CN107375921B - 一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 - Google Patents
一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107375921B CN107375921B CN201710438062.4A CN201710438062A CN107375921B CN 107375921 B CN107375921 B CN 107375921B CN 201710438062 A CN201710438062 A CN 201710438062A CN 107375921 B CN107375921 B CN 107375921B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glycyrrhizin
- liposome
- adjuvant
- parts
- mixed liquor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 100
- 239000004378 Glycyrrhizin Substances 0.000 title claims abstract description 93
- LPLVUJXQOOQHMX-UHFFFAOYSA-N glycyrrhetinic acid glycoside Natural products C1CC(C2C(C3(CCC4(C)CCC(C)(CC4C3=CC2=O)C(O)=O)C)(C)CC2)(C)C2C(C)(C)C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O LPLVUJXQOOQHMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 93
- 229960004949 glycyrrhizic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 93
- UYRUBYNTXSDKQT-UHFFFAOYSA-N glycyrrhizic acid Natural products CC1(C)C(CCC2(C)C1CCC3(C)C2C(=O)C=C4C5CC(C)(CCC5(C)CCC34C)C(=O)O)OC6OC(C(O)C(O)C6OC7OC(O)C(O)C(O)C7C(=O)O)C(=O)O UYRUBYNTXSDKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 93
- 235000019410 glycyrrhizin Nutrition 0.000 title claims abstract description 93
- LPLVUJXQOOQHMX-QWBHMCJMSA-N glycyrrhizinic acid Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]1O[C@@H]1C([C@H]2[C@]([C@@H]3[C@@]([C@@]4(CC[C@@]5(C)CC[C@@](C)(C[C@H]5C4=CC3=O)C(O)=O)C)(C)CC2)(C)CC1)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LPLVUJXQOOQHMX-QWBHMCJMSA-N 0.000 title claims abstract description 93
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 64
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 32
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 claims abstract description 31
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 229940083466 soybean lecithin Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 25
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 16
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 241000446313 Lamella Species 0.000 claims description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 13
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 abstract description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 abstract description 2
- 240000008917 Glycyrrhiza uralensis Species 0.000 abstract 1
- 235000000554 Glycyrrhiza uralensis Nutrition 0.000 abstract 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 13
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 7
