BRPI0711235A2 - composto, composição farmacêutica, método para induzir seletivamente uma resposta imune tipo th-1 em um mamìfero, método para tratar uma doença que requer uma resposta tipo th-1, método para aumentar a imunogenicidade para um antìgeno em um mamìfero e método para preparar um composto - Google Patents

Abstract

COMPOSTO, COMPOSIçAO FARMACEUTICA, MéTODO PARA INDUZIR SELETIVAMENTE UMA RESPOSTA IMUNE TIPO TH-1 EM UM MAMìFERO, MéTODO PARA TRATAR UMA DOENçA QUE REQUER UMA RESPOSTA TIPO TH-1, MéTODO PARA AUMENTAR A IMUNOGENICIDADE PARA UM ANTIGENO EM UM MAMìFERO E MéTODO PARA PREPARAR UM COMPOSTO. A invenção é dirigida a um novo C-glicolipídio sintético que induz, seletivamente, uma resposta imune do tipo Th-1 caracterizada pelo aumento da secreção de IL-12 e pela ativação aumentada de células dendríticas. Os compostos da invenção são, portanto, úteis no tratamento de infecções, cânceres, distúrbios de proliferação celular, e doenças auto-imunes, tanto diretamente quanto como adjuvantes.

Description

"COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA INDUZIRSELETIVAMENTE UMA RESPOSTA IMUNE TIPO TH-I EM UMMAMÍFERO, MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA QUE REQUER UMARESPOSTA TIPO TH-1, MÉTODO PARA AUMENTAR AIMUNOGENICIDADE PARA UM ANTÍGENO EM UM MAMÍFERO E MÉTODOPARA PREPARAR UM COMPOSTO".Campo da invenção

A presente invenção é dirigida a um novo C-glicolipídiosintético que induz, seletivamente, uma resposta imunetipo Th-I caracterizada pelo aumento da secreção de IL-12e por uma ativação aumentada das células apresentandoantígeno (APCs) tais como as células dendríticas, e sãoúteis no tratamento de infecções, cânceres, distúrbios daproliferação celular, e doenças auto-imunes, tantodiretamente quanto como adjuvantes.Histórico da invenção° As respostas imunes tipo Th-I e tipo Th-2 foram,originalmente, definidas como respostas imunes por doissubgrupos distintos células T CD4+ (célula T auxiliar -Th) que secretam dois grupos diferentes de citocinas.Para uma revisão, recente, ver Berkers e Ovaa, "TrendsPharmacol. Sci."", 2005, 26(5): 252-257, e as referênciasaqui citadas.

As células Thl secretam citocinas tipo Th-I incluindointerferon-gama (IFN-γ) e interleucina 12 (IL-12). Afunção principal das citocinas é para dar suporte àimunidade mediada pelas células que resulta na eliminaçãodas células do tumor, vírus e outros patógenosintracelulares por estímulo da defesa mediada porfagócitos e pelo aumento da atividade das células t CD8 +(células T citotóxicas) e células killer naturais (NK).Em adição, as citocinas Thl inibem a troca da síntese dasimunoglobulinas pelas células B, e suprimem a produção dedeterminados isotipos de imunoglobulinas tais como IgGl eIgE, o último sendo particularmente importante por causaralergias. IL-12 é secretada principalmente pelas célulasapresentadoras de antígenos (APCs) incluindo as célulasdendríticas (DCs) e macrófagos, e ativa as células T CD8+e as células NK. As células Th2 secretam citocinas tipoTh-2 incluindo IL-4, IL-5, IL-IO e IL-13. A funçãoprincipal das citocinas tipo Th-2 é dar suporte aimunidade humoral (por exemplo, estimular as reaçõesimunes mediada pelas IgE e pelas célulasplantão/eosinófilos) e para regular a diminuição dasrespostas imunes do tipo Th-I.

A desregulação do balanço entre a resposta imune tipo Th-1 e tipo Th-2 causa a doença. Muitos tipos de câncer sãocaracterizados por uma predominância da resposta tipo Th-2, e muitos patógenos esquivam-se do sistema imune pelaprodução de citocinas que mudam o balanço de Th1-Th2 parao modo Th2 (Wilson e Delovitch, 2003, "Nat. Ver.Immunol.," 3:211-222; Dredge, "Câncer Immunol.Immunother.,", 2002, 51:521-531; Servet e Zitvogel,"Curr. Mol . Med.", 2002, 2:739-756; Pinto, "Pediatrics",2006, Abril, 17 [Republ. Antes da impressão]). Muitasdoenças auto-imunes tais como asma são tambémcaracterizadas pela mudança no balanço de Thl-Th2 para omodo Th2 . Ao contrário, as doenças auto-imunes, taiscomo, diabetes tipo 1 e a esclerose múltipla são mediadaspelas células Th-1 autopatogênicas e são caracterizadaspela hipo-responsividade das células Th2, as quaisconduzem a um perfil de citocinas tipo Th-I (Hayakawa etal., 2004, "Curr. Med. Chem., 11:241-252; Wilson eDelovitch, 2003; "Nat. Rev. Immunol.," 3:211-222; VanKaer, 2004, "Immunol. Cell Biol.," 82: 315-322).As células T killer naturais tem uma participação crucialna regulação das respostas imunes tipo Th-I e Th-2. Ascélulas NKT são uma população única de linfócitos que co-expressam os marcadores de células NK junto com umreceptor de célula T semiconstante (TCR). No camundongo,o TCR de muitas células NKT consiste de uma cadeia Vainvariante codificada pelo segmento de gene Val4 e Jal8emparelhada com um grupo variável de cadeias vβcodificadas, principalmente, por segmentos de gene deνβ8,2, νβ7 ou νβ2. Estes TCR capacitam as células NKT areconhecer o complexo principal da histocompatibilidade(MHC) da molécula da classe CDld tipo I, que é capaz deapresentar moléculas hidrofóbicas tais como lipídios epeptídeos hidrofóbicos para as células NKT.

Até aqui, apenas umas poucas moléculas demonstraramativar as células NKT. Destas, a alfa-galactosilceramida(α-GalCer), um glicolipídio originalmente extraído deesponjas marinhas de Okinawan (Natori et al.,"Tetrahedron", 50:2771-2784, 1994) é o melhorcaracterizado. Um análogo sintético de α-GalCer, KRN 7000(2S, 3S, 4R)-1-O(α-D-galactopiranosil0-2 -(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-,-octadecanotriol, pode serobtido da "Pharmaceutical Research Laboratories", KirinBrewery (Gumna, Japão) ou sintetizado como descrito emMorita et La., "J. Med. Chem.", 1995, 38:2176-2187.Outros derivados de α-GalCer estão descritos na patentenorte-americana No.: US 5,780,441 (Kirin). Seguindo adescrição inicial de Kirin, α-GalCer demonstrou potencialno tratamento de diversas doenças, incluindo tumoresprimários e suas metástases, doenças infecciosas taiscomo malária e hepatite B, e muitas doenças auto-imunestais como diabetes e asma (ver Hayakawa et al., 2004,"Curr. Med. Chem.", 11:241-252; Wilson e Delovitch, 2003,"Nat. Rev. Immunol", 3:211-222; Taniguchi et al., 2 003,"Annu. Rev. Immunol.", 21: 483-513 ; Van Kaer, 2004;"Immunol. Cell Biol.", 82: 315-322). Foi demonstradotambém que α-GalCer pode ser utilizado como adjuvantecapaz de melhorar e/ou prolongar a duração da respostaimune protetora induzida por outros antígenos (ver, US2003-0157135 e Gonzalez-Aseguinolaza et al., "J. Exp.Med.", 2002, 195: 617-24).

0 α-GalCer pode ativar as células NKT tanto in vitroquanto in vivo (Kawano et al., 1997, "Science", 278:1626-1629; Burdin et al., 1998, "J. Immunol., 161: 3271-3281; Spada et al., 1988, "J. Exp. Med.", 188: 1529-1534;Brossay et al., 1998; "J. Exp. Med.", 188: 1521-1528).Como mostrado na figura 1, α-GalCer, quando presente comCDld por APCs tal como monócitos, células dendríticasimaturas derivadas de monócitos e macrófagos, interagemcom o TCR das células NKT que ativam, subseqüentemente,tanto as células NKT quanto as APCs, e conduzem a umaprodução tanto das IFN-γ das citocinas tipo Th-I quantoIL-4 das citocinas tipo Th-2 pelas células NKT. Oreceptor da IL-12 é então ativado na superfície da céluladas células NKT e, simultaneamente, IL-12 é produzidapelos APCs ativados. IL-12 produzida pelas APCs induzemuma segunda onda de IFN-γ a partir das células NKT eativa as células NK para também produzir IFN-γ (Hayakawaet al., 2004; "Curr. Med. Chem.", 11:241-252; Kawano etal. , 1997; "Science", 278, 1626-1629; Godfrey et al.,2000; "Immunol. Today", 21:573-583; Wilson et al . , 2002;"Trends Mol . Med., 8: 225-231; Matsuda et al. , 2000, "J.Exp. Med.", 192: 741-753). A ativação das células NKT porα-GalCer pode, assim, resultar em uma ativação secundáriade muitos outros tipos de célula, incluindo as célulasNK, as células B, as células T CD8+, as célulasdendríticas e as células mielóides e na diferenciação dascélulas T CD4+ tanto em células Thl quanto Th2.

Foi demonstrado que a administração de α-GalCer aoscamundongos resultou, rapidamente, em uma forte atividadeanti-malária, inibindo o desenvolvimento de estágiosintra-hepatocístico dos parasitas da malária nosroedores, P. yoeli e P. berghei (Gonzalez-Aseguinolazaet al., 2000, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA, 97: 8461-8466). O α-GalCer foi incapaz de inibir o desenvolvimentodo parasita no fígado do camundongo desprovido tanto doIFN-γ quanto do receptor do IFN-γ, indicando que aatividade anti-malária do glicolipídio é primariamentemediada por IFN-γ. O IL-4 estimulado por um α-GalCerpermite que o glicolipídio melhore um número dediferentes doenças auto-imunes, incluindo o diabetes tipoI auto-imune e a encefalomielite auto-imune (Wilson etal, 2002, uTrends Mol. Med.", 8: 225-231).Importantemente, em adição a sua capacidade de estimulara resposta imune, foi demonstrado que a-GalCer,independentemente de sua dosagem, não induz toxicidadenos roedores e em macacos (Nakagawa et al., 1998, "CâncerRes.", 58: 1202-1207).

A eficácia da terapia com α-GalCer, entretanto, éseveramente limitada pelo estimulo concomitante tanto dascitocinas Th-I quanto Th-2 (ou seja, IFN-γ, IL-12 e IL-4). (Pai et al., 2001, "J. Immunol.", 166: 662-668;Berkers e Ovaa, "Trends Pharmacol. Sci.", 2005; 26: 252-257. Ao contrário, pouco efeito foi observado empacientes com tumores sólidos em um estudo Fase I, com a-GalCer (Giaccone et al., 2 002, "Clin. Câncer Res.", 8:3702-3709) . 0 tratamento com α-GalCer demonstrou ser maiseficaz se o perfil das citocinas das células NKT formudado, por exemplo, em relação ao tipo Th-I poradministração das células dendríticas pulsadas por CDld(Fujii et al., 2002, "Nat. Immunol.", 3: 867-874).Um análogo de α-GalCer que poderia seletivamente induziruma resposta imune tipo Th-I ou Th-2 teria, assim, umpotencial terapêutico mais promissor.

Muitos análogos α-GalCer foram recentementedesenvolvidos, onde um átomo de carbono substitui o átomode oxigênio da ligação glicosídica. Ver, por exemplo, apatente norte-americana No. US 6,635,622; Schmieg et al.,2003, "J. Exp. Med.", 198 (11) : 1631-1641; Chen et al.,"Org. Lett.", 2004, 6: 4077-80; Yang et al., "Angew Chem.Int. Ed. Engl.", 2004; 43:3818-22, e os pedidos depatente de sua propriedade Nos.: US 10/462,211 (US 2004-0127429); 11/193,852 (US 2006-0019246); 11/096,340 (US2005-0222048). Os referidos análogos são resistentes àdeglicosilação e, portanto, tem uma vida de prateleiralonga (Bertozzi et al., "Synthesis of C-glycosides:stable mimics of O-glycosidic linkages", no artigo"Modern Methods in Carbohydrate Synthesis", Khan e0'Neill, editores, Harwood Academic Publishers, Londres,U.K., 1996, páginas 316-351; Bertozzi et al., 1992, "J.Am. Chem. Soc.", 114: 10639-10641; Levy e Tang, "TheChemistry of C-Glycosides", Elsevier Science Ltdl, 1995;Postema, "C-Glycoside Synthesis", CRC Press, Inc., 1995).O α-GalCer CRONY 101 foi o primeiro exemplo de um C- glicosídeo que teve um potencial terapêuticosignificativamente melhorado comparado com sua duplicadaO-glicosídico. Como demonstrado em Schmieg et al. , (2003,"J. Exp. Med.", 198: 1631-1641) e Yang et al. , (2004,"Angew. Chem. Int. Ed. Engl.", 43: 3818-3822), na administração in vivo de CRONY 101 resulta na produçãodiminuída da IL-4 da citocina tipo Th-2 (quando comparadocom α-GalCer) e melhorada, produção prolongada dos IFN-gdas citocinas tipo Th-1 e de IL-12 conduzindo a umaatividade melhorada em 100-1000 vezes contra asmetástases de melanoma e a malária, respectivamente.

A IL-12 das citocinas tipo Th-1 foi recentemente atrativapara uma parte da atenção devido a sua regra essencial nainteração entre os braços inatos e adaptativos daimunidade pela regulação da resposta inflamatória e pelaresistência inata à infecção e ao câncer (revisado emColombo e Trinchieri, "Cytokine Growth Factor Rev.",2002, 13: 155-68; Watford, "Cytokine Growth Factor Rev.",2003, 14: 361-368) . IL-12 endógena é requerida pararesistência a muitos patógenos e tumores. Ao contrário,em modelos de tumores experimentais, o tratamento com orecombinante IL-12 teve um efeito anti-tumor dramático notumores transplantados, tumores induzidos quimicamente, enos tumores que surgiram espontaneamente em camundongosmodificados geneticamente.

Como especificado acima, IL-12 é principalmente secretadopor vários APCs tais como as células dendríticas emacrófagos e contribui para a resposta imune tipo Th-1(Roitt, Brostoff, Male, "Immunology", mosby Ed., 6th Ed.;Ma e Trinchieri, "Adv. Immunol.", 2001, 79: 55-92; Hilkens, "Blood", 1997; 90: 1920-1926; Szabo, "Annu. Rev.Immunol.", 2003; 21: 713-58). IFN-γ e uma cascata deoutras citocinas pró-inflamatórias secundárias eterciárias por IL-12 tiveram um efeito tóxico direto nascélulas infectadas e de tumor ou podem ativar o mecanismoanti-angiogênico potente. O estimulo da atividade de IL-12 na imunidade antígeno-específica dependeprincipalmente de sua capacidade em determinar ouaumentar as respostas dos linfócitos T citotóxicos e Thl.

Devido a sua capacidade, IL-12 tem uma atividadeadjuvante potente no câncer e em outras vacinas. Os dadospromissores obtidos nos modelos pré-clínicos daimunoterapia anti-tumor tiveram uma expectativa muitomaior do que a IL-12 seria um agente terapêutico potentecontra o câncer. Entretanto, a toxicidade excessivaobservada nos experimentos clínicos de IL-12 apontou anecessidade de se conseguir a ativação de IL-12 em umlocal do que de uma forma sistêmica.

Sumário da invenção

Como pode ser observado a partir do histórico dainvenção, acima, existe uma grande necessidade no estadoda técnica pra novos compostos imuno-estimulantes quetenham baixa toxicidade in vivo, alta estabilidade invivo, e a capacidade de induzir, seletivamente, aresposta imune tipo Th-1, em particular, a resposta imunetipo Th-I associada com uma produção local aumentada deIL-12. A presente invenção é dirigida a estas e outrasnecessidades do estado da técnica provendo novos C-glicolipídios sintéticos. Os compostos da presenteinvenção podem tratar doenças que requerem uma respostatipo Th-I para controlar inclusive, mas não estãolimitados as, várias infecções, cânceres, distúrbiosproliferativos, e doenças auto-imunes. Estes compostospodem também aumentar uma imunogenicidade de um antígenoem um mamífero.

Os C-glicolipídios da presente invenção incluem compostosda fórmula (I):<formula>formula see original document page 9</formula>

Onde:

X é O ou NH;

Y é -CH2-CH2- OU CH=CH-;

Quando Y for -CH2-CH2-; Q é um alquenila C23-C32 ou R1-O-

R2;

Quando Y for -CH=CH-; Q é alquila C27-C32; alquenila C23-C32; -R1-O-R2-; ou alquila C6-C8 substituída com fenila;R1 e R2 são grupos alquila ou alquenila substituídos ounão-substituídos, de modo que R1 e R2 combinados tenhamde 23 a 32 átomos de carbono;

R3 é -OH ou monossacarídeo, e R4 é H, ou R3 é H e R4 é -OHou um monossacarídeo; e

R5 é hidrogênio ou um monossacarídeo; e saisfarmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dos mesmos.

