KR101520512B1

KR101520512B1 - 면역 보강제로의 모노미콜릴 글리세롤의 용도

Info

Publication number: KR101520512B1
Application number: KR1020107002113A
Authority: KR
Inventors: 엘세 마리 아거; 클레어 앤더슨; 피터 앤더슨; 걸드얄 벌스라; 데이비드 미니킨
Original assignee: 스태튼스 세룸 인스티튜트
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2008-06-26
Publication date: 2015-05-14
Also published as: RU2010101274A; SI2167124T1; US20100310585A1; DK2167124T3; EP2167124B1; CA2691840A1; JP2010531820A; ES2394729T3; AU2008271756A1; HK1143086A1; RU2479317C2; PL2167124T3; BRPI0811796A2; IL203016A; KR20100045449A; HRP20120722T1; CA2691840C; CN101790384A; EP2167124A1; US8563009B2

Abstract

여기서 우리는 MMG 및 이의 알파- 및 케토미콜릭 산 유도체들을 M. bocis BCG(Copenhagen)으로부터 유도되고, 극히 낮은 투여량으로 인간 DC`s를 자극하고 활성화시킬 수 있는 높은 생활성 지질로 정의하였다. 인간 DC`s의 면역 조절 물질의 직접적인 역할에 더하여, 우리는 인간 투여에 적합한 새로운 면역 보강제의 개발에 사용되는 것을 보여주었다. 또한, 우리는 암치료, 및 감염성 질병 및 알츠하이머 질병과 같은 장애에 대한 백신 면역 보강제를 위한 높은 활성의 합성 MMG 유사체를 정의한다.

Description

면역 보강제로의 모노미콜릴 글리세롤의 용도{THE USE OF MONOMYCOLYL GLYCEROL(MMG) AS AN ADJUVANT}

본 발명은 면역조절물질, 면역 보강제, 상기 면역 보강제 및 백신 또는 이러한 면역 보강제를 포함하는 전달 체계를 제조하기 위한, 모노미콜릴 글리세롤, 이의 합성 동족체, 유사체 또는 변형된 형태체(version)의 사용을 개시한다.

처음의 백신은 생(live), 독성 약화(attenuated) 병원체(pathogens)로 구성되었다. 독성 약화 형태는 가깝게 관련된 유기체를 자연적으로 발생시키거나 배지에서 연속적인 계대 접종을 통하여 획득되었다. 예를 들어, 사람의 결핵(tuberculosis;TB)은 우형결핵균(Mycobacterium bovis)의 독성 약화된 균주를 가지는 백신, 오랫동안 80년 이상 개발된 the M. bovis BCG 백신으로 싸워왔다. 그러나, (다른 백신보다 더 많은) 30억 이상의 BCG 도즈(dose)가 투약되어 왔음에도 불구하고, 이는 모든 인구에서 항상 만족스러운 인간 TB에의 저항력을 제공하는 것은 아니다.

오늘날, 더 최근의 접근은 고순도 물질, 예를 들어, 정제된 재조합 단백질 또는 펩티드를 사용하는 것이다. 이러한 백신들은 분명하고 부반응들은 최소화된다. 불행하게도, 많은 고순도 물질들은 높은 면역원성을 가지지 않고, 방어를 부여할 정도의 충분한 면역 응답을 유도하지 않는다. 이를 위해, 항원은 면역 보강제라고 불리는 면역 응답 효과를 증가시키는 작용제로부터 어느 정도의 도움을 필요로 한다. 병원체에 의존할 때, 방어는 체액 또는 세포-매개 응답 지배(cell-mediated response predominates)를 필요로 할 수 있다. 면역 혈청을 전달할 수 있는 면역 반응은 만기 체액 면역(termed humoral immunity)이고, 감염성 인자와 결합된 항원성 물질과 결합되고 이에 대한 면역 응답을 촉발하는 항체에 의해서 매개화되는 저항을 의미한다. 세포-매개 면역(cell-mediated immunity;CMI)는 면역 응답을 시작하는 면역 시스템의 세포에 따라 달라진다. CMI 또는 T 보조자(T helper;Th) 1, 면역 응답은 일반적으로 리슈만편모충(Leishmania), 및 결핵을 포함하는 세포내 병원체를 퇴치하는 것과 연관되지만, 또한, 다른 타입의 감염, 예를 들어, 효모 감염 칸디다(Candida)를 퇴치하는 역할을 가진다. 체액, 또는 Th2, 반응 응답은 세포외병원체, 예를 들어, 헤르민스 감염(helminth infection) 에 대한 방어를 위하여 필요로 한다.

여러 경우들, 예를 들어, 인플루엔자, 헤파티티스 C(Hepatitis C;HCV), 인간 면역 결핍증 바이러스(Human Immunodeficiency Virus;HIV), 클라미디아(Chlamydia) 및 말라리아에 있어서, 감염의 단계에 따라서, 혼합된 Th1/Th2 응답이 필요할 수 있다(Mosmann and Sad 1996). 이러한 바이러스들은 생활 주기의 일부는 세포 내이지만, 이들은 또한 세포 외 상태, 예를 들어 세포들 사이의 전송을 겪기 때문에, Th1 및 Th2 둘 다 요구된다.

특정 종류의 (체액 또는 세포-매개된) 면역 응답의 촉진은 면역 보강제의 선택에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들어, M. 결핵(M. tuberculosis ) 같은 세포 내 병원체에 대항하는 방어 면역은 세포-매개된 면역 응답을 필요로 하고, TB에 대항하여 직접 연관되는 백신을 위한 적합한 면역 보강제는 Th1 응답을 향상시킬 수 있다(Lindblad et al. 1997).

많은 면역 보강제들이 존재하지만, 이들 중 대부분은 인간으로의 적용을 방해하는 많은 문제점들을 가지고 있다. 오직 일부의 면역 보강제들, 예를 들어, 알루미늄-기반의 면역 보강제(AlOH-염) 및 MF-59가 인간 적용에 적합하지만, 이들은 Th2-편재 응답(Th2-biased responses)을 유발하는데, Th2-편재 응답은 Th1 응답을 필요로하는 TB 백신 및 다른 백신들에 부적합하도록 만든다(Lindblad et al. 1997).

지난 20-30년 동안 많은 새로운 면역 보강제 시스템이 확립되었고, 현재 이들 중 몇개는 개발 중에 있다. 이에도 불구하고, 새로운 면역 보강제 시스템에 대한 필요가 여전히 인식되고 있으며(Moingeon et al. 2001), 임상 적용에 응용될 수 있는 선택의 폭이 좁은 것이 분명하다.

면역 보강제(설명을 돕기 위해, 라틴어로 adjuvare)는 백신에 투입될 때, 특정 면역 응답을 직접 기여, 가속화, 연장 및/또는 향상시키는 어떤 물질로 정의될 수 있다. 면역 보강제는 전달 체계 또는 면역 조절 물질/면역 자극 물질의 두 개의 주 카테고리로 나누어진다. 전달 체계는 예를 들어, 에멀젼(emulsions), 폴리스티렌 입자들(polystyrene particles), 니오좀(niosomes), ISCOMS, 비로솜(virosomes), 마이크로스피어(microsphere), 또는 계면활성제와 비슷한 리포솜(liposomes)일 수 있는데, 이들은 지질 이중층(lipid bilayer)으로 형성되는 운송체이다. 리포솜은 (운송체 내에서 또는 그 표면에 부착되어) 항원의 수송체로 기능하고, 천천히 계속적인 항원의 방출하면서 접종 부위에 축적 부위(depot)을 형성할 수 있다. 주입 및 식작용 이후에 얼마 동안, 리보솜적인 전달(liposomal presentation)은 항원의 특정량이 단 항원-전달 세포에 이용될 수 있도록 보장할 수 있다(Gluck 1995). 면역 조절 물질은 구별되는 세포 또는 수용체, 예를 들어, APCs의 표면 상의 톨-유사 수용체(toll-like receptor)를 목표로 한다. 전달 체계 및 면역 조절 물질은 예를 들어, Glaxo 계열의 면역 보강제와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 백신 항원을 전달하는 것에 더하여, 전달 체계는 또한 면역 조절 물질을 전달하는데 사용될 수 있다.

백신에 대한 구성 요소임에 더하여, 면역 조절 물질은 항원 없이 투여될 수 있다. 이러한 접근에 의해서, 면역 시스템을 부분적으로 활성화시키는 것, 예를 들어, 항원-전달 세포의 성숙, 항-종양 및 항-바이러스 활성에 있어서 중요한 시토카인(cytokine) 생산을 가능하게 한다. 따라서, 면역 조절 물질의 투여는 암 및 피부 병의 제거를 보조할 수 있다. 부분적으로 투여될 수 있는 면역 조절 물질의 예는 예를 들어 Taxol과 같은 Taxanes, 톨-유사 수용체 7/8 리간드 Resiquimod, Imiquimod, Gardiquimod이다.

디메틸디옥타데실암모늄-브로마이드(Dimethyldioctadecylammonium-bromide), -클로라이드, -포스페이트, -아세테이트 또는 다른 유기 또는 무기 염들(DDA)는 리포필릭 4차 암모늄 화합물인데, 이는 40℃ 이상의 온도의 수용액에서 양이온성 리포솜을 형성한다. DDA는 APCs로의 백신 항원의 섭취(uptake)를 향상시키는 효과적인 절달 체계이다. DDA 및 면역 조절제의 조합이 설명된다. 인간에게 DDA를 포함하는 Arquad 2HT의 투여는 효과가 보장되고, 명확한 부반응을 유도하지 않는다(Stanfield, 1973). DDA 및 TDB 또는 DDA 및 MPL의 조합은 전달 운송체(DDA) 및 면역 조절 물질(TDB 또는 MPL) 사이에서, 이 구성성분을 홀로 얻어지는 응답과 비교하여, 극히 증가된 농도의 CMI 응답을 가지는 매우 명확한 시너지를 보여주었다. 따라서, DDA는 백신 항원에 대한 효과가 보장되는 전달 운송체이고, TB 및 다른 세포 내 병원체에 대한 백신을 위한 면역 보강 시스템을 촉진시키는 면역 조절 물질이다.

미코박테리아(mycobacteria)로부터의 다양한 화합물들은 면역 조절을 가지는 것으로 보고되었다. M. bovis BCG로부터 추출된 지질은 면역 보강제로 사용될 때, 난 알부민(ovalbumin)에 대한 피부 테스트 응답은 기니 돼지들에서 획득되었다(Hiu 1975). M. bovis BCG의 전체 극성 지질로부터 상승되는 온도에서 형성된 리포솜은 난 알부민에 대한 체액 응답을 생성할 수 있고, 이러한 극성 지질로부터 제조되는 백신은 종양 세포로 공격된 쥐에게 방어력을 준다(WO 03/011336). 기니 돼지를 위한 실험적인 TB 백신에서의 항원으로의 M tuberculosis H37Rv의 전체 지질의 효과는 (Dascher et al. 2003)에 의해서 연구되어 왔다. 이러한 연구에서, 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine;DSPC)에 기초한 리포솜은 M tuberculosis H37Rv 전체 지질 추출물과 혼합되었다. 용매를 제거한 후, 지질은 PBS 버퍼에서 면역 보강제로서 디메틸디옥타데실암모늄(DDA)으로 재구성되었다. 이러한 백신에 의해서 면역화된 기니 돼지는 세균의 현저한 감소를 보이지 않고, 이러한 DDA와 혼합된 리포솜 제제는 강한 항원이 부족하거나, 콜레스테롤:DSPC를 가지는 미코박테리아 지질의 제제는 DDA의 면역 보강 효과를 방해하는 것이 밝혀졌다. 대안적으로 다양한 지질의 혼합물이 투여될 때, 효과적인 지질은 전체 지질의 너무 한정된 비율로 구성될 수 있다.

