BRPI0811796A2 - Uso de um monomicolil glicerol (mmg) ou de homólogos ou análogos sintéticos e versões modificadas, adjuvante ou imunomodulador, homólogo ou análogo de mmg sintético ou uma versão modificada, vacina e sistema de aplicação - Google Patents

Abstract

aqui nós identificamos mmg e seus ácidos derivados alfa e ceto-cetomicolicos como lipidios altamente bioativos derivados de m.bovis bcg (copenhagen) capazes de estimular a ativar dcs humanas em doses extremamente baixas. além de seu papel direto como imunoestimuladores de dcs humanas, demostramos seu uso no desenvolvimento de uma nova geração de adjuvantes adequados para administração em humanos. nos ainda identificamos um numero de mmg analogos sinteticos altamente ativos com grande potencial para o tratamento do câncer, e apra adjuvantes de vacinas contra tanto doenças infecciosas como transtornos do tipo doença de alzheimers.

Description

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	USO	DE UM MONOMICOLIL GLICEROL	(MMG) OU	DE
HOMÓLOGOS	OU	ANÁLOGOS SINTÉTICOS E VERSÕES	MODIFICADAS,
ADJUVANTE	OU	IMUNOMODULADOR, HOMÓLOGO OU ANÁLOGO DE	MMG
SINTÉTICO	OU	UMA VERSÃO MODIFICADA, VACINA	E SISTEMA	DE
APLICAÇÃO
		Campo da invenção
	A	presente invenção descreve a	utilização	do

monomicolil glicerol (MMG), uma versão homóloga, análoga ou modificada sintética do mesmo para preparar um imunomodulador, um adjuvante, o adjuvante e uma vacina ou um sistema de aplicação que compreende este adjuvante. Fundamentos gerais

As primeiras vacinas consistiam em patógenos vivos, atenuados. As formas atenuadas eram organismos intimamente 15 relacionados naturais ou obtidos através de passagens em série na cultura. Por exemplo, a tuberculose (TB) no homem por muitos anos foi combatida pela vacinação com uma cepa atenuada de Mycobacterium bovis - a vacina BCG de M. bovis desenvolvida há mais de 80 anos. No entanto, embora mais de 3 20 bilhões de doses do BCG sejam administradas (mais do que qualquer outra vacina), as mesmas nem sempre oferecem uma resistência satisfatória à TB humana em toda a população.

Atualmente, uma abordagem mais moderna utiliza substâncias altamente purificadas, por exemplo, proteínas ou 25 peptídeos purificados recombinantes. Estas vacinas são bem definidas e as reações colaterais são minimizadas.

Infelizmente, muitas substâncias altamente purificadas não são muito imunogênicas e não induzem uma imunoresposta suficiente para conferir proteção. Para fazer isto, o 30 antígeno necessita da ajuda dos agentes potencializadores de imunoresposta chamados de adjuvantes. Dependendo do patógeno, a proteção pode requerer que uma resposta humoral ou mediada por células predomine. Uma reação imunológica que pode ser

2/43 transferida com soro imune é denominada imunidade humoral e refere-se à resistência que é mediada pelos anticorpos que se ligam ao material antigênico associado com um agente infeccioso e provoca desse modo uma imunoresposta contra ele. A imunidade mediada por células (CMI) conta com as células do sistema imune que armam uma imunoresposta. Uma imunoresposta de CMI ou T assistente (Th)1 é geralmente associada com o combate dos patógenos intracelulares, incluindo a leishmaniose e a tuberculose, mas também tem um papel no combate de outros tipos de infecção, por exemplo, a infecção pela levedura Candida. Uma imunoresposta humoral ou Th2é requerida para a defesa contra patógenos extracelulares, por exemplo, infecções por helmintos.

Em uma série de casos, por exemplo, Influenza, Hepatite C (HCV), Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), Clamídia e Malária, dependendo do estágio da infecção, uma resposta Thl/Th2 misturada pode ser requerida (Mosmann e Sad 1996). Estes requerem Thl e Th2 porque partes de seu ciclo de vida são intracelulares, mas também passam por fases extracelulares, por exemplo, transmissão entre células.

O desenvolvimento de um tipo específico de imunoresposta (humoral ou mediada por células) pode ser determinado pela escolha do adjuvante. Por exemplo, a imunidade protetora contra patógenos intracelulares como a M. tuberculosis requer uma imunoresposta mediada por células e um adjuvante apropriado para uma vacina de subunidade dirigida contra a TB deve intensificar uma resposta Thl (Lindblad et al. 1997).

Há um grande número de adjuvantes, mas a maioria deles padece de numerosos problemas que impossibilitam a sua utilização em seres humanos. Somente alguns adjuvantes são aceitos para a utilização em humanos, por exemplo, os adjuvantes à base de alumínio (sais de A1OH) e MF-59, mas

3/43 ambos induzem respostas com tendências a Th2, que os tornam inadequados para uma vacina contra a TB e outras vacinas que requerem uma resposta de Thl (Lindblad et al. 1997).

Durante os últimos vinte a trinta anos, uma série de novos sistemas adjuvantes foi identificada e alguns deles estão atualmente em desenvolvimento. Apesar disso, a necessidade de novos sistemas adjuvantes ainda é reconhecida (Moingeon et al. 2001) e é evidente pela escassez de escolhas disponíveis para a utilização clínica.

Um adjuvante (do latim adjuvare, ajudar) pode ser definido como qualquer substância que, quando administrada na vacina serve para direcionar, acelerar, prolongar e/ou intensificar a imunoresposta específica. Os adjuvantes foram divididos em duas categorias principais dos sistemas de aplicação ou imunomoduladores/imunoestimuladores. O sistema de aplicação pode, por exemplo, ser emulsões, partículas de poliestireno, niossomos, ISCOMS, virossomos, microesferas ou lipossomos similares a tensoativos, que são vesículas compostas de duas camadas de lipídio. Os lipossomos agem como carregadores do antígeno (dentro das vesículas ou unidos à superfície) e podem formar um depósito no sítio de inoculação permitindo a liberação lenta e contínua do antígeno. Durante algum tempo após a injeção e a fagocitose, a apresentação lipossomal garante que uma quantidade específica do antígeno se torne disponível para a classifícaçao das células de apresentação do antígeno (Gluck 1995) . Os imunomoduladores alvejam células ou receptores distintos, por exemplo, receptores toll-like na superfície das APCs. Os sistemas de aplicação e os imunomoduladores podem ser utilizados conjuntamente, por exemplo, como na série Glaxo de adjuvantes. Portanto, além de aplicar o sistema de aplicação do antígeno com a vacina também pode ser utilizado para aplicar os imunomoduladores. Além de ser um componente em uma

4/43 vacina, os imunomoduladores podem ser administrados sem o antígeno. Por esta abordagem é possível ativar localmente o sistema imune, por exemplo, visto como a maturaçao das células de apresentação do antígeno, a produção de citocina, que é importante para a atividade antitumor e anti-viral. Desse modo, a administração dos imunomoduladores pode, por exemplo, suportar a erradicação de do câncer e de doenças da pele. Os exemplos de imunomoduladores que podem ser administrados localmente são os Taxanes, por exemplo, Taxol, o ligando 7/8 do receptor Resiquimod parecido com toll, Imiquimod, Gardiquimod.

Brometo, cloreto, fosfato e acetato de dimetildioctadecilamônio ou outros sais orgânicos ou inorgânicos (DDA) são um composto de amônio quaternário lipofílico, que forma lipossomos catiônicos em soluções aquosas a temperaturas acima de 4 0 °C. O DDA é um sistema de aplicação muito eficiente que intensifica a captação do antígeno vacinai nas APCs. As combinações de DDA e de agentes imunomoduladores foram descritas. A administração de Arquad 2HT, que compreende o DDA, em seres humanos, foi promissora e não induziu a efeitos colaterais evidentes (Stanfield, 1973). A combinação de DDA e de TDB ou de DDA e de MPL mostrou uma sinergia muito clara entre o veículo de aplicação (DDA) e o imunomodulador (TDB ou MPL) com níveis de resposta à CMI altamente elevados comparados à resposta obtida com um ou outro componente sozinho. O DDA é, portanto, um veículo de aplicação promissor para o antígeno vacinai e um imunomodulador, por exemplo, no desenvolvimento de um sistema adjuvante para uma vacina contra a TB e outros patógenos intracelulares.

Vários compostos de micobacterias foram relatados por ser imunomoduladores. Quando os lipídios extraídos do BCG de M. bovis foram utilizados como um adjuvante, uma resposta

5/43 do teste da pele à ovalbumina foi obtida em porquinhos-daindia (Hiu 1975). Os lipossomos formados em temperaturas elevadas a partir dos lipídios polares totais do BCG de M. bovis podem gerar uma resposta humoral à ovalbumina e uma vacina preparada a partir destes lipídios polares conferiu proteção em camundongos quando do estimulo com células de tumor (Pedido de Patente WO 03/011336). 0 efeito dos lipídios totais de H3 7Rv de M. tuberculosis como o antígeno em uma vacina experimental contra a TB em porquinhos-da-índia foi investigado (Dascher et al. 2003) . Neste estudo, os lipossomos com base no colesterol e 1,2-distearoil-snglicero-3 -fosfocolina (DSPC) foram misturados com um extrato total de lipídios de H37Rv de M. tuberculosis. Após a remoção do solvente, os lipídios foram reconstituídos com dimetildioctadecilamônio (DDA) como um adjuvante em tampão de PBS. Os porquinhos-da-índia imunizados com esta vacina nao mostraram uma redução significativa nas bactérias, sugerindo que esta formulação de lipossomos misturados com DDA não tem um antígeno forte ou que a formulação de lipídios micobacterianos com Colesterol:DSPC impede o efeito adjuvante do DDA. Alternativamente, à medida que uma mistura de vários lipídios é administrada, os lipídios eficazes podem constituir uma proporção muito limitada de lipídios totais.