Em uma configuração preferida, Y é -CH=CH- em umaconformação trans- ou eis-. Mais preferivelmente, Y é -CH=CH- em uma conformação trans-.

Preferidos são aqueles compostos que estimulam a secreçãoaumentada de IL-12. Tais compostos incluem:<formula>formula see original document page 10</formula>

cis- (A-I) ,(apesar de as conformações trans- e cis- acima serem dacadeia Q do ácido graxo [também denominado GCKl09 eGCKl51, respectivamente]). Em cada um dos casos, o grupo

Y é um etileno trans-.

<formula>formula see original document page 10</formula>

(A-5),

e sais farmaceuticamente aceitáveis e ésteres dos mesmos.Estes compostos provêem uma resposta tipo Th-I deespecificidade superior e tem um perfil farmacocinéticosuperior ao de CRONY. Sem estar ligado por qualquerteoria particular, acredita-se que estes compostosprovejam uma secreção balanceada melhorada de IL-12 pelascélulas dendríticas e IFN-γ por células NKT ou célulasNK, que refletem ainda na especificidade da resposta e nasegurança melhorada dos compostos. Estes compostos tambémnão estimulam substancialmente a secreção de IL-4 pelascélulas KNT ou NK.

Os C-glicolipídios adicionais da presente invençãoincluem os compostos da fórmula:

<formula>formula see original document page 11</formula>

Onde

Y é -CH2-CH2-;

X é O, R5 é H, R3 é OH, R4 é H; e

Q é - (CH2) 27-CH3, e sais farmaceuticamente aceitáveis eésteres dos mesmos.

Uma outra configuração da invenção é uma composiçãofarmacêutica compreendendo um composto como definidoacima em associação com um veículo farmaceuticamenteaceitável. A composição farmacêutica pode compreenderainda um antígeno.

Ainda em uma outra configuração da invenção é provido ummétodo para estimular uma resposta específica tipo Th-1,pelas células NKT e a ativação das células dendríticas,em um mamífero, dito método compreendendo administrar aomamífero, uma quantidade eficaz de um composto dapresente invenção.

Os compostos da invenção induzem a resposta imune tipoTh-I de modo seletivo e eficientemente, porque eles sãoeficazes não tratamento tanto quando usados diretamentequanto quando usados como adjuvantes conjuntamente comantígenos específicos de doenças. Portanto, uma outraconfiguração da invenção é um método para tratar umadoença que requeira uma resposta tipo Th-1, para controleem um mamífero que precisa desta resposta, dito métodocompreendendo a administração ao mamífero de umaquantidade eficaz do composto da fórmula (I) . Exemplosnão limitativos das doenças que requerem uma respostatipo Th-I para controle incluem infecções, cânceres,distúrbios proliferativos, e doenças auto-imunes tipo Th-2. Em uma configuração preferida, a doença que requereuma resposta tipo Th-I para controle é uma doença viralinfecciosa, por exemplo, uma infecção viralimunodeficiente humana (HIV), infecção pelo vírus dahepatite C (HCV), infecção viral da hepatite B (HBV),infecção pelo vírus da herpes, ou infecção viralsincicial respiratória (RSV). Em uma outra configuraçãopreferida, a doença é um câncer, por exemplo, um tumorsólido, tal como um carcinoma de próstata ou seio. Aindaem uma outra configuração preferida, a doença é asma.

Em uma outra configuração preferida ainda, é provido ummétodo para melhorar a imunogenicidade de um antígeno emum mamífero através da imunização do mamífero com oantígeno e juntamente com um adjuvante compreendendo ocomposto da fórmula (I). Em uma configuração preferida, oantígeno é HlV-específico, malária específico, ou câncerde próstata específico.

Ainda em uma outra configuração é provido um método parapreparar os compostos da fórmula (I) como descrito aqui.Uma configuração distinta é um método para preparar umcomposto da fórmula (I) :

<formula>formula see original document page 12</formula>

Onde:

X é 0 ou NH;

Y é -CH2-CH2- OU CH=CH-;

Quando Y for -CH2-CH2-; Q é um alquenila C23-C32 ou R1-O-R2;Quando Y for -CH=CH-; Q é alquila C27-C32; alquenila C23-R1-O-R2-; ou alquila C6-C8 substituída com fenila;R2 são grupos alquila ou alquenila substituídos ounão-substituídos, de modo que R1 e R2 combinados tenhamde 23 a 32 átomos de carbono;R3 é -OH ou monossacarídeo, e R* é H, ou Rj é H e R4 é -OHou um monossacarídeo; eR5 é hidrogênio ou um monossacarídeo; e saisfarmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dos mesmos.O método compreendendo as etapas de:(a) reagir um composto da fórmula (II)

<formula>formula see original document page 13</formula>

para primeiro remover Pgl, seguido pelo tratamento com uméster p-nitrofenila tendo a fórmula III:

<formula>formula see original document page 13</formula>

onde Q é como definido acima; e

(b) subseqüentemente, desproteger Pg2 e Pg3 e,opcionalmente, hidrogenar a dupla libação carbono-carbonoadjacente ao grupo cíclico para formar um composto dafórmula (I) . De acordo com uma configuração preferida, ocomposto da fórmula (II) é:<formula>formula see original document page 14</formula>

Breve descricao dos desenhosa figura 1 ilustra uma representacao esquematica dacitocina e da ativação da célula imune por O- e C-glicolipídios;

As figuras 2A, 2B, e 2C representam o perfil cinético deIFN-γ das citocinas tipo Th-I que é liberado naadministração dos compostos da invenção ou os compostosde controle para camundongos BALB/c (Figura 2A) e C57BL/6(Figuras 2B e 2C). Os compostos representados nas figurassão:

A = composto (trans-A-1);B = composto (A-2);C = composto (A-3);D = composto (A-4);E = composto (A-5);Z = controle (PBS sozinho);CRONY = α-C-GalCer;KRN = α-GalCer ;GCK109 = (A-1 conformação trans-);GCK151 = (A-1 conformação eis-); eGCK152 [A-7].

Os níveis de IFN-γ no soro foram medidos em 0, 2, 6, 12,24, 48 e 72 horas após a administração do composto peloensaio da imunoabsorbância ligado a enzima (ELISA). Osdados foram expressos como a média +/- desvio padrão (SD)em duas diluições diferentes do soro combinado.As figuras 3A, 3B, e 3C representam o perfil cinético deIL-12 das citocinas tipo Th-I que é liberado naadministração dos compostos da invenção ou de compostosde controle para camundongos BALB/c (Figura 3A) e C57BL/6(Figuras 3B e 3C) . Os compostos representados nas figurassão:

A= composto (trans-A-1);B = composto (A-2);C = composto (A-3);D = composto (A-4);E = composto (A-5);Z = controle (PBS sozinho);CRONY =Oc-C-GalCer;KRN = α-GalCer;GCKl0 9 = (trans- A-l);GCKl51 = (eis- A-l); eGCKl52 [A-7].

Os níveis de IL-12 no soro foram medidos em 0, 2, 6, 12,24, 48 e 72 horas após a administração do composto peloensaio da imunoabsorbância ligado à enzima (ELISA). Osdados foram expressos como a média +/- desvio padrão (SD)em duas diluições diferentes do soro combinado.As figuras 4A, 4B, e 4C representam o perfil cinêtico daIL-4 citocinas tipo Th-2 que é liberado na administraçãodos compostos da invenção ou os compostos de controlepara camundongos BALB/c (Figura 4A) e C57BL/6 (Figuras 4Be 4C) . Os compostos representados nas figuras são:A = composto (trans-A-1);B = composto (A-2);C = composto (A-3);D = composto (A-4);E= composto (A-5);Z = controle (PBS sozinho);CRONY =Oc-C-GalCer;KRN = α-GalCer;GCKl0 9 = (trans- A-l);GCKl51 = (eis- A-l); eGCK152 [A-7].

Os níveis de IL-4 no soro foram medidos em 0, 2, 6, 12,24, 48 e 72 horas após a administração do composto peloensaio da imunoabsorbância ligado à enzima (ELISA). Osdados foram expressos como a média +/- desvio padrão (SD)em duas diluições diferentes do soro combinado.

As figuras 5A e 5B representam os níveis de citocina doscompostos da invenção medidos por ELISA em um experimentohumano in vitro do sistema de célula NKT. A concentraçãode IFN-g ou IL-4 foi determinada por ELISA na cultura dossobrenadantes das células dendríticas imaturas (DCs) queforam co-cultivadas por 18 horas com singeneicos CD14-das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) empresença de vários glicolipídios (ou seja, GCK109 [trans-A-1 ] ; GCKl51 [eis- A-l] ; GCK127 [A-2] ; GCK152 [A-7] , ecompostos controle CRONY = α-C-GalCer; e KRN = a-GalCer) ; e

As figuras 6A e 6B representam o número de citocinasecretoras de PBMCs na incubação com os compostos dapresente invenção medidos por ELISPOT em um experimentohumano in vitro do sistema de célula NKT. 0 número dePBMCs secretores de IFN-γ e IL-4 foi determinado porELISPOT no co-cultivo de DCs imaturas com PBMCs CD14-singeneicos na placa de ELISPOT por 22-26 horas empresença de vários glicolipídios (ou seja, GCK142 [A-6] ;GCKl0 9 [trans- A-I]; GCK151 [eis- A-I]; GCK127 [A-2] ;GCK152 [A-7], e compostos controle CRONY =a-C-GalCer; eKRN = α-GalCer).

Descrição detalhada da invenção

Definições:

Os termos "resposta imune tipo Th-1" e "resposta imunetipo Th-2" como usados aqui se referem as respostasimunes mediadas por células T auxiliares CD4+ Thl e Th2 ,respectivamente.

Os termos "citocinas tipo Th-1" e "citocinas tipo Th-2"se referem as citocinas produzidas pelas células Thl eTh2, respectivamente. As citocinas tipo Th-I incluem, masnão estão limitadas a, IFN-γ e IL-12. Um exemplo nãolimitativo de uma citocina do tipo Th-2 é IL-4.O termo "doença que requer uma resposta imune tipo Th-1para controle" se refere a uma doença caracterizada poruma predominância da resposta imune tipo Th-2 e um perfilde citocina tipo Th-2. Exemplos das referidas doençasincluem sem limitação doenças virais infecciosas taiscomo infecção HIV, infecção HCV, infecção HBV, infecçãopelo virus da herpes, e infecção RSV; câncer tal como umcarcinoma da próstata ou carcinoma de mama; e doençasauto-imunes do tipo Th-2 tais como asma e alergia.0 termo "indução seletiva da resposta imune tipo Th-1"como usado aqui se refere à indução e/ou aumento e/ouduração elevada de uma resposta imune tipo Th-I que nãocausa uma indução concorrente e/ou melhorada e/ou umaduração aumentada de uma resposta imune tipo Th-2. Paraos compostos da presente invenção, a indução seletiva daresposta imune tipo Th-1 é refletida na secreção elevadaIL-12 e em uma ativação aumentada das células dendríticas(quando comparado aos compostos da técnica anterior), queocorrem sem um aumento concorrente da secreção de IL-4.

0 termo "monossacarídeo" se refere a uma molécula deaçúcar tendo uma cadeia de 3-10 átomos de carbono naforma de um aldeído (aldose) ou cetona (Cetose) . Osmonossacarídeos apropriados contemplados para uso nainvenção incluem tanto os de ocorrência natural quanto osmonossacarídeos sintéticos. Exemplos não limitativos demonossacarídeos apropriados incluem trioses, tais como,glicerose e diidroxiacetona; tetroses tais como eritrosee eritrulose; pentoses tais como xilose, arabinose,ribose, xilulose, ribulose; metil pentoses (6-deoxihexoses), tais como raminose e fucose; hexoses, taiscomo glicose, manose, galactose, frutose e sorbose; eheptoses, tais como glucoheptose, galamanoheptose,sedoheptulose e manoheptulose. Os monossacarídeospreferidos incluem, mas não estão limitados a, hexoses.

Uma "quantidade eficaz" do composto para tratamento deuma doença, por exemplo, um câncer, uma doençainfecciosa, ou uma doença auto-imune, é uma quantidadeque resulta na melhora medida de pelo menos um sintoma ouparâmetro da doença em um mamífero, incluindo humanos.Como usado aqui, o termo "sais farmaceuticamenteaceitáveis" ou "ésteres dos mesmos" se refere àquelessais (por exemplo, sal carboxilato, sais com adição deaminoácidos) e ésteres dos compostos da presente invençãoque são, dentro do escopo do julgamento médico apropriadopara uso no contato com os tecidos de pacientes sem atoxicidade indevida, irritação, resposta alérgica, oucondições do gênero, correspondente com uma proporçãorazoável de risco/benefício, e eficácia para seu usopretendido, bem como as formas ziteriônicas, quandopossível, dos compostos da invenção.

O termo "tratar" é usado aqui, referindo-se a prevençãode uma doença ou para aliviar ou melhorar pelo menos umsintoma de uma doença em um indivíduo. Dentro dosignificado da presente invenção, o termo "tratar" podetambém significar prolongar a pré-revelação, ou seja, operíodo entre a infecção e a manifestação clínica de umadoença.

O termo "terapeuticamente eficaz" aplicado a dose ou aquantidade refere-se àquela quantidade de um composto oucomposição farmacêutica que é suficiente para resultar emuma atividade desejada na administração para um mamíferonecessitando da mesma.

Os termos "farmaceuticamente aceitável" e"fisiologicamente aceitável" são utilizadosintercaladamente e quando usado em relação comcomposições da invenção se referem as entidadesmoleculares e outros ingredientes das citadas composiçõesque são fisiologicamente toleráveis e não produzemtipicamente reações desagradáveis quando administradas aum humano. Preferivelmente, como utilizado aqui, o termo"farmaceuticamente aceitáveis" significa aprovado por uma

Agência Regulatória, do Governo Federal ou Estadual oulistado na Farmacopéia Norte-Americana ou outrasfarmacopéias geralmente reconhecidas par auso emmamíferos, e mais particularmente em humanos.O termo "veículo" refere-se a um diluente, excipiente, ouveículo com o qual o composto da invenção é administrado.Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis,tais como água ou óleo, incluindo aqueles de petróleo,animal, vegetal ou de origem sintética, tais como óleo deamendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim edo gênero. Água ou solução aquosa, soluções salinas edextrose aquosa e soluções glicerol são preferivelmenteutilizadas como veículos, particularmente para soluçõesinjetáveis. Os veículos farmacêuticos apropriados, estãodescritos em: "Remington's Pharmaceutical Sciences", porE.W. Martin, 18th Edição.

Os termos "adjuvantes" e "imunoadjuvante" são usadosintercaladamente aqui e referem-se aos compostos oumisturas que podem ser não-imunogênica quandoadministrada aos hospedeiros sozinhos, mas que aumentam aresposta imune do hospedeiro para àqueles antígenosquando administrado conjuntamente com aquele antígeno.Como usado aqui, os termos "administração conjunta","administrado conjuntamente", e "administrando conjunto"se referem à administração de dois agentes, tais como umadjuvante imune e um antígeno, simultaneamente em umacomposição, ou simultaneamente em composições diferentes,ou seqüenciais. Para a administração seqüencial a serconsiderada "conjunta", entretanto, o antígeno e oadjuvante devem ser administrados separadamente por umintervalo de tempo que permite ainda que o adjuvanteaumente a resposta imune para o antígeno. Por exemplo,quando o antígeno for um polipeptídio, o antígeno e oadjuvante serão administrados no mesmo dia,preferivelmente dentro de uma hora da administração dooutro, e mais preferivelmente simultaneamente.Entretanto, quando o ácido nucléico for liberado aoindivíduo e o antígeno polipeptídio for expresso nascélulas do indivíduo, o adjuvante é preferivelmenteadministrado dentro de 24 horas da administração do ácidonucléico e, mais preferivelmente, dentro de 6 horas.O termo "indivíduo" como utilizado aqui refere-se a umanimal tendo um sistema imune, preferivelmente, ummamífero. Os indivíduos aos quais a presente invenção éaplicável incluem, mas não estão limitados as, vacas,cavalos, ovelhas, porcos, aves domésticas (por exemplo,galinhas), cabras, gatos, cachorros, roedores (porexemplo, Hamsters, camundongos, ratos, coelhos), macacos,primatas, e humanos. Em uma configuração preferida, oindivíduo é um humano.