미코박테리아로부터의 다양한 정제 구성 성분은 또한 이들의 면역 보강 활성에 대해서 연구되어 왔다. 정제 단백질 유도체(PPD)는 그 자체적으로 지연 과민(delayed type hypersensitivity) 반응을 유도하지 않지만, Wax D(미코박테리아 세포 벽 펩티도글리칸(peptidoglycan) 조각-아라비노갈락탄-미콜릭산(fragment-arabinogalactan-mycolic acid) 복합체)가 면역 보강제로 추가될 때, 강한 반응이 관찰되었다(Yamazaki S 1969). 면역 조절 물질 SSM 또는-100, M. tuberculosis로부터 추출된 지질 아라비노마난(arabinomannan)은 항 종양 활성을 가진다(Suzuki F 1986). 또 다른 미코박테리아 세포 유도되는 화합물은 트리할로스 6,6'-디미콜레이트(trehalose 6,6'-dimycolate;TDM)(코드 인자(cord factor); 글리코립피드(glycolipid)를 포함하는 미콜릭산(mycolic acid))이다(Saito et al, 1976). 또한, TDM(또는 합성 유사체)는 면역 자극 효과를 가지고 다양한 면역 보강 제제에 포함된다(McBride et al. 1998)(Koike et al. 1998).

Silva et al(1985)의 논문에서, Mycobaterium bovis BCG로부터 정제된 5개의 구성 성분들은 지질-코팅된 탄 입자들(lipid-coated charcoal particles)로 정맥 내에 주입되었고, 쥐의 폐에에서 염증 반응(inflammatory reaction)을 일으켰다. 5개의 구성 성분들은 TDM, 트리할로스 모노미콜레이트(trehalose monomycolate;MMT), 글루코스 모노미콜레이트(glucose monomycolate;MMGlc), 아라비노스 모노미콜레이트(arabinose monomycolate;MMAr), 및 글리세롤 모노미콜레이트(glycerol monomycolate;MMGlyc)를 포함한다. 논문은 모노미콜릴글리세롤 헤드그룹(headgroup)을 기술하는 반면, 미콜산(mycolid acid)의 조성이 부실하게 정의되고, 구조적인 데이터가 제공되지 않는다. 게다가, 지질의 투여에 대한 반응은 단지 폐에서의 염증 활성도로 기술되는 반면, 면역 보강 효과로 알려진 특이 면역 응답을 향상시키는 능력은 기술되지 않는다.

미코박테리아-유도된(mycobacterial-derived) 지질의 면역자극 및 염증의 활성은 오랫동안 동물(쥐) 모델에서 면역 응답을 자극할 수 있는 지질에 대한 계속되어온 문헌으로 알 수 있음에도 불구하고, 오늘날 인간 가지세포(human dendritic cells;DCs)를 자극하는 능력을 가지는 개개의 지질은 규명되지 않았다. 예를 들어; TDM은 전염증성 응답(proinflammatory)의 측면에서 가장 활성을 가지는 미코박테리아 지질으로 보여졌음에도 불구하고, TDM으로의 자극에 대한 가지세포의 활성은 관찰되지 않았다(Uehori et al, 2003). 따라서, TDM은 여러 논문들에서 염증성 활성을 보여왔고, 이러한 지질은 명확히 면역 응답을 시작하는데 중요한 가지세포를 활성화시키는 능력이 명백히 부족하다. 인간 가지세포를 활성화시키는 능력을 가지는 그러한 지질의 규명은 인간에의 사용이 적합한 새로운 면역 보강 시스템의 일부로써 사용될 수 있다는 것을 제시한다. 또한, 인간에 적합한 Th1-유도 면역보강제(Th1-inducing adjuvants)의 부족은 중요한 결과인 Th1-증진 능력을 가지는 단일 미코박테리아 유도된 지질의 식별하도록한다.

DCs는 M. tuberculosis와 같은 병원체로의 감염에 대한 면역 응답을 직접 유도하는 필수적인 역할을 하는 전문적인 항원 제시 세포(antigen presenting cells;APC)이다. 따라서, 활성화된 DC에 의한 IL-12의 생산은 Th-1 세포에 의해서 IFN-γ를 생산시키는데 가장 중요한 시토카인(cytokine)이기 때문에, M.tuberculosis를 제어하는데 필수적인 단계인데, Th-1 세포는 대식 세포(macrophases)의 활성을 증진시킨다(Nathan et al. 1983). 또한, 최근 면역 응답을 조절하는 시도에서 미코박테리아는 DC를 목표로 한다는 것을 나타내는 증거가 발견되었고, 이러한 과정에서 미코박테리아 지질에 대한 중요한 역할이 확립되었다.

미코박테리아의 세포 외피의 40%까지의 건조 중량은 지질을 구성한다(Minnikin 1982). 이러한 지질은 이와 같은 과(family)의 유기체의 차별되는 병원성(pathogenicity)과 관련되었고, 미코박테리아 감염에 대한 주 응답(host response)에서 실질적인 역할을 한다(Brennan and Goren 1979). 이러한 지질 중 중요한 것은 병원성과 관련되는 것으로 알려진 프티오세롤 디미코세로세이트(phthiocerol dimycocerosate;PDIM) 왁스(Minnikin et al. 2003); PDIM-부족 M.tuberculosis 돌연변이 쥐의 약화된 성장을 보여준다(Sirakova et al. 2003). PDIMs와 가깝게 관련된 것은 소위 "페놀릭 글리코립피드(phenolic glycolipid;PGLs)인데, 좋은 예로, Mycobacterium bovis에서 발견되는 2-메틸람모노실 페놀프티오세롤 디미코세로세이트(2-methylrhamnosyl phenolphthiocerl dimycocerosates)("미코사이드 B(mycoside B)")이다. 이러한 모노글리코실 PGL lc M. tuberculosis의 분리주의 초과 발병력(hypervirulence) 사이의 관련성은 최근 보여진다(Reed et al. 2004).

특히 주목할 만한 또 다른 지질 클래스는 "코드 인자"라고 불리는 트리할로스-6,6-디미콜레이트(trehalose-6,6-dimycolates;TDM)이다. TDM은 TNF-α, IL-6 및

IL12와 같은 전염증성의 시토카인의 방출을 자극하는 것에 의해서, 육아종 병변의 유지를 증진시키고, Th-1-증진 시토카인 IFN-γ(Lima et al. 2001)는 포식소체-리소좀(phagosome-lysosome) 융합을 억제(indrigo et al. 2002)하는 것에 의해서 대식세포 내의 M. tuberculosis의 생존을 연장시키는 역할을 가진다. TDM의 미콜레이트 성분의 미세 구조는 초기 감염 동안 대식 세포의 전연증성 반응에서 중요하다(Rao et al, 2005).

미코박테리아 생존을 증가시키는 이들의 역할에도 불구하고, 미코박테리아 지질의 면역조절력은 새로운 세대의 Th-1-유도 면역 보강제를 생산하는데 활용도리 수 있다. 단백질 면역 조절 활성을 가지는 개개의 지질을 규명하는데 있어서, 여전히 잠재적인 면역 보강 활성을 유지하는 동안, Freund의 완전 면역 보강제(CFA)인 오일과 혼합된 M. tuberculosis의 열 살균된 전체 세포와 관련된 독성 문제를 피할 수 있는 것이 가능할 수 있다. M. bovis Bacillus-Calmette-Guerin(BCG)의 극성 지질로부터 형성되는 리포솜은 최근 쥐 뼈, 골수-유도된(marrow-derived) 가지 세포(BM-DC)를 활성화시키는 것을 보여준다. 주된 활성은 지질 글리코포스포립피드 포스포아티디 디메노사이드(glycophospholipid phospholipid phosphatidylinositol dimannoside)에 기여한다고 알려졌다(Sprott et al).

최근 우리 실험실에서의 연구는 강한 체액 및 세포 매개 성분을 가지는 M. bovis 및 미코박테리아 지질 추출물 및 복합적이고 지속적인 면역 응답을 증진시킬 수 있는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA)의 새로운 면역 보강 조합물을 특성화시켰다(Rosenkrands et al. 2005). 전체 BCG 지질의 주된 면역 활성은 무극성 지질에 기인한다는 것이 밝혀졌다.

이러한 연구들이 면역 보강제로서 기능하는 미코박테리아 지질의 가능성을 확인하는 동안, 최적의 용액이 홀로 강한 활성을 가지는 단일의 가장 높은 면역자극의 지질을 식별할 것이다. 이는 더 간단하고, 더 싼 면역 보강제를 제시할 것이고, 세계적으로 투여되는 백신들에서 사용을 위한 많은 양의 면역 보강제를 생산할 수 있는 청정 시스템을 가능하게 하는 지질의 합성 유사체를 만들 수 있는 가능성을 열 것이다.

실시예는 MMG 또는 이의 동족체, 유사체 및 변형된 형태체를 사용하여, 향상된 효과를 가지는 백신 및 전달 체계를 제공하고자 한다.

실시예는 MMG 및 이의 알파- 및 케토미콜릭 산 유도체들을 M. bocis BCG(Copenhagen)으로부터 유도되고, 극히 낮은 투여량으로 인간 DC`s를 자극하고 활성화시킬 수 있는 높은 생활성 지질을 개시한다. 인간 DC`s의 면역 조절 물질의 직접적인 역할에 더하여, 우리는 인간 투여에 적합한 새로운 면역 보강제의 개발에 사용되는 것을 보여주었다. 또한, 우리는 암치료, 및 감염성 질병 및 알츠하이머 질병과 같은 장애에 대한 백신 면역 보강제를 위한 높은 활성의 합성 MMG 유사체를 정의한다.

이에 따라서, 실시예는 향상된 효과를 가지는 백신 및 전달 체계를 제공할 수 있다.

도 1. M. bovis BCG의 무극성 및 극성 지질의 면역자극 활성의 분리 및 평가.
도 2. MMG, TAG, PDIM 및 PGL의 구조들.
도 3 MMG에 의한 인간 가지세포의 활성화.
도 4. MMG의 알파- 및 케토미콜레이트는 면역자극이다.
도 5. M. bovis BCG Copenhagen으로부터 분리된 MMG에 의한 IFN-γ 방출.
도 6. MMG 면역보강제로 독성 TB 감염에 대한 방어.
도 7. IFN-γ 방출은 MMG 및 DDA의 결합에 의해서 강화된다.
도 8. IFN-γ 방출은 MMG/DDA 조합물에 TDB의 추가에 의해서 향상된다.
도 9. 합성 MMG 유사체의 구조의 예.
도 10. 면역 응답은 자연 및 합성 MMG 유사체에서 비교된다.
도 11. 더 짧은 사슬 길이에 따른 더 높은 면역 응답.

본 발명은 인간 DCs를 활성화시킬 수 있는 면역자극의 지질, 모노미콜릴 글리세롤(MMG) 및 이의 합성 동족체(homologues), 유사체(analogues) 및 변형된 형태체가 개시된다. MMG는 전체 BCG 지질 중 무극성 부분으로부터 유도되고, 이러한 지질과 관련하여, 면역 보강 및 방어 효과를 유도하는 것으로 추정된다. 더 작은 탄소 뼈대를 가지는 합성 MMG는 생체 외에서 인간 DCs에서의 자연 MMG의 자극 특성을 향상시킬 수 있고, 또한, 생체 내에서 강한 Th1 응답을 유도하는데, Th1 응답은 쥐 모델에서, TB에 대한 길게 지속되는 방어 면역 응답으로 바뀐다.