- 239000011162 core material Substances 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 5
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 5
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 5
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 5
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 3
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 3
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 3
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000006208 butylation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 108010034145 Helminth Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000167880 Hirundinidae Species 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- 230000003118 histopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100001252 long-term toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
- A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
- C12N2750/14334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
本发明属于兽用疫苗佐剂技术领域，尤其涉及一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法，主要包含以下几种原料成分：大豆卵磷脂10‑50份、胆固醇3‑17份、丁基化羟基甲苯1‑5份、硬脂胺0.1‑3份、磷脂酸0.1‑2份、甘草皂苷0.5‑2份、胞壁酰三肽0.5‑2份，本发明将中药甘草提取物甘草皂苷和肽类佐剂胞壁酰三肽相结合，通过注入法和冻融法制备成具有免疫增强作用的脂质体免疫佐剂，甘草皂苷脂质体佐剂应用于疫苗安全性好、副作用小，因具有双层膜结构，可提高抗原的稳定性，同时将充分发挥甘草皂苷和胞壁酰三肽的免疫调节作用及脂质体的载体效应，达到持久、高效的免疫促进作用，增强疫苗的免疫效果。
Description
技术领域
本发明属于兽用疫苗佐剂技术领域，尤其涉及一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法。
背景技术
脂质体是人工合成的具有单层或多层单位膜样结构的脂质小囊，由一个或多个类似细胞单位膜的类脂双分子层包裹水相介质所组成，又称磷脂双分子层囊泡，具有佐剂兼载体效应，是诱导相关亚单位抗原的抗体和T淋巴细胞反应的灵活而强大的运载系统。脂质体的结构有利于将抗原递呈给免疫活性细胞。吞噬细胞吞噬脂质体，并能破坏脂质体的膜结构，释放抗原并形成免疫复合物，有利于维持长时期的高效价抗体及产生免疫记忆。脂质体在宿主体内可以生物降解，本身无毒性，并且能够降低抗原的毒性，无局部注射反应。
甘草皂苷是一种有效的生物应答修饰剂，其免疫调节作用表现在对免疫活性细胞、细胞因子、补体等多方面。甘草皂苷能显著提高小鼠静脉对碳粒的廓清指数，增强了网状内皮系统的活力，增强腹腔巨噬细胞吞噬功能及消除腹腔巨噬细胞的抑制活性。在巨噬细胞和淋巴细胞的协同下诱生IFN，并增强干扰素、IL-1 、IL-2的产生。IL-2亦称为T 细胞分化因子，促进T，B 淋巴细胞和胸腺细胞的增生。IL-2 的产生促进抑制性T 细胞或细胞毒性T 细胞产生IFN-γ。同时还可抑制IL-4 的产生，增强Th3 功能，抑制Th2，调节Th3 /Th2失衡。甘草皂苷还可以直接抑制补体活化，降低循环免疫复合物水平。
免疫佐剂是指先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，以及增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原性的物质。随着人们对各种病原的抗原成分及免疫机理的深入了解和越来越多的亚单位疫苗成分被纳入免疫学研究过程，对佐剂的研究和应用将会越来越深入和广泛。佐剂的作用原理主要包括3个方面：①激活先天性免疫应答反应，如弗氏佐剂、免疫刺激复合物和CpG佐剂等；②提高抗原对免疫系统的递呈和刺激作用，如脂质体类佐剂和免疫刺激复合物(ISCOM)；③延长抗原(免疫原)在机体内的存在时间和保持对免疫系统的持续激活作用。很多佐剂中的矿物油成分主要是起到缓释作用。除了弗氏佐剂兼具这3种特性以外，大多数佐剂在功能上都存在一定的缺陷。
胞壁酰三肽是微生物免疫佐剂中的一种，是从分枝杆菌细胞壁中分离得到的具有活性的结构片段，它能增强体液免疫和细胞免疫，提高疫苗、菌苗、病毒亚单位及寄生虫苗的保护力，被认为是最有发展前途的佐剂之一。虽然分子量很小，但具有很强的佐剂活性，可以替代弗氏完全佐剂中的整体分枝杆菌，促进机体对外源抗原的特异性免疫反应，主要作用是活化巨噬细胞，在注射部位形成肉芽肿，吸引吞噬细胞，进一步增强吞噬细胞和淋巴细胞活性，使其更易捕获抗原。