O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentrode uma faixa de erro aceitável para um valor particularcomo determinado por um técnico no assunto, que dependeráem parte de como o valor for medido ou determinado, ouseja, as limitações do sistema de medida. Por exemplo,"cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais que 1desvio padrão, conforme prática do estado da técnica.Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa deaté 20%, preferivelmente até 10%, mais preferivelmente,até 5%, e mais preferivelmente, até 1% de um determinadovalor. Alternativamente, particularmente com relação aossistemas ou processos biológicos, o termo pode significardentro de uma ordem ou grandeza, preferivelmente dentrode 5-vezes, e mais preferivelmente, dentro de 2-vezes umvalor. Onde um valor particular for descrito na aplicaçãoe nas reivindicações, a menos que de outro modo indicado,o termo "cerca de" significa dentro de uma faixa de erroaceitável para o valor particular deveria assumirDe acordo com a presente invenção podem ser empregadastécnicas convencionais de biologia molecular,microbiologia, e técnicas de DNA recombinante conhecidasdo estado da técnica. As referidas técnicas são bemconhecidas e são explicadas completamente na literatura.Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis,"Molecular Cloning": A Laboratory Manual, Segunda Edição(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York" (aqui "Sambrook et al., 1989");Clonagem de DNA: "A Practical Approach", Volumes I e II(D.N. Glover Ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis"(M.J. Gai Ed., 1984); Hibridização do ácido nucléico[B.D., Hames & S.J. Higgins Eds., (1985)]; Transcrição eTranslação [B.D. Hames & S.J. Higgins, Eds, (1984)];Cultura de célula animal [r.I. Freshney, Ed. (1986)];Células imobilizadas e Enzimas [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", 91984);F.M. Ausubel et al. (Eds.), "Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley & Sons, Inc. (1994).Compostos da presente invenção:

Os compostos preferidos são da fórmula (I) onde X é O, R5é H, R3 é OH e R4 é H.

Preferivelmente, os compostos da presente invenção têmpelo menos uma ligação nucleofílica na cadeia lateral dolipídio (ou seja, o grupo Q). Cada ligação nucleofílica épreferivelmente uma ligação éter (ou seja, Q é -R1-O-R2)ou uma ligação dupla (ou seja, Q é alquenila). A ligaçãonucleofílica é, preferivelmente, posicionada em um mínimode seis átomos de carbono a partir do átomo de carbonoterminal da cadeia lateral Q. Por exemplo, a ligaçãodupla pode ser localizada em qualquer posição de 6 a 22átomos de carbono a partir do carbono terminal da cadeialateral Q.

De acordo com uma configuração, Q é um alquenila C23-C32contendo de 23 a 32 átomos de carbono, preferivelmente 25a 32, mais preferivelmente de 28 a 32 átomos de carbono,e tendo uma, duas, ou três duplas ligações.

Preferivelmente, Q tem apenas uma ligação dupla.

Preferivelmente, a dupla ligação está localizada entre C7e C12 (a partir do final da ligação do grupo Q para ogrupo carbonila) e mais pref erivelmente entre C7 e C10(por exemplo, entre C9 e C10). Preferivelmente, Q é -C8H16-CH=CH-Ci8H37. Uma família particular de compostos é quandoQ for um alquenila C23-C32 e Y for -CH=CH-,preferivelmente em uma conformação trans-,

Em uma outra configuração, Q é -R1-O-R2. 0 átomo deoxigênio pode estar localizado em qualquer lugar dentrodo grupo Q, mas está preferivelmente localizado entre C1e C25 (a partir do final da ligação do grupo Q com ogrupo carbonila) (por exemplo, entre C1 e C2 e entre C9 eC10) e mais pref erivelmente entre C18 e C25 (por exemplo,entre C19 e C2o) · Por exemplo, Q pode ser -C19H38-O-C6Hi3-.Uma família particular de compostos é quando Q é -R1-O-R2e Y é -CH2-CH2-. Em uma configuração preferida, Q é -R1-O-R2 e tanto R1 e R2 são grupos alquila.

Ainda em uma outra configuração, Q é -R1-O-R2 e pelomenos um dos R1 e R2 é alquenila. 0 grupo Q contémpreferivelmente de 1 a 3 ligações duplas e maispreferivelmente apenas uma ligação dupla. A ligação duplae o átomo de oxigênio podem estar localizados em qualquerlugar dentro do grupo Q. Preferivelmente, R1 é alquenilae, mais preferivelmente, R1 é alquenila e R2 é alquila.Quando o grupo Q contiver uma ligação dupla, elapreferivelmente, estará localizada entre C7 e Cx2 (apartir do final da ligação do grupo Q com o grupocarbonila) , mais pref erivelmente entre C7 e C10, e aindamais pref erivelmente entre C9 e C10. 0 átomo de oxigênioestá preferivelmente localizado entre Ci e C25 (a partirdo final da ligação do grupo Q com o grupo carbonila)(Por exemplo, entre C1 e C2 ou entre C9 e C10) e maispref erivelmente entre C18 e C25 (por exemplo, entre C19 eC20) . Por exemplo, Q pode ser -C8H16-CH=CH-C9Hi8-O-C6Hi3.De acordo com uma outra configuração, Y é -CH=CH- e Q éalquila C27-C23, pref erivelmente um alquila C27 ou C28.De acordo com uma outra configuração preferida Y é -CH=CH- e Q é -R1-O-R2, onde R1 e R2 são como definidosacima. Pref erivelmente, Q contém de 23 a 32 átomos decarbono, mais pref erivelmente de 25 a 32 átomos decarbono, e ainda mais pref erivelmente, de 28 a 32 átomosde carbono. Por exemplo, Q pode ser -C19H38-O-C6Hi3.

Os compostos preferidos da invenção incluem, mas nãoestão limitados a:<formula>formula see original document page 23</formula><formula>formula see original document page 24</formula>;

e sais farmaceuticamente aceitáveis e ésteres dos mesmos.Outros compostos preferidos da invenção incluem, mas nãoestão limitados a, àqueles mostrados na tabela B abaixo esais farmaceuticamente aceitável e ésteres dos mesmos.TABELA B

<table>table see original document page 25</column></row><table>Um composto distinto da invenção é um composto tendo afórmula:

<formula>formula see original document page 26</formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou éster do mesmo.Usos terapêuticos

Os compostos da invenção são úteis para tratar qualquerdoença que se beneficiaria a partir de uma induçãoseletiva de uma resposta imune tipo Th-1, especialmente apartir de uma resposta imune tipo Th-1 associada com umasecreção IL-12 aumentada e ativação melhorada de célulasapresentadoras de antígenos (APCs) tais como célulasdendríticas, que ocorrem sem uma melhora concorrentesubstancial da secreção de IL-4.

Sem estar ligada a qualquer teoria particular, osinventores da presente invenção acreditam que oscompostos da invenção media seletivamente a indução daresposta imune Th-1 por ligação ao TCR de APCs, os quaisativam as células NKT e resultam na secreção de IFN-γpelas células NKT. Entretanto, as células NKT assimativadas não secretam substancialmente quantidadessignificativas de IL-4. As células NKT ativadas ligam-seainda às células apresentando os antígenos (APCs) taiscomo as células dendríticas através do ligante CD40causando uma secreção local melhorada de IL-12. Areferida liberação local de IL-12 permite evitar osefeitos negativos associados com a toxicidade de IL-12 epermite a produção de uma resposta imune tipo Th-1 muitoeficiente e específica, por exemplo, contra tumores oupatógenos. Os inventores também acreditam que oscompostos da presente invenção agem indiretamente nascélulas dendríticas e demonstram menor atividade naativação da célula NK secundária quando comparada com α-GalCer ou α-C-GalCer (CRONY). A ativação não-específicadas células NK está assim, substancialmente limitada, oque melhora a segurança e a tolerância dos compostos dainvenção sobre os compostos da técnica anterior.

Estas propriedades tornam os compostos da invenção úteispara o tratamento do câncer, por exemplo, como agentesanti-tumor para inibir o crescimento dos tumores, e parao tratamento dos distúrbios proliferativos celulares. Oscompostos da invenção podem ser usados sozinhos, ou emcombinação com quimioterapia, radioterapia ouimunoterapia.

Mais especificamente, os compostos da invenção são úteisno tratamento de uma variedade de cânceres incluindo, masnão limitados a, carcinoma tais como carcinoma de bexiga,mama, cólon, rim, fígado, pulmão, incluindo o câncer depulmão de células pequenas, câncer de pulmão de célulasnão pequenas, esôfago, vesícula biliar, ovário, pâncreas,testicular, estômago, renal, fígado, cérvix, tireóide,próstata, e pele, incluindo carcinoma escamoso decelular; tumores hematopoiéticos de linhagens linfóides,incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemialinfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma decélula T, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin,linfoma de célula do couro cabeludo, e linfoma deBurkett; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide,incluindo, leucemia mielogenosa aguda e crônica, leucemiada síndrome mielodisplásica e promielocísticas; tumoresde origem mesenquimal, incluindo fibrosarcoma erabdomiosarcoma; tumores do sistema nervoso central eperiférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, gliomae tumores das células de Schwann (Schwannomas); outrostumores incluindo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma,osteosarcoma, xenoderoma pigmentoso, keratoctantoma,câncer folicular tireóide e sarcoma de Kaposi. Em umaconfiguração preferida, o câncer é um tumor sólido talcomo carcinoma de próstata ou carcinoma de mama.Os distúrbios proliferativos celulares para os quais oscompostos são úteis incluem, mas não estão limitados a,hiperplasia benigna da próstata, pólipos adenomatosofamiliar, neuro-fibromatose, psoríases, proliferação lisada célula vascular associada com aterosclerose, fibrosepulmonar, artrite glomerulonefrite, e estenose ereestenose pós-cirúrgica.

Em uma outra configuração, os compostos da invençãotambém são úteis para o tratamento de doençasinfecciosas, incluindo tanto infecções virais quantoinfecções não-virais.

Por exemplo, os compostos são úteis no tratamento deinfecções virais causadas por retroviridae (por exemplo,vírus da imunodeficiência humana, tal como HIV-I (tambémreferido como HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV, ou HIV-III);e outros isolados, tais como HIV-LP; Picornaviridae (porexemplo, vírus da pólio, vírus da hepatite A,enterovírus, vírus Coxsackie, rinovírus, ecovírus) ;Calciviridae (por exemplo, cepas que causamgastroenteritis); Togaviridae (por exemplo, vírus daencefalite eqüina, vírus da rubéola); Flaviridae (porexemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite, vírus dafebre amarela); Coronaviridae (Por exemplo, coronavírus);Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatitevesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo,vírus Ebola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírusparainfluenza, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírussincicial respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo,vírus influenza); Bungaviridae (por exemplo, vírusHantaanf vírus Bunga, vírus flebovírus e Nairo); Arenaviridae (vírus da febre hemorrágica); Recoviridae (porexemplo, reovírus, orbivírus e rotavírus); Birnaviridae;Hepadnaviridae (vírus da hepatite B) ; Parvoviridae(parvovírus); papovaviridae (papiloma vírus, víruspolioma); Adenoviridae (mais adenovírus); Herpesviridae(vírus simples da herpes (HSV) 1 e 2; vírus herpesZoster, varicela, citomegalovírus (CMV), vírus daherpes) ; Poxviridae (vírus da varíola, vírus vaccinia,vírus da varíola); e Iridoviridae (por exemplo, vírus dafebre suína africana); e vírus não classificados (porexemplo, agentes etiológicos de encefalopatiasEspongiformes, o agente da hepatite delta (acredita-seser um satélite defeituoso do vírus da hepatite B); osagentes da hepatite não-A, não-B (classe 1 = transmitidainternamente; classe 2 = transmitida parenteralmente (ouseja, Hepatite C) ; vírus Norwalk e vírus relacionados eastrovírus)).

Os compostos da invenção também são úteis no tratamentode infecções bacterianas causadas por Helicobacterpylori, Borellia burgdorferi, Legionella pneumophilia,Mycobacteria sps (por exemplo, M. tubercuolosis, M.avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae),Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseriameningitidis, Listeria monoeytogen.es, Streptoeoeeuspyogenes (Grupo A - Streptoeoeeus), Streptoeoeeusagalaetiae (Grupo B - Streptoeoeeus), Streptoeoeeus(grupo viridans), Streptoeoeeus faeealis, Streptoeoeeusbovis, Streptoeoeeus (espécie anaeróbiea), Streptoeoeeuspneumoniae, Campylobaeter sp patogênico, Enterocoeeus sp,Pseudomonas sp, Pneumoeoceus sp, Chlamidia sp,Haemophilus influenzae, Baeillus antracis,corynebacterium diphtheriae, eorynebacterium sp,Erysepelothris rhusiopathiae, Clostridium perfringers,Clostridium tetani, Enterobaeter aerogenes, Klebsiellapneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp,Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis,Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira,Actinomyces israelli e Francisella tularensis. Infecçõesfúngicas ou por protozoas causadas por Cryptococcusneoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis,Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candidaalbicans.

Os compostos da invenção também são úteis no tratamentode infecções causadas por outros organismos infecciosostais como protistis incluindo Plasmodium sp, Leishmaniasp, Schistosoma sp e Toxoplasma sp bem como leveduras eoutros fungos.

Em uma configuração preferida, os compostos da invençãosão úteis no tratamento de doenças auto-imunes, as quaisrequerem uma resposta tipo Th-I para controle, tal comoda asma e alergia.

Os métodos terapêuticos e profiláticos da invenção podemser usados em conjunto com outros tratamentos. Porexemplo, um tratamento anti-câncer usando os compostos dapresente invenção podem ser usados em combinação com aquimioterapia e/ou radioterapia. Os tratamentos anti-virais usando os compostos da presente invenção podem serusados em combinação com o tratamento IFN-a.Em conjunto com os métodos da presente invenção, ainvenção também provê composições farmacêuticas ecomposições de vacina compreendendo uma quantidadeimunogenicamente eficaz de um composto da Fórmula (I) e,opcionalmente, um imuno-estimulante adicional, veículo ouexcipiente (preferivelmente todos farmaceuticamenteaceitáveis).

Formas de administração

As formas de administração dos compostos e composições dainvenção incluem, mas não estão limitadas a, oral,enteral, intravenoso, intramusculares, intra-tumoral,subcutânea, transdérmico, intranasal, transmucosal(incluindo retal e bucal), e inalação. Preferivelmente,uma administração oral, transdérmica, subcutânea, ou umarota por inalação ou intranasal é utilizada (por exemplo,via formulação oral sólida ou líquida, adesivos de pele,sprays nasais, respectivamente). Em alguns casos, oscompostos podem ser pulsados com células dendríticassingenéicas, seguido por transferência intravenosa dentrodos pacientes. Ou seja, as células dendríticas podem serincubadas com os compostos para permitir que as célulasdendríticas se liguem ao composto através de suasmoléculas CDld. Estas células dendríticas carregadas como composto podem então ser intravenosamente transferidasdentro dos pacientes. A transferência intravenosa podeser tanto local quanto sistêmica.

Composições farmacêuticas

As formas de dosagens sólidas para administração oral doscompostos e composições da invenção incluem cápsulas,tabletes, pílulas, pós, grânulos e supositórios. Nasreferidas formas de dosagem sólidas, o composto ativo dainvenção pode ser misturado com pelo menos um excipienteinerte habitual (ou veículo) tal como citrato de sódio oufosfato de cálcio; ou (um) enchimento ou espessante, comopor exemplo, amido, lactose, sacarose, glicose, manitol,e ácido sílico; (b) ligantes, como por exemplo,carboximetilcelulose, alginatos, gelatina,polivinilpirrolidona, sacarose, e acácia; (c) umectantes,como por exemplo, glicerol; (d) agentes desintegrantes,como por exemplo, Agar-agar, carbonato de cálcio, batataou amido de tapioca, ácido algínico, determinadossilicatos complexos, e carbonato de sódio; (e) soluçõesretardadoras, como por exemplo parafina; (f) aceleradoresde absorção, como por exemplo, compostos de amônioquaternário; (9g) agentes umidificantes, como porexemplo, álcool cetila, e monoestearato de glicerol; (h)adsorventes, como por exemplo, Caolin e bentonita; e (i)lubrificantes, como por exemplo, talco, estearato decálcio, estearato de magnésio, polietileno glicol sólido,lauril sulfato de sódio, ou misturas dos mesmos. No casode cápsulas, tabletes e pílulas, as formas de dosagempodem também compreender agentes de tamponamento. Asreferidas composições sólidas ou composição sólida quesão similares àquelas descritas podem ser empregadas comoenchimentos em cápsulas de gelatina moles e duras usandoexcipientes tais como lactose ou leite, açúcar bem comomoléculas de alto peso molecular, polietileno glicol e dogênero.

As formas de dosagem sólidas tais como tabletes,cápsulas, drágeas, pílulas e grânulos podem serpreparados com revestimentos e cascas, tais comorevestimentos entéricos ou outros revestimentosapropriados ou cascas. Muitos dos referidos revestimentose/ou cascas são bem conhecidos do estado da técnica, epodem conter agentes de opacidade, as referidascomposições também podem liberar o composto ativo ou oscompostos em uma determinada parte do trato intestinal deuma maneira tardia. Exemplos de composições embutidas quepodem ser usadas como substâncias poliméricas e ceras. Oscompostos ativos podem ser também utilizados em uma formamicro-encapsulada, se apropriado, com um ou mais dosexcipientes acima mencionados.