본 발명은 면역 조절물질, 면역 보강제 및 백신을 제조하기 위해서, 또는 인간 가지 세포를 유일하게 자극할 수 있는 면역 보강제를 포함하는 전달 체계를 위해서, 모노미콜릴 글리세롤(MMG) 또는 이의 합성 동족체, 유사체 및 변형된 형태체의 사용을 개시한다.

면역 조절물질 MMG 또는 이의 합성 동족체, 유사체 및 변형된 형태체는 항원 없이 투여될 것이다. 이러한 접근에서, 면역 체계를 부분적으로 활성화시키는 것, 예를 들어, 항원 전달 세포(antigen-presenting cells)의 성숙, 항-종양 및 항-바이러스 활성에 중요한 시토카인 생성을 가능하게 한다.

면역 보강제(adjuvant)(돕기 위해, 라틴어로 adjuvare)는 백신으로 투여될 때, 특이 면역 반응을 직접 유발, 가속화, 연장 및/또는 강화시키는데 기여하는 물질로 정의된다. 면역 보강제의 본성에 따라서, 면역 보강제는 세포-매개 면역 반응(cell-mediated immune response), 체액 면역 반응(humoral immune response) 또는 이들 둘을 증진시킬 수 있다. 백신 면역 보강제(vaccine adjuvant)으로 사용될 때, 항원 성분이 면역 보강제에 추가된다. 면역 보강제에 의해서 매개되는 면역 반응의 강화는 비-특이적(non-specific)이기 때문에, 같은 면역 보강제는 다른 표적에 대한 반응을 증진시키기 위한 다른 항원으로, 예를 들어, M tuberculosis에 대한 면역을 증진시키기 위한 M tuberculosis로부터의 항원으로 또는 특정 종류의 종양에 대한 면역을 증진 시키기 위한 종양으로부터 유도된 항원으로 사용될 수 있다.

본 발명에 의해서 개시되는 바람직한 면역 보강제는 MMG 또는 이의 합성 동족체, 유사체 또는 변형된 형태체를 포함하는 면역 보강제인데, 이는 전달 담체(delivery vehicle) 예를 들어, 에멀전(emulsions), 폴리스티렌 입자들(polystyrene particles), 노이솜(noisomes), IS-COMs, 비로솜(virosomes), 마이크로스피어(microspheres) 또는 리포솜(liposomes)과 같은 계면활성제(surfactant)를 더 포함한다. 바람직한 계면활성제는 가장 바람직하게 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 또는 클로라이드(dimethyldioctadecylammonium bromide or chloride;DDA-B or DDA-C) 또는 이의 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate) 또는 아세테이트(acetate) 염(DDA-X), 또는 디메틸디옥타데시닐암모늄 브로마이드 또는 클로라이드(dimethyldioctadecenylammonium bromide or chloride; DODA-B or DODA-C) 또는 이의 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트 화합물에 기초하는 양이온성 지질이다. 본 발명에서 사용되는 다른 형태의 바람직한 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane; DOTAP), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로판(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄- 프로판(1,2-distearoyl-3-trimethylammonium-propane) 및 디올레일-3-디메틸암모늄 프로판(dioleoyl-3-dimethylammonium propane; DODAP) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trirnethylammonium; DOTMA)을 포함하고, 이에 한정되지 않는다. 다른 계면 활성제는 DXPC, DXPE, DXPG 또는 이들의 조합들로부터 선택되는데, 여기서, X는 사슬길이(chainlength) 설명, 예를 들어, P=팔미토일(16C), S=스테아로인(18C), A=아라치도일(arachidoyl)(20C)의 치환이다.

전달 담체는 또한, TLR 및 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A; MPL), 폴리이노시닉 폴리시티딜릭산(polyinosinic polycytidylic acid; poly-IC), 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide;MDP), 지모산(zymosan), 이중쇄 RNA(double-stranded RNA; dsRNA), DC-Chol, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(oligodeoxynucleotides), 양이온성 펩티드(cationic peptides), TDM, TDB, 타목시펜(tamoxifen) 또는 이러한 분자들의 유사체와 같은 비-TLR 리간드(regands)와 같은 다른 면역 조절 물질들을 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 바람직한 면역 보강제는 MMG 또는 이의 동족체, 유사체 또는 변형된 형태체를 포함하고, 전달 담체로 TLR- 또는 비-TLR 리간드를 포함한다.

MMG 또는 이의 합성 동족체, 유사체 및 변형된 형태체를 포함하는 전달 체계는 암, 자가면역 장애(autoimmune disorder), 알츠하이머(Alzheimer)와 같은 신경 장애(nerve disorder), 기도 염증(airway inflammation), 염증성 장애(inflammatory disorders), 감염병(infectious disease), 피부 장애(skin disorders), 알레르기(allergy), 천식(asthma) 또는 병원체에 의한 병을 치료하는데 사용될 수 있다. MMG 또는 이의 합성 동족체, 유사체 및 변형된 형태체는 하나 이상의 백신, 항원, 항체, 세포 독성제(cytotoxic agents), 알레르기 항원(allergen), 항생제(antibiotics), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), TLR- 및 비-TLR 작용제, TLR- 및 비-TLR 대항제(antagonist), 펩티드, 단백질, 유전자 치료 벡터(gene therapy vectors), DNA 백신 또는 동시-자극 분자들(co-stimulatory molecules)와 조합하여 투여된다.

항원 성분 또는 물질은 기능성 항체(performed antibody) 및/또는 T 및 B 세포에 대한 특이 수용체와 반응하는 분자이다. 백신접종(vaccination)의 맥락에서, 특이 T 또는 B 세포의 증가를 자극할 수 있는 분자는 면역 세포(immune cells)의 기억 집단(memory population)의 형성을 유도하는데, 항원이 면역 세포에 의해서 두번째 만날 때, 면역 세포는 더 빠른 "기억" 응답을 촉진시킬 것이다. 기억 집단은 거의가 클론이기 때문에, 이는 실제로 항원이 어떤 분자들 또는 분자들의 집합을 의미하는데, 이러한 분자들은 이전에 항원에 노출된 개인으로부터의 면역 세포에 재 접촉될 때, 면역 응답의 증가를 자극할 수 있다.

본 발명은 추가적으로 비경구적으로, 구강 또는 점막 투여를 또는 면역 보강제를 포함하는 전달 체계에 대한 백신을 개시한다. 바람직한 백신은 세포 내 병원체, 예를 들어, 독성 미코박테리아(a virulent mycobacterium, 예를 들어, 융합 생성물(fusion product) Ag85b_TB 10.4, Ag85b_ESAT-6_Rv2660, Ag85b_TB10.4_Rv2660 and Ag85a_TB10.4_Rv2660), Plasmodium falciparum(Mspl, Msp2, Msp3, Amal, GLURP, LSA1, LSA3 or CSP), Chlamydia trachomatis(예를 들어, CT184, CT521, CT443, CT520, CT521, CT375, CT583, CT603, CT610 or CT681), HIV, 인플루엔자 or 헤파티티스(Hepatitis) B 또는 C로부터의 항원 에피토프(antigenic epitope)를 포함한다. 면역 보강제 또는 전달 체계는 또한 암, 알레르기 또는 자가면역 질병을 치료하기 위한 백신에 사용될 수 있다.

전체 미코박테리아 지질 추출물은 화학적 또는 물리적인 공정에 의해서, 미코박테리아, 예를 들어, BCG , M microti , M. tuberculosis 및 M. vaccae로부터 획득된다. 현재의 작업에서, 추출을 위해 사용되는 방법은 (아래 도시된 바와 같이) 유기 용매의 작용이지만, 당업자에게 알려진 다른 방법들이 가능하다.

무극성 지질 부분은 비-극성(non-polar) 지질로 정의된다. 무극성 지질 부분은 메탄올/살린(methanol/saline) 및 석유 에테르(petroleum ether)의 이상성(biphasic) 혼합물로 미코박테리아를 처리하는 것에 의해서 획득된다. 석유 에테르 추출물은 무극성(비-극성) 지질로 구성된다. 여기에서, 극성 지질 부분은 미코박테리아 및 남아있는 수용상(aqueous pahse)에 클로로포름을 추가하는 것에 의해서 획득된다. 무극성 지질 부분에서의 주된 성분은 피토세롤 디미코세로세이트(phtiocerol dimycocerosates), 트리아실글리세롤(triacylglycerols), 트리할로스미콜리페네이트(trehalose mycolipenates) 및 메나퀴논(menaquinones)이다. 극성 지질 부분의 주된 성분은 포스페티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스페티딜그릴세롤(phosphatidylglycerol) 및 포스페티딜이노시톨(phosphatidy linositol)과 같은 인지질(phospholipids)이다. 중간 극성의 지질은 설포립피드(sulpholipids), 트리할로스 미콜레이트, (페놀릭 글리코립피드(phenolic glycolipid), PGL's를 포함하는) 글리코실레이트 페놀프티오세롤(glycosylated phenolphthiocerols) 및 아실레이트 트리할로스(acylated trehaloses)이다(Dobson et al, 1985).

MMG는 무극성 지질 부분으로부터 획득되는 지질 모노미콜릴 글리세롤, 알파-MMG 및 케토-MMG와 같은 유도체 및 이의 자연 및 합성 유사체를 지칭한다. MMG는 톨루엔/아세톤(95:5)에서 TLCs 운행(TLCs run)에 의해서 분리될 수 있다. PGL 및 MMG는 이러한 방법에 의해서 함께 추출되지만, 클로로포름:메탄올:0.880 암모니아(97:3:0.5)에서 1-D TLC로 분리될 수 있다. MMG의 유도체들, 알파-MMG 및 케토-MMG는 5% 수용성 TBAH(2.5㎖)으로 16×100㎜ 튜브에서, 100℃로 밤새 가열되어 획득될 수 있다(Minnikin 1988).

MMG의 합성 동족체, 유사체 및 변형된 형태체는 화학적 합성의 통상적인 방법에 의해서 생성될 수 있다. 유사체는 구조에서 유사하지만, 기본 조성면에서 다른 화합물의 그룹 중 하나를 지칭하고, 동족체는 동족 시리즈의 화합물들 중 어떤 멤버를 지칭한다. 이러한 화합물들은 탄소 사슬 길이를 변화시킬 수 있는데; 특히, 감소된 크기는 감소되는 독성과 연관되고, 따라서, 유사체의 명시적인 독성을 줄이는데 기여할 수 있다. 따라서, 합성된 형태체는 각각의 지질 말단에서 8-36 탄소를 가지고 0-3 이중 결합을 가지는 알킬-사슬에 기초할 수 있다. 또한, 단순화된 형태는 지질 말단들(lipid tails) 중 하나를 제거하여 형성될 수 있다. 합성 MMG의 탄소 뼈대 크기는 바람직하게 C8-C36, 예를 들어, 3-히드록시-2-에틸-헥사노익산-2,3-디히드록시프로필 에테르(3-hydroxy-2-ethyl-hexanoic acid-2,3-dihydroxypropyl ester)(C8), 3-히드록시-2-부틸-옥타오익산-2,3-디히드록시프로필 에테르(3-hydroxy-2-butyl-octanoic acid-2,3-dihydroxypropyl ester)(C12), 3-히드록시-2-헥실-데카노익산-2,3-디히드록시프로필 에테르(3-hydroxy-2-hexyl-decanoic acid-2,3-dihydroxypropyl ester)(C16), 3-히드록시-2-헵틸-언데카노익산-2,3-디히드록시프로필 에테르(3-hydroxy-2- heptyl-undecanoic acid-2,3-dihydroxypropyl ester)(C18), 3-히드록시-2-테트라데실-옥타데카노익산-2,3-디히드록시프로필 에테르(3-hydroxy-2-tetradecyl-octadecanoic acid-2,3-dihydroxypropyl ester(C32) 또는 3-히드록시-2-헥사데실-이코사노익산-2,3-디히드록시옥시프로필 에테르(3-hydroxy-2-hexadecyl-icosanoic acid-2,3-dihydroxypropyl ester(C36)이고, 가장 바람직하게 C8 또는 C16이다. 변형된 형태체는 글리세롤 모이어티(moiety)를 다른 폴리올 헤드기, 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리세롤 등으로 치환에 의해서 제조될 수 있다. 글리세롤 뿐만 아니라, 합성 모노미콜레이트의 약 C2 및 C3의 스테레오케미스트리(sterochemistry)는 다양할 수 있다. 이하에서, 홀로 쓰여진 MMG는 위에서 기술된 MMG의 합성 동족체, 유사체 또는 변형된 형태체를 의미한다.