Vários componentes purificados das micobactérias também foram investigados quanto ã sua atividade adjuvante. 0 derivado de proteína purificada (PPD) não induziu uma reação de hipersensibilidade do tipo atrasada em si, mas quando Wax D (um complexo de ácido micólico e fragmento de arabinogalactana e peptidoglicana da parede celular micobacteriana) foi adicionada como um adjuvante, uma forte reação foi observada (Yamazaki S 1969). 0 imunomodulador SSM ou Z-100, uma arabinomanana de lipídio extraída de M. tuberculosis, tem atividade antitumor (Suzuki F 1986). Outro

6/43 composto derivado de células micobacterianas é a trealose 6,6¹-dimicolato (TDM) (fator do cordão; um ácido micólico que contém glicolipídio) (Saito et al, 1976) . Além disso, o TDM (ou análogos sintéticos) tem efeitos imunoestimulatórios e foram incluídos em várias formulações adjuvantes (McBride et al. 1998) (Koike et al, 1998).

Em um documento da autoria de Silva et al, (1985), cinco componentes purificados do BCG de Mycobacterium bovis de fra foram injetados intravenosamente como partículas de carvão vegetal revestidas por lipídio e causaram o surgimento de uma reação inflamatória nos pulmões dos camundongos. Os cinco componentes incluíram o TDM, o monomicolato de trealose (MMT), monomicolato de glicose (MMGIc), monomicolato de arabinose (MMAr) e um monomicolato de glicerol (MMGlic). O papel descreve o grupo principal do monomicolilglicerol, ao passo que a composição dos ácidos micolidicos e mal definida e nenhum dado estrutural é fornecido. Além disso, a reação quando da administração de lipídios é descrita somente como uma atividade inflamatória nos pulmões, ao passo que a capacidade de intensificar uma imunoresposta específica conhecida como um efeito adjuvante não é descrita,

Embora a atividade imunoestimulatória e inflamatória dos lipídios derivados de micobactérias tenha sido reconhecida por muitas décadas com uma literatura de expansão dos lipídios capazes de estimular imunorespostass em modelos animais (murinos), até hoje lipídios individuais com a capacidade de estimular células dendriticas humanas (DCs) não foram identificados. Por exemplo; embora o TDM tenha mostrado ser o lipídio micobacteriano mais ativo em termos de respostas pró-inflamatórias, nenhuma ativação de células dendríticas quando da estimulação com TDM foi observada (Uehori et al, 2003) . Assim, embora o TDM mostre atividade inflamatória em diversos documentos, este lipídio

7/43 aparentemente não tem a capacidade de ativar as células dendríticas que são essenciais para iniciar uma imunoresposta. A identificação de tal lipídio com a capacidade de ativar células dendríticas humanas deve sugerir que poderia ser utilizada como parte de um novo sistema adjuvante que seria apropriado para a utilização em seres humanos. Além disso, a falta de adjuvantes indutores de Thl apropriados para a utilização humana torna a identificação de um lipídio derivado de micobactéria único com potencialidade promotora de Thl uma descoberta significativa.

As DCs são células de apresentação do antígeno profissionais (APC) que desempenham um papel essencial no direcionamento da imunoresposta quando da infecção por patógenos, tais como a M. tuberculosis. Desse modo, a produção de IL-12 pelas Des ativadas representa uma etapa vital no controle da infecção da M. tuberculosis uma vez que é esta citocina que é de importância vital na condução da produção de IFN-γ pelas células Th-1, que promovem a ativação dos macrófagos (Nathan et al. 1983). Além disso, nos últimos anos, evidências foram descobertas, as quais indicam que as micobactérias também alvejam as DCs em uma tentativa de modular a imunoresposta e um papel crucial para os lipídios micobacterianos neste processo foi estabelecido.

Até 40% do peso a seco do envelope das células de micobactérias é compreendido de lipídios (Minnikin 1982). Estes lipídios foram associados com a patogenicidade distintiva desta família de organismos e sao conhecidos por muito tempo por desempenhar um papel substancial na resposta do hospedeiro à infecção micobacteriana (Brennan e Goren, 1979). Dentre estes lipídios, são relevantes as cepas de dimicocerosato de ftiocerol (PDIM) (Minnikin et al. 2002) , cuja presença se mostrou correlacionada com a patogenicidade; os mutantes de M. tuberculosis deficientes em PDIM mostram um

8/43 crescimento atenuado nos camundongos (Sirakova et al. 2003). Os também chamados de glicolipídios fenólicos estão intimamente relacionados aos PDIMs (PGLs), e bom exemplo dos mesmos inclui os dimicocerosatos de fenolftiocerol 2metilramnosil (micosídeo B) encontrados em Mycobacterium bovis. Uma ligação entre este PGL de monoglicosila e a hipervirulência de determinados isolados da M. tuberculosis foi demonstrada recentemente (Reed et al. 2004).

Outra classe de lipídio de interesse particular são os trealose-6,6“dimicolatos (TDM), os chamados fatores de cordão, O TDM promove a manutenção de lesões granulomatosas ao estimular a liberação de citocinas pró-inflamatórias, tais como o IFN-γ de citocina promotor de TNF-α, IL-6 e IL-12 e Th-1 (Lima et al. 2001) e tem um papel no prolongamento da sobrevivência da M. tuberculosis dentro dos macrófagos ao inibir a fusão fagossomo-lisossomo (Indrigo et al. 2002) . A estrutura fina dos componentes do micolato de TDM é importante na ativação pró-inflamatória dos macrófagos no início da infecção (Rao et al, 2005) .

Apesar de seu papel na intensificação da sobrevivência micobacteriana, os poderes imunomoduladores dos lipídios micobacterinaos também podem ser utilizados para criar uma nova geração de adjuvantes de indutores de Thl. Ao identificar lipídios individuais com atividade imunoestimulatória potente, pode ser possível evitar os problemas com a toxicidade associada com a utilização das células inteiras mortas pelo calor da M. tuberculosis misturadas com óleo - adjuvante completo da Freund (CFA) - ao manter a atividade adjuvante potente. Certamente, foi mostrado recentemente que os lipossomos formados dos lipídios polares do Bacillus-Calmette-Guerin (BCG) de M. bovis ativam as células dendríticas derivadas da medula óssea de murinos (Bm-DC). Foi verificado que a maior parte desta atividade é

9/43 atribuível ao lipídio de dimanosídeo de fosfatidilinositol de glicofosfolipídio (Sprott et al. 2004).

Os estudos recentes nos laboratórios caracterizaram a nova combinação adjuvante de um extrato do lipídio micobacteriano do BCG de M. bovis e o brometo de dimetiIdioctadecilamônio (DDA) que é capaz de promover uma imunoresposta complexa e sustentada, com um forte componente humoral, e mediada por células (Rosenkrands et al. 2005). Foi verificado que a maior parte da atividade adjuvante dos lipídios totais do BCG é atribuível aos lipídios apoiares.

Embora estes estudos tenham confirmado adicionalmente o potencial dos lipídios micobacterinaos de agir como adjuvantes, a solução mais favorável deve ser a identificação do lipídio único mais imunoestimulatório que, sozinho, tem uma atividade potente. Isto deve representar um adjuvante ainda mais simples e mais barato e também deve levantar a possibilidade de produzir análogos sintéticos do lipídio permitindo um sistema mais limpo que podería ser produzido em grandes quantidades requeridas de um adjuvante para a utilização nas vacinas que são administradas mundialmente.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção descreve um lipídio imunoestimulatório, monomicolil glicerol (MMG) e homólogos, análogos e versões modificadas sintéticas do mesmo, com capacidade de ativar as DCs humanas. O MMG é derivado da fração apoiar dos lipídios totais do BCG e é responsável pela indução do adjuvante e pelo efeito protetor associado com estes lipídios. O MMG sintético com uma cadeia principal de carbono menor tem a capacidade de intensificar as propriedades estimulantes do MMG natural em DCs humanas in vitro e também induz uma forte resposta Thl in vivo, que se traduz em uma imunoresposta protetora durável e longa contra

10/43 a TB no modelo de camundongo.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção descreve a utilização do monomicolil glicerol (MMG) ou de homólogos e análogos sintéticos e versões modificadas do mesmo para preparar um imunomodulador, um adjuvante e uma vacina ou um sistema de aplicação que compreende este adjuvante que tem uma capacidade exclusiva de estimular as células dendríticas humanas.

Como imunomoduladores, o MMG ou os homólogos, análogos e as versões modificadas sintéticas do mesmo serão administrados sem antígeno. Por meio desta abordagem, é possível ativar localmente o sistema imune, por exemplo, visto como a maturação de células de apresentação do antígeno, a produção de citocina que é importante para a atividade antitumor e anti-viral.

Um adjuvante (do latim adjuvare, ajudar) pode ser definido como qualquer substância que, quando administrada na vacina, serve para direcionar, acelerar, prolongar e/ou intensificar a imunoresposta específica. Dependendo da natureza do adjuvante, pode promover uma imunoresposta mediada por células, uma imunoresposta humoral ou uma mistura dos dois. Quando utilizado como um adjuvante vacinai, um componente antigênico é adicionado ao adjuvante. Uma vez que a intensificação da imunoresposta mediada por adjuvantes é não-específica, é bem compreendido no campo que o mesmo adjuvante pode ser utilizado com antígenos diferentes para promover respostas contra alvos diferentes, por exemplo, com um antígeno da M. tuberculosis para promover imunidade contra a M. tuberculosis ou com um antígeno derivado de um tumor, para promover imunidade contra tumores daquele tipo específico.

