施例
一．CpG ODN的化学合成与纯化
根据常规的亚磷酰胺法或氢膦酸酯法(参见金冬雁，金奇，候云德编著的“核酸和蛋白质的化学合成与序列分析”，科学出版社，1996,1-24页；Gait,M.J.主编，Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford 1990)，用Applied Biosystemes公司的381A型或391A型DNA自动合成仪进行固相法DNA化学合成。表1列出了合成的CpG ODN序列。所用的二氧化硅可控孔径玻璃柱或聚苯乙烯固相支撑体，二甲氧基三苯甲基(DMT)保护羧基的脱氧核苷(A、C、G、T)或它们的硫代衍生物以及其它试剂均购自Perkin ElmerCorp.。按设计的CpG ODN序列(见表1)合成，直至完毕，用29％浓氨水55～60℃反应8-16h、将CpG ODN从固相支持柱上水解下来，离心干燥机上浓缩干燥。用乙醇溶解，再离心干燥一次。
通常20个碱基以下的CpG ODN不必纯化。若要纯化可用水溶解，离心取上清，以丁醇连续抽提三次弃去上层有机相，再离心干燥即可。纯度达到要求。若要求更高纯度，可用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法来纯化。大规模纯化可用硅胶反相层析法(Water公司的Sep-PAK C18柱)或Mono-Q FPLC阴离子交换柱以10mMol/L同NaOH,0.6-1.0mol/L NaCl连续梯度洗脱(参见金冬雁等所著书，同上)。合成的CpG序列是否正确可用质谱仪进行质谱分析，也可用DNA自动分析仪进行分析。所得CpG ODN应取样测定热原质反应(鲎试验法)，若有热原质应重复以上纯化过程加以去除。
二．磷脂脂质体的制备
磷脂脂质体的主要原料为卵磷脂(PC)和胆固醇(Chol)。由于天然卵磷脂是混合物含有较多不饱和键：制备的脂质体稳定性差，故宜采用卵磷脂分离衍生的饱和组分，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)等(Sigma产品)制备。通常将PC与Chol按7∶3分子比混合(或DSPC:DSPE=1∶3分子比，或DSPC:DSPG:DSPE-PEG=10∶3∶1.45分子比混合后，再按7∶3分子比加入Chol)，以氯仿-甲醇(9∶1)溶解，置于旋转蒸发器的圆球形烧瓶中、旋转蒸发成贴在瓶壁上的乾膜：加人生理盐水或PBS液振荡后形成白色乳浊悬液。即为磷脂脂质体。此法称为“脱水-复水法”(详见Gregoriadis G编的Liposomes as tools in Basic Research andindustry一书CRC Press Inc.1995 Boca Raton。)此法优点是，脂质虽用有机溶剂溶解，但包裹的抗原等物质不直接接触有机溶剂，活性不会受损。但磷脂脂质体的原料较贵，脱水复水法的包裹率50～60％左右也不太满意。故本发明推荐采用下述非磷脂脂质体Novasome。
三．非磷脂脂质体破伤风类毒素疫苗(TT-Novasome)的制备
按照表2列出的试剂用量，制备了一系列疫苗。制备方法主要包括：取所述量的二氧乙烯十六烷基醚(商品名Brij 52,Aldrich公司产品)，胆固醇(上海伯奥生物科技公司)，油酸(上海远航试剂厂)，混合加热到100℃融化澄清。取此液态混合脂质1.0ml置于一无菌针筒中50～60℃保温。另取所述量含有所述浓度抗原和所述浓度CpG ODN的缓冲溶液置于另一无菌针筒内，50～60℃预热3～5分钟。二针筒以双通针头(直径0.47mm)连接，来回推注45～50次，操作温度从50～60℃移至37℃，再移至室温。即获乳白色可流动的TT-Novasome疫苗，4～10℃保存待用。Novasome疫苗的规模化生产可采用美国Biocybemetics Inc.制造的Micro Vesicular Systems装置。本发明手工制备和Biocybemetics Inc.的机器制备均采用反复压力喷雾方法使脂质与抗原-CpG ODN水溶液混合物反复经一小孔喷头喷出，逐步形成所需大小的脂质体颗粒，制备中抗原物质仅短暂接触较高(50～60℃)温度，不接触有机溶剂。因此抗原活性基本上不会遭到伤害。还有其它制备脂质体的方法，如果这些方法不接触高温或有机溶剂，则也可用于本发明。(规模化生产Novasome疫苗参见Liposomes as tools in Basic Research andindustry一书241～250页Gregoriadis G编著1995.CRC Press Inc.Boca Raton)。