항원 성분 또는 물질은 폴리펩티드 또는 폴리 펩티드의 일부일 수 있는데, 이는 동물 또는 여기서 생물학적인 아쎄이들 중 일부에 의해서 측정되는 인간에서 및/또는 생물학적인 샘플에서 면역 응답을 이끌어낸다. 폴리펩티드의 면역원성 부분은 T-세포 에피토프 또는 B-세포 에피토프일 수 있다. 면역 반응 동안 인지되는 적절한 T-세포 에피토프를 식별하기 위해서, "브르트 력(brute force)" 방법을 사용할 수 있는데: T-세포는 선형이기 때문에, 폴리펩티드의 결실 돌연변이는, 대칭적으로 구성된다면, 에를 들어, 여기에 기술된 IFN-감마 아쎄이에 이러한 결실 돌연변이를 제공하는 것에 의해서, 면역 인지에 있어서 폴리펩티드의 어느 영역이 필수적인지를 나타낸다. 또 다른 방법은 폴리펩티들로부터 유도된 올리고펩티드(더 바람직하게 20 아미노산 잔기의 길이를 가지는 합성 올리고 펩티드)를 중복하는데 이용된다. 이러한 펩티드들은 생물학적 아쎄이(예를 들어, 여기에 기술된 바와 같이, IFN-감마 아쎄이)로 테스트 되었고, 이들 중 일부는 펩티드에서 T-세포 에피토프가 존재한다는 증거로 양성 응답을 나타낼 것이고, (이에 따라서, 면역원성을 가질 것이다).

비록, T-세포의 최소 길이는 적어도 6개의 아미노산들로 나타나지만, 그러한 에피토프들은 더 긴 길이의 아미노산으로 구성되는 것이 일반적이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 조각은 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 및 적어도 30개의 아미노산 잔기들과 같은 적어도 7개의 아미노산 잔기들의 길이를 가진다. 따라서, 본 발명의 방법의 중요한 실시예에서, 폴리펩티드 조각은 많아야 40, 35, 30, 25, 및20개의 아미노산 잔기와 같은 많아야 50개의 아미노산 잔기의 길이를 가진다. 10 및 20 사이의 아미노산 잔기들의 길이를 가지는 폴리펩티드는 진단 툴로 매우 가장 효과적이라는 것이 증명될 것이고, 따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 폴리펩티드 조각의 특별히 바람직한 길이는 18, 15, 14, 13, 12 및 심지어 11개의 아미노산일 수 있다.

특별히, 항원 물질은 대사작용하는(metabolising) Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis 및 Mycobacterium avium와 같은 다른 환경 미코박테리아(environment mycobacteria)로부터 유도될 수 있다. 특히, 이런 미코박테리아의 여과액으로부터의 흥미로운 물질은 TB 환자들 및 다른 동물 모델들에서의 결핵의 초기 상태에서 세포 매개된 면역을 위한 지배 표적(dominant targets)인 Ag85A, Ag85B, , ORF2c, Rv 1036 and Rv0285과 같은 다른 초기 알레르기 항원뿐만 아니라 (ESAT6 및 TB 10.4와 같은) ESAT-6 유전자 과(family) 단백질이다. TB 감염의 이후 단계 동안의 지배 표적인 Rv2653, Rv2655, Rv2656, Rv2657, Rv2658, Rv2659, Rv2660와 같은 다른 항원들도 관련이 있다. 이들의 se당 면역원성은 낮지만, 본 명세서의 이하의 상세한 설명 부분에서 보여주는 바와 같이, 본 발명의 면역 보강제 조합물과 조합하여 결핵에 대항하여 높고, 지속적인 면역을 유발하기 위한 중요한 후보들이라는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 면역 보강제 조합물과 조합하여 적용할 수 있는 많은 다른 항원들 뿐만아니라 ESAT-6 유전자 과 단백질은 오늘날, 인공적으로, 예를 들어, 합성으로 또는 유전자 재조합 기술들로 생산될 수 있다.

융합 단백질은 백신에서 항원성 물질에 특별히 잘 적합하다고 증명되었는데, 예를 들어, 융합 생성물 Ag85b_TB10.4, Ag85b_ESAT-6_Rv2660, Ag85b_TB10.4_Rv2660 및 Ag85a_TB10.4_Rv2660는 TB에 대하여 매우 효과적이라고 입증되었다.

백신은 접종을 위해서, 죽은, 독성 약화된 또는 다르게 변형된 마이크로유기체 또는 이의 일부의 현탁액(suspension)으로 만들어지고, 질병에 대하여 면역을 생성한다. 백신은 질병을 방지하기 위해서 예방적으로 또는 암 또는 잠복 감염 질병과 같은 이미 존재하는 질병과 싸우는 치료 백신으로, 뿐만 아니라 알레르기 및 자가면역 질병과 관련하여, 투여될 수 있다. 백신은 면역 응답을 증강시키기 위하여 적합한 면역 보강제로 유화될 수 있다.

백신은 복용 제제(dosage formulation)과 호환되는 방법으로, 및 치료에 효과적이고 면역원성을 가질 양으로 투여될 수 있다. 투여되는 양은 치료될 대상에 따라서 예를 들어, 면역 응답을 가질 개개인의 면역 체계의 용량, 및 원하는 보호의 정도에 따라서, 달라진다. 적합한 복용량 범위는 바람직하게, 약 0.1㎍ 내지 1000㎍의 범위를 가지는, 더 자세하게, 약 1㎍ 내지 300㎍의 범위를 가지는 백신 접종 당 수백 마이크로 그램의 활성 성분이다. 초기 투여 및 추가 접종(booster shot)에서의 적합한 요법은 또한 다양하나, 초기 투여 후에 추가 접종 또는 다른 투여가 진행되는 것이 전형적이다.

적용의 방법은 매우 다양할 수 있다. 백신의 투여를 위한 통상적인 방법이 적용된다. 이들은 고형의 생리적으로 수용가능한 기재(solid physiologically acceptable base) 또는 생리적으로 수용가능한 분산액, 비경구적으로, 주입에 의해서 구강 또는 점막 적용을 포함한다. 백신의 복용량은 투여의 경로에 따라 달라질 것이고, 백신 접종되는 사람의 나이에 따라서 더 낮은 정도로, 백신 접종되는 사람의 크기에 따라서 달라질 것이다.

백신은 통상적으로 비경구적으로, 주입에 의해서, 예를 들어, 피하로(subcutaneously) 또는 근육내로 투여된다. 다른 방식의 투여에 적합한 추가적인 제제는 좌약 및 어떤 경우에는 구강 또는 점막 제제를 포함한다. 좌약에 대하여, 전통적인 바인더 및 수송제(carriers)는, 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜(polyalkalene glycols) 또는 트리글리세라이드(triglycerides)를 포함하는데; 그러한 좌약은 활성 성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게, 1-2%의 범위로 포함하는 혼합물로 형성될 수 있다. 구강 제제는 예를 들어, 마니톨(mannitol), 락토스(lactose), 녹말, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 소듐 사카린(sodium saccharine), 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트(carbonate) 등의 약학적인 등급에 따라서, 일반적으로 적용되는 부형제를 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제(tablets), 환제(pills), 캡슐, 지속적인 방출 제제 또는 파우더의 형태를 가지고, 더 나아가 10-95%의, 바람직하게 25-70%의 활성 성분을 포함한다.

예를 들어, 백신 선택은 다음과 같을 수 있다:

단백질 백신: 폴리펩티드(또는 이의 적어도 하나의 면역원성 부분), 펩티드 혼합물 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 단백질 조성물.

생 재조합 백신: 비-병원체 마이크로유기체 또는 바이러스에서 백신에서의 관련된 항원의 발현. 그러한 마이크로유기체의 잘 알려진 예들은 Mycobacterium bovis BCG, 살모넬라(Salmonella) 및 녹농균(Pseudomonas)이고, 바이러스의 예들은 우두 바이러스(Vaccinia Virus) 및 아데노바이러스(Adenovirus)이다.

이러한 모든 백신 구조물들에서, 적합한 면역 보강제의 추가는 향상된 백신 효과를 초래한다(Brandt et al, 2000), (van Rooij et al, 2002), (Bennekov et al, 2006).

리포솜(또는 지질 담체)는 지질 이중층에 의해서 감싸지는 수용성 구획(compartments)이다. 지질 성분은 통상적으로 콜레스테롤 및 다른 전하 지질(charged lipid)로 보강되는 인지질 또는 계면 활성제와 같은 다른 양친매성 물질(amphiphiles)이다. 리포솜은 수-용성 및 지질-용해성 화합물을 감쌀 수 있고, 리포솜은 수송제로 동작된다. 리포솜은 면역 보강제와 같은 약, 감염병 및 염증의 치료, 암 치료, 및 유전자 치료에서 전달 체계로 사용되어왔다{Gregoriadis et al, 1995}. 리포솜의 면역 보강 효과에 영향을 미치는 인자는 리포솜의 크기, 지질의 조성, 및 표면 전하이다. 항원 위치(예를 들어, 리포솜의 표면에 흡수되거나, 공유적으로 결합되는지, 아니면, 리포솜의 수용성 구획에 감싸지는지 여부)는 또한 중요할 수 있다. 가지 세포는 항원 전달 담체로 사용될 수 있다. 가지 세포와 같은 항원 발현 세포에 항원의 적재는 항 종양 면역의 역할을 가지는 활성 T-세포를 생성하는데 효과적인 방법으로 보여진다.

4차 암모늄 화합물, 예를 들어, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 또는 클로라이드(dimethyldioctadecylammonium bromide or chloride;DDA-B or DDA-C) 또는 이의 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate) 또는 아세테이트(acetate) 염(DDA-X), 또는 디메틸디옥타데시닐암모늄 브로마이드 또는 클로라이드(dimethyldioctadecenylammonium bromide or chloride; DODA-B or DODA-C) 또는 이의 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트 화합물에 기초하는 양이온성 지질이다. 본 발명에서 사용되는 다른 형태의 바람직한 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane; DOTAP), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로판(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄- 프로판(1,2-distearoyl-3-trimethylammonium-propane) 및 디올레일-3-디메틸암모늄 프로판(dioleoyl-3-dimethylammonium propane; DODAP) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trirnethylammonium; DOTMA)은 수용성 배지에 분산될 때, 지질 이중층, 모든 유형의 단층 또는 다층의 리포솜, 미셀과 같은 지질 집합체를 형성하는 능력을 가진다. 이러한 구조의 지질 멤브레인은 글리코립피드, 예를 들어, 담체 분산을 안정화시키는 것으로 보여지는 MMG 또는 알파, 알파'-트리할로스 6,6'-디베헤네이트(alpha, alpha'-trehalose 6,6'-dibehenate;TDB)와 같은 다른 양친매성 화합물들이 포함되기 위한 훌륭한 매트릭스를 제공한다(Davidesen et al, PCT/DK2005/000467).