疫苗免疫是预防动物传染病的一个重要手段。佐剂是提高疫苗免疫效果的一个重要成分，迄今人们已经发现许多物质具有佐剂活性，但是只有少数被许可在实际中使用，许多具有免疫佐剂活性的物质由于其毒性作用而限制了其实际应用。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中存在的不足而提供的一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法，其目的在于将甘草皂苷和胞壁酰三肽包被于脂质体内，通过脂质体的膜结构缓慢降解，使包于其内的免疫佐剂缓慢、长久释放，充分发挥甘草皂苷和胞壁酰三肽的免疫调节作用及脂质体的载体效应，从而达到持久、高效的免疫促进作用，增强疫苗的免疫效果。
本发明的目的是这样实现的：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂10-50份、胆固醇3-17份、丁基化羟基甲苯1-5份、硬脂胺0.1-3份、磷脂酸0.1-2份、甘草皂苷0.5-2份、胞壁酰三肽0.5-2份。
一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂15-45份、胆固醇5-15份、丁基化羟基甲苯2-4份、硬脂胺0.5-2.5份、磷脂酸0.5-1.5份、甘草皂苷0.7-1.8份、胞壁酰三肽0.7-1.8份。
一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30份、胆固醇10份、丁基化羟基甲苯2.4份、硬脂胺1.2份、磷脂酸1.2份、甘草皂苷1份、胞壁酰三肽1份。
一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂的制备方法，其特征在于：具有以下步骤：
步骤1）将大豆卵磷脂、胆固醇按3:1的比例混合均匀后得到混合液1，再将丁基化羟基甲苯、硬脂胺、磷脂酸按2:1:1的比例混合均匀得到混合液2，将混合液2倒入混合液1中得到混合液3；
步骤2）将步骤1）得到的混合液3溶于有机溶剂乙醚中，得到混合液4，用注射器将混合液4缓慢注入加热至50-55℃的PBS内，得到混合液5；
步骤3）采用恒温磁力搅拌器不断搅拌混合液5，直至有机溶剂乙醚挥发干净，得到大的多孔脂质体；
步骤4）将步骤3）所得的多空脂质体的混悬液过高压均质机3次，得到大单室脂质体；
步骤5）将步骤4）得到的大单室脂质体与甘草皂苷、胞壁酰三肽按4:1:1的比例混合，混合均匀后得到药液1；
步骤6）将步骤5）得到的药液1快速冷冻，形成冰晶的片层和破碎的膜同时存在的状态，在室温状态下缓慢融化，连续冻融3次，使脂膜之间不断重新融合，伴随着甘草皂苷和胞壁酰三肽在脂质体间的渗透和包被，形成均一的小单室脂质体，即为所述的甘草皂苷脂质体。
本发明的有益效果在于将中药提取物免疫佐剂和微生物免疫佐剂相结合，实现优势互补，利用胞壁酰三肽易于被巨噬细胞捕获的功能，同时发挥甘草皂苷增强巨噬细胞吞噬的功能，进而促进细胞因子的产生。不仅有效的提高疫苗的细胞免疫效果，还显著的增强疫苗的体液免疫效果。
附图说明
图1为甘草皂苷脂质体免疫佐剂对抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。
图2为豚鼠的细小病毒疫苗抗体滴度。
图3为后备母猪的细小病毒疫苗抗体滴度。
图4为不同佐剂的传染性支气管炎病毒灭活苗接种鸡血清中抗体滴度。
具体实施方式
实施例1：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30g、胆固醇10g、丁基化羟基甲苯2.4g、硬脂胺1.2g、磷脂酸1.2g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂的制备方法，其特征在于：具有以下步骤：
步骤1）将大豆卵磷脂、胆固醇按3:1的比例混合均匀后得到混合液1，再将丁基化羟基甲苯、硬脂胺、磷脂酸按2:1:1的比例混合均匀得到混合液2，将混合液2倒入混合液1中得到混合液3；
步骤2）将步骤1）得到的混合液3溶于有机溶剂乙醚中，得到混合液4，用注射器将混合液4缓慢注入加热至50-55℃的PBS内，得到混合液5；
步骤3）采用恒温磁力搅拌器不断搅拌混合液5，直至有机溶剂乙醚挥发干净，得到大的多孔脂质体；
步骤4）将步骤3）所得的多空脂质体的混悬液过高压均质机3次，得到大单室脂质体；
步骤5）将步骤4）得到的大单室脂质体与甘草皂苷、胞壁酰三肽按4:1:1的比例混合，混合均匀后得到药液1；
步骤6）将步骤5）得到的药液1快速冷冻，形成冰晶的片层和破碎的膜同时存在的状态，在室温状态下缓慢融化，连续冻融3次，使脂膜之间不断重新融合，伴随着甘草皂苷和胞壁酰三肽在脂质体间的渗透和包被，形成均一的小单室脂质体，即为所述的甘草皂苷脂质体。
脂质体佐剂制备工艺研究：
1、脂质体膜材料的选择
脂质体属颗粒复合物，由两种类型的脂质分子组成，即卵磷脂和胆固醇，天然的卵磷脂来自蛋黄和大豆，它们是形成细胞膜的主要磷脂成分，也是制备脂质体的主要原料。胆固醇可通过与脂质双分子层的相互作用降低脂质体的通透性和流动性，增加其稳定性，从而减少被包物质渗漏。因此，本发明选择大豆卵磷脂和胆固醇作为脂质体的主要膜材料。
另外，为提高脂质体的抗氧化率和药物包封率，选择加入丁基化羟基甲苯、硬脂胺和磷脂酸。丁基化羟基甲苯是一有效的抗氧化剂，磷脂分子中都含有不饱和的酰基链，是其过氧化降解的薄弱环节，加入丁基化羟基甲苯，可抑制磷脂双分子层的氧化。在双分子层中加入硬脂胺和磷脂酸分别使膜带正、负电荷，因带电后引起脂质体球相互排斥，提高了脂质体的包封率。
本发明将大豆卵磷脂和胆固醇分别按照3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1的比例混合，制备双分子层脂质体然后用显微镜和激光粒度分布仪检测脂质体的形态，确定最佳的混合比例。