表 2
| 疫苗编号 | Brij 52(g) | 胆固醇(g) | 油酸(g) | TT/CpG ODN溶液(ml) | CpG ODN浓度(μg/ml) | TT浓度(μg/ml) |
| 1 | 1.8 | 0.6 | 0.1 | 3 | 120 | 12 |
| 2 | 1.92 | 0.75 | 0.33 | 4 | 500 | 150 |
| 3 | 2.2 | 0.7 | 0.1 | 5 | 250 | 25 |
| 4 | 2.2 | 0.7 | 0.1 | 5 | 750 | 250 |
| 5 | 2.4 | 1.0 | 0.5 | 6 | 1300 | 600 |
四．本发明佐剂配制的疫苗的动物接种
本发明佐剂可用于人体也可用于动物。用本发明佐剂配制的人用疫苗需首先进行临床前的动物接种试验。例如本发明采用的Balb/c、C57和C3H等品系小鼠进行接种试验。
| 小鼠品系 | 接种途径 | 脂质体疫苗用量(每次每只小鼠) |
| Balb/c | 肌肉/皮下 | 0.1ml |
| Balb/c | 肌肉/皮下 | 0.2ml |
| Balb/c | 肌肉/皮下 | 0.5ml |
| Balb/c | 滴鼻* | 5μl |
| Balb/c | 滴鼻 | 7μl |
| Balb/c | 滴鼻 | 10μl |
*：滴鼻给予时，应先用乙醚轻度麻醉小鼠后，用微量加样器长细针头，向小鼠两鼻孔分别滴入疫苗。因鼻腔吸收不足30％，故一次接种应连滴鼻三次，每天一次。如此共接种1-3次，间隔时间3周。
五．本发明佐剂配制的疫苗接种效果的检测
在疫苗的临床前动物接种试验中，需从体液免疫和细胞免疫两方面来检查考核疫苗加本发明佐剂，或不加佐剂，或加其它佐剂的效果。体液免疫是取接种动物的血清、血浆，唾液，气管和肠腔灌洗液等样品测定其中的中和抗体，特异性IgG.IgA.IgM等抗体的水平。对于小鼠可进一步测定样品中IgG1、IgG2a、IgG2b亚型特异性抗体水平。测定方法采用各种免疫试验方法，这些都是本领域的常规，一般技术人员都知道。细胞免疫应答的测定常取接种动物的脾细胞，引流淋巴结细胞等进行培养在培养中加入相应抗原刺激淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、4、6、10、12、IFNr、TNF等，或刺激淋巴细胞转化增殖，或测定细胞毒性T细胞活性。这些试验都是免疫学的常规试验。一般技术人员都知道。除此之外，还可以用相应的病原体对接种动物作攻击试验，观察动物存活或体内病原体能否繁殖。以及给接种动物耳廓或足垫注射相应抗原观察迟发性变态反应(DTH)的强弱。这些试验也是本领域技术人员周知的。
我们用破伤风类毒素(TT)所做动物实验结果如下表3：
表3．
不同佐剂TT疫苗免疫后小鼠抗体应答和脾细胞分泌细胞因子的比较
| 所用疫苗 | 血清特异性抗体水平(μg/ml) | 细胞因子IL-2试验(pg/ml) | ||
| 总IgG | IgG1 | IgG2a | ||
| TT-NovasomeTT-Al(OH)3单纯TT | 26791007589 | 1944960268 | 4.11.8<0.06 | 50804474- |
以上试验显示，脂质体是Th2型佐剂，其效能高于铝佐剂，但Th1型应答诱导能力弱。而CpG ODN主要属于Th1型佐剂，据Z.Woldoveanw等(Vaccine 1998:16(11/12),1216)报道CpG ODN在体外能刺激小鼠脾细胞产生较高细胞因子和B细胞增殖(见后文表4)。
表4．
CpG ODN体外对小鼠脾细胞的免疫刺激
| CpGODN | 细胞因子试验(pg/ml) | B细胞增殖 | ||
| IFNY | IL-12 | IL-6(pg/ml) | 刺激指数(SI) | |
| 无CpG基序的对照ODNCpGODNNo.1CpGODNNo.2CpGODNNo.3CpGODNNo.4 | 123815474488 | 473189380641206971 | 06057719726289 | 1.914262624 |
可见，本发明联合佐剂的两种主要成分脂质体和CpG ODN本身虽有佐剂活性，但单独使用活性不够高也不够全面，比弗氏佐剂(FCA)差很还。
我们用流行性出血热疫苗所作的研究结果如下：
表5．
不同佐剂出血热疫苗皮下接种小鼠血清抗体应答与脾细胞因子分泌测定