MMG 및 전달 체계의 조합은 DDA가 홀로 투여될 때보다 상승효과의 방식으로 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 따라서, DDA는 낮은 농도의 IFN-γ 생성을 촉진하지만, MMG와의 조합에서, IFN-γ 생성은 극적으로 향상된다.

본 발명의 리포솜은 당업계에서 널리 알려진 다양한 방법들에 의해서 제조될 수 있다(Davidsen et al, PCT/DK/2005/000467), 리포솜/전달 체계로의 MMG의 결합은 리포솜 및 MMG의 단순 혼합을 포함하는 당업계에서 널리 알려진 다양한 방법들에 의해서 실현될 수 있다. 특히, 리포솜으로 MMG의 결합은 Davidesen et al, PCT/DK/2005/000467에 기술된 바와 같이 실현될 수 있다.

병에 면역을 제공하는 것에 더하여, 본 발명의 면역 보강제 조합물은 또한 se 당 빈약한 면역원성 물질인 화합물에 대하여 항체를 생성하는데 사용될 수 있고, 그러한 항체는 예를 들어, 의약 및 분석 화학 분야에서 미지의 화합물의 검출 및 정량화를 를 위하여 사용될 수 있다.

도면 범례

도 1. M. bovis BCG 의 무극성 및 극성 지질의 면역자극 활성의 분리 및 평가. M. bovis BCG Copenhagen으로부터 추출된 극성 및 무극성 지질은 2-D TLC에 의해서 분석되었다. 극성 지질 부분에서, 1-4는 포스패티디이노시톨 매노사이드이고, PI는 포스패티딜이노시톨이고, PE는 포스패티딜에탄올아민이고, DPG는 디포스패티딜글리세롤(카디오립피드(cardiolipid)이다. PG는 L-알파-포스패티딜-DL-글리세롤이고, 5 및 6은 알려지지 않는 인지질이다. 무극성 부분에서 TAG는 트리아실글리세롤이고, PDIM은 프티오세롤 디미코세로세이트 A, B 및 C이고, MMG는 모노미콜릴 글리세롤이고, PGL은 페놀릭 글리코립피드이고, FFA는 무지방산(패널 A)이다. iDC는 24시간동안 배지, LPS(0.1㎍/㎖), MPL(100㎍/㎖), 코드 인자(CF)(100㎍/㎖), 무극성 지질(0.1-100㎍/㎖) 또는 극성 지질(0.1-100㎍/㎖)에서 배양된다. 처리 이후의 DC에 대한 일정 농도의 표면 표지(surface markers)의 기하 평균 형광 세기(MFI)가 도시된다. 3개의 다른 도너(doner)(패널 B)를 사용하는 3개 실험들 중에서 하나의 대표적인 실험으로부터 얻어진다. 100㎍/㎖ 무극성 또는 극성 지질로 처리 이후에 얻어지는 배양 상청액은 시토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-12에서 ELISA에 의해서 분석되었다. 3부로 수행된 3개의 실험들 중 하나의 대표적인 실험들로부터 얻어진 데이터는 3개의 다른 도너들을 사용하여 제시되었다(±s.e.m)(패널 C). DC로 배양되 후의 PPD-음성 도너로부터의 T-세포에 의한 증식(패널 D) 및 IFN-γ 방출(패널 E)은 MLR 아쎄이에서 100㎍/㎖ 무극성 또는 극성 지질로 24시간 동안 처리되었다. 3부로 수행된 3개의 실험들 중 하나의 대표적인 실험으로부터 얻어진 데이터가 제시된다(±s.e.m).

도 2. MMG , TAG , PDIM 및 PGL 의 구조들. 개개의 PDIM, TAG, PGA 및 MMG의 2-D TLC 분석 및 MMG, PGL, PDIMs 및 TAGs의 대표적인 구조(패널 B).

도 3 MMG 에 의한 인간 가지세포의 활성화. iDC는 24시간 동안 배지(점선) 또는 MMG, PDIM, PGL 또는 TAG(10㎍/㎖)에서 배양되었다. 지질 제조는 내독소 오염이 없는 것으로 밝혀졌다(<0.0001 ng LPS/㎍ lipid). 치리 후 6개의 도너들 중 한의 대표적인 도너에 대한 DC에서의 표면 표지의 MFI 농도이 도시된다(패널 A). MMG, PDIM A, PGL 또는 TAG(10㎍/㎖)로 처리 후 얻어지는 배양 상청액은 시토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-12에서의 ELISA에 의해서 분석된다(패널 B). 3부로 수행된 다른 도너들을 사용하는 3번 또는 4번의 실험에서 얻어진 평균(±s.e.m) 데이터가 얻어졌다. 터키 테스트를 사용하여 데이터가 분석되었다.

도 4. MMG 의 알파- 및 케토미콜레이트는 면역자극이다. iDC는 배지 및 MMG(10㎍/㎖)의 알파- 또는 케토미콜레이트에서 24시간동안 배양되었다. 처리 후 DC에서의 표면 표지의 MFI가 도시된다.

도 5. M. bovis BCG Copenhagen 으로부터 분리된 MMG 에 의한 IFN -γ 방출.

C57BL/6 쥐들은 DDA 리포솜에 결합되는 BCG Copenhagen으로부터 분리된 ㅈ지지질에 기초하는 면역보강제와 조합하는 Ag85B-ESAT-6로 면역화되었다. 백신 접종 후 몇일에(days post vaccination) 배수 림프절(drain lymph nodes)로부터 분리된 PBMC에 의해서 IFN-γ 방출이 측정되었다.

도 6. MMG 면역보강제로 독성 TB 감염에 대한 방어. C57BL/6 쥐들은 DDA 및 10 또는 50㎍의 MMG 기초의 면역 보강제와 조합하는 Ag85B-ESAT로 3번 면역화되었다. 최종 백신 접종 후 6주, 쥐들은 M. tuberculosis로 에어로졸 시험 감염되었다. 6주 후, 폐 및 비장에서 세균의 수가 측정되었다. 표준 BCG 백신 접종된 쥐들은 양성 대조군으로 분류되고, 항원 없이 DDA/MMG(10㎍)으로 면역되는 쥐들은 음성 대조군으로 분류된다. 실험 백신들의 방어 효과는 면역화되지 않는 쥐와 비교하여, 폐에서의 세균 부하의 Log10 감소로 표현된다. 결과는 각각의 그룹 ±SEM에서의 6마리 쥐들에 대한 평균값이다. 면역화되지 않는 대조군과 현저히 다른 값은 *P<0.05로 표시하였다.

도 7. IFN -γ 방출은 MMG 및 DDA 의 결합에 의해서 강화된다. 두 실험에서, C57BL/6 쥐들은 DDA 또는 DDA/MMG에서(패널 A) 또는 MMG 또는 DDA/MMG에서(패널 B) Ag85B-ESAT-6로 면역화되었다. 최종 백신 접종 이후 3주에서 혈액(패널 A) 또는 ㅂ비장(패널 B)으로부터 분리된 PBMC에 의해서 IFN-γ 방출(release)은 측정되었다.

도 8. IFN -γ 방출은 MMG / DDA 조합물에 TDB 의 추가에 의해서 향상된다. C57BL/6 쥐들은 DDA 리포솜 또는 TDB를 포함하는 DDA 리포솜과 결합되는 MMG와 투여되는 Ag85B-ESAT-6로 면역되었다. 백신 접종후 5달에 혈액으로부터 분리되는 PBMC에 의해서 IFN-γ 방출이 측정되었다.

도 9. 합성 MMG 유사체의 구조의 예.

도 10. 면역 응답은 자연 및 합성 MMG 유사체에서 비교된다. C57BL/6 쥐들은 DDA, DDA/MMG(10㎍), DDA/MMG C36(10㎍) 또는 DDA/MMG C16(10㎍)에서의 Ag85B-ESAT-6으로 면역화되었다. 최종 면역화 이후 3주에 혈액으로부터 분리된 PBMC에 의해서 IFN-γ 방출이 측정되었다.

도 11. 더 짧은 사슬 길이에 따른 더 높은 면역 응답. C57BL/6 쥐들은 DDA 또는 8 내지 36의 사슬 길이 범위의 다양한 MMG 유사체를 가지는 DDA에서의 Ag85B-ESAT-6(1㎍/dose)으로 면역화되었다. 최종 면역화 이후 3주에서 혈액으로부터 분리되는 OBMC에 의해서 IFN-γ 방출이 측정되었다.

예들

물질 및 방법

M. Bovis BCG 로부터 무극성 및 극성 지질의 추출

Mycobacterium bovis BCG(Copenhagen)은 변형된 Sauton 배지에서 배양되었다. 미코박테리아는 2-3주 후 수집되고, PBS에서 현탁되고, 60℃에서 1 1/2시간 동안 배양하는 것에 의해서, 사멸시켰다. 무극성 및 극성 지질은 표준 프로토콜에 따라서 추출되었다(Dobson et al, 1985), (Rosenkrands et al, 2005).

무극성 지질의 추출을 위하여, 메탄올:0.3% NaCl(440㎖) 및 440㎖의 석유 에테르가 20g의(젖은 무게) 미코박테리아에 추가되었고, 혼합물은 2시간 동안 교반되었다. 원심 분리 이후에, 상층은 제거되고, 하층은 440㎖의 석유 에테르로 재-추출되었다. 양 추출물로부터의 상청액 상(supernatant phases)은 모여지고(pooled) 증발되어 무극성 지질을 제공한다.

극성 지질의 추출을 위하여, 생물량(biomass)을 포함하는 메탄올릭 살린(methanolic saline) 용액은 100℃에서 10분 동안 비등 수조(boiling water bath)에서 가열되었고, 37℃에서 10분 동안 냉각되었다. 클로로포름:메탄올:0-3% NaCl(9:10:3) 520㎖가 첨가되고, 혼합물은 밤새 교반되었다. 전체 혼합물은 소결 유리 깔대기(sintered glass funnel)을 통과하였고; 필터 케이트(filter cake)가 수집되고, 클로로포름:메탄올:0-3% NaCl(5:10:4) 170㎖로 두번 재추출되었다. 모든 3개의 수용성 메탄올릭 클로롤포흠 상은 모여지고, 클로로포름:0.3% 수용성 NaCl(1:1) 580㎖가 10분동안 교반되면서 추가되었다. 상 분리 이후에, 상부 수용성 층은 제거되고, 버려졌다. 하부 유기층은 건조되도록 증발되어 극성 지지을 제공한다.

개개의 무극성 지질의 정제

PDIMs 및 TAGs는 TLCs 런을 사용하여 석유 에테르/아세톤(98:2)에서 분리되었고; 프티오세롤 A에기초하는 오직 PDIM의 주된 성분이 회수되었다. PGL 및 MMG는 톨루엔/아세톤(95:5)에서 TLCs 런에 의해서함께 분리된다. PGL 및 MMG는 클로로포름:메탄올:0.880암모니아(97:3:0.5)에서 1D-TLC에서 분리되었다. PDIMs, TAGs, PGL 및 MMG는 500 MHz ¹H 및 ¹³C 핵자기공명(nuclear magnetic resonance;NMR)(Bruker drx500) 및 MALDI-TOF 질량 스펙트로스코피(mass spectroscopy;MS)(Bruker Biflex IV)에 제공되었다. 재수화되는(rehydrated) 지질 추출물(1㎎/㎖)의 샘플들(10㎕)는 SDS-PAGE{Laemmli et al} 및 도은 염색법(silver staining)에 의해서 남아있는 단백질 양에 대하여 분석되었다. 지질 제조물은 내부독성(endotoxin) 오염이 없는 것으로 밝혀졌다(<0.001ng LPS/㎍ 지질).