本发明将丁基化羟基甲苯、硬脂胺和磷脂酸分别按照1：1：1、2：1：1、3：1：1、4：1：1、5：1：1的比例混合后，加入到脂质双分子层中，经注入法及过高压均质机后，制得大单室脂质体，将得到的脂质体在强光（4500lx）条件下放置2、4、6、12、24h，观察脂质体的外观、形态及粒径，确定最佳比例。
2、脂质体芯材的选择
本发明选择的脂质体芯材为甘草皂苷和胞壁酰三肽，将两种芯材按照1：1的比例混合均匀后，使脂质体的膜材和芯材分别按照4：1、6：1、8：1、10：1、12：1、14：1的比例，将芯材缓慢加入到脂质体膜中，经冻融法，制备小单室脂质体，并检测其粒径和药物包封率。
3、考察冻融次数对脂质体的影响
冻融法制备脂质体的过程中，冻融的次数对脂质体的粒径及包封率有很大的影响，本发明在脂质体制备的过程中，分别冻融1、2、3、4、5次，观察不同冻融次数对脂质体包封率的影响，确定最佳冻融次数。
4、脂质体佐剂制备工艺研究结果
（1）脂质体膜材料的选择结果
当大豆卵磷脂和胆固醇的比例为3：1时，观察到脂质体外观呈圆形或椭圆形，脂质体形态较为规则；脂质体的粒径为34.6μm。而按照2：1：1的比例加入丁基化羟基甲苯、硬脂胺和磷脂酸后，在强光下放置24h后，对脂质体的外观影响较小，粒径为36.1μm。
（2）脂质体芯材的选择结果
当脂质体的膜材与芯材的比例为4：1时，得到的小单室脂质体粒径最小，为0.86μm；包封率最高，为86.6%。
（3）冻融次数对脂质体的影响
经不同的冻融次数后发现，冻融3次后，脂质体的包封效果最好，包封率为89.4%。冻融次数少于3时，脂质体包封效果较差，渗漏较多甘草皂苷和胞壁酰三肽，冻融次数多于3时，对包封率均为85%左右，变化不明显，故选择冻融3次。
实验1、长期毒性试验
将健康大鼠80只，雌雄各半，体重200-200g，每组20只；甘草皂苷脂质体肌肉注射LD50的4份剂量组分别为580-430mg/kg，设三个剂量组为高剂量组120 mg/kg、中剂量组80mg/kg、低剂量组40 mg/kg和一个生理盐水对照组，分别为0.05-0.15 mg/kg体重肌肉注射给药，对照组0.15 mg/kg体重肌肉注射给药，连续30天；观察并记录动物的中毒表现及死亡情况，死亡动物观察主要器官的中毒性病变，存活动物继续饲养观察一周。
实验结果：每天观察动物的基本情况，记录进食量，每周称体重，调整给药量。结果显示：所有动物没有死亡，而动物进食量和体重随剂量的增加而下降，每组抽取4只对脑、心、脾、肺、肾、卵巢、睾丸、胸腺、肾上腺、胃肠、淋巴结、脑垂体等脏器进行病理组织学检查，发现高剂量组的部分脏器出现异变，出现病灶，其余各组未见异常。
实验2：甘草皂苷脂质体佐剂对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
1、试验动物分组及处理
将体重为20g左右的昆明小鼠随机分为3组，分别为空白对照组、环磷酰胺对照组、佐剂组，每组12只，记录小鼠试验前体重。佐剂组每只小鼠腹腔注射0.2ml甘草皂苷脂质体佐剂，环磷酰胺对照组每只小鼠腹腔注射0.2ml环磷酰胺，空白对照组不注射任何试剂。
2、脾淋巴细胞增殖试验
在给药后的第7天，称重并剖杀试验鼠，用75%酒精浸泡3~5分钟消毒后，无菌条件取出小鼠脾脏，提取并纯化脾淋巴细胞，将纯化后的脾淋巴细胞在37℃ 5%CO2培养箱中培养48h后，加入20μl CCK8溶液，继续培养2h后酶标仪测OD值计算增殖结果，结果如图1。
结果显示，佐剂组的OD值极显著高于环磷酰胺对照组及空白组，说明甘草皂苷脂质体佐剂可明显刺激免疫抑制的小鼠脾淋巴细胞增殖。脾脏作为机体最大的外周淋巴组织器官，是T、B淋巴细胞定居的场所，也是产生免疫应答的重要部位，在天然免疫和适应性免疫反应中均有重要作用。这也证明甘草皂苷脂质体佐剂具有免疫促进作用。
实验3：猪细小病毒甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗的制备及免疫效果
1、猪细小病毒甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗的制备
将步骤4）所得的空白大单室脂质体、甘草皂苷、胞壁酰三肽及灭活的猪细小病毒按照4：1：1：1的比例混合均匀，快速冷冻，再缓慢融化，连续冻融3次后，制得猪细小病毒甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗。
2、试验免疫效果
1）豚鼠的细小病毒抗体滴度试验
将体重在350g以上的豚鼠分为2组，一组为空白组，一组为免疫组，每组6只，免疫组每只腿部肌肉注射0.5ml猪细小病毒甘草皂苷脂质体灭活苗，空白组注射0.5ml生理盐水。于免疫后的7、14、21、28天采血，分离血清，测定HI抗体效价。
2）后备母猪的细小病毒抗体滴度试验
选择6月龄的细小病毒抗体阴性青年后备母猪12头，分为空白组和免疫组2组，于配种前一个月进行疫苗免疫，疫苗组颈部肌肉注射猪细小病毒甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗2ml，空白组不做处理，14天后加强免疫一次。于免疫后的7、14、21、28、35、42、49、56天采血，分离血清，测定HI抗体效价。
3、试验结果
如图2所示，免疫组豚鼠在免疫后的7到28天，细小病毒抗体呈不断的上升趋势，在第七天时HI检测平均抗体水平达到96，在28天，抗体滴度达到1280，而空白组的细小病毒抗体滴度仅为0。
如图3所示，免疫组后备母猪不同时间段的细小病毒平均HI抗体滴度分别为96、341.3、682.7、1365.3，说明猪接种细小病毒甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗后，可快速产生相应的抗体，并且抗体滴度高，维持时间长。
实验4：鸡传染性支气管炎甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗的制备及免疫效果