*：通过两次注射进行接种。CpG为CpGNo.1。第一针用量为20μg/小鼠。第二针用量为10μg/小鼠。
| 佐剂 | 血清特异性抗体水平(μg/ml) | 细胞因子试验(pg/ml) | ||||
| 总IgG | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IFNγ | IL-4 | |
| 未接种Al(OH)3NovasomeFCANovasome-CpG* | -60.4583.31989.03289.9 | -50.1442.01560.62679.6 | -0.41.472.271.2 | -0.20.7114.9220.0 | 173.2173.2179.3386.9185.4 | 15.921.521.730.918.0 |
表6．
不同佐剂出血热疫苗皮下或滴鼻接种后
小鼠血清中和抗体与IgG抗体水平比较
ΔCpG ODN用量50μg/每鼠ΔΔCpG ODN用量20μg/每鼠ΔΔΔFCA中卡介苗用量10mg/ml
| 佐剂 | 接种途径 | 血清中和抗体滴度 | 血清特异性抗体水平 | ||
| 总IgG | IgG1 | IgG2a | |||
| Al(OH)3 | 滴鼻 | 不能测出 | 不能测出 | ||
| 皮下 | 31.8 | 65.3 | 54.6 | 0.35 | |
| Novasome | 滴鼻 | 50.4 | 108.2 | 96.5 | 0.70 |
| 皮下 | 160.0 | 634.1 | 501.2 | 2.55 | |
| CpGODN△ | 皮下 | 320.0 | 462.3 | 405.1 | 14.20 |
| Novasome△△-CpG | 滴鼻 | 63.5 | 204.2 | 178.5 | 2.01 |
| 皮下 | 639.7 | 2342.4 | 2128.1 | 83.5 | |
| FCA△△△ | 滴鼻 | 不能测出 | 不能测出 | ||
| 皮下 | 508.2 | 2004.2 | 1327.2 | 82.3 | |
由以上二表可以看出：Novasowe-CpG诱导的IgG1抗体比FCA高，IgG2a抗体与FCA相当。细胞因子IFNr和IL-4比FCA低一些，但比铝佐剂和单用Novasome高(统计学有显著差别)。免疫小鼠耳廓迟发性变态反应(DTH)试验也显示Novasome-CpG诱导的DTH比FCA低一些。但比铝佐剂和单用Novasome明显要强。表明，本发明的脂质体-CpG佐剂组合物诱导的Th1型和Th2型应答都很强，不单单是二者的叠加，而是明显协同效应，性能已基本上达到或接近FCA的水平。尤其需要指出的是，铝佐剂疫苗和FCA佐剂疫苗滴鼻基本无效或效果甚微，而利用脂质体-CpG佐剂组合物的疫苗经鼻粘膜给药能被吸收诱导全身抗体应答。诱导的血清抗体水平比铝佐剂疫苗皮下接种诱导的还高。
若进一步根据不同疫苗的免疫要求，从上述CpGODN序列中，选择各自适合的序列。再对用量进行优化，此联合佐剂的优越性会更好地体现。
Claims (12)
1．一种用于疫苗的佐剂组合物，它包含脂质体和CpG ODN，所述的CpGODN与疫苗所用的抗原物质一起被脂质体所包裹，所形成的单位剂量疫苗中含CpG ODN 10μg-500μg，含脂质体20mg-300mg。
2．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中单位剂量疫苗中含CpG ODN 10μg-100μg。
3．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中单位剂量疫苗中含CpG ODN 20μg-50μg。
4．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中单位剂量疫苗中含脂质体20mg-200mg。
5．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中单位剂量疫苗中含脂质体20mg-50mg。
6．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中所述的脂质体包含提纯的天然卵磷脂或其衍生物饱和卵磷脂，以及胆固醇。
7．根据权利要求6所述的佐剂组合物，其中所述的饱和卵磷脂选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或它们的组合物。