모노미콜릴 글리세롤의 가수분해( hydrolysis )

모노미콜릴 글리세롤은 16×100㎜ 튜브들에서 5% 수용성 TBAH(2.5㎖)로 100℃에서 밤새도록 가열되었다. 냉각 후, 혼합물은 물(2㎖)로 희석되었고, 클로로메탄에서의 10%의 아이도메탄(idomethane) 용액(3㎖)가 첨가되고, 튜브들 1 시간동안 로터(roter)에 놓여진다. 상부 수용성층은 버려지고, 하부 층은 동일 부피의 1M HCl 및 물로 세정되고, 증발되고 건조되어 잔유물을 생성하고, 생성물은 TLC(석유 에테르:아세톤 95:5)에 의해서, 알파- 및 케토 미콜레이트 메틸에스테르를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 제조용 TLC는 (위에서와 같이) 알파 메틸 미콜레이트 및 케토 메틸 미콜레이트를 제공한다.

트리메틸실릴 유도(trimethylsilyl derivatisation)는 알파-MMG 및 케토-MMG를 분리하는데 사용되었다. MMG 혼합물 및 600㎖의 TRI-SIL 작용제(Pierce)는 20분 동안 75℃로 가열되었다. 냉각된 용액은 이후 질소 스트림(stream)에서 건조되었고, 제조용 TLC 플레이트에 적하되고, 석유-에테르:톨루엔(50:50)에서 성장되었고, 알파-MMG 및 케토-MMG 띠(band)는 0.01% 로다민(rhodamine)를 사용하여 시각화되고, 장파장 형광에서 검사되었다. 대응하는 띠는 TLC 플레이트로부터 벗겨지고, 알파-MMG 및 케토-MMG는 디에틸-에테르(3×5㎖)를 사용하여 3번 실리카 겔로부터 추출되었다. 모여진 추출물은 건조되고, 트리메틸실릴 그룹은 헵탄:메탄올(1:1) 및 약간의 파라-톨루엔 설포닉산(para-toluene sulfonic acid) 결정의 첨가에 의해서 제거되고, 1시간 동안 혼합되었다. 헵탄층은 회수되고, 건조되도록 증발되어, 정제된 알파-MMG 및 케토-MMG를 제공하였다.

C36 의 생성물을 보이는 MMG 의 합성

3-히드록시-2-테트라데실-옥타데카노익산(3-Hydroxy-2-tetradecyl-octadecanoic acid) (Datta et al, 1991에 따라서 합성되는 합성 C32 코리노미콜릭산(corynomycolic acid))(lOOmg, 0.20mmol, leq) 및 4-피롤리디노피리딘(4- pyrrolidinopyridine)(lOOmg, 3eq)는 50㎖ 둥근 바닥 플라스크(round bottom flask)에 배치되고, 디클로로메탄(500㎕)에 50㎕의 2,2-디메틸-4-히드록시메틸-1,3-디옥솔란(2,2-dimethyl-4-hydroxymethyl-1,3-dioxolan)(sn-이소프로필리딘 글리세롤(sn-isopropylidene glycerol)) 용액이 4Å 분자채(molecualr sieves)를 따라서 추가된다. 혼합물은 상온에서 높은 진공도로 완전 건조되었고, N',N-디시클로헥실카보디이미다졸(N', N-dicyclohexylcarbodiimidazole;DCC)(15㎖, 0.1 M DCC in DCM, 5eq)이 추가되고, 반응은 밤새도록 상온에서 교반되면서 진행되었다. 분자채는 여과에 의해서 제거되고, 반응 혼합물은 진공에서 건조되고, 잔유물은 플래시 컬럼 크로마토그래피(Fluka 60741 Silica Gel 60)를 사용하여 정제되었고, 5%의 증가량으로 헥산:에틸 아세테이트(8:2)에서의 핵산으로 용리 분해하여, 순수한 이소프로필리딘 방어 화합물(3-hydroxy-2- tetradecyl-octadecanoic acid-2,2-dimethyl-[l,3]-dioxolan-4-ylmethyl ester)을 56%의 수율(68㎎)로 획득했다. C₃₈H₇₄O₅Na [M+Na⁺] 633.5536에 대한 ¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) δ_H 0.90 (t, 6H, CH₃), 1.20 (s, 54H, CH₂), 1.40 (s, 3H, CH₃), 1.45 (s, 3H, CH₃), 2.50 (m, 1H, CH), 4.05-4.40 (m, 5H, CH₂, CH); ¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz) δ_C 15.0(CH₃), 22.1, 28.8, 28.9, 29.0, 31.4 (CH₂), 29.1 (CH₃), 52.1 (CH(CH₂)₁₃CH₃), 63.2 (CH₂OCO), 69.3 (CH₂O), 73.4 (CH(CH₂)₁₄CH₃), 174.3 (C=O); m/z (EI) 633.55 [M+Na⁺] (100%); HRMS calcd는 633.5527를 발견하였다.

3-히드록시-2-테트라데실-옥타데카노익산-2,2-디메틸-[1,3]-디옥솔란-4-일메틸 에스테르(68㎎, leq)(3-Hydroxy-2-tetradecyl-octadecanoicacid-2,2-dimethyl-[l,3]-dioxolan-4-ylmethyl ester)는 6㎖의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid):테트라히드로푸란(tetrahydrofuran):물(부피비로 8:17:3) 수용액에 용해되었고, 상온에서 밤새도록 교반되었다. 용액은 포화된 수용성 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate)로 중화되었고, 혼합물은 클로로포름으로 두 번 추출되었다. 유기 추출물은 물 및 염수로 세정되고, 건조되고, 진공에서 감압되어 흰색 고체의 조생성물(crude product)을 생산하였는데, 이는 10g 실리카 겔 Varian Bond Elut 12256026 카트리지의 플래시 컬럼 크로마토 그래피에 의해서, 정제되었고, 5% 증가의 헥산:에틸 아세테이트(7:3)에서의 헥산으로 용리되고, 49% 수율(32mg)으로 백색 고체로 제목의 화합물(title compound)을 제공한다. 융점 72-74℃. C₃₅H₇₀O₅Na [M+Na⁺] 593.5121에 대한 ¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) δ_H 0.90 (t, 6H, CH₃), 1.25 (s, 54H, CH₂), 2.50 (m, 1H, CH), 3.45-3.85 (m, 3H, CH, CH₂), 4.25 (m, 2H, CH₂); ¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz) δ_C 15.0 (CH₃), 26.3, 30.9, 31.3, 33.5 (CH₂), 47.5 (CH(CH₂) ₁₃CH₃), 68.4 (CH₂), 69.5 (CH(CH₂)₁₄CH₃), 72.5 (CH_2O), 76.4 (CH), 175.4 (C-1); m/z (EI) 593.50 [M+Na⁺] (100%); HRMS calcd는 593.5143을 찾아내었다.

가지세포 아쎄이

인간 PBMC-유도 DCs는 Romani et al., 1994로부터 변형된 방법을 통하여 획득되었다. 말초 혈액은 백혈구 연층(buffy coat)으로부터 획득되었다. 간단하게, 단핵세포(monocyte)는 Ficoll-Hypaque 원심분리(Lymphoprep 1077 density medium, Nycomed, Oslo, Norway)에 의해서 분리되었고, 이어서, 항-CD14-라벨 마그네틱 ㅂ비드(MACS; Miltenyi Biotech, Bergesh Gladbach, Germany)를 사용하는 14-양성 세포의 분리가 이루어진다. 단핵세포는 10% FCS, 50 μM 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 100 U/㎕ 페니실린(penicillin), 100 μg/ml 스트렙토미신( streptomycin), 2 mM L-글루타민(L-glutamine)(all Gibco)(CM)으로 보충되는 완전 RPMI 1640에서 100 ng/ml 인간 재조합 GM-CSF (Prepotech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 50 ng/ml 인간 재조합 IL-4 (Becton Dickinson (BD))의 존재하에서, 7일 동안 37℃에서, 5% CO₂에서 배양되었다.

7일에 iDC(1×10⁵ 세포/㎖)는 추가적인 24시간 동안 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide;LPS)(Escherichia coli O127:B8)(Sigma-Aldrich, Brondby Denmark) 또는 M. bovis BCG-유도된 지질로 배양되었다. 지질 추출물은 건조된 M. bovis 지질 물질의 클로로포름:메탄올(2:1)로의 재용해 및 이어지는 용매의 증발 및 CM으로 프로브 초음파처리(probe sonication)에 의해서 제조되었다. 지질은 미성숙 DCdp 0.1 내지100㎍/㎖로 추가되었다.

유량 세포 분석( flow cytometric analysis )

DCs는 관련 mAb(BD Pharmingen)로 처음 배양(30분, 4℃) 이어서, 1/20 희석된 F1TC-혼성결합된 산양 항-마우스 Ig(FITC-conjugated goat anti-mouse Ig)(Jackson ImmunoRearch Laboratories, West Grove, PA)로 배양(30분, 4℃)에 의해서, 표면 표지로 염색된다. 비-특이 Ab 결합은 관련된 1차 인간 mAb의 추가 전에 10% 소태아 혈청(foetal calf serum) 용액(15분 4℃)으로 차단되었다. 염색된 세포는 FACScan flow cytometer(BD)를사용하여, 유량 세포 분석법에 의해서 즉시 조사되었고, CellQuest 소프트웨에로 분석되었다.

시토카인 측정

DC 배양 상청액은 -20℃에서 수집되고 저장되었다. 분비 IL-12p70, IL-6 및 TNF-α는 ELISA(BD)에 의해서 제조자 지시사항에 따라서 측정되었다.

혼합된 백혈구 반응( mixed leucocyte reaction ; MLR ) 아쎄이

혼합된 백혈구 반응 아쎄이를 위한 iDC는 위와 비슷하게, 단핵세포로부터 생성되었다. 결과로 생성된 세포는 24시간 동안 동일한 배지(iDC) 또는 지질(10 또는 100㎍/㎖)을 포함하는 배지에서 배양되었다. 0.125×105 내지 2×10⁵의 DCs의 역가측정(titrations)는 평평한 바닥의 96-웰 미세역가 플레이트에서 PPD-음성 도너로부터 알레르기 항원 T세포(allogenic T 세포)(10⁵ 세포/웰)로 37℃/5% CO₂에서 배양되었다. T 세포는 Pan-T 세포 분리 키트(Miltenyi)를 사용하여 제조자 지시에 따라서 분리되었다. DC 알레르기 항원 T-세포 동시배지(cocultures)는 6일 동안 배양되었다. 분비 IFN-γ가 제조자 지시사항에 따라서 ELISA(BD)에 측정될 때까지 상청액은 -20℃에서 수집되고 저장되었다. 두 아쎄이들은 이후, 최종 18시간의 배양 동안에, 1μCi/웰의 [³H] 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지로 펄스(pulsed)되었다. 세포들은 수집되었고, T-세포 증식은 액체 섬광 계수(liquid scintillation counting)(Microbeta Systems)에 의해서 측정되었다. 모든 아쎄이들은 적어도 3개의 다른 도너들을 사용하여 3부로 수행되었다.