As formas de dosagens líquidas para administração oralincluem emulsões farmaceuticamente aceitáveis, soluções,suspensões, xaropes, e elixires. Em adição aos compostosativos, as formas de dosagens líquidas podem conterdiluentes inertes comumente usados na técnica, tais comoágua ou outros solventes, agentes solubilizantes eemulsificantes, como por exemplo, álcool etílico, álcoolisopropílico, carbonato de etila, acetato de etila,álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol,1, 3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos, emparticular, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim,óleo de germe de milho, óleo de oliva, óleo de rícino eóleo de gergelim, glicerol, álcool tetrahidrofurfuril,polietileno glicol e ésteres de ácido graxo sorbitana oumisturas destas substâncias, e do gênero. Se desejado, acomposição pode também incluir adjuvante, tais comoagentes umidificantes, emulsificantes e agentes desuspensão, adoçantes, aromatizantes e/ou agentesodorizantes.

A composição pode incluir um veículo, como definido aqui.Os veículos apropriados incluem, macromoléculas que sãosolúveis no sistema circulatório e que sãofisiologicamente aceitáveis, como definido aqui. 0veículo preferivelmente é relativamente estável nosistema circulatório com uma meia vida no plasmaaceitável para liberação. As referidas macromoléculasincluem, mas não estão limitadas a, lecitina de soja,ácido oléico e trioleato de sorbitana, com trioleato desorbitana sendo preferido.

As suspensões, em adição aos compostos ativos, podemconter agentes de suspensão, tais como, álcool isosteariletoxilado, ésteres sorbiol e polioxietileno sorbitana,celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio,bentonita, Agar-agar, tragacanto, e do gênero. Misturasdos agentes de suspensão podem ser utilizadas sedesejado.

As composições para administração retal são,preferivelmente, supositórios que podem ser preparadospor misturas dos compostos da presente invenção comexcipientes não-irritativos apropriados ou veículos taiscomo manteiga de cacau, polietileno glicol, ousupositórios em cera que são sólidos em temperaturasordinárias mas líquidos na temperatura do corpo e,portanto, derretem no reto ou na cavidade da vagina eliberam o composto ativo.

As composições apropriadas para injeção parenteral podemcompreender soluções aquosas ou não-aquosas estéreisfisiologicamente aceitáveis, dispersões, suspensões ouemulsões, e pós-estéreis para reconstituição dentro desoluções injetáveis estéreis ou dispersões. Exemplos deveículos não-aquosos ou aquosos apropriados, diluentes,solventes ou veículos incluem, água, etanol, polióis(propileno glicol, polietileno glicol, glicerol, e dogênero), misturas apropriadas dos mesmos, óleos vegetais(tais como óleo de oliva) e ésteres orgânicos injetáveistais como, oleato de etila. A fluidez própria pode sermantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento talcomo lecitina, para manutenção do tamanho requerido dapartícula no caso de dispersões e pelo uso desurfactantes.

As formas de dosagens para administração tópica de umcomposto da invenção incluem pomadas, pós, sprays einalantes. O composto ativo pode ser misturado sobcondições apropriadas (por exemplo, condições deesterilização) com um veículo fisiologicamente aceitávele qualquer conservante, tampão, ou propulsor como podeser requerido. Formulações oftalmológicas, pomadasoculares, pós, e soluções são também contempladas comoestando dentro do escopo desta invenção.

Os compostos da invenção podem ser formuladosvantajosamente em uma forma apropriada para administraçãopara inalação ou intra-nasalmente, o que éparticularmente útil quando do tratamento de asma oudoenças respiratórias alérgicas. A seleção dosexcipientes particulares para as referidas formulaçõesdepende da forma de dosagem desejada, ou seja, se umasolução deve ser usada em gotas ou como spray (aerossol)ou como uma suspensão, pomada ou gel a ser aplicado nacavidade nasal.

Um pacote aerossol ou pressurizado pode ser empregadopara este propósito. A referida formulação aerossolcompreende partículas muito finas líquidas ou sólidascarregadas por um gás propulsor sob pressão para um sítiode aplicação terapêutica. Quando um aerossol farmacêuticoé empregado nesta invenção, o aerossol contém o compostoterapeuticamente ativo, que pode ser dissolvido,suspenso, ou emulsifiçado em uma mistura de um veículofluido e um propulsor. 0 aerossol pode estar na forma deuma solução, suspensão, emulsão, pó, ou preparação semi-sólida. 0 aerossol empregado na presente invenção estápretendido para administração como partículas finas,sólidas ou como vapor líquido via trato respiratório deum paciente. Vários tipos de propulsores conhecidos de umtécnico no assunto podem ser utilizados. Exemplos depropulsores apropriados incluem, mas não estão limitadosa, hidrocarbonos ou outros gases apropriados. No caso doaerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode serdeterminada pela provisão de um valor a ser liberado comuma quantidade dosada. A presente invenção pode tambémser realizada com um nebulizador, que é um instrumentoque produz partículas líquidas muito finas com um tamanhosubstancialmente uniforme em um gás. Preferivelmente, umliquido contendo o composto da invenção é disperso comoconta-gotas. As pequenas gotas podem ser conduzidas poruma corrente de ar através de um tubo externo donebulizador. 0 vapor resultante penetra dentro do tratorespiratório do paciente.

Alternativamente, uma composição em pó contendo oscompostos da invenção, com ou sem um lubrificante,veículo, ou propulsor pode ser administrada a um mamíferonecessitando desta terapia. Esta configuração da invençãopode ser realizada com um dispositivo convencional paraadministração de uma composição farmacêutica em pó porinalação. Por exemplo, uma mistura de pó do composto e umpó básico apropriado tal como lactose ou amido pode estarpresente em uma forma de dose unitária em, por exemplo,cápsulas ou cartuchos, por exemplo, de gelatina, oubolhas, pacotes, a partir dos quais o pó pode seradministrado com o auxílio de um inalador.

Para administração aerossol, o composto da invenção podeestar na forma de partículas micronizadas de cerca de 1 acerca de 20 μm, preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 10 μm.

Em uma configuração específica, os compostos da invençãosão liberados por lipossomos ou partículas micelares.

Quando administrado parenteralmente, tanto por rotaintravenosa, subcutânea quanto intramuscular, oslipossomos podem prover uma liberação controlada em"depósito" do fármaco encapsulado sobre um período detempo prolongado, e reduzir os efeitos colaterais dofármaco, por limitação da concentração do fármaco livrena corrente sangüínea. Os lipossomos podem alterar adistribuição no tecido de e na tomada do fármaco, em umarota terapeuticamente favorável, e pode aumentar aconveniência da terapia, por permitir administração menosfreqüente do fármaco.

Quando administrado por inalação, os lipossomos podem seradaptados para, de acordo com a composição lipídica,liberar um fármaco capturado em uma taxa de liberaçãoselecionada que pode variar, em meia vida, a partir depoucas horas a muitos dias. Adicionalmente, a extensão dofármaco que é seqüestrada nos lipossomos, efeitoscolaterais relacionados à rápida percepção dentro dotrato respiratório e da corrente sangüínea são reduzidos.

Uma vantagem adicional dos lipossomos para liberação dofármaco ao tecido da mucosa é que as superfícies doslipossomos podem ser modificadas para espessuras maioresde tecidos, para melhorar o tempo de resistência doslipossomos no sítio de tecido alvo.

Vários métodos para preparação de lipossomos com capturado fármaco são conhecidos. Em um método, vesículasformadoras de lipídios são depositadas como um filme finonas laterais de um frasco, e vagarosamente re-hidratadopor adição de um tampão aquoso. 0 fármaco a ser capturadopode ser incluído tanto no filme líquido (no caso de umfármaco lipofílico), quanto em um meio de hidrataçãoaquoso (no caso de um fármaco hidrofílico) . Os lipossomosque se forma são vesículas multi-lamelares (MLVs) tendotamanhos heterogêneos entre cerca de 0,05 e 10 mícrons.

Os MLVs podem ser subseqüentemente processados,tipicamente por homogeneização, sonicação, ou extrusãopor membrana, para produzir, uma suspensão de tamanhomenor, mais uniforme. 0 tamanho do lipossomo abaixo decerca de 0,2-0,4 mícrons é geralmente preferido. Oslipossomos nesta faixa de tamanho podem ser esterilizadosatravés da passagem por um filtro com uma profundidade de0,4 5 microns, tendo menos tendência a agregar, e tambémpode demonstrar maior distribuição favorável no órgãoquando administrado intravenosamente (Gabizon). Uma vezque a formulação lipossomal é preparada, ela pode serliofilizada, preferivelmente, usando crioprotetores,presentes tanto no meio interno bem como no meio externodos lipossomos.

Estes crioprotetores podem ser selecionados a partir deaçúcares tais como sacarose, trealose, lactose, maltose,manitol, ciclodextrina e seus derivados.

Estes crioprotetores podem se também poliméricos taiscomo polietileno glicol, dextrana, polivinilpirrolidona,ou amido hidroxietila.

Estes crioprotetores podem ser usados sozinhos ou comouma combinação.

Os aminoácidos podem ser ainda utilizados quando docongelamento-secagem das formulações lipossomais.Os crioprotetores são introduzidos dentro da camadaintralipossomal aquosa durante a preparação doslipossomos vazios para uso destes crioprotetoresdissolvidos no meio de hidratação. Externamente, oscrioprotetores são introduzidos durante a realização dadiafiltragem após o término do processo de carga dofármaco. Os crioprotetores desejados podem também serintroduzidos por troca do tampão externo de qualquerformulação de suspensão lipossomal por diafiltragem. Asuspensão lipossomal é colocada dentro de garrafas eliofilizada.

Outras formulações não-lipossomais compreendendo ocomposto da invenção podem ser congeladas-secas também.

Uso do adjuvante

A invenção provê ainda um método para melhorar aimunogenicidade de um antígeno em um mamífero, ditométodo compreendendo imunizar o mamífero juntamente com oantígeno e com um adjuvante compreendendo um composto daFórmula I.

De acordo com a presente invenção, o uso dos compostos daFórmula I como um adjuvante resulta em uma melhora e/ouextensão da duração da imunidade protetora induzida porum antígeno. Por exemplo, como descrito aqui,administração conjunta dos compostos da Fórmula I compeptídeos correspondentes aos epítopos das células T oucélulas B de tumor ou antígenos virais, ou constructos deDNA, expressando estes antígenos melhoram as respostasimune antígeno-específicas.Os adjuvantes da Fórmula I podem ser administradosconjuntamente com qualquer antígeno, em particular, comantígenos derivados de agentes infecciosos ou de tumores.Como especificado acima, a atividade do adjuvante doscompostos da invenção é atribuída pelo menos em parte asua capacidade de melhorar e/ou estender as respostas dascélulas T tipo Th-I antígeno específica mediada pelascélulas dendríticas e mediada por NKT e as respostas dascélulas T CD8+.

Quando comparado aos compostos da técnica anterior(incluindo KRN70 0 0 e CRONY 101), a capacidade doscompostos da presente invenção em conseguir uma induçãoseletiva de resposta imune tipo Th-I (ou seja, conseguiruma eficiente, específica e localizada ativação dosistema da célula NKT e, em particular, secreção IL-12aumentada e eficiente e ativação secundária localizadadas células dendríticas na ausência da secreção aumentadade IL-4), resulta em uma citotoxidade aumentadalocalizada das células NKT ativadas na ausência de umacitotoxicidade não-específica, tornando o composto dainvenção muito eficaz na imunogenicidade aumentada devários tumores e antígenos infecciosos caracterizados porbaixa imunogenicidade. Além disso, a ativação das célulasNKT pelos compostos da presente invenção é dependente deuma molécula CDld, que é monomórfica entre os individuais(Porelli, "Adv. Immunol.", 59: 1-98, 1995), indicando queos adjuvantes da invenção podem ser utilizados por todosos pacientes, sem levar em consideração o haplotipo MHC.De acordo com a presente invenção, um antígeno e umadjuvante compreendendo um composto da Fórmula (I) sãoconjuntamente administrados. Formas de administração deum antígeno e de um adjuvante incluem, mas não estãolimitadas a, administração oral, enteral, intravenosa,intramuscular, intra-tumoral, subcutânea, transdérmica,intranasal, transmucosal (incluindo retal e bucal), einalação. Preferivelmente, uma rota oral, transdérmica,subcutânea, ou inalação ou rota intranasal é utilizada(por exemplo, via formulações orais sólidas ou líquidas,adesivos de pele, ou sprays nasais, respectivamente). Atransferência intravenosa pode ser tanto local ousistêmica. A administração simultânea de uma adjuvantecompreende um composto da presente invenção com oantígeno é preferido e geralmente permite uma imuno-estímulo muito mais eficiente. Se contido em duascomposições diferentes, os adjuvantes e antígenos dainvenção são administrados, preferivelmente, no mesmosítio e, pref erivelmente, não mais do que dentro de umcentímetro um do outro.

Como o adjuvante da invenção exerce sua atividade imuno-estimulatória em combinação com uma pluralidade deantígenos diferentes, ele é portanto, útil tanto paraaplicações preventivas quanto para aplicaçõesterapêuticas. Consequentemente, em um aspecto adicional,a invenção provê um método profilático e/ou terapêuticopara tratar uma doença que requer uma resposta tipo Th-Ipara controle em um mamífero compreendendo aadministração conjunto ao referido mamífero de umantígeno e um adjuvante compreendendo um composto dafórmula (I). Este método pode ser útil, por exemplo, paraproteger contra e/ou tratar várias infecções bem comopara tratar várias doenças neoplásicas.

Em uma configuração é provido um método para melhorar umaresposta imune para uma infecção do vírus daimunodeficiência humana (HIV), uma infecção do vírus dahepatite C (HCV), infecção do vírus da hepatite B (HBV),infecção do vírus da herpes, ou uma infecção do vírussincicial respiratório (RSV) em um mamífero poradministração conjunto ao mamífero de um antígeno vírus-específico e um composto adjuvante da fórmula (I). Umaoutra configuração é um método para aumentar a respostaimune para um câncer de próstata ou mama em um mamíferopor administração conjunto ao mamífero de um antígenocâncer-específico e um composto adjuvante da fórmula (I).

Os métodos terapêuticos e profiláticos da invenção podemser usados em conjunto com outros tratamentos. Porexemplo, um tratamento anti-câncer usando um antígenotumor-específico e um adjuvante da presente invençãopodem ser usados em combinação com quimioterapia e/ouradioterapia. As vacinas anti-virais compreendendoadjuvantes da invenção podem ser usadas em combinação como tratamento IFN-a.

Em conjunto com os métodos da presente invenção, ainvenção provê composições de vacina e composiçõesfarmacêuticas compreendendo uma quantidade

imunogenicamente eficaz de um antígeno e uma quantidadeimunogenicamente eficaz de uma adjuvante compreendendo umcomposto da fórmula (I) e, opcionalmente, um imuno-estimulante adicional, veículo ou excipiente(preferivelmente todos os farmaceuticamente aceitáveis) .O referido antígeno e o adjuvante podem ser tantoformulados como uma composição única quanto em duascomposições separadas.

Os antígenos usados em composições imunogênicas doexemplo da presente invenção (por exemplo, vacina) podemser derivados de uma célula eucariótica (por exemplo,tumor ou parasita bem como leveduras e outros fungos) ,célula bacteriana, partícula viral, ou qualquer porçãodos mesmos. No caso do material para o qual a respostaimunogênica é dirigida ser pobremente antigênica (por

exemplo, um sintético ou um antígeno subunidade), elepode ser adicionalmente conjugado a uma molécula veículotal como albumina ou hapteno, usando uma técnica deligação de padrão covalente, por exemplo, com um dosvários kits de reagente disponíveis comercialmente. Elepode incluir ainda uma entidade de molécula específicapara induzir um alvo específico para APCs, tal como umasubunidade beta da toxina Shiga, peptídeos com afinidadea célula dendrítica específica (Haicheur N, Bismuth E.,Bosset S., Adotevi O, Warnier G, Lacabanne V, Regnault A,Desayard C, Amigorena S, Ricciardi-Castagnoli P, Goud B,Fridman WH, Joahannes, L, Tartour Ε. A subunidade B datoxina Shiga fundida ao antígeno do tumor produz CTL e ascélulas dendríticas alvo para permitir a apresentaçãorestrita da classe I MHC dos peptídeos derivado deantígenos exógenos. J. Immunol., 2000, Setembro 15; 165(6): 3301-8), peptídeo com afinidade aos receptores DEC-205 (Sevilla et al. , "J. Exp. Med.", 2000, 192: 1249-1260) , um anticorpo contra DC-SIGN (Tacken PJ, de VriesIJ, Gijzen K, Joosten B, Wu D, Rother RP, Faas SJ, PuntCJ, Torensma R, Adema GJ, Figdor CG) . A indução eficazde naive e respostas da célula T recorrente pelo antígenoalvo para as células dendríticas humanas via um anticorpoanti-DC-SIGN humanizada. "Blood", 2 005, Agosto 15:106 (4) : 1278-85.