1、鸡传染性支气管炎甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗的制备
将步骤4）所得的空白大单室脂质体、甘草皂苷、胞壁酰三肽及灭活的鸡传染性支气管炎病毒按照4：1：1：1的比例混合均匀，快速冷冻，再缓慢融化，连续冻融3次后，通过冻融法制得鸡传染性支气管炎病毒甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗。
2、鸡传染性支气管炎甘草皂苷脂质体佐剂灭活苗免疫效果
取传染性支气管炎病毒非免疫鸡60只，随机分为2组，分别为甘草皂苷脂质体佐剂组和白油佐剂组，自由采食饮水，在21日龄时，甘草皂苷脂质体佐剂组和白油佐剂组分别肌肉注射疫苗0.5ml/只，空白组不做任何处理，分别在7、14、21、28、35、42、49、56、64天时翅静脉采血，分离血清，HI法检测接种鸡血清中的抗体效价。
3、试验免疫效果
如图4所示，以甘草皂苷脂质体为佐剂的鸡传染性支气管炎病毒灭活苗接种鸡血清中的抗体滴度明显较高，并且抗体下降慢，抗体维持时间长；而以白油为佐剂的鸡传染性支气管炎病毒灭活苗抗体产生慢，并且抗体滴度较低，抗体下降比较快。
以下实施例中甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法与实施例1相同，不再赘述。
实施例2：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂10g、胆固醇3g、丁基化羟基甲苯1g、硬脂胺0.1g、磷脂酸0.1g、甘草皂苷0.5g、胞壁酰三肽0.5g。
实施例3：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂45g、胆固醇15g、丁基化羟基甲苯4g、硬脂胺2.5g、磷脂酸1.5g、甘草皂苷1.8g、胞壁酰三肽1.8g。
实施例4：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂12g、胆固醇4g、丁基化羟基甲苯1g、硬脂胺0.1g、磷脂酸0.1g、甘草皂苷0.5g、胞壁酰三肽0.5g。
实施例5：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂15g、胆固醇5g、丁基化羟基甲苯1g、硬脂胺0.1g、磷脂酸0.1g、甘草皂苷0.5g、胞壁酰三肽0.5g。
实施例6：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂18g、胆固醇6g、丁基化羟基甲苯1g、硬脂胺0.1g、磷脂酸0.1g、甘草皂苷0.5g、胞壁酰三肽0.5g。
实施例7：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂21g、胆固醇7g、丁基化羟基甲苯1g、硬脂胺0.1g、磷脂酸0.1g、甘草皂苷0.5g、胞壁酰三肽0.5g。
实施例8：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂24g、胆固醇8g、丁基化羟基甲苯1g、硬脂胺0.1g、磷脂酸0.1g、甘草皂苷0.5g、胞壁酰三肽0.5g。
实施例9：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂27g、胆固醇9g、丁基化羟基甲苯1g、硬脂胺0.1g、磷脂酸0.1g、甘草皂苷0.5g、胞壁酰三肽0.5g。
实施例10：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30g、胆固醇10g、丁基化羟基甲苯1g、硬脂胺0.1g、磷脂酸0.1g、甘草皂苷0.5g、胞壁酰三肽0.5g。
实施例11：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30g、胆固醇10g、丁基化羟基甲苯4g、硬脂胺2.5g、磷脂酸1.5g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例12：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂33g、胆固醇11g、丁基化羟基甲苯4g、硬脂胺2.5g、磷脂酸1.5g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例13：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂36g、胆固醇12g、丁基化羟基甲苯4g、硬脂胺2.5g、磷脂酸1.5g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例14：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂39g、胆固醇13g、丁基化羟基甲苯4g、硬脂胺2.5g、磷脂酸1.5g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例15：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂42g、胆固醇14g、丁基化羟基甲苯4g、硬脂胺2.5g、磷脂酸1.5g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例16：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30g、胆固醇10g、丁基化羟基甲苯2.2g、硬脂胺1.1g、磷脂酸1.1g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例17：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30g、胆固醇10g、丁基化羟基甲苯2g、硬脂胺1g、磷脂酸1g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例18：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30g、胆固醇10g、丁基化羟基甲苯1.8g、硬脂胺0.9g、磷脂酸0.9g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例19：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30g、胆固醇10g、丁基化羟基甲苯1.6g、硬脂胺0.8g、磷脂酸0.8g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