Um adjuvante preferido descrito pela invenção é um

11/43 adjuvante que compreende o MMG ou uma versão homóloga, análoga ou modificada sintética do mesmo que compreende adicionalmente um veículo de aplicação, por exemplo, emulsões, partículas de poliestireno, niossomos, ISCOMS, virossomos, microesferas ou lipossomos similares a tensoativo. Os tensoativos preferidos são lipídios com maior preferência catiônicos à base de brometo ou cloreto de dimetildioctadecilamônio (DDA-B ou DDA-C) ou em sal de sulfato, fosfato ou acetato do mesmo (DDA-X) ou em brometo ou cloreto de dimetildioctadecenilamônio (DODA-B ou DODA-C) ou no composto de sulfato, fosfato ou acetato do mesmo (DODA-X). Outros tipos de lipídios catiônicos preferidos utilizados na presente invenção incluem, mas sem ficar a eles limitados, 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP), 1,2dimiristoil-3-trimetilamônio-propano, 1,2-dipalmitoil-3trimetilamônio-propano, 1,2-distearoil-3-trimetilamôniopropano e dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP) e N-[1(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) , Outros tensoativos são escolhidos entre DXPC, DXPE, DXPG ou combinações dos mesmos, onde X é uma substituição para a descrição do comprimento da cadeia, por exemplo, P palmitoil (16C), S = estearoil (180), A = araquiidoil (200).

veículo de aplicação também pode ser utilizado para outros imunomoduladores tais como TLR e ligandos de nãoTLR como MPL (lipídio de monofosforil A), ácido policitidílico poliinosínico (poli-IC), dipeptídeo de muramila (MDP), zimosan, RNA de cordão duplo (dsRNA), DCChol, oligodeoxinucleotídeos de CpG, peptídeos catiônicos, TDM, TDB, tamoxifeno ou quaisquer análogos de quaisquer destas moléculas. Desse modo, um adjuvante preferido compreende o MMG ou uma versão homologa, analoga ou modificada do mesmo e compreende adicionalmente ligandos de TLR ou de não-TLR em um veículo de aplicação.

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Os sistemas de aplicação que compreendem o MMG ou homólogos e análogos sintéticos e versões modificadas do mesmo podem ser utilizados para o tratamento do câncer, um distúrbio autoimune, um distúrbio nervoso, por exemplo, Alzheimer, inflamação das vias aéreas, distúrbios inflamatórios, doença infecciosa, distúrbios da pele, alergia, asma ou uma doença causada por um patógeno. O MMG ou os homólogos e análogos sintéticos e as versões modificadas do mesmo são administrados em combinação com uma ou mais vacinas, antígenos, anticorpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleotídeos anti-sentido, agonistas de TLR e de não-TLR, antagonistas de TLR- e de nãoTLR, peptídeos, proteínas, vetores da terapia de genes, vacinas com DNA ou moléculas co-estimulatórias.

Um componente ou uma substância antigênica é uma molécula que reage com o anticorpo pré-formado e/ou com os receptores específicos nas células T e B. No contexto da vacinação, uma molécula que pode estimular o desenvolvimento de células específicas T ou B, conduzindo à formação de uma população de memória das células imunes que promoverão uma resposta da memória mais rápida se o antígeno for novamente encontrado pelas células imunes. Uma vez que as populações de memória são raramente clonais, na prática, isto significa que um antígeno é qualquer molécula ou coleção de moléculas que podem estimular um aumento nas imunorespostass quando são novamente encontradas pelas células imunes de um indivíduo que foi exposto previamente às mesmas.

A invenção descreve adicionalmente uma vacina para a administração parenteral, oral ou mucosal ou um sistema de aplicação que compreende o adjuvante. Uma vacina preferida compreende um epítopo antigênico de um patogeno intracelular, por exemplo, uma micobactéria virulenta (por exemplo, os produtos da fusão Ag85b_TB 10.4, Ag85b_ESAT-6_Rv2660,

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Ag85b_TB 10,4_Rv2660 e Ag85a_TB 10.4__Rv2660) , Plasmodium falciparum (Mspl, Msp2, Msp3, Amai, GLURP, LSAl, LSA3 ou CSP), Chlamydia trachomatis (por exemplo, CT184, CT521, CT443, CT520, CT521, CT375, CT583, CT603, CT610 ou CT681), HIV, influenza ou hepatite B ou C. O adjuvante ou o sistema de aplicação também pode ser utilizado nas vacinas para o tratamento do câncer, alergia ou doenças autoimunes.

Um extrato micobacteriano total do lipídio é uma mistura dos lipídios obtidos das micobactérias, por exemplo, BCG, M. microti, M, tuberculosis e M. vaccae, por um processo químico ou físico. No trabalho atual, o método utilizado para a extração é a ação de solventes orgânicos (tal como descrito abaixo), mas outras possibilidades, conhecidas pelos elementos versados na técnica são possíveis.

A fração do lipídio apoiar é definida como lipídios não-polares. A fração do lipídio apoiar é obtida pelo tratamento de micobactérias com uma mistura bifãsica de metanol/solução salina e de éter de petróleo. 0 extrato do éter de petróleo é composto de lipídios (não-polares) apoiares. Daqui por diante, a fração do lipídio polar é obtida pela adição de clorofórmio às micobactérias e â fase aquosa residual. O extrato de clorofórmio contém os lipídios polares restantes. Os componentes principais na fração do lipídio apoiar são dimicocerosatos de ftiocerol, triacilgliceróis, micolipenatos de trealose e menaquinonas. Os componentes principais da fração do lipídio polar são fosfolipídios tais como a fosfatidiletanolamina, o fosfatidilglicerol e o fosfatidilinositol. Os lipídios de polaridade intermediária são sulfolipídios, micolatos de trealose, fenolftioceróis glicosilados (incluindo glicolipídios fenólicos, PGLs) e trealoses aciladas (Dobson et al, 1985).

MMG refere-se ao lipídio monomicolil glicerol

14/43 obtido da fração do lipídio apoiar e derivados, por exemplo, alfa-MMG e ceto-MMG e análogos naturais e sintéticos dos mesmos, O MMG pode ser isolado pela execução de TLCs em tolueno/acetona (95:5) . O PGL e o MMG sao extraídos juntos por este método, mas podem ser separados em TLC 1-D em clorofórmio:metanol:0,880 (97:3:0,5). Os derivados de MMG, alfa-MMG e ceto-MMG, podem ser obtidos por meio de aquecimento até a manhã seguinte a 100 °C com 5¾ de TBAH aquoso (2,5 ml) em um tubo de 16 x 100 mm (Minnikin, 1988).

Uma versão homóloga, análoga ou modificada sintética do MMG pode ser produzida por meio de qualquer método de síntese química convencional. Um análogo refere-se a um de um grupo de compostos similares na estrutura, mas diferentes com respeito à composição elementar e homólogo refere-se a qualquer elemento de uma série de homólogos de compostos. Estes compostos podem ser de comprimentos variados da cadeia de carbono; em particular, um tamanho reduzido foi associado com toxicidade reduzida e pode, portanto, servir para diminuir qualquer toxicidade aparente dos análogos. Desse modo, as versões sintéticas podem ser baseadas na cadeia de alquila com, por exemplo, 8 a 36 carbonos e com 0 a 3 ligações duplas em cada cauda do lipídio. Alternativamente, uma forma simplificada pode ser obtida ao remover uma das caudas do lipídio. O tamanho da cadeia principal de carbono do MMG sintético é preferivelmente C8-C36, por exemplo, ácido 3-hidróxi-2-etil hexanóico-2,3-diidroxipropil éster (C8) , ácido 3-hidróxi-2-butil-octanóicO2,3-diidroxipropil éster (C12), ácido 3-hidróxi-2-hexil-decanóico-2,3-diidroxipropil éster (C16) , ácido 3-hidróxi-2-heptil-endecanóico-2,3diidroxipropil éster (C18), ácido 3-hidróxi-2-tetradeciloctadecanóico-2,3-diidroxipropil éster (C32) ou ácido 3hidróxi-2-hexadecilicosanóico-2,3-diidroxipropil éster (C36) e com a máxima preferência C8 ou C16. A versão modificada

15/43 pode ser preparada ao substituir a porção do glicerol por outros grupos poliol principais, por exemplo, polipropileno glicol e polietileno glicerol. A estereoquímica em torno de C2 e de C3 do monomicolato sintético bem como do glicerol pode ser variada. A seguir, o MMG escrito sozinho também significa uma versão homóloga, análoga ou modificada sintética do MMG, tal como descrito acima.

O componente ou a substância antigênica pode ser um polipeptídeo ou parte do polipeptídeo, que provoca uma imunoresposta em animais ou seres humanos e/ou em uma amostra biológica determinada por qualquer um dos ensaios biológicos descritos na presente invenção. A porção imunogênica de um polipeptídeo pode ser um epítopo de células T ou um epítopo de células B. A fim de identificar os epítopos das células T relevantes que são reconhecidos durante uma imunoresposta, é possível utilizar um método de força bruta: uma vez que os epítopos de células T são lineares, os mutantes de apagamento do polipeptídeo, se construídos sistematicamente, revelam quais regiões do polipeptídeo são essenciais no reconhecimento imune, por exemplo, ao sujeitar estes mutantes de apagamento, por exemplo, ao ensaio de IFN-gama descrito na presente invenção. Outro método utiliza os oligopeptídeos de sobreposição (preferivelmente sintéticos contendo um comprimento de, por exemplo, vinte resíduos de aminoácido) derivados do polipeptídeo. Estes peptídeos podem ser testados em ensaios biológicos (por exemplo, o ensaio IFN-gama tal como descrito na presente invenção) e alguns destes irão prover uma resposta positiva (e, desse modo, imunogênica) como a evidência quanto à presença de um epítopo de células T no peptídeo. Os epítopos lineares de células B podem ser determinados ao analisar o reconhecimento de células B aos peptídeos de sobreposição que cobrem o polipeptídeo de interesse tal como descrito, por exemplo, em Harboe et al,

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1998 .