Exemplos dos antígenos preferidos da presente invençãoincluem (i) antígenos malária-específico tais comoesporozoíta plasmodiais irradiados ou antígenospeptídicos sintéticos compreendendo pelo menos uma célulaT e/ou epítopo célula B da proteína circunsporozoítamalaria (CS) (ver abaixo); (ii) proteína viral ouantígenos peptídicos tais como àqueles derivados a partirdo vírus influenza (por exemplo, hemaglutininaglicoprotéica de superfície (HA) e neuraminidase (NA)[tais como influenza turca HA ou influenza de aves HÁ) ;vírus da imunodeficiência (por exemplo, um antígeno dovírus da imunodeficiência felina (FIV), um antígeno. dovírus da imunodef iciência do símio (SIV) , ou um antígenodo vírus da imunodeficiência humana (HIV), tais como, osantígenos gpl20, gpl60, pl8, Gag pl7/p24, Tat, Pol, Nef,e Env; herpes vírus (por exemplo, uma glicoproteína, talcomo, obtida do herpes vírus de felinos, herpes vírus deeqüinos, herpes vírus de bovinos, vírus pseudo raiva,herpes vírus canino, vírus simplex herpes (HSV, porexemplo HSV tk, gB,gD), Vírus da doença de Marek, herpesvírus dos turcos (HVT), ou citomegalovírus (CMV) , ouvírus Epstein-Barr); vírus da hepatite (por exemplo,antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg)); (iii)antígenos bacterianos tais como lipo-polissacarídeosisolados a partir das paredes de células bacterianasgram-negativas e estafilococos específicos, estreptococosespecíficos, pneumococos específicos (por exemplo, PspA[ver, a publicação internacional No.: WO 92/14488],Neisseria gonorréia específica, Borrelia específica (porexemplo, antígenos OspA, OspB, OspC de Borreliaassociados com doença de Lyeme tal como Borreliaburgdorfeir, Borrelia afzelli, e Borrelia garinii [ver,por exemplo, a Patente U.S. No. 5,523,08 9; a publicaçãointernacional Nos.: WO 90/0441, WO 91/09870, WO 93/04175,WO 96/06165, WO 93/08306; PCT/US92/08697; Bergstrom etal., "Mol. Microbiol.", 3: 479-486, 1989; Johnson et al. ,"Infect. And Immun.", 60: 1845-1853, 1992; Johnson etal . , "Vaccine", 13: 1086-1094, 1995; "The SixthInternational Conference on Lyme Borreliosis: Progresson the Development of Lyme Disease Vaccine", Vaccine 13:133-135, [1995] ; (iv) , e proteínas tumor-específica taiscomo, receptores ErbB, Melan A [MARTI], gplOO,tirosinase, TRP-1/gp75, e TRP-2 (em melanoma); MAGE-1 eMAGE-3 (na bexiga, cabeça e pescoço, e carcinoma decélulas não-pequenas); HPV EG e proteínas E7 (em câncercervical); Mucin [MUC-1] (em câncer de mama, de pâncreas,de cólon, e câncer de próstata); antígeno próstata-específico [PSA] (em câncer de próstata); antígenocarcinoembriônico [CEA] (em câncer de cólon, mama egastrointestinal) e os referido antígenos tumor-específico divididos como MAGE-2, MAGE-4, MAGE- 6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1, 2, 8; CAGE-3 A 7, LAGE-1,NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2, e WT-1 (gene dotumor de Willms).

A lista acima dos antígenos são exemplos pretendidos,como o antígeno de interesse pode ser derivado a partirde qualquer patógeno ou tumor humano ou animal. Comrelação ao DNA codificando os antígenos derivados dopatógeno de interesse, atenção é dirigida a, por exemploas patentes norte-americanas Nos.: 4,722,848; 5,174,993;5,338,683; 5,494,807; 5,503,834; 5,505,941; 5,514,375;5,529,780; a patente inglesa No.: GB 2,269,820 B; e apublicação internacional Nos.: WO 92/22641; WO 93/03145;WO 94/16716; WO 96/3941; PCT/US94/06652. Com relação aosantígenos derivados de viroses tumorais, referência éfeita também ao "Molecular Biology of Tumor Viruses", RNATumor Viruses, Segunda Edição, Editado por Wess et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. Para uma listade antigenos adicionais úteis nas composições da invençãover também "Stedman's Medicai Dictionary" (24° edição, 1982).

Em uma configuração, as composições da presente invençãoprovêm imunidade protetora contra malária, em particularcontra P. yoelii e espécies plasmodiais humanas maioresP. falciparum e P. vivax. Estas composições compreendemum ou mais dos componentes a seguir:

(i) pelo menos um peptídeo malária específicocompreendendo um epítopo de célula T capaz de retirar umaresposta de célula T anti-malária preferivelmente, emmamíferos de antecedentes genéticos diversos (porexemplo, YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK[SED.ID.NO:1] ou SYVPSAEQI[SEQ.ID.NO:2] epítopo de célula T de P. yoelii proteínaCS [Renia et al., "J. Immunol.", 22: 157-160, 1993;Rodrigues et al, "Int. Immunol.", 3: 579-585, 1991] ou(NVDPNANP)n [SEQ.ID.N0:3] OU EYLNKIQNSLSTE WSPCSVT[SEQ. ID.N0:4] epítopo de célula T de P. falciparum daproteína CS [Nardin et al., "Science", 246:1603, 1989;Moreno et al., "Int. Immunol.", 3: 997: 1991; Moreno etal., "J. Immunol.", 151: 489, 1993]); e/ou (ii) pelomenos um peptídeo malária específico compreendendo umepítopo de célula B (por exemplo, (NANP)3 [SEQ.ID.NO:5]epítopo de célula B localizado dentro da região repetidada proteína CS de P. falciparum [Nardin et al., "J. Exp.Med.", 156: 20, 1982; Nardin et al., "Ann. Rev.Immunol.", 11: 687, 1993]) capaz de estimular a produçãode anticorpos anti-malária (ou seja, neutralizantes) (porexemplo, dirigido contra o esporozoíta do organismomalarial). Preferivelmente, as composições imunogênicasda presente invenção compreendem pelo menos um epítopo decélula B e pelo menos um epítopo de célula T. Os epítoposde célula B preferivelmente puxam a produção dosanticorpos que reconhecem especificamente e se ligam aproteína circunsporozoíta da malaria (CS).Alternativamente, ou em adição, as composições dainvenção podem compreender epítopos de células B e/oucélulas T derivadas de, e reativo com, ouros componentesda malária, tais como, por exemplo, a proteína 1 ou 2,secretada pelo eritrócito de o P. vivax (PvESP-1 ouPvESP-2) (ver, por exemplo, a patente norte-americanaNo.: US 5,874,527), a proteína de superfície doesporozoíta de P. falciparum designado Trompospondinrelacionado com a proteína de adesão (anônima) (TRAP),também chamada proteína de superfície 2 de esporozoíta(SSP2), LSA-1, hsp70, SALSA, STARP, Hepl7, MAS, RAP-1, eRAP-2. Em uma configuração, os componentes dos epítopo dacélula Beo epítopo da célula T são incorporados dentrodos peptídeos dos antígenos múltiplos (MAPs), formando umpolipeptídio macromolecular sintético contendo uma altadensidade dos epítopos. Os métodos para a síntese de MAPsão bem conhecidos da técnica (ver, por exemplo, Tam,nProc. Natl. Acad. Sci.", USA, 85: 5409, 1988; Tam,uMeth. Enzymol.", 168: 7, 1989).

A presente invenção também abrange os epítopos dascélulas B e células T derivados de outras espéciesplasmodiais, incluindo sem limitação P. malariae, P.ovale, P. reichenowi, P. knowlesi, P. cynomolgi, P.brasilianum, P. berghei, e P. chabaudi. Estes epítoposcompreendem tipicamente entre 8 e 18 resíduosaminoácidos, derivado de uma proteína plasmodial.Em uma outra configuração específica, um antígenopreferido da invenção é HlV-específica (tal como epítopoda célula T, RGPGRAFVTI [SEQ.ID.NO;6] da proteína pl8) .Em uma configuração específica, o antígeno da invençãopode ser apresentado por um vírus recombinanteexpressando o antígeno. Preferivelmente, o vírus éselecionado a partir do grupo consistindo de umadenovírus recombinante, vírus da varíola recombinante, evírus Sindbis recombinante.

Quando usado como adjuvante, os compostos da invençãopodem ser administrados como parte de uma composiçãofarmacêutica ou vacina compreendendo um antígeno ou comouma formulação separada, que é administrada conjuntamentecom uma segunda composição contendo um antígeno. Emqualquer uma destas composições do composto da invençãopodem ser combinados com outros adjuvantes e/ouexcipientes/veículos. Estes outros adjuvantes incluem,mas não se limitam a, emulsão oleosa, e adjuvantesbaseados em emulsificantes tais como adjuvante de Freundcomplete, adjuvante de Freund incompleto, MF59 ou SAF;gel mineral tal como hidróxido de alumínio (alum) ,fosfato de alumínio ou fosfato de cálcio; adjuvantesderivado microbiano, tais como toxina do cólera (CT) ,toxina pertussis, toxina (LT) de Escherichia coli instávelao calor, toxinas mutantes (por exemplo, LTK63 ou LTR72),Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) , Corynebacterium parvum,porções DNA CpG, dipeptídeo muramil, ou lipídio Amonofosforil; adjuvantes particulados tais como complexosimunoestimulatórios (ISCOMs), lipossomos, microesferasbiodegradáveis, ou saponinas (por exemplo, QS-21);citocinas tais como IFN-γ, IL-2, IL-12 ou GM-CSF;adjuvantes sintéticos tais como copolímeros bloqueadoresnão-iônicos, análogos de peptídeos muramila (por exemplo,N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina [thr-MDP], N-acetil-nor-muramyl-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-[1' -2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfori-loxi]etilamina), polifosfazenos, ou polinucleotídeossintéticos, e substâncias ativas de superfície tal comolisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos,emulsões de hidrocarbono, ou hemocianinas do moluscoKeyhole limpet (KLH) . Preferivelmente, estes adjuvantesadicionais são também farmaceuticamente aceitáveis parauso em humanos.Pureza das composições

Os compostos da presente invenção são preferivelmentepurificados a um nível de pureza de pelo menos 75%, maispreferivelmente, pelo menos 85%, ainda maispreferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% OU 99%.

Dosagens eficazes

Uma quantidade eficaz para tratamento das doenças podefacilmente ser determinada por métodos empíricosconhecidos dos técnicos no assunto, tal como peloestabelecimento de uma matriz de dosagens e freqüênciasde administração em comparação com um grupo de unidadesexperimentais ou um submetido a cada um dos pontos namatriz. A quantidade exata a ser administrada a umpaciente irá depender das doenças particulares, o estadoe a severidade da doença, e a condição física dopaciente. Uma melhora mensurável de qualquer sintoma ouqualquer parâmetro pode ser determinada por um médico noassunto ou relatado pelo paciente ao médico. A atenuaçãosignificante clinicamente ou a melhora significaperceptível ao paciente e/ou ao médico.

Será também entendido que a forma de dosagem específica eo nível da dose para qualquer paciente particulardependerá de uma variedade de fatores incluindo aatividade dos compostos específicos empregados; a idade,peso do corpo, saúde geral, e sexo do indivíduo sendotratado; o tempo e a rota de administração; a taxa deexcreção; outros fármacos que foram previamente sendoadministrados; e a severidade da doença particularsubmetida à terapia.

A quantidade do agente a ser administrada pode variar decerca de 0,1 a cerca de 500 μg/kg/administ ração,pref erivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 100μg/kg/administração e mais pref erivelmente de cerca de 1a cerca de 50 μg/kg/dia. Será entendido que ascomposições farmacêuticas da presente invenção nãonecessitam de si mesmos contém a quantidade total doagente que é eficaz no tratamento do distúrbio, como areferida quantidade eficaz pode ser alcançada poradministração de uma pluralidade de doses da referidascomposições farmacêuticas.

Por exemplo, os compostos da invenção podem serformulados em cápsulas ou tabletes, cada um contendopreferivelmente 0,06-3,00 mg dos compostos da invenção.A toxicidade e a eficácia terapêutica, das composiçõescontendo compostos da invenção, podem ser determinadaspor procedimentos farmacêuticos padrões em animaisexperimentais, por exemplo, por determinação de LD50 (adose letal a 50% da população) e o ED50 (a doseterapeuticamente eficaz em 50% da população). A proporçãoda dose entre tóxica e efeito terapêutico é o índiceterapêutico e ela pode ser expressa como a proporçãoLD50/ED50. Composições que apresentam grande índiceterapêutico são preferidas. Embora terapêuticos queapresentem efeitos colaterais tóxicos possam ser usados(por exemplo, quando tratam várias formas de cânceres ouinfecções que ameaçam a vida), cuidados deveriam sertomados para construção de um sistema de liberação que éo objetivo, tal como composições imunogênicas ao sítioespecífico (por exemplo, tecido Iinfóide mediante umaresposta imune, tumor ou um órgão suportando replicaçãodo agente infeccioso) de modo a minimizar o danopotencial para outros tecidos e órgãos e, desse modo,reduz os efeitos colaterais.

Como especificado acima, os dados obtidos a partir dosestudos animais podem ser usados na formulação de umafaixa de dosagem para uso em humanos. A dosagemterapeuticamente eficaz de compostos da presente invençãoem humanos situa-se preferivelmente dentro de uma faixade concentrações circulantes que incluem o ED50 com poucaou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro destafaixa dependendo da forma de dosagem empregada e da rotade administração utilizada. Idealmente, uma dose simplesdeveria ser utilizada.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir ilustram a invenção sem limitação deseu escopo.

I. Exemplos sintéticos

A. Preparação dos intermediáriosOs intermediários para formação da cadeia de lipídios -C(O)-Q podem ser preparados como mostrado no esquemasintético 1A e 1B abaixo.

Esquema 1A

<formula>formula see original document page 48</formula>

Esquema 1B

<formula>formula see original document page 48</formula>

Nos esquemas 1A e 1B, cada ocorrência de Alk representa,independentemente, uma cadeia alquila de modo que umnúmero total de átomos de carbono na cadeia de ácidograxo é de 23 a 32 átomos de carbono. No esquema IA, oácido carboxílico (A) é convertido ao ésterparanitrofenólico (B) usando paranitrofenol em presençade DIC. Similarmente, o alquenol (E) é convertido aoalceno éter (F) por tratamento com hidreto de sódio e umalcano halogenado apropriado. Finalmente, o ésterparanitrofenólico (B) é convertido ao ácido graxo final(D) ou (G) por reação (B) com um composto alcenoapropriado em presença da segundo geração decatalisadores Grubbs. 0 intermediário (D) ou (G) podemser purificados por métodos conhecidos na técnica, taiscomo por cromatografia em coluna sobre a sílica gel.

As sínteses de intermediários específicos estão mostradasnos esquemas 2A - 2E abaixo.

Esquema 2A

<formula>formula see original document page 49</formula>

Esquema 2B

<formula>formula see original document page 49</formula><formula>formula see original document page 50</formula><formula>formula see original document page 51</formula>

Composto 2: Para a solução do ácido não decilênicoinicial (4,1 g, 22,2 mmol, 1,1 equivalente) em DCM anidro(120 ml) foi adicionado paranitrofenol (2,9 g, 20,9mmol). Em presença de DIc (3,6 ml, 1,2 equivalentes) e 4-DMAP (60 mg), a mistura de reação foi agitada emtemperatura ambiente durante a noite, imediatamente apóst.l.c (PE-EA 6:1, Rf: 0,52) indicando que a reaçãoterminou. A suspensão foi diluída com DCM e filtradaatravés de celite. 0 filtrado foi concentrado para proverum resíduo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia emcoluna fresca (Petroéter-CHCl3 2:1) para prover éster 2(6,23 g, 98%).

1H NMR (300 MHz, CDCl3) 8.31 (d, J = 9.2 Hz, 2 Η), 7.32(d, J = 9.2 Hz, 2 Η), 5.84 (m, 1 Η, H-10), 5.03 (m, 2 H,H-11), 2.64 (t, J = 7.5 Hz, 2 Η, H-2), 2.09 (m, 2 H, H-9), 1.80 (m, 2 Η, H-3), 1.48-1.35 (m, 10 Η, H-4-8), 3.96(br s, 1 Η), 3.87 (dd, J = 9.8, 2.4 Hz, 1 Η), 3.51 (m, 2Η), 2.50 (d, J = 2.1 Hz, 1 Η), 13C NMR (75 MHz, CDCl3):171.1, 155.5, 145.2, 139.0, 125.1, 122.3, 114.2, 34.4,33.8, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 24.9.

Composto 2a: Para uma solução do ácido não decilênicoinicial em metanol é adicionado ao DCC e 4-DMAP. Amistura de reação é agitada durante a noite a temperaturaambiente.

Composto 4: Para uma solução agitada do composto 2 (197mg, 0,646 mmol) e 1-eicoseno (850 mg, 4,2 equivalentes)em CH2Cl2 seco (15 ml) foi adicionado Grubbs segundageração de catalisador (65 mg, 12 mol%) e a mistura foiagitada novamente por 1 dia, imediatamente após t.l.c(PE-DCM 1:1, Rf: 0,40) indicou o consumo do éster 2. Areação foi concentrada em vácuo e então submetida a umacromatografia em coluna usando sílica gel (PE-DCM 2:1)para resultar no título do composto 4 (190 mg, 53%,trans/cis: 4:1).

1H NMR (500 MHz, CDCl3) 8.27 (d, J = 9.1 Hz, 2 Η) , 7.28(d, J = 9.1 Hz, 2 Η), 5.35 (m, 2 Η, H-10, H-ll), 2.59 (t,J = 7.5 Hz, 2 Η, H-2) , 2.02 (m, 4 Η, H-9, H-12), 1.76(pent., J = 7.5 Hz, 2 Η, H-3), 1.42-1.25 (m, 42 Η, H-4-8,H-13-H-28) , 0.88 (t, J = 6.7 Hz,3 Η, H-29) 13C NMR (125MHz, CDCl3): 171.3, 155.6, 145..3, 130.5, 130.2, 125.2,122.4, 34.3, 32.6, 32.6, 31.9, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5,29.4, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 24.7, 22.7, 14.1.Composto 4a: Para agitação da solução do composto 2a e 1-eicoseno em CH2C12 seco foi adicionado Grubbs segundageração de catalisador e a mistura foi novamente agitadadurante 1 dia. A reação foi então concentrada em vácuo efoi então submetida a uma coluna de cromatografia usandosílica gel para resultar no título do composto 4a.Composto 6: Para uma solução de álcool ω-não decilênico(2 ml, 98%, 9,74 mmol) em THF anidro (15 ml) e DMF (5 ml)foi adicionado hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 584mg, 1,5 equivalentes) a 0°C em 10 minutos seguido poradição de TBAI (80 mg) e 1-bromopentano (1,82 ml, 1,5equivalente). Após agitação durante a noite sob refluxo,t.l.c (PE-EA 6:1) indicou o consumo do álcool. A misturafoi diluída com DCM e extinta com água. A fase aquosa foiextraída com DCM (3x) , lavada com bicarbonato de sódiosaturado e então posta em salmoura. A fase orgânica foiseca (sulfato de sódio), concentrada e o resíduopurificado por uma cromatografia em coluna fresca(Petroéster-DCM, 3:1), para prover éter 6 (2,21 g, 99%,Rf: 012 com PE-DCM 3:1). Composto 7 foi produzido domesmo modo que o 6 e resultou em 94%.6: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) 5.81 (m, 1 Η, Η-10), 4.95 (m,2 Η, H-11) , 3.38 (t, J = 7.0 Hz, 4 Η, Η-1, H-I'), 2.03(πι, 2 Η, H-9) , 1.56 (m, 4 Η, Η-2, Η-2 ' ) , 1.37-1.27 (m, 16Η, H - 3 - 8; Η-3 1 -4 1 ) , 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3 Η, Η-5') 13CNMR (125 MHz, CDCl3): 138.9, 114.1, 71.0, 70.6, 33.8,31.9, 29.8, 29.5, 29.5, 29.4, 29.1, 28.9, 26.2, 19.4,14 . 1 .

Composto 8: para a agitação da solução éster 2 (190 mg,0,62 3 mmol) e éter 6 (200 mg, 0,833 mmol, 1,3 equiv.) emclorofórmio seco (2 0 ml) foi adicionado Grubbs segundageração de catalisador (36 mg, 7 mol%) e a mistura foiref luxada por 1 dia, até a reação ser concentrada emvácuo e então submetida à cromatografia em coluna usandosílica gel (PE-DCM 3:2) para resultar no composto título8 (174 m, 84%, trans/cis: 4:1, Rf: 0,16 com PE-DCM 1:1).Composto 9 foi produzido pela mesma via que o composto 8,em um rendimento de 81%.

8: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) 8.26 (d, J = 9.0 Hz, 2 Η) ,7.27 (d, J = 9.1 Hz, 2 Η) , 5.37 (m, 2 Η, H-10, H-ll),3.38 (t, J = 6.7 Hz, 4 Η, H-20, H-22), 2.58 (t, J = 7.5Hz, 2 Η, Η-2) , 1.96 (m, 4 Η, H-9, H-12), 1.75 (pent, J =7.4 Hz, 2 H, H- 3) , 1.56 (m, 4 Η, H-19, H-23), 1.39 (m, 2Η, H-4) , 1.32-1.25 (m, 24 Η, H-5-8, H-13-18, H-24-25),0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3 Η, H-26) 13C NMR (125 MHz, CDCl3):171.1, 155.6, 145.3, 130.5, 130.2, 125.2, 122.4, 71.0,34.3, 32.6, 32.7, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2,29.0, 26.2, 25.8, 24.7, 22.6, 14.1.

Composto 13: Composto 4a é dissolvido em DCM/MeOH (1:1) ea solução é adicionada a 5% Pd em carbono (30 mol%) . Amistura de reação é então agitada sob hidrogênio até areação ser determinada para completar por uma análiseTLC. A reação é então concentrada em vácuo e é entãosubmetido a cromatografia em coluna usando sílica gelpara resultar no título do composto 13.Composto 14: éster de metila 13 (147 mg, 0,32 mmol) foidissolvido em 10 ml iPrOH/THF (1:1) e a ele foiadicionado 100 mg de NaOH em água (2 ml) . A mistura foiagitada a 60 0C por 5 horas, imediatamente tlc (PE/EA12:1) indicou que a hidrólise foi completa. Apósneutralização com 2 N HCl, a solução foi concentradadiretamente em vácuo. Para uma solução do resíduo doácido graxo acima em DCM (10 ml) foi adicionadoparanitrofenol (160 mg, 0,5 mmol) . Em presença de DCC(160 mg) e 4-DMAP (35 mg) , a mistura de reação foiagitada em temperatura ambiente, imediatamente t.l.c (PE-EA 10:1) indicou que a reação foi finalizada. A suspensãofoi diluída com DCM e à ela foi adicionada pequenaquantidade de sílica gel. Após evaporação, o resíduo foipurificado por uma cromatografia em coluna fresca (PE/EA20:1) para prover o éster 14 (154 mg, 86%).1H NMR (500 MHz, CDCl3) 8.27 (d, J = 9.1 Hz, 2 Η) , 7.28(d, J = 9.1 Hzr 2 Η) , 2.59 (t, J = 7.5 Hz, 2 Η, H-2),1.76 (pent., J = 7.5 Hz, 2 Η, H-3), 1.41 (pent., J = 7.0Hz, 2 Η, H-4), 1.37- 1.22 (m, 48 Η, H-5 a H-28), 0.88 (t,J = 7.0 Hz, 3 Η, H-29) , 13C NMR (125 MHz, CDCl3): 171.3,155.6, 145.3, 125.2, 122.4, 34.4, 33.7, 31.9, 30.2, 29.7,29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.4, 29.2, 29.2, 29.1,26.7, 24.8, 22.7, 14.1.

Uma aproximação alternativa da síntese dos intermediáriosespecíficos usando a química de emparelhamento "Julia-Lythgoe-Kocienski", é descrita no esquema 2E. Usando estaaproximação, disponível comercialmente, alquilbrometo 18é reagido com o comercialmente disponível benztiazol tiol19 para formar o ácido carboxílico 2 0 após deslocamentodo brometo. O tioéter no ácido carboxílico 20 é entãooxidizado com mCPBA para formar sulfona 21. A sulfona 21é então reagida com aldeído 23 (o qual é sintetizado apartir do álcool 22 comercialmente disponível usando, porexemplo, em condições uSwern") em presença dehexametildisilazeto de lítio sob condições de "Julia-Lythgoe-Kocienski". Isto irá prover o ácido carboxílicoalceno 24. O ácido carboxílico 24 pode então serconvertido diretamente em um éster p-nitrofenila não-saturado 4 sob tratamento com p-nitrofenol em presença deDCC e DMAP, ou para um éster p-nitrofenila saturado 15através de (1) hidrogenação com, por exemplo, 5% depaládio em carbono em presença de hidrogênio, e (2)tratamento do ácido saturado resultante 2 5 com p-nitrofenol em presença de DCC e DMAP.ESQUEMA 2E

<formula>formula see original document page 56</formula>Β. Preparação de Glicolipídios

Os glicolipídios da presente invenção podem serpreparados pelo método demonstrado no Esquema 3 abaixo.

<formula>formula see original document page 57</formula>

No esquema 3, Zé -CH=CH-, O, -O-Alk-CH=CH-, ou -CH=CH-O-; e cada uma das ocorrências de Alk representa,independentemente, uma cadeia alquila de modo que onúmero total dos átomos de carbono na cadeia de ácidograxo seja de 23 a 32 átomos de carbono. O composto (H) édesprotegido (ou seja, o BOC e os grupos protetoresisopropilideno são removidos), preferivelmente, por sertratado com ácido trifluoroacético e trietilsilano emdiclolormetano, e reagido com éster de ácido graxo (D) ou(G) para produzir compostos (I). O composto (I) é entãodesprotegido, por exemplo, com sódio e amônia, paraproduzir o composto ligado ao alceno (J) ou reduzido, porexemplo, com gás hidrogênio sobre paládio em carbono,para produzir o composto ligado ao alcano (K) . Oscompostos podem ser purificados pelos métodos conhecidosda técnica, tal como por cromatografia em coluna fresca.O composto (H) pode ser preparado pelo uso de uma reaçãoJulia-Lythgoe-Kocienski em pote entre um aldeído básicode açúcar instável (L) e um sulfona (M) como destacado noesquema 3 abaixo.Esquema 3a

<formula>formula see original document page 58</formula>

Uma síntese alternativa do análogo -CH2-CH2- ligado aocomposto (H) , composto (U) é representado no esquema 3abaixo.

Esquema 3b

<formula>formula see original document page 58</formula>

No esquema 3b, aldeído (0) é derivado do alceno (N) .Homologação via química Wittig, seguido por redução paraálcool permitindo um álcool alílico para tratamento comepoxidação Sharpless bem estabelecida para formar o epóxi(Q). 0 azido de sódio aberto com a inversão conduz aoaldeído amino hidróxi protegido (S). Então a químicaGrignard provê o álcool (T).A síntese de glicolipídios específicos é mostrada noEsquema 4 abaixo.Esquema 4

<formula>formula see original document page 59</formula>

Procedimento típico para formação de amida: Composto 10(53 mg, 0,054 mmol) foi dissolvido em DCM (4 ml) e à elefoi adicionado as quantidades adequadas de ácidotrifluoroacético (0,2 ml) e trietilsilano (0,1 ml) a 0°C.Após agitação a temperatura ambiente por 2 horas, amistura foi diretamente concentrada em vácuo. Para asolução do resíduo acima em THF foi adicionado o éster p-nitrofenil de ácido graxo 4 (31 mg, 1,03 equiv.) e aquantidade de catalisador de DMAP. A mistura foi entãoagitada em temperatura ambiente durante 2 horas,imediatamente t.l.c (Petroéter-EtOAc, 2:1) indicou que aamidação foi finalizada. A mistura foi evaporada epurificada por cromatografia em coluna fresca (Petroéter-EtOAc -CHCl3, 2,5:1:0,5) provendo o composto 11 (39 mg,58% para 2 etapas).

Composto 11 (cadeia E-amida) : 1H NMR(500 MHz, CDCl3):7.37-7.23 (m, 20 H, 4 Ph), 5.97 (dd, 1 H, J2,ι = 15.3 Hz,J2,3 = 6.7 Hz, H- 2) , 5.89 (m, 2 H, NH, H-l), 5.37 (s, 2 H,H -10" , H-Il") , 4.75 e 4.53 (2d, 2 H, J = 11.9 Hz, PhCH2),4.73 (t, 1 H, J3,NH e 3;2, = 7.0 Hz, H-3), 4.66 (s, 2 H,PhCH2), 4.65 e 4.60 (2 d, 2 H, J = 12.2 Hz, PhCH2), 4.57(br s, 1 H, H-I'), 4.50 e 4.44 (2 d, 2 H, J = 11.9 Hz,PhCH2), 3.99 (br s, 2 Η, H-2 ' , H-5'), 3.89 (s, 1 H, H-4'), 3.69 (dd, 1-H, J6'a,6'b = 9-2 Hz, J6-a,5 = 7.3 Hz,H-6 ' a) , 3.59 (dd, 1 H, J3-,2- = 8.2 Hz, J3-, 4- = 2.1 Hz, H-3'), 3.48 (dd, 1 H, J6'b,6'a = 10.3 Hz, J6-b,5 = 4.7 Hz,H-6 ' b) , 3.45 (br, 2 Η, H-4, H-5), 2.99 (d, 1 H, J - 7.0 Hz,OH-4) , 2.16 (t, 2 H, J2"3 = 7.3 Hz, H-2"), 1.95 (br s, 4Η, H-911 , H- 12"), 1.79 (d, J = 6.1 Hz, OH-5) , 1.62 (m, 2H, 2 χ H-3"), 1.42-1.18 (m, 68 H, 2 χ H-4" a 2 χ H-8", 2x H-13" a 2 χ H-28", 2 χ H-6 a 2 χ H-18), 0.88 (t, 6 H, J= 6.9 Hz, 3 χ H-19, 3 χ H-26"); 13C NMR (125 MHz, CDCl3)173.1, 138.4, 138.3, 138.2, 138.0, 130.4, 130.2, 129.8,128.4, 128.3, 128.1, 127.8, 127.8, 127.7, 127.6, 127.4,126.2, 115.6, 78.2, 76.9, 76.7, 74.5, 73.6, 73.2, 73.3,73.1, 72.9, 68.7, 53.7, 36.8, 33.8, 32.6, 31.9, 29.7,29.7, 29.5, 29.4, 29.2, 25.7, 25.7, 22.7, 14.1.Composto 13 (cadeia amida E/Z 4:1): 1H NMR(500 MHz,CDCl3): 7.34-7.22 (m, 20 H, 4 Ph), 5.97 (dd, 1 H, J2,ι =15.6 Hz, J2;3 = 6.5 Hz, H-2), 5.91-5.86 (m, 2 Η, NH, H-l),5.37 (s, 2 H, H- 10", H-ll"), 4.76 e 4.54 (2 d, 2 H, J =11.6 Hz, PhCH2), 4.72 (t, 1 H, J3iNH e 3,2 = 7.0 Hz, H-3),4.67 (s, 2 Η, PhCH2), 4.65 e 4.60 (2 d, 2 Η, J = 12.2 Hz,PhCH2), 4.57 (br s, 1 Η, H- 1'), 4.50 e 4.44 (2 d, 2 Η, J= 11.9 Hz, PhCH2), 4.00 (br s, 2 Η, H-2', H-5'), 3.90 (t,1H, J = 2.6 Hz, H-4 1 ) , 3.69 (dd, 1-H, J6<a,6'b = 9.9 Hz,Jg' a, s = 7.4 Ηζ,Η-6'a), 3.59 (dd, 1 H, J3-,2- = 8.4 Hz,J3.= 5.9 Hz, H-3 1 ) , 3.50 (dd, 1 H, J6-b'6'a = 10.2 Hz,J6-b' 5 = 4.5 Ηζ,Η-6'b), 3.46 (br, 2 H, H-4, H-5), 3.39 (t,4 H, J = 6.7 Hz, H - 2 0" , H-22"), 2.98 (br s, 1 Η, OH-4),2.16 (t, 2 H, J2»,3» = 7.5 Hz, H-2"), 1.95 (br s, 4 H, H-9", H-12") , 1.80 (br s, OH-5) , 1.62 (m, 2 H, 2 χ H-3"),1.56 (m, 4 Η, H-19", H-23"), 1.42-1.20 (m, 54 H, 2 χ H-4"a 2 χ H-8", 2 χ H-13" a 2 χ H- 18",2 χ H-24" a 2 χ H-26",2χ H-6 a 2 χ H-18) , 0.88 (t, 6 H, J = 6.9 Hz7 3 x H-19,3χ H- 27"); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) 173.1, 138.5, 138.3,138.2, 138.1, 130.4, 130.3, 129.8, 128.4, 128.4, 128.3,128.3, 128.1, 127.8, 127.8, 127.7, 127.6, 127.6, 127.5,78.2, 76.9, 76.7, 74.7, 73.76, 73.3, 73.2, 73.0, 71.0,53.8, 36.9, 33.8, 32.6, 31.9, 31.7, 29.8, 29.8, 29.7,29.7, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.5, 29.4, 29.3, 29.2,29.2, 29.2, 26.2, 25.9, 25.7, 22.7, 22.6, 14.1, 14.0.

Composto trans-(A-I) : 1H NMR(500 MHz, piridina-d5) : δ8.67 (d, 1 H, J = 8.7 Hz, NH), 6.92 (m, 2H, H-I, H-2),6.86 (br s, 1 H, 2'-OH), 6.57 (br s, 1 Η, 4-OH), 6.52 (brs, 1 H, 3'- OH) , 6.43 (br s, 1 H, 6 ' -OH) , 6.35 (br s, 1H, 4 ' -OH) , 6.28 (br s, 1 Η, 5-OH) , 5.93 (m, 1 H, H- 3),5.53 (m, 2 Η, H-10", H-ll"), 5.15 (m, 1 H, H-I'), 4.84(dd, 1 H, J3.,2-- = 9.1 Hz, J1^2- = 6.1 Hz, H-2'), 4.61 (brs, 1 H, H-4'), 4.58 (t, 1 H, J = 6.0 Hz, H-5'), 4.37 (m,2 H, H-6a1, H- 6b'), 4.28 (m, 3 H, H-3', H-4, H-5,), 2.45(t, 2 H, J = 7.5 Hz, H-2"), 2.31 (m, 1 H, H-6a), 2.06 (m,4H, H-9", H-12"), 1.93 (m, 2 H, H-7a, H-6b), 1.83 (m, 2H, H-3"), 1.70 (m, 1 H, H-7b), 1.44-1.17 (m, 62 Η, H-8 aH-18, H-4" a H-8", H-13" a H-28"), 0.88 (t, 6 H, J = 6.8Hz, 3 χ H-19, 3 χ H-29").

A-2: 1H NMR(500 MHz, piridina-d5) : 8.55 (d, 1 H, J = 9.5Hz, NH), 6.90 (m, 2H, H-l, H-2), 6.71 (br s, 1 H, 21-OH),6.44 (br s, 1 H, 4-OH), 6.37 (br s, 1 H, 3'-OH), 6.29 (brs, 1 Η, 6 1 - OH), 6.22 (d, 1 Η, J = 4.0 Hz, 4 '-OH), 6.13(br s, 1 Η, 5 - OH), 5.89 (m, 1 Η, Η-3), 5.15 (m, 1 Η, H-1'), 4.84 (m, 1 Η, Η-2'), 4.60 (br s, 1 Η, Η-4·), 4.56(dt, I Hi J = 5.9 Hz, 1.7 Hz, Η-5'), 4.41 (m, 2 Η, H-6a',H-6b1 ), 4.29 (m, 3 Η, Η-31), 4.26 (m, 2 Η, Η-4, Η-5,),2.45 (t, 2 Η, J = 7.5 Hz, Η-2"), 2.28 (m, 1 Η, H-6a),1.93 (m, 2 Η, H-7a, H-6b), 1.84 (m, 2 Η, Η-3"), 1.71 (m,1 Η, H-7b), 1.46-1.17 (m, 72 Η, Η-8 to Η-18, Η-4" to H-28"), 0.89 (t, 6 Η, J = 6.9 Hz, 3 χ H- 19, 3 χ Η-29").13C NMR (125 MHz, piridina-d5) 175.1, 132.4, 127.8, 78.7,76.8, 74.9, 73.1, 73.0, 71.3, 70.6, 63.0, 54.3, 37.4,34.9, 34.5, 32.5, 30.9, 30.7, 30.5, 30.5, 30.4, 30.3,30.3, 30.2, 30.2, 30.2, 30.0, 27.5, 26.9, 26.8, 23.3,14.6 .

A- 3 : MS (ES, m/z): 896.7 (Μ + Η)+; 1H NMR(500 MHz,piridina-d5): 8.39 (d, 1 Η, J = 8.8 Hz, NH), 6.61 (d, 1Η, J = 4.0 Hz, 2'-OH), 6.45 (d, 1 Η, J = 4.8 Hz, 4-ΟΗ),6.33 (m, 2 Η, 3'- OH, 6 '-OH), 6.12 (d, 1 Η, J = 4.1 Hz,4'-0Η), 5.94 (d, 1 Η, J = 4.2 Hz, 5-ΟΗ), 5.53 (m, 2 Η, H-11", H -12"), 5.13 (m, 1 Η, Η-3), 4.72 (m, 1 Η, J 3-,2< =9.3 Hz, Η-2'), 4.52 (m, 3 Η, H-I', Η-4', H-6a'), 4.36 (m,1 Η, H- 6b' ), 4.23 (m, 4 Η, Η-3', Η-4, Η-5, Η-5'), 2.72(m, 1 Η, H-2a), 2.58 (m, 1 Η, H-Ia), 2.46 (m, 2 Η, Η-2"),2.33 (m, 2 Η, H-6a, H-1b), 2.31 (m, 1 Η, H-1b), 2.22 (m,1 Η, H-2b), 2.06 (m, 4 Η, Η-10", Η-13"), 1.94 (m, 2 Η, H-7a, H- 6b), 1.85 (m, 2 Η, Η-3"), 1.71 (m, 1 Η, H-7b),1.48-1.17 (m, 64 Η, Η-8 to Η-18, Η-4" a Η-9", Η-14" to H-28"), 0.89 (t, 6 Η, J = 6.8 Hz, 3 χ Η-19, 3 χ Η-29"); 13CNMR (125 MHz, piridina-d5) 173.8, 131.2, 131.1, 78.9,77.4, 74.2, 73.1, 72.6, 71.0, 70.8, 63.1, 53.1, 37.4,34.9, 33.3, 32.5, 30.8, 30.6, 30.5, 30.4, 30.4, 30.3,30.3, 30.2, 30.2, 30.2, 30.1, 30.0, 30.3, 29.9, 27.0,26.9, 26.9, 23.3, 23.0, 14.6.

A-5 (e Α-4): 1H NMR(500 MHz, piridina-d5): δ 8.49 (d, 1Η, J= 9.0 Hz, NH), 6.73 (d, 1 Η, J = 4.7 Hz, 2'-0Η), 6.56(d, 1 Η, J = 4.7 Hz, 4-ΟΗ), 6.46 (m, 2 Η, 3'-0Η, 6'-OH),6.24 (d, 1 Η, J = 4.4 Hz, 4 '-OΗ), 6.07 (d, 1 Η, J = 4.7Hz, 5-OH) , 5.13 (m, 1 Η, Η-3), 4.72 (dd, 1 Η, J3',2' = 8.7Hz, J ',2' = 5.5 Hz, Η-2' ), 4.50 (m, 3 Η, H-1', Η-4 ' , H-6a'), 4.36 (dd, 1 Η, J 6a',6b- = 11-3 Hz, J 5',6b' = 4.5 Hz,H-6b'), 4.23-4.19 (m, 4 Η, Η-3', Η-4, Η-5, Η-5'), 3.39 (m, 4 Η, H- 20", Η-22"), 2.71 (m, 1 Η, H-2a), 2.58 (m, 1Η, H-1a), 2.45 (m, 2 Η, Η-2"), 2.30 (m, 2 Η, H-6a, H-1b),2.19 (m, 1 Η, H-2b) , 1.91 (m, 2 Η, H-7a, H-6b) , 1.83 (m,2 Η, Η-3"), 1.68 (m, 1 Η, H-7b), 1.60 (m, 4 Η, Η-19", H-23"), 1.51-1.18 (m, 56 H (ou 58 H para Α-4), Η-8 to Η-18, Η-4" a Η-18", Η-24"-Η-25" (ou -Η-26" for Α-4)), 0.85 (t,6 Η, J = 6.9 Hz, 3 χ Η-19, 3 χ Η-26"); 13C NMR (125 MHz,piridina-d5) 173.8, 78.8, 77.5, 74.1, 73.0, 72.5, 71.3,71.0, 70.7, 63.1, 53.0, 37.3, 34.8, 32.5, 32.3, 30.7,30.6, 30.5, 30.4, 30.3, 30.2, 30.2, 30.0, 27.0, 26.9, 26.6, 23.3, 14.6.

A-6: Composto A-6 é preparado usando o mesmo procedimentocomo descrito acima para o composto A-l, exceto para ocomposto 10 é reagido com o composto 16 para formar abenzila protegida A-6. Os grupos benzila são entãoremovidos com sódio em amônia para prover o título docomposto A-6.

A-7: Composto A-7 é preparado usando o mesmo procedimentocomo descrito acima para o composto A-l, exceto para ocomposto 10 é reagido com o p-nitrofenil-ω-fenil- heptanoato para formar a benzila protegida A-7. Os gruposbenzila são então removidos com sódio em amônia paraprover o título do composto A-7.

p-nitrofeinil-ω-fenilheptanoato é preparado por reação deuma quantidade equimolar de p-nitrofenol e o ácidofenilheptanóico em diclorometano em presença de umequivalente de DCC e 5 mol% DMAP. 0 precipitado dediciclohexil uréia é filtrado após a reação sercompletada, e o diclorometano se removido a vácuo. 0material é então cromatografado rapidamente em sílica gelpara purificação.

II. Exemplos Biológicos

Exemplo 1: Determinação do perfil cinético das citocinastipo Th-I e Th-2 que são liberados na administração invivo dos compostos da invenção.

Materiais e Métodos

Compostos testados

α-GalCer (KRN700) foi sintetizado por Kirin Brewery(Gumma, Japão). α-C-GalCer (CRONY 101) foi sintetizadocomo descrito em Schmieg J., Yang G., Franck RW, Tsuji M,2003. A proteção superior contra malária e metástases demelanoma por um análogo C-glicosídeo da célula T killernatural ligante a α-galactosilceramida. "J. Exp. Med.",198: 1631-1641.

<formula>formula see original document page 64</formula>

Os outros C-glicolipídios sintéticos testados foramsintetizados como descrito acima.

Administração do composto in vivo

Camundongos C57BL/6 fêmeas com cinco a seis semanas deidade foram adquiridos da Taconic. Cada glicolipídio foiarmazenado em 1 mg/ml em DMSO a 100%. Camundongos foraminjetados intravenosamente com 1 mg de cada um dosglicolipídios diluídos em 200 mL de salina tampão-fosfatoestéril (PBS). Em pontos do tempo indicados, o soro foicolhido a partir de cada animal, e as concentrações deIFN-g, IL-4 e, IL-12 no soro foi avaliado por ensaioimunológico por ligação com enzima (ELISA).

Avaliação da citocina por ensaio imunológico por ligaçãocom enzima - ELISA

As concentrações de soro de IFN-g, IL-4, e IL-12 foramavaliadas usando um kit ELISA (eBioscience, San Diego,CA). Resumidamente, placas para ELISA com 96 poços comfundo plano (NUNC) foram revestidas com anticorpos decaptura de acordo com as recomendações do fabricante eincubadas durante a noite a 40C. As placas foram lavadascom PBS + 0,05% de Tween 20 (PBS-T) , então incubados deacordo com o fabricante provendo uma solução bloqueadoradurante 1 hora a temperatura ambiente para bloquearsítios de ligação não-específicos. Após lavagem com PBS-Τ, o soro diluído 1:10 foi adicionado aos poços eincubado por 2 horas a temperatura ambiente. As placasforam então incubadas a temperatura ambiente por 1 horacom um anticorpo de detecção biotinilado, lavado,incubado com avidina conjugada para a peroxidase derábano silvestre (HRP) durante 30 minutos em temperaturaambiente, lavada, e finalmente incubada com uma soluçãosubstrato de tetrametilbenzidina no escuro por 10 minutosem temperatura ambiente. Os anticorpos avidina-HRP, e asolução substrato foram todos diluídos de acordo com arecomendação do fabricante. As reações foraminterrompidas com ácido sulfúrico 2, ON e a concentraçãode citocina em cada poço foi determinada por comparaçãocom a absorbância de 450 nm em cada poço com um padrãoconhecido.

Resultados

Os níveis de citocinas Th-1 e Th-2 foram determinados emdois antecedentes genéticos diferentes, ou seja, emcamundongos C57B1/6 e camundongos BALB/c. Os compostos aseguir foram administrados: A = composto (A-l conformaçãotrans-) ; B = composto (A-2) ; C= composto (A-3) ; D =composto (A-4) ; E = composto (A-5) ; Z = controle (PBSsozinho); CRONY = α-c-GalCer; KRN = α-GalCer; GCK109 (Α-Ι conformação trans-); GCK151 (A-l conformação eis-);GCK152 (1-7). Os níveis de citocinas foram medidos em 0,2, 6, 12, 24, 48 e 72 horas após a administração docomposto. Os níveis de citocinas tipo Th-I IFN-γ e IL-12estão resumidos nas figuras 2A-2C e 3A-3C,respectivamente. Os níveis de citocinas tipo Th-2 IL-4estão resumidos nas figuras 4A-4C. Os valores numéricoscorrespondentes são também providos nas tabelas 1-5abaixo. A tabela 7 prove as proporções IFN-g/IL-4 e IL-12 /IL- 4 para os vários compostos, que podem serutilizados como indicadores de sua capacidade paraestimular, seletivamente, as respostas imunes tipo Th-I.Como a seguir, a partir das figuras e tabelas, quandocomparado com α-GalCer (KRN), vários C-glicolipídiossintéticos testados da invenção produziram (i) níveiscomparáveis ou maiores e secreção prolongada tanto dascitocinas tipo Th-I IFN-γ e IL-12 quanto (ii) níveismuito menores de citocinas tipo Th-2 IL-4. 0 efeito foiparticularmente pronunciado no caso do composto A-I(conformação trans-), A-2 e A-5.

A capacidade dos compostos da presente invenção eminduzirem, seletivamente, níveis elevados de citocinastipo Th-1 IL-12 na ausência da indução de citocinas tipoTh-2 indica que estes compostos são potentesestimuladores seletivos da resposta imune tipo Th-1 que élocal e estão associados com a ativação secundária dascélulas dendríticas. Os compostos da presente invençãosão, portanto, úteis no tratamento de várias doenças querequerem uma resposta tipo Th-1 para controlar ambas,quando utilizados diretamente e quando usados comoadjuvantes.

TABELA 1:

Níveis de IFN-γ na administração de glicolipídios para oscamundongos BALB/c.

<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>TABELA 2:

Níveis de IFN-γ na administração de glicolipídios para oscamundongos C57BL/6.

<table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table>

TABELA 3:

Níveis de IL-12 na administração de glicolipídios para oscamundongos BALB/c.

<table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table>TABELA 5:

Níveis de IL-4 na administração de glicolipídios emcamundongos BALB/c.

<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>

TABELA 6:

Níveis de IL-4 na administração de glicolipídios aoscamundongos C57BL/6.

<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>

TABELA 7:

Proporções de IL-12/IL-4 e IFN-y/IL-4 para osglicolipídios alvos (calculada com base nos valores das

tabelas 1-6).

<table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table>

EXEMPLO 2:

Determinação da capacidade dos novos C-glicolipídiossintéticos da invenção em inibir a infecção malárica emetástases de tumores.

Os camundongos foram administrados i.m., s.c., i.v. oui.p. com uma dose única do C-glicolipidio sintético dainvenção GCK109 (A-1 conformação trans-), GCK151 (A-1conformação cis-) e GCK127 (A-2), ou dos compostoscontrole CRONY = α-C-GalCer e KRN = α-GalCer. 0 efeitoprotetor de todos os compostos é determinado 2-8 semanasapós a imunização.

Para testar a proteção contra a infecção malárica, osesporozoítos de P. yoelii obtido a partir de glândulassalivares dissecadas de mosquitos infectados são usadospara ativação. A ativação dos camundongos imunizados como C-glicolipídios sintéticos ou dos compostos de controlepara determinar o desenvolvimento do estágio no sangue dainfecção da malária é realizada por uma injeçãointravenosa (i.v.) de 75 esporozoítos viáveis dentro daveia da cauda. Iniciando 4 dias após a ativação,esfregaços diários do sangue periférico são obtidos apartir de cada camundongo e examinados microscopicamentequanto a presença do parasita no estágio do sangue até odia 17 após ativação. Os camundongos foram consideradospositivos para parasitemia se pelo menos um estágio nosangue do parasita for observado durante o tempo doexame.A ativação dos camundongos imunizados com C-glicolip£diossintéticos ou dos compostos de controle para determinar odesenvolvimento do estágio no fígado da infecção damalária for realizada por injeção i.v. de 10,000esporozoítos viáveis dentro da veia da cauda. 0 resultadoda ativação é determinado 40-42 horas mais tarde atravésda medida das moléculas rRNA 18s específico de P. yoeliino fígado dos camundongos usando um método de RT-PCRquantitativo em tempo real, como ensinado em Bruna-Romeroet al., "Int. J. Parasitol.", 31, 1449-1502, 2001.Resumidamente, após a transcrição reversa do RNAextraído, o cDNA é gerado e sua quantidade analisada porPCR tempo real usado em um Sistema de Detecção deSeqüência GeneAmp® 5700 (PE Applied Biosystem,s FosterCity, CA). Os primers e a sonda fluorogênica sãoconstruídos de modo habitual usando o Software "ABI PrismPrimer Express" (PE Biosystems), usando a seqüência rRNAde P. yoelii (17XNL) 18S. Por exemplo, o primer 5'-GGGGATTGGTTTTGACGTTTTTGCG-3' (54 nM) [SEQ.ID.NO:7] e 5'-AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAT-3' (60nM) [SEQ.ID.NO:8]podem ser utilizados, juntos com o corante específicodsDNA, SYBR Green I incorporado dentro do tampão dereação de PCR (PE Biosystems, Foster City, CA) de modo adetectar o produto de PCR gerado. 0 perfil da temperaturada reação é de 95°C durante 10 minutos, seguido por 35ciclos de desnaturação de 95 °C por 15 segundos eanelamento/extensão a 60°C durante 1 minuto. A quantidadeprecisa das moléculas cDNA 18S derivada do parasitadetectada neste ensaio é determinada por análise deregressão linear usando os valores CT obtidos tanto apartir das amostras do fígado quanto daquelas amostrasobtidas de uma curva padrão gerada com quantidadesconhecias do plasmídeo cDNA 18S.