实施例20：一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30g、胆固醇10g、丁基化羟基甲苯1.4g、硬脂胺0.7g、磷脂酸0.7g、甘草皂苷1g、胞壁酰三肽1g。
Claims (1)
1.一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂，其特征在于：包括以下重量份数的原料组成：大豆卵磷脂30份、胆固醇10份、丁基化羟基甲苯2.4份、硬脂胺1.2份、磷脂酸1.2份、甘草皂苷1份、胞壁酰三肽1份；
所述甘草皂苷脂质体免疫佐剂的制备方法，具有以下步骤：
步骤1）将大豆卵磷脂、胆固醇按3:1的比例混合均匀后得到混合液1，再将丁基化羟基甲苯、硬脂胺、磷脂酸按2:1:1的比例混合均匀得到混合液2，将混合液2倒入混合液1中得到混合液3；
步骤2）将步骤1）得到的混合液3溶于有机溶剂乙醚中，得到混合液4，用注射器将混合液4缓慢注入加热至50-55℃的PBS内，得到混合液5；
步骤3）采用恒温磁力搅拌器不断搅拌混合液5，直至有机溶剂乙醚挥发干净，得到大的多孔脂质体；
步骤4）将步骤3）所得的多孔脂质体的混悬液过高压均质机3次，得到大单室脂质体；
步骤5）将步骤4）得到的大单室脂质体与甘草皂苷、胞壁酰三肽按4:1:1的比例混合，混合均匀后得到药液1；
步骤6）将步骤5）得到的药液1快速冷冻，形成冰晶的片层和破碎的膜同时存在的状态，在室温状态下缓慢融化，连续冻融3次，使脂膜之间不断重新融合，伴随着甘草皂苷和胞壁酰三肽在脂质体间的渗透和包被，形成均一的小单室脂质体，即为所述的甘草皂苷脂质体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710438062.4A CN107375921B (zh) | 2017-06-12 | 2017-06-12 | 一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710438062.4A CN107375921B (zh) | 2017-06-12 | 2017-06-12 | 一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107375921A CN107375921A (zh) | 2017-11-24 |
| CN107375921B true CN107375921B (zh) | 2019-10-29 |
Family
ID=60333318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710438062.4A Active CN107375921B (zh) | 2017-06-12 | 2017-06-12 | 一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107375921B (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1136918A (zh) * | 1995-03-16 | 1996-12-04 | 株式会社Lg化学 | 一次注射疫苗的配制品 |
| CN1182370A (zh) * | 1995-04-25 | 1998-05-20 | 史密斯克莱·比奇曼生物公司 | 含有皂苷和固醇的疫苗 |
| CN1301572A (zh) * | 1999-10-28 | 2001-07-04 | 上海生物制品研究所 | 用于疫苗的佐剂组合物 |
| CN1364644A (zh) * | 2002-02-05 | 2002-08-21 | 北京多米诺医药研究所 | 免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗及其制备方法 |
| CN1543974A (zh) * | 2003-11-19 | 2004-11-10 | 复旦大学 | 三七总皂苷脂质体及其制备方法 |
| CN101440116A (zh) * | 2008-09-25 | 2009-05-27 | 杭州市第六人民医院 | 甘草皂苷及其制备方法和应用 |
| CN102647977A (zh) * | 2009-10-08 | 2012-08-22 | 阿祖瑞博有限公司 | 经皮注射针形式的药物和疫苗的配制剂 |
| CN103417479A (zh) * | 2012-05-16 | 2013-12-04 | 吉林大学 | 一种人参皂苷Rg3脂质体及其制备方法 |
| CN104288759A (zh) * | 2013-07-16 | 2015-01-21 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种禽流感疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN104524563A (zh) * | 2014-12-12 | 2015-04-22 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 疫苗组合物及其制备方法和应用 |