8．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中所述的脂质体是包含聚二氧乙烯脂肪醚类的非磷脂脂质体。
9．根据权利要求8所述的佐剂组合物，其中所述的聚氧乙烯脂肪醚类是聚二氧乙烯十六烷基醚。
10．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中所述的CpG ODN是长度为6至20个核苷酸的寡核苷酸。
11．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中所述的脂质体采用脱水-复水法或反复压力喷雾法来制备。
12．根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中所述CpG ODN的核糖-磷酸酯链骨架被硫代。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100340289C (zh) * | 2002-07-05 | 2007-10-03 | 利普生技术有限公司 | 增强核酸接种免疫应答的方法 |
| CN100402090C (zh) * | 2006-06-15 | 2008-07-16 | 南京农业大学 | 一种黏膜免疫的复合佐剂 |
| CN103025351A (zh) * | 2010-05-28 | 2013-04-03 | 辉瑞动物保健公司 | 包含胆固醇和作为唯一的佐剂-载剂分子的cpg的疫苗 |
| CN107375921A (zh) * | 2017-06-12 | 2017-11-24 | 商丘美兰生物工程有限公司 | 一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 |
| CN110151702A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-08-23 | 昆明医科大学 | 聚乙二醇修饰流感疫苗脂质体及其制备方法 |
| CN118078983A (zh) * | 2024-02-05 | 2024-05-28 | 昆明超启生物科技有限公司 | 一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺 |
-
1999
- 1999-10-28 CN CN 99119884 patent/CN1301572A/zh active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100340289C (zh) * | 2002-07-05 | 2007-10-03 | 利普生技术有限公司 | 增强核酸接种免疫应答的方法 |
| CN100402090C (zh) * | 2006-06-15 | 2008-07-16 | 南京农业大学 | 一种黏膜免疫的复合佐剂 |
| CN103025351A (zh) * | 2010-05-28 | 2013-04-03 | 辉瑞动物保健公司 | 包含胆固醇和作为唯一的佐剂-载剂分子的cpg的疫苗 |
| CN107375921A (zh) * | 2017-06-12 | 2017-11-24 | 商丘美兰生物工程有限公司 | 一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 |
| CN107375921B (zh) * | 2017-06-12 | 2019-10-29 | 商丘美兰生物工程有限公司 | 一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 |
| CN110151702A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-08-23 | 昆明医科大学 | 聚乙二醇修饰流感疫苗脂质体及其制备方法 |
| CN118078983A (zh) * | 2024-02-05 | 2024-05-28 | 昆明超启生物科技有限公司 | 一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺 |
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