항원

Ag85B 및 ESAT-6의 융합 단백질(이하에서는 Ag85B-ESAT-6로 지칭한다)는 이전에 기술한 바와 같이 재조합 단백질로 생성하였다(Olsen et al, 2001).

동물들

8 내지 12 주의 암컷 BALB/c 또는 C57BL6 쥐들은 Bomholtgaard(Ry, Denmark) 또는 Harlan Scandinavia(Denmark)로부터 획득된다. 감염된 쥐들은 BL-3 라미나 흐름 안전 밀봉(laminar flow safety enclosure) 내의 우리에 배치된다.

면역화

쥐들은 각각의 접종 사이의 2주 간격으로 3번 간격으로 꼬리의 기저(base of the tails)에 피하로(subcutaneously) 면역화되었다. 다르게 나타나지 않는다면, 백신(0.2㎖/mice)은 2㎍의 융합 단백질 Ag85B-ESAT-6, 유화된 250㎍의 DDA, 및 10㎍의 재수화되는 지질 추출물로 구성된다. 어떤 경우에, 11mol% TDB는 DDA 리포솜에 결합되었다(Davidesen et al, PCT/DK2005/000467). M. tuberculosis 감염과 관련된 실험에서의 양성 대조군으로서, 하나의 그룹의 쥐들은 BCG Danish 1331의 일 복용량을 받아들여, 꼬리의 기저에 피하로 주입하였다. 전체 또는 개개의 지질 추출물은 Milli Q water로 건조된 M. bovis 지질 물질을 1 또는 5 mg/ml로 재수화하고, 이어서 프로브 초음파처리에 의해서 제조되었다. 표준 지질 백신은 항원을 살린(saline)에 혼합하고, 이어서 재수화된 지질 추출물 및 DDA의 추가 및 소용돌이 혼합(vortex mixing)에 의해서 제조되었다. 백신은 밤새 방치되어 항원을 흡수하도록 하였다.

림프구 배양

혈액 샘플 또는 샅고랑 림프절은 가장 늦은 접종 이후 7-150일의 쥐로부터 얻어지고, 이전에 기술한 바대로 제조된다(Rosenkranda et al, 2005). 세포 배양은 2-메르캅토에탄올, 글루타민, 페니실린-스트렙토미신, 헤페스(hepes), 및 10% 소태아혈청으로 보충되는 200㎕ 부피의 RMPI에 2×10⁵ 세포를 포함하는 둥근 바닥 마이크로역가 웰에서 3부(triplicate)로 수행되었다. 재-자극을 위한 항원은 5㎍/㎖의 농도로 사용된다. 배지 만 또는 5㎍/㎖의 ConA를 포함하는 웰들은 모든 실험에서 음성 및 양성 대조근올 각각 포함된다. 배양 상청액은 항원의 존재 하에서 72시간의 배양 후에 평행 배양(parallel culture)으로부터 수집되었고, IFN-γ의 양은 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent) 아쎄이에 의해서 결정된다(Brandt et al, 2000).

실험적인 감염

백신 효율 측정을 위하여, 최초 접종 후 2.5월에 독성의 약 25 CFU의 M. tuberculosis Erdman을 폐에 증착시키도록 조절되는 Glas-Col 흡입 노출 시스템에서의 에어로졸 방법에 의해서 시험 감염되었다. BCG의 성장을 선택적으로 방해하기 위해서, ml당 2㎍의 2-티오페네카르복실산 히드라지드(2-thiophenecarboxylic acid hydrazide)로 보충되는 Middlebrook 7H11 한천(agar)에 연속적인 희석액을 플레이팅(plating)하는 것에 의해서, 비장 및 폐에서의 세균 부하는 6주에 결정되었다. 집락들(colonies)은 37℃에서의 배양의 2-3주 후에 계수되었다.

통계적 분석

감염된 쥐들 및 대조군 쥐들 사이의 집락들의 수에서의 차이점은 다양한 분석에 의해서 테스트되었다. 현저한 효과가 나타날 때, 평균들 사이의 차이는 Dunnett's test에 의해서, 평가되었다. 인간 DC 아쎄이에서, 다른 지질들의 응답에 따라서 시토카인의 방출에서의 차이는 다양한 분석에 의해서 테스트되고, 현저한 효과과 관찰될 때, 평균들의 차이는 Tukey test에 의해서 평가되었다.

예 1

M. bovis BCG 로부터의 무극성 지질의 분리 및 면역자극 활성

M. bovis BCG의 전체 지질은 극성 및 무극성 부분으로 나누어진다. 극성 부분에서 식별될 수 있는 지질은 포스패티딜이노시톨 매노시드(phosphatidylinositol mannosides)(1-4), 포스패티딜이노시톨(phosphatidylinositol)(PI), 포스패티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)(PE), 디-포스패티딜글리세롤(di-phosphatidylglycerol)(DPG) 및 L-알파-포스패티딜-DL-글리세롤(L-alpha-phosphatidyl-DL-glycerol)(PG)이었다. 알려지지 않는 인지질도 또한 식별되었다(7 및 8)(도 1A). 무극성 부분에서 식별된 주된 지질은 프티오세롤 디미코세로세이트(phthiocerol dimycocerosates)(PDIMs), 트리아실 글리세롤(triacyl glycerols) (TAGs), 페놀 글리코립피드(phenolic glycolipid) (PGL) 및 모노미콜릴 글리세롤( monomycolyl glycerol)(MMG)이다(Fig. 1). FFA는 유리지방산(free fatty acids)이다.

무극성 및 극성 지질의 비교 면역자극 활성은 인간 말초혈액 단핵세포 유도된 미성숙 DC(iDC)를 사용하여 조사될 수 있다(도 1). 무극성 지질의 처리는 처리되지 않는 대조군들과 비교하여, 활성 표지 CD 86, CD40 및 HLA-DR의 농도이 복용량에 의존하여 증가되는 결과를 도출하였다(도 2B). 100㎍/㎖의 무극성 지질의 투여량은 중요 면역 자극 분자 LPS(0.1 ㎍/㎖)로 관찰되는 것과 비교될 수 있는 DC 활성 및 미코박테리아 코드인자(TDM) 및 MPL과 비교하여 더 우수한 DC 활성의 결과를 도출하였다. 이러한 분자들의 상향조절(up regulation)은 향-염증매개자 종양-괴사인자-α(pro-inflammatory mediators tumour-necrosis factor-α)(TNF-α), 인터루킨(interleukin)(IL)-6 및 IL- 12의 분비(secretion)을 수반하였다(도 2C). 극성 지질로 처리된 iDC의 상청액에서의 이러한 향-염증성 시토카인의 농도은 이러한 아쎄이를 사용하는 검출의 한계 아래이다. 최종적으로, 우리는 DC활성에 대한 다른 판독으로, PPD-음성 도너(도 2D & E)로 부터의 알레르기 항원 T세포를 사용하여, 혼합된 백혈구 반응(MLR)을 사용하였다. 추가적으로, 무극성 지질로 처리된 DCs의 높은 활성 상태를 지지할 때, 우리는 증식 및 IFN-γ 방출의 높은 농도을 발견하였고, 극성 부분에 의해서 MLR이 유도되지 않았다.

예 2

M. bovis BCG 의 무극성 지질 추출물로부터의 개개의 지질의 분리 및 MMG 의 특성

면역자극 무극성 부분으로부터의 지질은 제조용 TLC를 사용하여 분리되고, 프티오세롤디미코세로세이트 A(PDIM A), TAG, PGL 및 MMG의 순수한 샘플을 제공하고; 소량의 프티오세롤 B 및 프티오디올론 A(phthiodiolone A)는 검출되었으나, 적용된 대표적인 방법에 의해서 회수되지는 않았다(도 2A). 지질의 구조 및 동일성은 ¹H 핵자기공명(NMR) 및 질량 스펙트로스코피(MS)에 의해서 확인되었다(도 2B, 데이터는 기재되지 않음). MMG 성분은 1-모노아실 글리세롤의 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 특성을 표시한다(Gunstone et al, 1991). 전체 MMG 부분(표1)의 NMR 데이터와 결합되는 MALD1-TOF MS는 cis 및 trans 형태로 알파-미콜레이트 및 케토-미콜레이트의 존재를 나타낸다. 주 성분들의 대략적인 비율은 각각 1.00:0.29:0.24이었다.

정제된 MMG의 MALD1-TOF 질량 스펙트로스포피. 신호들은 M+Na⁺이온에 대한 m/z이다. 연속의 주된 성분들은 굵은 글씨로, 밑줄 그은 주된 성분으로 도시된다.

MMG			탄소수
c-keto	t-keto	α
		1206	79
		1234	81
		1262	83
1306			84
1335			86
	1349		87
1363			88
	1377		89
1391			90
	1405		91

예 3

MMG에 의한 인간 가지 세포의 활성화

정제된 MMG, PDIM A, PGL 및 TAGs는 이들의 인간 iDC를 활성화시키는 능력에 대하여 평가되었다. 이러한 아쎄이에서, MMG는 동일하게 CD86, CD40 및 HLA-DR의 뚜렷한 상향 조절을 이끄는 DC 활성화의 가장 중요한 유도제(inducer)로 밝혀졌다(도 3A). 심지어 MMG는 미코박테리아의 병원성과 오래 관련되어오고, 두번째로 가장 높은 활성의 지질로 알려지는 지질인 PDIM A보다 더 DCs를 활성화시켰고, PGL 및 TAGs는 더 낮은 활성화를 유도하였다. 6개의 각각의 도너들에서, 활성화의 순서는 MMG > PDIM A > PGL > TAGs로 관찰되었고, 처리되지 않은 iDC와 관련된 농도 이상의 CD86 농도에서의 평균 배수 증가는 각각 1.91±0.29, 1.82±0.43, 1.52±0.26 및 1.32±0.14이다. 시토카인 유도는 가장 중요한 면역자극 지질로 두드러지는 MMG와 같은 전체적인 추세(도 3B)로 따라온다. IL-6은 PGL 또는 TAG에 의해서 유도되는 것보다 현저히 큰 농도(P<0.05)에서 MMG에 노출되는 DC에 의해서 방출된다. 다른 지질들에 의한 시토카인 유도들 사이에는 현저한 차이가 기록되지 않았자. 따라서, MMG는 M. bovis BCG의 무극성 지질 부분에서 가장 중요한 면역자극 지질로 분류될 수 있다.

예 4

알파- 및 케토 - MMG 의 면역자극 활성

이 예에서, 우리는 MMG의 자극 특성을 더 분할하고, 이의 중요한 면역 자극 용량에 대한 활성 성분을 규명하고자 한다. 알파-MMG 및 케토-MMG는 MMG의 트리메틸실릴 에테르(trimethylsilyl ethers)의 제조, 제조용 TLC 및 알파-MMG 및 케토-MMG를 제공하는 후속되는 트리메틸실릴 에테르 보호기의 가수분해에 따라서 분리된다. 알파 및 케토-미콜레이트는 도 2B에 기재되었다. 인간 iDC를 활성화 시키는 능력에 대하여 추정할 때, 알파- 및 케토-MMG는 활성화 표지의 농도에서 2-3배 증가를 위하여 자극한다(도 4). 따라서, MMG의 두 서브-성분은 또한 인간 DC를 자극하는 현저한 능력을 보여준다.

예 5

M. bovis BCG 로부터 분리된 MMG 에 의한 Th1 면역 응답의 유도

MMG의 면역 보강 활성을 연구하기 위하여, 분리된 지질은 쥐에서 IFN-γ 생성을 유도하는 능력에 대하여 테스트되었다. C57BL/6 쥐들은 10㎍의 전체 또는 개객의 지질들로 투여되었다. 생체 내에서, DDA는 지질을 전달하는 담체로서 기능한다. 따라서, 2㎍의 융합 단백질 Ag85B-ESAT-6 및 10㎍의 재수화 지질 추출물, 유화된 250㎍의 DDA가 피하 경로로 투여되었다. DDA 리포솜과 결합되는 10㎍의 MMG의 투여량은 배수 림프절로부터 분리된 PBMC의 재자극에서 10ng/ml의 IFN-γ 농도; 동일한 투여량의 DDA에서의 전체 지질로 기록되는 것과 비교가능한 농도를 결과로 도출하였다(도 5). PDIM-A 또한, IFN-γ 생성을 비록 낮은 농도로 유도하지만, TAG 또는 PGL과 결합된 DDA 리포솜은 매우 작은 IFN-γ 방출을 촉진한다(도 5 및 미도시). 전체 지질 추출물 또는 개개의 지질에서의 재자극에 대한 회상 응답(recall response)이 관찰되지 않기 때문에, 이러한 개개의 지질은 면역 보강제로 기능하는 것으로 나타난다(데이터 미도시). MMG는 따라서 생체 내에서 가장 활성적인 무극성 지질이라는 것이 규명되었고, 홀로 BCG-유도된 전체 지질의 주된 면역 보강 활성을 차지할 수 있다.

예 6

MMG-기판의 면역 보강제의 방어 효과

TB 감염에 대한 방어를 제공하는 MMG-기반의 면역 보강제의 능력을 측정하기 위해서, C57BL/6 쥐들은 MMG(두 개의 다른 투여량) 및 DDA로 전달되는 Ag85B-ESAT-6로 면역화되었다. BCG 백신 접종 및 면역 보강제 홀로 받는 쥐들의 그룹들은 각각 양성 및 음성 대조군들로 분류된다. 최종 백신 접종 후 6주에, 쥐들은 생 결핵균(M. tuberculosis)으로 에어로졸 경로(aerosol route)로 시험 접종된다. 세균 로드(bacterial load)를 죽이는 백신의 능력은 6주 후에, 폐 및 비장에서 측정되었다. 이러한 데이터는 면역 보강제로서 MMG/DDA의 방어의 현저한 수준 및 BCG의 방어와 비교할 만한 방어 수준을 보여준다(도 6). 항원 없이 면역 보강제로 백신 접종된 쥐들은 세균의 성장을 방지하는데 실패했기 때문에, 예상한 바와 같이, 이러한 효과는 특이 효과이다.

예 7

MMG 및 DDA 의 결합에 의한 더 향상된 효과

면역 조절 물질 및 전달 체계의 결합의 효과를 측정하기 위해서, C57BL/6 쥐들은 DDA 홀로 또는 FFA/MMG의 조합으로(예 1, 도 7A) 또는 예 2에서(도 7B) MMG 홀로 또는 DDA/MMG의 조합으로 백신 접종되었다. 이러한 실험들로부터 면역 응답은 DDA 및 MMG의 결합에 의해서, 현저하게 향상된다는 것이 명확하게 되었다.

예 8

MMG 및 DDA 리포솜으로 TBD /제 3 성분의 결합에 의한 면역 응답의 향상

다른 면역 조절 성분과 결합될 때, MMG의 면역 보강 활성에 대한 효과를 연구하기 위해서, Ag85B-ESAT-6 및 DDA 리포솜과 결합되는, 또는 면역 조절 물질 TDB와 결합되는 DDA 리포솜과 결합되는 10㎍ MMG로 피하로 면역화되는 C57BL/6 쥐들에 대한 면역 응답이 초기 백신 접종 후 5월에 측정되었다. DDA 리포솜과 결합되는 MMG의 조합은 혈액으로부터 분리되는 PBMC의 재자극에 대한 ~25ng/ml의 IFN-γ 농도를 결과로 도출하였고, TDB 결합된 DDA 리포솜이 적용될 때, IFN-γ의 방출이 현저히 증가되었다(도 8). 따라서, 상승 효과가 MMG, DDA 및 TDB 사이에서 관찰되었고, MMG 및 DDA의 조합에 제 3 성분의 추가는 면역 보강 활성을 더 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

예 9

MMG 유사체의 면역 보강 활성은 자연 MMG 와 비교할 만하다.

합성 MMG 유사체의 면역우너성 효과를 측정하기 위해서, C57BL/6 쥐들은 자연 MMG, 16개의 탄소를 가지는 합성 MMG 유사체(도 9에 도시) 및 36개의 탄소를 가지는 합성 MMG 유사체의 MMG로 조합된 Ag85B-ESAT-6로 면역화되었다(모두 10㎍/DDA/MMG). 면역 응답은 최종 백신 접종 후 1 주에 혈액에서 측정되었고, 3개의 MMG-기반의 면역 보강제로 응답의 비교할만한 수준을 보여주었고, DDA에 대해서는 그 자체로 더 낮은 효과를 다시 보여주었다.

예 10

더 짧은 사슬 길이에 따른 더 높은 면역 응답

더 짧은 사슬 길이를 가지는 합성 MMG 유사체의 면역원성 효과를 측정하기 위해서, C57BL/6 쥐들이 홀로의 DDA, 자연 MMG를 가지는 DDA, 또는 C8에서 C36의 범위의 다른 합성 유사체를 가지는 DDA에서 Ag85B-ESAT-6으로 면역화되었다(모두 1㎍/투여량). 면역 반응은 최종 백신 접종 이후 3주에 측정되었고, 합성 MMG 유사체는 심지어 1㎍에서의 투여 농도에서도 활성화된다는 것을 보여주었다. 더욱이, 이러한 결과는 또한, 더 짧은(16C 이하) 합성 MMG 유사체는 자연 MMG와 비교하여 더 효과적이라는 것을 보여주었다.***P < 0.001.(도 11)

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Claims

면역 보강제를 제조하기 위한, 8-36개의 탄소들로 이루어지고, 0-3개의 이중 결합들을 각각 함유하는 지질 말단을 갖는 알킬-사슬 기반의 합성 모노미콜릴글리세롤(MMG).
제 1 항에 있어서, 상기 알킬-사슬은 8-16개의 탄소들을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 모노미콜릴글리세롤(MMG).
8-36개의 탄소들로 이루어지고, 0-3개의 이중 결합들을 각각 함유하는 지질 말단을 갖는 알킬-사슬 기반의 합성 모노미콜릴글리세롤(MMG)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 보강제.
제 3 항에 있어서, 계면 활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 보강제.
제 4 항에 있어서, 상기 계면 활성제는 DDA-B, DDA-C, DDA-X, DODA-B, DODA-C, DODA-X, DOTAP, DODAP, 또는 DOTMA인 것을 특징으로 하는 면역 보강제.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 추가적인 면역 조절 물질을 포함하며, 상기 면역 조절 물질은 비-톨 유사 수용체(non-Toll-like-Receptor, TLR) 리간드 또는 TLR 리간드인 것을 특징으로 하는 면역 보강제.
8-36개의 탄소들로 이루어지고, 0-3개의 이중-결합을 각각 함유하는 지질 말단을 갖는 알킬-사슬들 기반의 합성 모노미콜릴글리세롤(MMG).
삭제
비경구(patenterally), 구강(oral), 점막(mucosal), 혀밑(sublingual), 경피(transdermal), 국소(topical), 흡입(inhalation), 비강내(intranasal), 에어로졸(aerosol), 안내(intraocular), 기관내(intratracheal), 직장내(intrarectal), 질내(vaginal), 유전자 건에 의한(by gene gun), 피부 패치(dermal patch) 또는 점안약(eye drop)이나 입안 세정(mouth-wash) 형태 중 어느 경로에 의해 투여하기에 적합한 제 3 항에 따른 면역 보강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 9 항에 있어서, 상기 항원 성분은 세포 내 병원체로부터의 항원 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 10 항에 있어서, 상기 항원 성분은 독성 미코박테리아로부터의 항원 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 11 항에 있어서, 상기 항원 성분은 융합 생성물 Ag85b_TB10.4, Ag85b_ESAT-6_Rv2660, Ag85b_TB10.4_Rv2660 및 Ag85a_TB10.4_Rv2660 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제 10 항에 있어서, 상기 항원 성분은 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 클라미디아 드라코마티스(Chlamydia trachomatis), HIV, 인플루엔자 또는 헤파티티스 B 또는 C로부터의 항원 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
암, 자가면역 장애(autoimmune disorder), 신경 장애(nerve disorder), 기도 염증(airway inflammation), 염증성 장애(inflammatory disorders), 감염병(infectious disease), 피부 장애(skin disorders), 알레르기(allergy), 천식(asthma) 또는 병원체에 의해서 발생되는 병을 치료하기 위하여 제3항에 따른 면역 보강제를 포함하는 백신.
암, 자가면역 장애(autoimmune disorder), 신경 장애(nerve disorder), 기도 염증(airway inflammation), 염증성 장애(inflammatory disorders), 감염병(infectious disease), 피부 장애(skin disorders), 알레르기(allergy), 천식(asthma) 또는 병원체에 의해서 발생되는 병을 치료하기 위한 제 7 항에 따른 합성 모노미콜릴글리세롤(MMG)를 포함하는 약학 조성물.
제 15 항에 있어서, 상기 합성 모노미콜릴글리세롤(MMG)는 하나 이상의 백신, 항원, 항체, 세포 독성제, 알레르기 항원, 항생제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, TLR 및 비-TLR 대항제(antagonist), 펩티드, 단백질, 유전자 치료 벡터(gene therapy vectors), DNA 백신, 면역 조절 물질 또는 동시-자극 분자들(co-stimulatory molecules)과 병행하여 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
암, 자가면역 장애(autoimmune disorder), 신경 장애(nerve disorder), 기도 염증(airway inflammation), 염증성 장애(inflammatory disorders), 감염병(infectious disease), 피부 장애(skin disorders), 알레르기(allergy), 천식(asthma) 또는 병원체에 의해서 발생되는 병을 치료하기 위하여 제3항에 따른 면역 보강제를 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 도 9에 도시된 8 내지 36개의 탄소들로 이루어진 알킬-사슬 기반의 합성 모노미콜릴글리세롤(MMG).
제 6 항에 있어서, 상기 비-TLR 리간드는 TDB 또는 MDP인 것을 특징으로 하는 면역 보강제.
제 6 항에 있어서, 상기 TLR 리간드는 Poly I:C인 것을 특징으로 하는 면역 보강제.
제 11 항에 있어서, 상기 독성 미코박테리아로는 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosiss), 미코박테리움 보비스(M. bovis) 또는 미코박테리움 아프리카눔(M. africanum)인 것을 특징으로 하는 백신.
제 21 항에 있어서, 상기 항원 성분은 융합 생성물 Ag85b_TB10.4, Ag85b_ESAT-6_Rv2660, Ag85b_TB10.4_Rv2660 및 Ag85a_TB10.4_Rv2660 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제 13 항에 있어서, 상기 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)로부터의 항원 에피토프는 Msp1, Msp2, Msp3, Amal, GLURP, LSA1, LSA3 또는 CSP인 것을 특징으로 하는 백신.
제 13 항에 있어서, 상기 클라미디아 드라코마티스(Chlamydia trachomatis)로부터의 항원 에피토프는 CT184, CT521, CT443, CT520, CT521, CT375, CT583, CT603, CT610 또는 CT681인 것을 특징으로 하는 백신.
제 14 항에 있어서, 상기 신경 장애는 알츠하이머인 것을 특징으로 하는 백신.