-
2017
- 2017-06-12 CN CN201710438062.4A patent/CN107375921B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1136918A (zh) * | 1995-03-16 | 1996-12-04 | 株式会社Lg化学 | 一次注射疫苗的配制品 |
| CN1182370A (zh) * | 1995-04-25 | 1998-05-20 | 史密斯克莱·比奇曼生物公司 | 含有皂苷和固醇的疫苗 |
| CN1301572A (zh) * | 1999-10-28 | 2001-07-04 | 上海生物制品研究所 | 用于疫苗的佐剂组合物 |
| CN1364644A (zh) * | 2002-02-05 | 2002-08-21 | 北京多米诺医药研究所 | 免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗及其制备方法 |
| CN1543974A (zh) * | 2003-11-19 | 2004-11-10 | 复旦大学 | 三七总皂苷脂质体及其制备方法 |
| CN101440116A (zh) * | 2008-09-25 | 2009-05-27 | 杭州市第六人民医院 | 甘草皂苷及其制备方法和应用 |
| CN102647977A (zh) * | 2009-10-08 | 2012-08-22 | 阿祖瑞博有限公司 | 经皮注射针形式的药物和疫苗的配制剂 |
| CN103417479A (zh) * | 2012-05-16 | 2013-12-04 | 吉林大学 | 一种人参皂苷Rg3脂质体及其制备方法 |
| CN104288759A (zh) * | 2013-07-16 | 2015-01-21 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种禽流感疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN104524563A (zh) * | 2014-12-12 | 2015-04-22 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 疫苗组合物及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 免疫修饰剂的研究进展;王文成;《畜牧兽医科技信息》;20030225;第19卷(第2期);第10-13页 * |
| 我国中草药等免疫佐剂的研究现状;胡莉萍;《山东畜牧兽医》;20150228;第36卷(第2期);第62-63页 * |
| 新型免疫佐剂研究进展;赵思俊 等;《中国动物检疫》;20160720;第33卷(第7期);第58页左栏第1段至第59页右栏第2段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107375921A (zh) | 2017-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Aucouturier et al. | Adjuvants designed for veterinary and human vaccines | |
| Rivera et al. | Ginseng and aluminium hydroxide act synergistically as vaccine adjuvants | |
| US5688772A (en) | Quinoa saponin compositions and methods of use | |
| CN104487084B (zh) | OspA的突变片段以及其相关方法和用途 | |
| Siles-Lucas et al. | Cestode parasites: application of in vivo and in vitro models for studies on the host-parasite relationship | |
| TW201014601A (en) | Novel adjuvant compositions | |
| CN111212846A (zh) | 三萜皂苷类似物 | |
| CN102782123B (zh) | 用于抑制肿瘤细胞增殖的改进的组合物 | |
| Chen et al. | The immune-adjuvant activity and the mechanism of resveratrol on pseudorabies virus vaccine in a mouse model | |
| BRPI0811796A2 (pt) | Uso de um monomicolil glicerol (mmg) ou de homólogos ou análogos sintéticos e versões modificadas, adjuvante ou imunomodulador, homólogo ou análogo de mmg sintético ou uma versão modificada, vacina e sistema de aplicação | |
| CN109134613B (zh) | 一种促进疫苗免疫反应的法氏囊七肽及其应用 | |
| JP2019108328A (ja) | 免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む新規のワクチン組成物 | |