O nível de proteção dos camundongos imunizados com C-glicolipídios sintéticos ou compostos controle contradesenvolvimento de melanoma de metástases do pulmão édetectado pela primeira ativação do camundongointravenosamente com 5x104 células de melanoma B16singenéicas suspensas em DMEM suplementado com 10% FCS.Duas semanas após a ativação, os camundongos sãosacrificados, os pulmões removidos, e o número de nódulosmetastáticos contados, como descrito em Fujii et al.,"Natl. Immunol'. 3, 867-874 (2002).

Todos os C-glicolipídios sintéticos da invenção mostramuma atividade potente na proteção frágil contra aativação da malária no fígado e as metástases demelanoma.

EXEMPLO 3:

Determinação do efeito adjuvante dos novos C-glicolipídios sintéticos da invenção.

Os camundongos são administrados i.m., s.c., i.v., oui.p. com uma dose única dos C-glicolipídios sintéticos dainvenção GCK109 (A-l conformação trans-), GCK151 (A-lconformação eis-) e GCK12 7 (A-2) ou compostos controleCRONY = α-C-GalCer e KRN = α-GalCer, e uma dose sub-ótima (1 x IO7 p.f.u.) de um adenovírus recombinanteexpressando a proteína CS de P. yoelli , AdPyCS(Rodrigues et al. , "J. Immunol.", 158: 1268-1274, 1997).A partir de 2 a 8 semanas após a imunização, algunscamundongos são sacrificados e seus baços removidos paraobter linfócitos de modo a medir os níveis de respostadas células T CD8+ específicas para a malária através deum ensaio ELISPOT. Os camundongos imunizados com AdPyCSsozinho são utilizados como um controle.

Os esplenócitos obtidos dos camundongos imunizados comAdPyCS e C-glicolipídios sintéticos ou compostoscontrole, ou camundongo controle (imunizados apenas comAdPyCS) são avaliados para determinar o número de (i)células T CD8+ específicas-CS produzindo IFN-γ (célulasTh-1) , e (ii) células T CD8+ específicas CS produzindoIL-4 (células Th-2) . 0 número de células T CD8 +específicas CS é determinado usando ensaio ELISPO(Miyahira et al. , "J. Immunol. Methods" , 1995; 181: 45-54) . Resumidamente, placas de nitrocelulose de 95 poços(Millipone, Bedford, MA) são revestidas durante a noite atemperatura ambiente com anticorpos monoclonais IFN-γanti-camundongo biotinilada ou IL-4 anti-camundongo(mAb). Após várias lavagens com PBS, várias diluições deesplenócitos em meio de cultura em presença ou naausência de peptídeos correspondentes aos epítopos CD8+são incubados para 2 0-24 horas a 370C em um incubador deCO2 a 5% em placas revestidas com IFN-γ anti-camundongoou IL-4 anti-camundongo mAb. Após a incubação, as placasforam lavadas com PBS-T. As placas são então incubadasdurante 3 horas a temperatura ambiente com IFN-γ anti-camundongo biotinilada ou IL-4 anti-camundongo mAb nasplacas, respectivamente. As placas foram lavadas com PBS-T antes da adição da Estreptavidin-AP conjugado e aincubação por 1 hora a temperatura ambiente. Após umalavagem adicional com PBS-T e uma lavagem com águadestilada, sítios são desenvolvidos com uma etapa doreagente BCIP/NPT. Os sítios são contados usando umleitor "Immune Spot" (Cellular Technology Ltd., Cleveland, Ohio).

O nível conseguido da proteção anti-malária é determinado2-8 semanas mais tarde por ativação dos camundongosimunizados com injeção i.v. dos esporozoítos vivos de P.yoelii. Os camundongos não imunizados são utilizados comocontrole.

Como especificado no Exemplo 2, supra, a proteção émedida através da medição da quantidade de parasita nosangue e no estágio do fígado. Os estágios do sangue, sãomonitorados pelo exame microscópico de esfregaço desangue corado com Giemsa, obtido diariamente a partir dodia 3 até o dia 14 após a ativação com 75 esporozoítosvivos de P. yoelii. Os estágios do fígado são medidos porremoção dos fígados dos camundongos 42 horas após aativação com 10,000 esporozoítos de P. yoelii, e a cargade parasita nos fígados é determinada, através da medidado rRNA plasmodial por um PCR-RT em tempo real comodescrito no Exemplo 2, supra.Todos os C-glicolipídios sintéticos da invençãodemonstram potente efeito adjuvante.

EXEMPLO 4:

Determinação do perfil das citocinas dos compostos dainvenção em um experimento humano in vitro em um sistemade célula NKT.

Materiais e Métodos

Produção de células dendríticas imaturas (DCs) e CD14-PBMCs. As células CD14+ foram isoladas a partir de"Leukopaks", usando contas magnéticas (Miltenyi biotec,Auburn, CA) emparelhada em um anticorpo monoclonal anti-CD14. As células dendríticas imaturas (DCs) foram entãogeradas a partir das células CD14+ após uma incubação detrês dias em presença de 300 U/ml de GM-CSF (Sistema R&D,Minneapolis, MN) e 100 U/ml de IL-4 (Sistema R&D,Minneapolis, MN). As células CD14- foram usadas comocélulas mononucleares do sangue periférico (PBMCs) paraos experimentos a seguir.

IFN-γ in vitro e IL-4 ELISA, usando PBMCs e DCs imaturas.Após a irradiação com 3000 rads, 5 χ 10^4 de célulasdendríticas imaturas foram co-cultivadas com 5 χ 10^5 deCD14- PBMCs singenéicas em presença de 10 ng/ml de váriosglicolipídios (ou seja, GCK109 [A-l conformação trans-],GCKl51 [A-l conformação eis-], GCK127 [A-2], GCK152 [A-7], e compostos controle CRONY= α-C-GalCer e KRN= a-GalCer em uma placa de 96 poços. Após cultura por 18horas, a concentração de IFN-γ ou IL-4 em sobrenadantesda cultura foi determinado por ELISA (BD Pharmingen, SanDiego, CA) seguindo as instruções do fabricante.IFN-γ in vitro e IL-4 ELISP0T, usando PBMCs e DCsimaturas. Placas de nitrocelulose com 96 poços (MilititerHA, Millipore) foram revestidas com 10 μg/ml deinterferon anti-humano γ mAb (Mabtech, OH), contendo em75 ml de PBS. Após incubação durante a noite atemperatura ambiente, os poços foram lavadosrepetidamente e bloqueados com meio de cultura por 1 horaa 37°C. Após irradiação com 3000 rads, 5xl0^5 célulasdendríticas imaturas foram co-cultivadas com 5 χ IO5células CD14= PBMCs singenéica em presença de 100 ng/mlde vários glicolipídios (ou seja, GCK109 [A-l,conformação trans-], GCK151 [A-l, conformação eis-]GCK127 [A-2], GCK152 [A-7], e compostos controle CRONY =α-C-GalCer e KRN = α-GalCer) na placa ELISPOT durante22-26 horas a 37°C e CO2 5%. Após lavagens extensivas dasplacas com PBS 0,05% Tween 20 (PBS Τ) , 1 μg/ml deinterferon γ mAb anti-humano biotinilado (Mabtech, OH),em PBS-T foi adicionado, e incubado durante a noite a4°C. Após a lavagem com PBST, as placas foram incubadascom 100 μΐ de estreptavidina marcada com peroxidase(Kirkegaard & Perry Laboratories), diluída de acordo comas instruções do fabricante. Os sítios foramdesenvolvidos após 1 hora de incubação, por adição de 50mM Tris HCl, pH 7,5, contendo 1 mg/ml de diidrato 3-3'-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) mais 5 μg/10 mlde H2O2 3 0%. Após 10 a 15 minutos, o número de sítioscorrespondentes as células secretoras de IFN-γ foideterminado usando um estero-microscópio. De modo adeterminar o número de epítopo específicos IL-4produzindo células NKT, um procedimento similar foiseguido, exceto que um par de IL-4 mAbs anti-humano(Mabtech, OH) foi utilizado.

Resultados

Os experimentos ELISA, como mostrado nas figuras 5A-5B,GCKl0 9 (A-l, conformação trans-), GCK151 (A-l,conformação eis-), GCK127 (A-2), e GCK152 [A-7] PBMCsativado para produzir um nível similar de IFN-γ, bem comoIL-4 quando comparado com KRN (α-GalCer) após 18 horas de

co-cultivo com DCs imaturas in vitro.

Os ensaios ELISPOT, como mostrado nas figuras 6A-6B,GCKl51 (A-l, conformação eis-) e GCK152 [A-7] estimularamconsistentemente em uma freqüência alta, PBMCs a secretartanto IFN-γ quanto IL-4, e a freqüência de PBMCs ativadoé similar aquela estimulada por KRN. GCK109 (A-l,conformação trans-) E gckl27 (A-2) foram também capazesde estimular freqüência similar de PBMCs em 24 horas apósco-cultivo com DCs imaturas.

Os dados acima também demonstram a interação dos C-glicolipídios testados da invenção com CDld em um lado eos receptores NKT constantes no outro lado. Isto é umaimportante indicação de que os compostos serão ativos emhumanos in vivo.

É possível, entretanto, que o sistema de célula humana invitro pode não permitir comparar a ativada de várioscompostos em uma rota que proverá projeções para suasrealizações in vivo. Por exemplo, este sistema de célulain vitro não levará em consideração muitos fatoresimportantes que influenciam a verdadeira respostabiológica in vivo, incluindo diferentes taxas dedegradação dos compostos in vivo e diferente cinética deseus efeitos. Também, o teste de interação neste sistemaexperimental é limitado às células NKT e o antígeno CDldpresente nas células. In vivo, outras células DCs e NKirão interferir para liberação adicional de IL-12 e IFN-γ. Finalmente, o composto controle KRN é mais solúvel emuma solução aquosa do que muitos compostos lipofílicostestados da invenção, o que torna o composto controlemais bio-disponível para teste in vitro em cultura decélula o que pode não refletir em uma situação in vivo,onde o composto teste pode ter um efeito mais prolongado.

A presente invenção não está limitada ao escopo dasconfigurações específicas descritas aqui. Ao contrário,várias modificações da invenção, em adição àquelas aquidescritas se tornarão aparentes aos técnicos no assunto apartir da descrição anterior e das figuras que acompanhamo pedido. Pretende-se que as referidas modificaçõesestejam dentro do escopo de proteção das reivindicaçõesanexas.

Deve ser ainda entendido que todos os valores sãoaproximados, e são providos para descrição.

As patentes, os pedidos de patente, as publicações,descrições de produtos, e protocolos que são citadosdurante a descrição do pedido de patente, a descriçãodestes foi incorporada aqui, por referência em suaíntegra para todos os propósitos.

Claims (46)

1. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula (I)<formula>formula see original document page 83</formula>onde :X é 0 OU NH;Y é -CH2-CH2- OU CH=CH-;Quando Y for -CH2-CH2-; Q é um alquenila C23-C32 ou R1-O-R2;Quando Y for -CH=CH-; Q é alquila C27-C32; alquenila C23-C32; -R1-O-R2-; ou alquila C6-C8 substituída com fenila;R1 e R2 são grupos alquila ou alquenila substituídos ounão- substituídos, de modo que R1 e R2 combinados tenhamde 2 3 a 32 átomos de carbono;R3 é -OH ou monossacarídeo, e R4 é H, ou R3 é H e R4 é -OHou um monossacarídeo; eR5 é hidrogênio ou um monossacarídeo; e saisfarmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dos mesmos.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de X ser O, R5 ser H, R3 ser OH eR4 ser H.

3. Composto, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de Y ser -CH=CH- e o composto ter uma conformação trans.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de Q ser -CeH16-CH=CH-C18H37.

5. Composto, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de Y ser -CH=CH- e Q ser alquila C27-C28 ou alquenila C28-C32.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de Q ser alquenila C28-C32 tendouma duas ou três ligações duplas.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de Q ser alquenila C28-C32 tendouma ligação dupla.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de a ligação dupla estarlocalizada entre o sétimo átomo de carbono a partir dogrupo carbonila e o décimo segundo átomo de carbono apartir do grupo carbonila.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de a ligação dupla estarlocalizada entre o sétimo átomo de carbono a partir dogrupo carbonila e o décimo átomo de carbono a partir dogrupo carbonila.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de a ligação dupla estarlocalizada no nono átomo de carbono a partir do grupocarbonila e o décimo segundo átomo de carbono a partir dogrupo carbonila.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 84</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

12. Composto, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de Yser -CH=CH- e Q é -R1-O-R2.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de o átomo 0 em -R1-O-R2 estarlocalizado entre o primeiro átomo de carbono e o vigésimoquinto átomo de carbono a partir do grupo carbonila.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de o átomo 0 em -R1-O-R2 estarlocalizado entre o oitavo átomo de carbono e o vigésimoquinto átomo de carbono a partir do grupo carbonila.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de Q ser -Ci9H38-O-C6Hi3.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 85</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

17. Composto, de acordo com a reivindicaçãocaracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 85</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

18. Composto, de acordo com a reivindicaçãocaracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 85</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

19. Composto, de acordo com a reivindicaçãocaracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 86</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

20. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 86</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dosmesmos.

21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um composto, conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 20, em associação com umveículo farmaceuticamente aceitável.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 21,caracterizada pelo fato de compreender ainda um antígeno.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de o antígeno ser um antígenoviral ou um tumor.

24. Método para induzir seletivamente uma resposta imunetipo Th-I em um mamífero, caracterizado pelo fato decompreender a administração ao mamífero de uma quantidadeeficaz de um composto conforme definido em qualquer umadas reivindicações de 1 a 20.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de o composto induzir umasecreção melhorada de IL-12.

26. Método para tratar uma doença que requer uma respostatipo Th-1, para controle em um mamífero necessitando damesma, caracterizado pelo fato de compreender aadministração ao mamífero de uma quantidade eficaz de umcomposto conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 20.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de a doença ser selecionada apartir do grupo consistindo de infecção, câncer,distúrbio de proliferação celular, e doença autoimune.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de a doença ser uma doença não-viral infecciosa.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de a doença ser uma doença viralinfecciosa.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de a doença ser uma infecção proHIV.

31. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de a doença ser uma infecção proHCV.

32. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de a doença ser uma infecção porHBV.

33. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de a doença ser uma infecção pormalária.

34. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de a doença ser um câncer.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de a doença ser carcinoma dapróstata ou melanoma.

36. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de a doença ser asma ou alergia.

37. Método para aumentar a imunogenicidade para umantígeno em um mamífero, caracterizado pelo fato decompreender imunizar o mamífero conjuntamente com umantígeno e com um adjuvante compreendendo o compostoconforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a-20.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de o antígeno e o adjuvante seremadministrados simultaneamente.

39. Método, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato de o antígeno ser HlV-específico.

40. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de o antígeno ser malária-específico.

41. Método para preparar um composto da fórmula (I):<formula>formula see original document page 88</formula>onde:X é O ou NH;Y é -CH2-CH2- ou CH=CH-;Quando Y for -CH2-CH2-; Q é um alquenila C23-C32 ou R1-O- R2;Quando Y for -CH=CH-; Q é alquila C27-C32; alquenila C23-C32; -R1-O-R2-; ou alquila C6-C8 substituída com fenila;R1 e R2 são grupos alquila ou alquenila substituídos ounão-substituídos, de modo que R1 e R2 combinados tenham de 23 a 32 átomos de carbono;R3 é -OH ou monossacarídeo, e R4 é H, ou R3 é H e R4 é -OHou um monossacarídeo; eR5 é hidrogênio ou um monossacarídeo; e saisfarmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dos mesmos, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) reagir um composto da fórmula (II)<formula>formula see original document page 89</formula>para primeiro remover Pgl, seguido pelo tratamento com uméster p-nitrofenila tendo a fórmula III:<formula>formula see original document page 89</formula>onde Q é como definido acima; e(b) subseqüentemente, desproteger Pg2 e Pg3 e,opcionalmente, hidrogenar a dupla libação carbono-carbonoadjacente ao grupo cíclico para formar um composto dafórmula (I) e, opcionalmente, converter o composto apartir da etapa (b) em um sal farmaceuticamente aceitávelou um éster do mesmo.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de o composto da fórmula (II)ser:<formula>formula see original document page 89</formula>

43. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 90</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dosmesmos.

44. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 90</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dosmesmos.

45. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 90</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dosmesmos.

46. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 90</formula>e sais farmaceuticamente aceitáveis ou ésteres dosmesmos.