Embora seja mostrado que o comprimento mínimo de um epítopo de células T é de pelo menos seis aminoácidos, é normal que tais epítopos sejam constituídos de extensões mais longas de aminoácidos. Desse modo, é preferível que o fragmento do polipeptídeo da invenção tenha um comprimento de pelo menos sete resíduos de aminoácido, tal como pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos doze, pelo menos catorze, pelo menos dezesseis, pelo menos dezoito, pelo menos vinte, pelo menos 22, pelo menos 24 e pelo menos trinta resíduos de aminoácido. Desse modo, em realizações importantes do método da presente invenção, é preferível que o fragmento do polipeptídeo tenha um comprimento de mais de 50 resíduos de aminoácido, tal como mais de 40, 35, 30, 25 e 20 resíduos de aminoácido. Espera-se que os peptídeos que têm um comprimento entre 10 e 20 resíduos de aminoácido provem ser os mais eficientes como ferramentas diagnosticas e, consequentemente, comprimentos especialmente preferidos do fragmento do polipeptídeo utilizado no método da presente invenção são 18, tal como 15, 14, 13, 12 e até mesmo 11 aminoácidos.

Especificamente, a substância antigênica pode ser derivada de uma cultura de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis metabolizada, e outras micobactérias ambientais como, por exemplo, Mycobacterium avium. Particularmente, substâncias interessantes do filtrado de tais micobactérias são as proteínas da família de genes ΕΞΑΤ6 (tais como ΕΞΑΤ6 e TB 10.4) bem como outros antígenos iniciais tais como Ag85A, Ag85B, ORF2c, Rvl036 e Rv0285 que são alvos dominantes para a imunidade mediada por células na fase inicial da tuberculose em pacientes de TB e em modelos animais diferentes. Além disso, outros antígenos tais como RV2653, RV2655, Rv2656, Rv2657, Rv2658, Rv2659, Rv2660 que

17/43 são alvos dominantes durante estágios mais avançados da infecção por TB são de relevância. Sua imunogenicidade per se é baixa, mas em combinação com combinações adjuvantes da presente invenção, tornou-se um candidato potente para provocar a imunidade elevada e persistente contra a tuberculose, tal como é demonstrado na seguinte parte detalhada deste relatório descritivo.

As proteínas da família de genes ΕΞΑΤ-6 bem como muitos outros antígenos aplicáveis em combinação com as combinações adjuvantes da presente invenção, podem atualmente ser produzidas artificialmente, por exemplo, sinteticamente ou por meio de técnicas genéticas recombinantes.

As proteínas de fusão se mostraram especialmente bem apropriadas como substâncias antigenicas nas vacinas, por exemplo, os produtos da fusão Ag85b_TB 10.4, Ag85b__ESAT6_Rv2660, Ag85b_TB 10.4_Rv2660 e Ag85a_TB 10.4_Rv2660 provaram ser muito eficazes contra a TB.

Uma vacina é definida como uma suspensão de microorganismos mortos, atenuados ou então modificados (bactérias, vírus ou riquétsias) ou partes dos mesmos para que a inoculação produza a imunidade contra uma doença. A vacina pode ser administrada como uma profilaxia para prevenir a doença ou como uma vacina terapêutica para combater doenças já existentes tais como o câncer ou doenças infecciosas latentes, mas também com relação à alergia e às doenças autoimunes. A vacina pode ser emulsionada em um adjuvante apropriado para potencializar a imunoresposta.

As vacinas são administradas de uma maneira compatível com a dosagem da formulação e em uma quantidade terapeuticamente eficaz e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunológico do indivíduo de armar uma imunoresposta e do grau de proteção desejado. As

18/43 faixas de dosagem apropriadas são da ordem de diversas centenas de microgramas de ingrediente ativo por vacinação com uma faixa preferida de aproximadamente 0,1 10 pg00 pg, tal como na faixa de aproximadamente 1 pg a 3 00 pg e especialmente na faixa de aproximadamente 1 pg a 50 pg. Os regimes apropriados para as vacinas de administração inicial e de reforço também são variáveis, mas tipificados por uma administração inicial seguida por inoculações subsequentes ou por outras administrações.

O modo de aplicação pode ser variado extensamente. Alguns dos métodos convencionais para a administração de uma vacina são aplicáveis. Acredita-se que eles incluam a aplicação oral ou mucosal em uma base sólida fisiologicamente aceitável ou em uma dispersão fisiologicamente aceitável, parenteralmente, por meio de injeção ou similares. A dosagem da vacina irá depender da via de administração e irá variar de acordo com a idade da pessoa a ser vacinada e, até um grau menor, com o tamanho da pessoa a ser vacinada.

As vacinas são administradas convencionalmente parenteralmente, por injeção, por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente. As formulações adicionais que são apropriadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais ou mucosais. Para supositórios, os aglutinantes e os carreadores tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados das misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de 0,5¾ a 10%, preferivelmente 1 a 2%. As formulações orais incluem os excipientes normalmente empregados como, por exemplo, tipos farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina do de sódio, celulose, carbonato de magnésio e outros ainda. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas,

19/43 cápsulas, formulações de liberação prolongada ou pós e contem vantajosamente 10 a 95% do ingrediente ativo, preferivelmente 25 a 70%.

A vacina de escolha pode, por exemplo, ser:

Vacina de Proteína: Uma composição vacinai que compreende um polipeptídeo (ou pelo menos uma porção imunogênica do mesmo), uma mistura do peptídeo ou um polipeptídeo de fusão.

Vacinas recombinantes vivas: Expressão do antígeno relevante em uma vacina em um microorganismo ou em um vírus não-patogênico. Exemplos bem conhecidos de tais microorganismos são o BCG de Mycobacterium bovis. Salmonella e Pseudomonas e os exemplos de vírus são o Vírus e o Adenovirus da Varíola Bovina,

Para todos estes construtos vacinais, a adição de um adjuvante apropriado resultou em eficácias vacinais intensificadas (Brandt et al, 2000), (van Rooij et al, 2002), (Bennekov et al, 2006).

Os lipossomos (ou vesículas de lipídios) são compartimentos aquosos envolvidos por duas camadas de lipídio. Os componentes do lipídio são geralmente fosfolipídios ou outros anfífilos tais como tensoativos, freqüentemente suplementados com o colesterol e outros lipídios carregados. Os lipossomos podem capturar os compostos solúveis em água e em lipídio que permitem desse modo que o lipossomo aja como um carreador. Os lipossomos foram utilizados como sistemas de aplicação em farmacologia e medicina tal como imunoadjuvantes, tratamento de doenças infecciosas e de inflamações, terapia do cancer e terapia de genes {Gregoriadis et al, 1995). Os fatores que podem ter uma influência no efeito adjuvante dos lipossomos são o tamanho lipossomal, a composição do lipídio e a carga de superfície. Além disso, a posição do antígeno (por exemplo, se adsorvido

20/43 ou acoplado de maneira covalente à superfície do lipossomo ou encapsulado em compartimentos aquosos lipossomais) também pode ser importante. As células dendríticas podem ser utilizadas como veículos de aplicação do antígeno. O carregamento do antígeno às células de apresentação do antígeno, tais como as células dendríticas, mostrou ser um método eficaz para a geração de células T ativas com um papel na imunidade antitumor.

Os compostos de amônio quaternário, por exemplo, o brometo ou cloreto de dimetildioctadecilamonio ou outros sais orgânicos ou inorgânicos do mesmo (DDA-B, DDA-C ou DDA-X), cloreto ou brometo de dimetildioctadecenilamônio ou outros sais orgânicos ou inorgânicos do mesmo (DODA-C, DODA-B ou DODA-X) ou 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamônio propano, l,2-dipalmitoil-3trimetilamônio-propano, 1,2-distearoil-3-trimetilamôniopropano e dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP) e N-[l(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) têm a capacidade de formar agregados de lipídio tais como duas camadas de lipídio, lipossomos de todos os tipos unilamelares e multilamelares, micelas e outros ainda quando dispersos em meio aquoso. As membranas do lipídio destas estruturas oferecem uma matriz excelente para a inclusão de outros compostos anfifílicos tais como glicolipídios, por exemplo, MMG ou alfa,alfa'-trealose 6,6'-dibeenato (TDB) que são mostrados para estabilizar dispersões de vesículas (Davidsen et al, PCT/DK2005/000467).

A combinação de MMG e do sistema de aplicação pode agir de uma maneira sinergística para intensificar a imunoresposta, por exemplo, quando o DDA é administrado sozinho. Desse modo, o DDA promove um baixo nível de produção de IFN-γ; no entanto, em combinação com a produção do MMG, a produção de IFN-γ é drasticamente intensificada.

21/43

Os lipossomos da presente invenção podem ser feitos por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos no estado da técnica (Davidsen et al, PCT/DK2005/000467). A incorporação do MMG nos sistemas de lipossomos/de aplicação pode ser feita por meio de uma variedade de métodos bem conhecida no estado da técnica incluindo a mistura simples dos lipossomos e do MMG. Em particular, a incorporação do MMG em lipossomos pode ser feita como descrito em Davidsen et al, PCT/DK2005/000467,

Além de prover imunidade contra as doenças, as combinações de adjuvantes da presente invenção também podem ser utilizadas para a produção de anticorpos contra os compostos que são substâncias imunogênicas fracas per se, e tais anticorpos podem ser utilizados para a detecção e a quantificação dos compostos em questão, por exemplo, na medicina e na química analítica.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1. Isolamento e avaliação da atividade imunoestimulatória dos lipídios apoiares e polares do BCG de M. bovis. Os lipídios apoiares extraídos de Copenhagen do BCG de M. bovis foram analisados por TLC de 2-D. Na fração do lipídio polar, 1-4 são os manosídeos de fosfatidilinositol, PI é fosfatidilinositol, PE é fosfatidiletanolamina e DPG é difosfatidilglicerol (cardiolipídio). PG é L-alfa-fosfatidilDL-glicerol, sendo que 5 e 6 sao fosfolipídios desconhecidos. Na fração apolar, TAG é triacilglicerol, PDIM são os dimicocerosatos de ftiocerol A, B e C, MMG é monomicolil glicerol, PGL são glicolipídios fenólicos e FFA são ácidos graxos livres (Painel A). As iDCs foram incubadas por 24 h na presença do meio sozinho, LPS (0,1 pg/ml) , MPL (100 pg/ml) , fator de cordão (CF) (100 pg/ml), lipídios apoiares (0,1-100 pg/ml) ou lipídios polares (0,1-100 pg/ml). A intensidade fluorescente do meio geométrico (MFI) dos níveis de

22/43 marcadores de superfície nas DCs após o tratamento é mostrada. Os dados foram obtidos de uma experiencia representativa de três utilizando três doadores diferentes (Painel B) . Os sobrenadantes da cultura obtidos após o tratamento com 100 pg/ml de lipídios polares ou apoiares foram analisados por ELISA quanto à presença dos citocinas IL-6, TNF-a e IL-12. Os dados obtidos de uma experiência representativa de três executada em triplicata, utilizando três doadores diferentes, são apresentados (+s.e.m) (Painel C) . A proliferação (Painel D) e a liberação de IFN-γ (Painel E) pelas células T dos doadores de PPD negativos após a incubação com DCs tratadas por 24 horas com 100 pg/ml de lipídios apoiares ou polares em um ensaio de MLR. Dados obtidos de uma experiência representativa de três executada em triplicata, utilizando três doadores diferentes, são apresentados (± s.e.m).

Figura 2. Estruturas de MMG, TAG, PDIM e PGL. Análise de TLC de 2-D dos lipídios individuais PDIM, TAG, PGL e MMG (Painel A) e estruturas representativas de MMG, PGL, PDIMs e TAGs (Painel B).

Figura 3. Ativação de células dendríticas humanas por MMG. As iDCs foram incubadas por 24h na presença do meio sozinho (linha pontilhada) ou MMG, PDIM, PGL ou TAG (10 pg/ml). Foi verificado que os preparados de lipídio estão livres de contaminação por endotoxinas (<0,001 ng de LPS/pg de lipídio). A MFI dos níveis de marcadores de superfície nas DCs para um doador representativo de seis após tratamento é mostrada (Painel A). Os sobrenadantes da cultura obtidos após o tratamento com MMG, PDIM A, PGL ou TAG (10 pg/ml) foram analisados por ELISA quanto ã presença das citocinas IL-6, TNF-a e IL-12 (Painel B) . O meio (+s.e.m.) dos dados obtidos da experiência três ou quatro utilizando doadores diferentes executados em triplicata são apresentados. Os dados foram

23/43 analisados utilizando o teste de Tukey.

Figura 4. Alfa e ceto-micolatos de MMG são imunoestimulatórios. As iDCs foram incubadas por 24 h na presença do meio sozinho e de alfa ou ceto-micolatos de MMG (10 pg/ml). A MFI dos marcadores de superfície nas DCs após o tratamento é mostrada.

Figura 5. Liberação de IFN-γ induzida por MMG isolado de BCG Copenhagen de M. bovis. Os camundongos C57BL/6 foram imunizados com Ag85B-ESAT-6 em combinação com os adjuvantes com base nos lipídios isolados de BCG Copenhagen incorporados nos lipossomos de DDA. A liberação de IFN-γ pelas PBMCs isoladas dos nódulos linfáticos de drenagem dias após a vacinação foi medida.

Figura 6. Proteção contra uma infecção virulenta de TB com os adjuvantes de MMG. Os camundongos C5 7BL/6 foram imunizados três vezes com Ag85B-ESAT-6 em combinação com os adjuvantes à base de DDA e 10 ou 5 0 pg de MMG. Seis semanas após a vacinação final, os camundongos receberam um estímulo em aerossol com M. tuberculosis. O número de bactérias foi medido nos pulmões e no baço seis semanas depois. Os camundongos que receberam uma vacinação de BCG padrão foram incluídos como um controle positivo e os camundongos imunizados com DDA/MMG (10 pg) sem antígeno, como um controle negativo. A eficácia protetora das vacinas experimentais é expressa como a redução de LoglO na carga bacteriana no pulmão comparada aos camundongos não imunizados. Os resultados são os valores médios para seis camundongos em cada grupo ± SEM. Valores significativamente diferentes do controle não imunizados são marcados como * P<0,05.

Figura 7. A liberação de IFN-γ ê intensificada ao combinar MMG e DDA. Em duas experiências, os camundongos C57BL/6 foram imunizados com Ag85B-ESAT-6 em DDA ou DDAIMMG (Painel A) ou MMG ou DDA/MMG (Painel B). A liberação de IFN-γ

24/43 pelas PBMCs isoladas do sangue (Painel A) ou nos baços (Painel B) três semanas após a última vacinação foi medida.

Figura 8. A liberação de IFN-γ é intensificada pela adição de TDB à combinação de MMG/DDA. Os camundongos C57BL/6 foram imunizados com Ag85B-ESAT-6 administrado em MMG incorporado aos lipossomos de DDA ou aos lipossomos de DDA que contêm TDB. A liberação de IFN-γ pelas PBMCs isoladas do sangue cinco meses após a vacinaçao foi medida.

Figura 9. Exemplos das estruturas de análogos de

MMG sintéticos.

Figura 10. As os análogos naturais e C57BL/6 foram imunizados (10 pg), em DDA/MMG C36 liberação de IFN-γ pelas após a última imunização

Figura 11.

imunorespostass são sintéticos de MMG.

comparáveis com

Os camundongos

DDA, em DDA/MMG com Ag85B-ESAT-6 em (10 pg) ou em DDA/MMG C16 (10 pg) . A

PBMCs isoladas do sangue uma semana foi medida.

Imunorespostass superiores com comprimento de cadeia mais curto. Os camundongos C57BL/6 foram imunizados com Ag85B-ESAT-6 em DDA ou DDA com vários análogos de MMG que variam de um comprimento de cadeia de 8 a 36 (1 pg/dose). A liberação de IFN-γ pelas PBMCs isoladas do sangue três semanas após a última imunização foi medida.

Exemplos

Material e Métodos

EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS APOLARES E POLARES DO BCG DE M._BOVIS

BCG de Mycobacterium bovis (Copenhagen) foi cultivado no meio modificado de Sauton. As micobactérias foram colhidas após 2 a 3 semanas, suspensas em PBS e mortas ao incubar por Ih e meia a 6 0 °C. Os lipídios polares e apoiares foram extraídos de acordo com protocolos padrão (Dobson et al, 1985), (Rosenkrands et al, 2005).

Para a extração dos lipídios apoiares, metanol: 0,3-s de NaCl (440 ml) e 440 ml de éter de petróleo foram

25/43 adicionados a 20 g de micobactérias (peso a úmido) e a mistura foi agitada por duas horas. Após a centrifugação, a camada superior foi removida e a camada inferior foi novamente extraída com 440 ml de éter de petróleo. As fases do sobrenadante de ambas as extrações foram agrupadas e evaporadas para se obter os lipídios apoiares.

Para a extração dos lipídios polares, a solução salina metanólica contendo a biomassa foi aquecida em um banho de água fervente por 10 minutos a 100°C seguido pelo resfriamento por 10 minutos a 37 °C. Um volume de 520 ml de clorofórmio:metanol: 0-3% de NaCl (9:10:3) foi adicionado e a mistura foi agitada ate a manha seguinte. A mistura total foi passada através de um funil de vidro sinterizado; o bolo do filtro foi coletado e novamente extraído duas vezes com 170 ml de clorofórmio:metanol: 0-3¾ de NaCl (5:10:4) . Todas as três fases de clorofórmio metanólicas aquosas foram agrupadas e 58 0 ml de clorofórmio: 0,3% de NaCl aquoso (1:1) foram adicionados, com agitação, por dez minutos. Após esperar a separação das fases, a camada aquosa superior foi removida e rejeitada. A camada orgânica inferior foi evaporada até a secagem para prover os lipídios polares.

PURIFICAÇÃO DE LIPÍDIOS APOLARES INDIVIDUAIS

PDIMs e TAGs foram isolados utilizando execuções de TLC em éter de petróleo (98:2); somente o componente principal de PDIM, à base de ftiocerol A, foi recuperado. O PGL e o MMG foram isolados juntos por execuções de TLC em tolueno/acetona (95:5). O PGL e o MMG foram separados em TLC 1-D em clorofórmio: metanol:0,880 de amônia (97:3:0,5). PDIMs, TAGs, PGL e MMG foram submetidos a 500 MHz de ressonância magnética nuclear de ¹H e ¹³C (NMR) (Bruker drxBOO) e espectroscopia de massa de MALDI-TOF (MS) (Bruker Biflex IV) . As amostras (10 μΐ) dos extratos de lipídio reidratados (1 mg/ml) foram analisadas por SDS_PAGE (Laemmli

26/43 et al, 1970) e pelo tingimento com prata (Blum et al, 1987) para o teor de proteína residual. Foi verificado que os preparados de lipídio estão livres de contaminação por endotoxinas (< 0,001 ng de LPS/pg de lipídio).

HIDRÔLISE DE MONOMICOLIL GLICEROL

O monomicolil glicerol foi aquecido até a manhã seguinte a 100 °C com 5% de TBAH aquoso ¢2,5 ml) em um tubo de 16 x 100 mm (Minnikin et al, 1988) . Após o resfriamento, a mistura foi diluída com água (2 ml) e uma solução de 10¾ de iodometano (3 ml) em diclorometano foi adicionada e os tubos colocados em um rotacionador por uma hora. A camada aquosa superior foi rejeitada, a camada inferior foi lavada com equivolumes de IM de HC1 e água e foi evaporada até a secagem para se obter um resíduo, foi mostrado por TLC (éter de petróleo:acetona 95:5) que contém metil ésteres de alfa e ceto-micolato. A TLC preparativa (como acima) resultou no alfa metil micolato e ceto metil micolato.

A derivatização de trimetilsilila foi utilizada para separar o alfa-MMG e o ceto-MMG.

A mistura de MMG e 600 ml do reagente TRI-SIL (Pierce) foram aquecidos a 75°C por vinte minutos. A solução resfriada foi então secada sob uma corrente de nitrogênio e carregada em uma placa de TLC preparativa e desenvolvida em éter de petróleo:tolueno (50:50) e as faixas de alfa-MMG e ceto-MMG foram visualizadas utilizando 0,01% de rodamina e examinadas sob a fluorescência da onda longa. As faixas correspondentes foram raspadas da placa de TLC e o alfa-MMG e o ceto-MMG foram extraídos em gel de silica três vezes utilizando dietil-éter (3x5 ml) . Os extratos agrupados foram secados e os grupos trimetilsilila foram removidos pela adição de heptano:metanol (1:1) e de alguns cristais de ácido para-tolueno sulfônico e foram misturados por 1 hora. A camada de heptano foi recuperada e evaporada até a secagem

27/43 para se obter o alfa-MMG e o ceto-MMG purificados.

SÍNTESE DE MMG QUE MOSTRA A PRODUÇÃO DE C36

Ácido 3-hidróxi-2-tetradecil-octadecanóico (ácido corinomicólico de C³² sintético, sintetizado de acordo com 5 Datta et al., 1991) (lOOmg, 0,20 mmol, 1 equiv.) e 4pirrolidinopiridina (100 mg, 3 equiv.) foi colocada em um frasco de 50 ml de fundo redondo e uma solução de 5 0 μΐ de 2,2-dimetil-4-hidroximetil-l,3-dioxolan (sn-isopropilideno glicerol) em diclorometano (500 μΐ) foi adicionada, junto com 10 crivos moleculares de 4A. A mistura foi levada até a secagem completa sob vácuo elevado à temperatura ambiente e N',Ndicicloexilcarbodiimidazol (DCC) (15 ml, 0,1M de DCC em DCM, 5 equiv.) foi adicionado e a reação foi colocada para agitar à temperatura ambiente até a manhã seguinte.

Os crivos moleculares foram removidos por meio de filtração, a mistura de reação foi reduzida até a secagem in vacuo e o resíduo foi purifxcado utilizando cromatografia de coluna de evaporação (Fluka 60741 Silica Gel 60) , ao eluir com hexano para hexano:acetato de etila (8:2) em incrementos 2 0 de 5% para se obter o composto protegido de isopropilideno puro (3-hidróxi-2-tetradecil-ácido octadecanóico-2,2-dimetil[1,3]-dioxolan-4-ilmetil) éster em 56% de rendimento (68mg). ²H NMR (CDC1₃, 300 MHz) δ_Η 0,90 (t, 6H, CH₃), 1,20 (s, 54H,

CH₂), 1,40 (s, 3H, CH₃), 1,45 (s, 3H, CH₃) , 2,50 (m, 1H,CH) ,

4,05-4,40 (m, 5H, CH₂, CH) ; ¹³C NMR (CDC1₃, 75MHZ) õ_c15,0 (CH₃) , 22,1, 28,8, 28,9, 29,0, 31,4 (CH₂) , 29,1 (CH₃) ,52,1 (CH (CH₂) i₃CH₃ ) , 63,2 (CH₂OCO), 69,3 (CH₂O) , 73,4 (CH (CH₂) ) ₄CH₃) , 174,3 (C=O); m/z (EL) 633,55 [M+Na-] (100%); HRMS calculado para C₃₈H₇₄O₅Na [M+Na⁺] 6 3 3,553 6 encontraram 63 3,552 7.

Ácido 3-hidróxi-2-tetradecil-octadecanóico-2,2dimetil-[1,3]-dioxolan-4-ilmetil (68 mg, 1 equiv.) foi dissolvido em 6ml de uma solução de ácido trifluoroacético:tetraidrofurano:água (8:17:3, em volume) e

28/43 agitado à temperatura ambiente até a manhã seguinte. A solução foi neutralizada com bicarbonato de sódio aquoso saturado e a mistura foi extraída duas vezes com clorofórmio. O extrato orgânico foi lavado com água e salmoura, secado e reduzido in vacuo para resultar no produto bruto como um sólido branco, que foi purificado pela cromatografia de coluna de evaporação em um cartucho Varian Bond Elut 12256026 em 10 g de gel de silica, ao eluir com hexano para hexano: acetato de etila (7:3) em incrementos de 5%, para se obter o composto de título como um sólido branco com rendimento de 49% (32 mg) . Ponto de fusão 72 a 74°C. H NMR (CDC1₃, 300 MHz) δ_Η 0,90 (t, 6H, CH₃) , 1,25 (s, 54H, CH₂) ,

2.50 (m, 1H, CH) , 3,45-3,85 (m, 3H, CH, CH₂) , 4,25 (m, 2H,

CH₂) ; ¹³c NMR (CDC1₃, 75 MHz) õ_c NMR, 15,0 (CH₃) , 26,3, 30,9, 31,3, 33,5 (CH₂) , 47,5 (CH (CH₂) ₁₃CH₃) , 68,4 (CH₂) , 69,5 (CH(CH₂) ₁₄CH₃) , 72,5 (CH₂O) , 76,4 (CH) , 175,4 (C-l) ; m/z (EI)

593.50 [M+Na⁺] (100%); HRMS calculado para C₃₅H₇₀O₅Na [M+Na⁺]

593,5121 encontraram 593,5143.

ENSAIOS DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

As DCs derivadas de PBMCs humanas foram obtidas de acordo com um método modificado de Romani et al. , 1994. O sangue periférico foi obtido de 'buffy coats'. Resumidamente, os monócitos foram isolados pela centrifugação de FicollHypaque (meio de densidade Lymphoprep 1077, Nycomed, Oslo, Noruega) seguido pela separação das células positivas de CD14 utilizando grânulos magnéticos rotulados anti-CD14 (MACS; Miltenyi Biotech, Bergesh Gladbach, Alemanha). Os monócitos foram cultivados em RPMI completo 164 0 suplementado com 10% de FCS, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina (todos da Gibco) (CM) e na presença de 100 ng/ml de GM-CSF recombinante humano (Prepotech, Rocky Hill, NJ, EUA) e de 50 ng/ml de IL-4 recombinante humano (Becton Dickinson (BD)) por sete dias a

29/43

37°C, com 5% de CO₂ .

No sétimo dia, as iDCs (1 x 10⁵ células) foram cultivadas por mais 24 horas com lipídios Lipopolisaccharide (LPS) (Escherichia coli 0127:B8) (Sigma-Aldrich, Brondby, Dinamarca) ou lipídios derivados do BCG de M. bovis . Os extratos do lipídio foram preparados ao redissolver o material seco do lipídio de M. bovis com clorofórmio:metanol (2:1), seguido pela evaporação do solvente e a sonicação da sonda em CM. Os lipídios foram adicionados às DCs imaturas de 0,1 a 100 pg/ml.

ANÁLISE DO FLUXO CITOMÉTRICO

As DCs foram tingidas para os marcadores de superfície pela incubação primeiramente com o mAb relevante (BD Pharmingen) (30 minutos, 4 °C) seguido por 1/20 Ig anticamundongo de cabra conjugado a FITC diluída (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) (trinta minutos, 4°C). A ligação não-específica de Ab foi bloqueada com 10¾ de solução de soro fetal de vitela (quinze minutos, 4 °C) antes da adição mAb humano primário relevante. As células tingidas foram examinadas pela citometria de fluxo imediatamente, utilizando um citômetro de fluxo FACScan (BD) e analisadas com o software CellQuest.

MEDIÇÕES DE CITOCINA

Os sobrenadantes da cultura de DCs foram coletados e armazenados a -20°C. IL-12p70, IL-6 e TNF-oí secretados foram medidos por ELISA (BD) de acordo com as instruções do fabricante.

ENSAIO DA REAÇÃO DE LEUCÓCITOS MISTURADA (MLR)

As iDCs para o ensaio reação de linfócitos misturada (MLR) foram geradas dos monócitos, como esboçado acima. As células resultantes foram cultivadas por 24 horas no mesmo meio (iDC) ou no meio contendo lipídios (10 ou 100 pg/ml) . As titulações de DCs de 0,125 x 105 a 2 x 10⁵ foram

30/43 incubadas a 37°C/5% de CO₂ com as células T alogenéicas (10⁵ células/cavidade) de um doador PPD negativo em placas de microtitulação de 96 cavidades com fundo plano. As células T foram isoladas utilizando um kit de isolamento de células Pan-T (Miltenyi) de acordo com as instruções do fabricante. As co-culturas de célula T alogenéicas de DCs foram incubadas por 6 dias. O sobrenadante foi colhido e armazenado a -20°C até que o IFN-γ secretado foi medido por ELISA (BD) de acordo com as instruções do fabricante. Ambos os ensaios foram então pulsados com o meio contendo 1 pCi/cavidade de timidina [³H] pelas 18 h finais da cultura. As células foram colhidas e a proliferação das células T foi medida pela contagem de cintilação líquida (Microbeta Systems). Todos os ensaios foram executados em triplicate utilizando pelo menos três doadores diferentes.

ANTÍGENOS

A proteína de fusão de Ag8 5B e de ESAT-6 (a seguir designadas Ag85BESAT-6) foi produzida como as proteínas recombinantes, tal como descrito previamente (Olsen et al. , 2001).

ANIMAIS

Camundongos fêmeas BALB/c ou C57BL/6, com oito a doze semanas de idade, foram obtidos junto à Bomholtgaard (Ry, Dinamarca) ou junto à Harlan Scandinavia (Dinamarca). Os camundongos infectados foram mantidos em gaiolas dentro de um cerco de segurança de fluxo laminar BL-3.

IMUNIZAÇÕES

Os camundongos foram imunizados subcutaneamente (s.c.) na base das caudas até três vezes com um intervalo de duas semanas entre cada imunização. As vacinas (0,2 ml/camundongo) consistiram em 2 pg da proteína de fusão Ag85B-ESAT-6, emulsionada em 250 pg de DDA e 10 pg do extrato de lipídio reidratado, a menos que esteja indicado de alguma

31/43 outra maneira. Em alguns casos, 11 mol% de TDB foram incorporados aos lipossomos de DDA (Davidsen et al, PCT/DK2005/000467). Como um controle positivo nas experiências envolvendo a infecção por M. tuberculosis, um único grupo de camundongos recebeu uma dose do BCG Danish 1331 injetada subcutaneamente na base da cauda. Os extratos totais ou individuais do lipídio foram preparados ao reidratar o material seco do lipídio de M. bovis com água de Milli Q em 1 ou 5 mg/ml seguido pela sonicação da sonda. As vacinas de lipídio padrão foram preparadas ao misturar o antígeno com solução salina, seguido pela adição do extrato reidratado do lipídio e DDA e pela mistura por turbilhonamento. A vacina descansou até a manhã seguinte para permitir a adsorção do antígeno.

CULTURAS DE LINFÓCITOS

As amostras de sangue ou os nódulos linfáticos inguinais foram retirados dos camundongos com 7 a 150 dias após a última imunização e preparados como descrito previamente (Rosenkrands et al., 2005). As culturas de células foram executadas em triplicata nas cavidades de microtitulação com fundo redondo que contêm 2x 10⁵ células em um volume de 2 00 μΐ de RPMI suplementado com 2mercaptoetanol, glutamina, penicilina-estreptomicina, HEPES e 10% de soro fetal de vitela. O antígeno para a reestimulação foi utilizado em uma concentração de 5 pg/ml. As cavidades contendo o meio somente ou 5 pg/ml de ConA foram incluídas em todas as experiências como controles negativos e positivos, respectivamente. Os sobrenadantes da cultura foram colhidos das culturas paralelas após 72 horas de incubação na presença do antígeno, e a quantidade de IFN-γ foi determinada pelo ensaio de imunossorvente ligado a enzimas (Brandt et al, 2000) .

INFECÇÕES EXPERIMENTAIS

32/43

Para a avaliação da eficácia vacinai, os camundongos foram estimulados dois meses e meio após a primeira imunização pela via em aerossol em um sistema de exposição por inalação Glas-Col calibrado para depositar aproximadamente 25 CFU de Erdman de M. tuberculosis virulenta nos pulmões. A carga bacteriana no baço e nos pulmões foi determinada seis semanas depois por meio de diluições em série pelo plaqueamento em ágar Middlebrook 7H11 suplementado com 2 μΐ de tiofeno-ácido carboxílico hidrazida por ml para inibir seletivamente o crescimento do BCG. As colônias foram contada após duas a três semanas de incubação a 37 °C.

ANALISES ESTATÍSTICAS

As diferenças no número das colônias entre os camundongos infectados e os camundongos do controle foram testadas pela análise de variância. Quando efeitos significativos foram indicados, as diferenças entre os meios foram avaliadas pelo teste de Dunnett. Para ensaios com DCs humanas, as diferenças na liberação de citocinas em resposta a lipídios diferentes foram testadas pela análise de variância e quando efeitos significativos foram indicados, as diferenças entre os meios foram avaliadas pelo teste de Tukey.

EXEMPLO 1

ISOLAMENTO E ATIVIDADE IMUNOESTIMULATÓRIA DOS LIPÍDIOS APOLARES DO BCG DE M. BOVIS

Os lipídios totais do BCG de M. bovis foram separados em frações polares e apoiares. Na fração polar, os lipídios que poderíam ser identificados eram os manosídeos de fosfatidilinositol (1-4), fosfatidilinositol (PI), fosfatidiletanolamina (PE), difosfatidilglicerol (DPG) e Lalfa-fosfatidil-DL-glicerol (PG). Uma série de fosfolipídios desconhecidos também foi identificada (7 e 8) (Figura IA). Na fração apoiar, os principais lipídios identificados eram

33/43 dimicocerosatos de ftiocerol (PDIMs), triacil gliceróis (TAGs), glicolipídio fenólico (PGL) e monomicolil glicerol (MMG) (Figura 1). FFA são os ácidos graxos livres.

A atividade imunoestimulatória comparativa dos lipídios apoiares e polares foi examinada utilizando DCs imaturas derivadas de monócitos do sangue periférico humano (iDC) (Figura 1). O tratamento com lipídios apoiares resultou em uma elevação dependente de dose dos níveis dos marcadores de ativação CD86, CD40 e HLA-DR em comparação aos controles não-tratados (Figura 2B) . Uma dose de 100 pg/ml de lipídios apoiares resultou na ativação de DCs comparável àquela observada com os LPS de moléculas imunoestimulatórios potentes (0,1 pg/ml) e superior em comparação àquela do fator de cordão micobacteriano (TDM) e MPL. A regulação para cima destas moléculas foi acompanhada pela secreção do fator-α de necrose de tumor dos mediadores pró-inflamatórios (TNF-α), interleucina (IL)-6 e IL-12 (Figura 2C) . Os níveis destas citocinas pró-inflamatórias nos sobrenadantes das iDCs tratadas com os lipídios polares estavam abaixo dos limites de detecção utilizando este ensaio. Finalmente, a reação de leucócitos misturada (MLR) foi utilizada com as células T alogenéicas de um doador PPD negativo (Figura 2D & E) , como outra leitura para a ativação das DCs, Com o suporte adicional do elevado estado de ativaçao das DCs tratadas com os lipídios apoiares, níveis elevados de proliferação e de liberação de IFN-γ foram verificados, ao passo que nenhuma MLR foi induzida pela fração polar.

EXEMPLO 2

ISOLAMENTO DE LIPÍDIOS INDIVIDUAIS DO EXTRATO DO LIPÍDIO APOLAR DO BCG DE M. BOVIS E CARACTERIZAÇÃO DO MMG

Os lipídios da fração apoiar imunoestimulatória foram isolados utilizando a TLC preparativa para se obter amostras puras do dimicocerosato de ftiocerol A (PDIM A) ,

34/43

TAGS, PGL e MMG; quantidades menores de ftiocerol B e ftiodiolona A também foram detectadas, mas não recuperadas pelos métodos preparativos empregados (Figura 2A) . A estrutura e as identidades dos lipídios foram confirmadas pela ressonância magnética nuclear de ¹H (NMR) e pela espectroscopia de massa (MS) (Figura 2B e dados não mostrados). O componente do MMG exibiu os espectros de NMR de ¹H e ¹³C NMR característicos de um 1-monoacil glicerol (Gunstone et al, 1991) . A MS de MALDI-TOF acoplada aos dados da NMR da fração total de MMG (Tabela 1) revelou a presença do alfamicolato e do ceto-micolato nas formas cis e trans. A relação aproximada dos componentes principais era de

1,00:0,29:0,24, respectivamente. Tabela 1
MMG	NUMERO	DO CARBONO
c-ceto t-ceto	α
	1206	79
	1234	81
	1262	83
1306		84
1335		86
1349		87
1363		88
1377		89
1391		90
1405		91
Tabela 1:	Espectrometria de massa	de MALDI-TOF do
MMG purificado. Os	sinais saem m/z para os	íons de M + Na+.

Os componentes principais das séries são mostrados em negrito com o componente principal sublinhado.

EXEMPLO 3

ATIVAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS PELO MMG MMG, PDIM A, PGL e TAGs purificados foram avaliados

35/43 quanto à sua capacidade de ativar as iDCs humanas. Nestes ensaios, foi verificado que o MMG é consistentemente o indutor mais potente da ativação de DCs, conduzindo a uma regulação para cima acentuada de CD86, CD40 e HLA-DR. (Figura 3A) . O MMG ativou até mesmo as DCs mais do que o PDIM A, um lipídio que foi associado por muito tempo com a patogenicidade das micobactérias (Cox et al. , 1999), que emergiu como o segundo lipídio mais ativo, sendo que o PGL e os TAGs induzem menos ativação. Em seis doadores individuais, a ordem de ativação foi observada como MMG > PDIM A > PGL > TAGs e o aumento de vezes médio nos níveis de CD86 acima dos níveis associados com as iDCs não-tratadas era l,91±0,29, l,82±0,43, l,52±0,26 e 1,32+0,14, respectivamente. A indução de citocinas seguiu a mesma tendência total (Figura 3B) com o MMG se destacando como o lipídio imunoestimulatório mais potente. A IL-6 foi liberada pelas DCs expostas ao MMG em níveis significativamente maiores (P < 0,05) do que aqueles induzidos pelo PGL ou pelo TAG. Nenhuma diferença significativa entre as induções de citocina pelos outros lipídios foi registrada. O MMG pode, portanto, ser classificado como o lipídio imunoestimulatório mais potente na fração apoiar do lipídio do BCG de M. bovís.

EXEMPLO 4

ATIVIDADE IMUNOE5TIMULATÓRIA DE ALFA E CETO-MMG

Neste exemplo, pretendeu-se demonstrar adicionalmente as propriedades estimulatórias do MMG e identificar o componente ativo responsável por sua capacidade imunoestimulatória potente. O alfa-MMG e o ceto-MMG foram separados após a preparação dos éteres de trimetilsilila de MMG, TLC preparativa e hidrólise subseqüente dos grupos protetores de éter de trimetilsilila para se obter o alfa-MMG e o ceto-MMG. As estruturas dos alfa e ceto-micolatos são documentadas na Figura 2B. Quando avaliado quanto à sua

36/43 capacidade de ativas as iDCs humanas, o alfa e o ceto-MMG foram estimulados na ordem de aumento de 2 a 3 vezes nos níveis dos marcadores de ativação (Figura 4) . Portanto, os dois subcomponentes do MMG também exibem uma capacidade acentuada de estimular as DCs humanas.

EXEMPLO 5

INDUÇÃO DE UMA RESPOSTA TH1 IMUNE PELO ISOLAMENTO DO BCG DE MMG DE M. BOVIS

A fim de estudar a atividade adjuvante do MMG, os lipídios isolados foram testados quanto à sua capacidade de induzir a produção de IFN-γ nos camundongos. Os camundongos C57BL/6 receberam 10 pg de lipídios totais ou individuais. In vivo, o DDA serve como um veículo ao qual se aplicam os lipídios. Portanto, 2 pg da proteína de fusão Ag85B-ESAT-6 e 10 pg do extrato reidratado do lipídio, emulsionado em 250 pg de DDA, foram administrados pela via subcutânea. Uma dose de 10 pg de MMG incorporada aos lipossomos de DDA resultou em níveis de IFN-γ de 10 ng/ml quando da reestimulação das PBMCs isoladas do linfonodo de drenagem; um nível que é comparável àquele registrado para os lipídios totais em DDA na dose equivalente (Figura 5) . PDIM-A também induz a produção de IFN-γ, embora em um nível mais baixo, sendo que os lipossomos de DDA com TAG ou PGL incorporado promoveram muito pouca liberação de IFN-γ (Figura 5 e dados nao mostrados). Deve-se observar que estes lipídios individuais parecem agir como adjuvantes uma vez que nenhuma resposta de recordação quando da reestimulação com um extrato total do lipídio ou lipídios individuais foi observada (dados não mostrados), O MMG também foi identificado, portanto, como sendo o lipídio apoiar mais ativo in vivo e, sozinho, seria o responsável pela maior parte da atividade adjuvante dos lipídios totais derivados do BCG.

EXEMPLO 6

37/43

EFICÁCIA PROTETORA DOS ADJUVANTES COM BASE NO MMG

Para avaliar a capacidade dos adjuvantes à base de MMG de prover proteção contra uma infecção por TB, os camundongos C57BL/6 foram imunizados com Ag85B-ESAT-6 aplicado em MMG (duas doses diferentes) e DDA. Grupos de camundongos que receberam uma vacinação com BCG e o adjuvante sozinho foram incluídos como controles positivos e negativos, respectivamente. Seis semanas após a última vacinação, os camundongos foram estimulados com M. tuberculosis através da via em aerossol. A capacidade das vacinas de diminuir a carga bacteriana foi medida nos pulmões e no baço seis semanas depois. Estes dados mostraram níveis significativos de proteção com MMG/DDA como um adjuvante e níveis protetores comparáveis àqueles do BCG (Figura 6) . Conforme esperado, este efeito era específico já que os camundongos vacinados com o adjuvante sem antígeno não tiveram o crescimento bacteriano inibido,

EXEMPLO 7

UM MELHOR EFEITO AO COMBINAR MMG E DDA

Para avaliar o efeito de combinar UM imunomodulador (MMG) e um sistema de aplicação (DDA), os camundongos C57BL/6 FORAM vacinados com o DDA sozinho ou com uma combinação de DDA/MMG (Experiência 1, Figura 7A ou Experiência 2, Figura 7B) com o MMG sozinho ou com uma combinação de DDA/MMG. A partir destas experiências, fica claro que a imunoresposta é drasticamente intensificada ao combinar o DDA e o MMG.

EXEMPLO 8

INTENSIFICAÇÃO DA IMUNORESPOSTA PELA INCORPORAÇÃO DO TERCEIRO COMPONENTE/TDB AOS LIPOSSOMOS DE MMG E DE DDA

A fim de estudar o efeito sobre a atividade adjuvante do MMG ao combinar com outros componentes imunoestimulatórios, a imunoresposta nos camundongos C57BL/6 após a imunização subcutânea com Ag85B-ESAT-6 e 10 pg de MMG

38/43 incorporado aos lipossomos de DDA ou aos lipossomos de DDA com os imunomoduladores TDB incorporados {Davidsen et al, PCT/DK2005/000467} foi avaliada 5 meses após a primeira vacinação. Embora a combinação do MMG incorporado aos 5 lipossomos de DDA tenha resultado em níveis de IFN-γ de ~25 ng/ml quando da reestimulaçao das PBMCs isoladas do sangue, a liberação de IFN-γ se elevou drasticamente quando os lipossomos de DDA com TDB incorporado foram empregados (Figura 8) . Um efeito sinergístico foi observado, portanto, 10 entre o MMG, o DDA e o TDB, indicando que a adição de um terceiro componente à combinação de MMG e DDA podería adicionalmente intensificar a atividade adjuvante.

EXEMPLO 9

A ATIVIDADE ADJUVANTE DOS ANÁLOGOS DO MMG É

COMPARÁVEL ÀQUELA DO MMG NATURAL

Para avaliar o efeito imunológico dos análogos de MMG sintéticos, os camundongos C57BL/6 foram imunizados com Ag85B-ESAT-6 em DDA com MMG natural, MMG sintético análogo com 16 carbonos (tal como ilustrado na Figura 9) e MMG 20 sintético análogo com 36 carbonos (tal como ilustrado na Figura 9) (todos com 10 pg/DDA/MMG).

A imunoresposta foi medida no sangue uma semana após a última vacinação e mostraram níveis de respostas comparáveis com os três adjuvantes à base de MMG, visto que o 25 DDA em si mostrou novamente um efeito inferior.

EXEMPLO 10

IMUNORESPOSTAS SUPERIORES COM COMPRIMENTO DE CADEIA

MAIS CURTO

Para avaliar o efeito imunológico dos análogos de

MMG sintéticos com comprimentos de cadeia mais curtos, os camundongos C57BL/6 foram imunizados com Ag85B-ESAT-6 em DDA sozinho, DDA com MMG natural, DDA com análogos sintéticos diferentes que variam de C8 a C36 (todos com 1 pg/dose) . A

39/43 imunoresposta foi medida no sangue três semanas após a última vacinação e demonstrou que os análogos de MMG sintéticos são ativados mesmo em níveis de dose de 1 pg. Além disso, estes resultados também demonstram que os análogos de MMG sintéticos mais curtos (de 16 C ou menos) são mais eficazes comparados ao MMG natural. *** P < 0,001. (Figura 11)

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Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. USO DE UM MONOMICOLIL GLICEROL (MMG) OU DE HOMÓLOGOS OU ANÁLOGOS SINTÉTICOS E VERSÕES MODIFICADAS, baseadas em cadeias de alquila com 8-36 carbonos, opcionalmente com uma cauda de lipídio com, 0-3 ligações duplas em cada cauda de lipídio e mais preferivelmente com sua cadeia de alquila de 8-16 carbonos, caracterizado pelo fato de servir para preparar um adjuvante ou um imunomodulador.
2. 2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos homólogos ou de análogos sintéticos de MMG ou das versões modificadas baseadas em cadeias de alquila com 8-36 carbonos serem tal como ilustrado na Figura 9.
3. 3. ADJUVANTE OU IMUNOMODULADOR, caracterizado pelo fato de ser preparado de tal como definido nas reivindicações 1 a 2 .
4. 4. ADJUVANTE OU IMUNOMODULADOR, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente um tensoativo.
5. 5. ADJUVANTE OU IMUNOMODULADOR, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é DDA-B, DDA-C, DDA-X, DODA-B, DODA-C, DODA-X, DOTAP, DODAP, DOTMA, DXPC, DXPE, DXPG ou combinações dos mesmos.
6. 6. ADJUVANTE OU IMUNOMODULADOR, de acordo com as reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de compreender um imunomodulador adicional em que o imunomodulador consiste em ligantes não-TLR, por exemplo, ligantes TDB e de MDP ou de TLR, por exemplo, Poli I:C e/ou qualquer análogo dos mesmos.
7. 7. HOMÓLOGO OU ANÁLOGO DE MMG SINTÉTICO OU UMA VERSÃO MODIFICADA, com base na cadeia de alquila com 8 a 36 carbonos, caracterizado pelo fato de ser opcionalmente com uma cauda de lipídio com 0 a 3 ligações duplas em cada cauda de lipídio.

   2/3
8. 8 . HOMÓLOGO OU ANÁLOGO DE MMG SINTÉTICO OU UMA VERSÃO MODIFICADA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser com 8 a 16 carbonos ou até 36 carbonos, tal como ilustrado na Figura 9.
9. 9. VACINA, caracterizada pelo fato de compreender um adjuvante ou um imunomodulador tal como definido nas reivindicações 3 a 6, para a administração parenteral, sublingual oral, mucosal, transdermal, tópica, por inalação, intranasal, aerossol, intraocular, intratraqueal, intrarretal, vaginal, pelo injetor de genes, emplastro dermal ou colírio ou na forma de enxaguante bucal.
10. 10. VACINA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o componente antigênico compreende um epítopo antigênico de um patógeno intracelular.
11. 11. VACINA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o componente antigênico compreende um epítopo antigênico de uma micobactéria virulenta, por exemplo, Mycobacterium tuberculosis, M. bovis ou M. africanum.
12. 12. VACINA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o componente antigênico é escolhido entre os produtos de fusão Ag85b _TB10.4, Ag8Sb_ESAT-6_Rv2660, Ag85b_TB 10.4_Rv2660 e Ag85a_TB 10.4_Rv2660.
13. 13. VACINA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o componente antigênico compreende um epítopo antigênico de Plasmodium falciparum (por exemplo, Mspl, Msp2, Msp3, Amai, GLURP, LSA1, LSA3 ou CSP), Chlamidia trachomatis (por exemplo, CT184, CT521, CT443, CT520, CT521, CT375, CT583, CT603, CT610 ou CT681), HIV, influenza ou hepatite B ou C.
14. 14. VACINA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de servir para o tratamento de

    3/3 câncer, um distúrbio auto-imune, distúrbios nervosos, por exemplo, Alzheimer, inflamação das vias aéreas, distúrbios inflamatórios, doença infecciosa, distúrbios da pele, alergia, asma ou uma doença causada por um patôgeno.
15. 15. SISTEMA DE APLICAÇÃO, caracterizado pelo fato de compreender um adjuvante ou um imunomodulador tal como definido nas reivindicações 3 a 6, pata o tratamento do câncer, de um distúrbio auto-imune, distúrbios nervosos, por exemplo, Alzheimer, inflamação das vias aéreas, distúrbios inflamatórios, doença infecciosa, distúrbios da pele, alergia, asma ou uma doença causada por um patôgeno.
16. 16. SISTEMA DE APLICAÇÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o MMG ou os homólogos e análogos sintéticos e as versões modificadas do mesmo são administrados em combinação com uma ou mais vacinas, antígenos, anticorpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleotídeos anti-sentido, agonistas de TLR e de não-TLR, antagonistas de TLR e de nãoTLR, peptídeos, proteínas, vetores da terapia de genes, vacinas com DNA, imunomoduladores ou moléculas coestimulatórias.