| Liang et al. | Effects of Taishan Robinia pseudoacacia Polysaccharides on immune function in chickens | |
| CN107375921B (zh) | 一种甘草皂苷脂质体免疫佐剂及其制备方法 | |
| AU769390B2 (en) | Vaccine composition | |
| CN104402971A (zh) | 一种具有免疫调节作用的多肽 | |
| WO1990003183A1 (en) | Immunotherapy vaccine for melanoma tumors | |
| CN109260214A (zh) | 芍药苷类化合物在制备治疗脓毒症药物中的应用 | |
| KR950010320B1 (ko) | 비-주사 투여용 네오카르지노스타틴 유도체 조성물 | |
| AU781316B2 (en) | Vaccine preparation containing fatty acid as a constituent | |
| Feng et al. | Enhancement of the immune responses to ovalbumin in mice by oral administration of the extract from Radix Cyathulae (RC) | |
| AU764052B2 (en) | Saponin-containing vaccine preparation | |
| CN109876140A (zh) | 一种治疗慢性乙肝的疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN109394750A (zh) | 羟基红花黄色素a在制备治疗脓毒症药物中的应用 | |
| CN107714648A (zh) | 一种免疫原和抗体的复合疫苗及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A glycyrrhizin liposome immune adjuvant and its preparation method Effective date of registration: 20201009 Granted publication date: 20191029 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2020980006651 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20211011 Granted publication date: 20191029 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2020980006651 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Licorice saponin liposome immune adjuvant and its preparation method Effective date of registration: 20211013 Granted publication date: 20191029 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2021980010624 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220915 Granted publication date: 20191029 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2021980010624 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A kind of glycyrrhizin liposome immune adjuvant and preparation method thereof Effective date of registration: 20220916 Granted publication date: 20191029 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2022980015417 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230918 Granted publication date: 20191029 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2022980015417 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A licorice saponin liposome immune adjuvant and its preparation method Effective date of registration: 20230921 Granted publication date: 20191029 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Zhecheng branch Pledgor: SHANGQIU MEILAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2023980057629 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |