CN118078983A - 一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫学领域，公开了一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺，包括体积百分比4%‑6%的角鲨烯和0.5%‑1%的吐温80，还包括质量百分比0.05%‑0.2%的可电离脂质或中性磷脂。配制工艺包括如下步骤：步骤S1：制备有机相溶液：按照体积百分比或质量百分比量取各成分溶解于无水乙醇溶液中；步骤S2：制备水相溶液；步骤S3：制备佐剂初乳液：将步骤S1制备的有机相溶液与步骤S2制备的水相溶液混合后获得佐剂初乳液；步骤S4：制备纳米脂质佐剂：佐剂初乳液均质；步骤S5：超滤去除无水乙醇；步骤S6：过滤除菌。本发明提供的佐剂所用原辅料安全可靠，制备工艺稳定可控且易于进行大规模生产，制备出的疫苗佐剂具有良好的保存稳定性和免疫增强性能。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺。
背景技术
本节中的陈述仅提供与本申请公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。
佐剂作为与抗原联合给药时的免疫增强剂是疫苗开发中不可忽视的重要内容。目前，已经批准用于人类疫苗的佐剂类型主要包括铝盐佐剂、乳化佐剂、Toll样受体（toll-like receptor，TLR）激动剂和复合佐剂。不同类型的佐剂其作用机制不尽相同，其中，铝盐佐剂在增强抗原呈递细胞的抗原摄取和呈递以增强免疫反应的同时还可以吸附抗原成分，提高抗原成分的稳定性；乳化佐剂则通过延长抗原与免疫系统的相互作用时间并募集先天免疫细胞到注射部位进一步增强免疫反应；TLR激动剂则是通过激活TLR相关的信号通路以刺激细胞因子分泌以及特异性免疫细胞的激活；复合佐剂的代表如AS01B佐剂体系包含３-O-去酰基-4-4-单磷酰基脂质A（monophosphoryl-lipid A, MPLA）和皂苷QS-21两种免疫刺激剂，以及二油酰磷脂酰胆碱和胆固醇；AS01B中的MPLA主要是TLR4激动剂，QS-21则可通过激活抗原递呈细胞以及激发Th1细胞免疫反应等机制来达到免疫细胞激活和免疫反应增强的效果。
虽然佐剂在疫苗制剂中具有重要作用，甚至直接关乎疫苗的成败，但是佐剂本身就是一种极为复杂的制剂体系，其配料、研发和生产控制均关乎了疫苗的安全性。在佐剂的研发过程中，必须关注并保证佐剂使用带来的增强免疫应答的潜在利益必须超过其所带来的风险。基于此，在疫苗的研发和配制过程中，本发明始终以原辅料安全可靠、配制工艺简单可控、佐剂制剂稳定性强、佐剂制剂均一性强以及佐剂免疫增强效果显著为主要目标。本发明利用已在临床使用并证明安全可靠且完全国产化的原辅料，设计了多种配制方案，并结合多种配制工艺进行了系统的摸索和研究。同时，本发明利用水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）表面糖蛋白gE抗原配伍不同的佐剂制剂作为免疫增强效果的研究手段，对不同佐剂制剂的免疫增强效果进行了评价。最终，本发明提供了一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺，其原辅料安全可靠，制备工艺简单可控，免疫增强效果显著，适用于规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于：提供了一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺，其原辅料安全可靠，制备工艺简单可控，免疫增强效果显著，适用于规模化生产。
本发明的技术方案如下：
一种适合规模生产的疫苗佐剂，包括体积百分比4%-6%的角鲨烯和0.5%-1%的吐温80，还包括质量百分比0.05%-0.2%的可电离脂质和中性磷脂中的一个或多个，纳米脂质颗粒粒径范围为70-160nm。
根据一种优选的实施方式，所述可电离脂质包括2-(2-羟基乙氧基)乙基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(DHA-1)和(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-辛基十二烷酸酯)(DHA-5)中的一种。优选地为DHA-1。
根据一种优选的实施方式，所述中性磷脂包括二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）或二硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）。优选为DSPC。
如前所述的一种适合规模生产的疫苗佐剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：制备有机相溶液：按照体积百分比量取4%-6%的角鲨烯和体积百分比0.5%-1%的吐温80，质量百分比0.05%-0.2%的可电离脂质和中性磷脂中的一个或多个溶解于无水乙醇溶液中，由于角鲨烯微溶于无水乙醇，因而无水乙醇的加入量（体积）需为角鲨烯加入体积的9倍及以上，以保证角鲨烯充分溶解于无水乙醇；
步骤S2：制备水相溶液；水相溶液可采用20mM的PB溶液，水相溶液的pH值可介于6.5-7.5之间；
步骤S3：制备初乳液：将有机相溶液与水相溶液以1:3-1:30的任意比例混合后即可获得佐剂初乳液；
步骤S4：制备纳米脂质佐剂：将步骤S3获得的佐剂初乳液进行800-1000bar均质10-15个循环即可获得目标粒径的纳米脂质佐剂；
步骤S5：除去无水乙醇：步骤S4的纳米脂质佐剂经300KD膜包超滤浓缩去除无水乙醇；
步骤S6：过滤除菌：经0.22um滤膜过滤除菌后无菌分装保存备用。
与现有的技术相比本发明的有益效果是：
1、一种适合规模生产的疫苗佐剂，由角鲨烯、吐温80、中性磷脂和可电离脂质制备方案所得纳米脂质颗粒能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫反应，进而辅助提高疫苗的免疫保护效果；
2、一种适合规模生产的疫苗佐剂的配制工艺，采用的制备工艺相较现有常用的超声-高压均质法、分散-高压均质法、微流控法等具有更高的工艺稳定性，制备出的纳米脂质颗粒的粒径具有较高的一致性和可控性，组成相对单一，性质稳定均一，能够保障制备出的纳米脂质颗粒的质量；
3、一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺，所提出的配制方法对于溶液pH的限制较少，能够利用多种溶液在较宽pH值范围内进行配制，制备方案简单，对制备设备的要求较低，可以有效降低生产成本。粒径可控，粒径范围为70-160nm之间，所配制的佐剂浓度大，其角鲨烯含量可达20-50mg/ml，产物具体浓度可通过配制过程调节。
附图说明
图1为实施例1-3所得纳米脂质佐剂的异常毒性的考察数据图；
图2为实施例1-3所得纳米脂质佐剂的免疫增强效果数据图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。在无特殊说明的情况下，本申请中所提及的方法均为本领域的常规方法；在无特殊说明的情况下，本申请所使用的实验材料均为市售。
实施例1
一种适合规模生产的疫苗佐剂，包括体积百分比4%-6%的角鲨烯、体积百分比0.5%-1%吐温80和质量百分比0.05%-0.2%的中性磷脂。所述中性磷脂为DSPC或DOPE。
采用如下制备方法制备：
步骤S1：制备有机相溶液：按照体积百分比量取4%-6%的角鲨烯和体积百分比0.5%-1%的吐温80，质量百分比0.05%-0.2%的中性磷脂溶解于无水乙醇溶液中；
步骤S2：制备水相溶液：配制pH值为6.5-7.5之间的20mM的PB溶液作为水相溶液；
步骤S3：制备初乳液：将有机相溶液与水相溶液以1:3-1:30的任意比例混合后即可获得佐剂初乳液；
步骤S4：制备纳米脂质佐剂：将步骤S3获得的佐剂初乳液进行800-1000bar均质10-15个循环即可获得目标粒径的纳米脂质佐剂；
步骤S5：除去无水乙醇：步骤S4的纳米脂质佐剂经300KD膜包超滤浓缩去除无水乙醇；
步骤S6：过滤除菌：经0.22um滤膜过滤除菌后无菌分装保存备用。详细的实验方案及所得纳米脂质颗粒的粒径结果见表格 1：
表格 1不同配制参数下实施例1配制所得纳米脂质颗粒的结果
从表格1可以看出，制备出的纳米脂质颗粒的粒径范围79.88-157.2nm之间，其中角鲨烯的浓度最高能够达到50.44mg/ml，最低为25.26 mg/ml，含量较高；可依据实际需要通过调节有机相溶液与水相溶液的比例来调整纳米颗粒粒径大小；其中两相比例越大纳米颗粒的粒径越大。此外，还可通过超滤后所得体积来调控角鲨烯含量，如需较大浓度的角鲨烯含量则可根据情况减少超滤后佐剂的体积。
更进一步的，按照实施例1.1的方案配制五批纳米脂质佐剂，制备的结果如表格2所示：
表格 2 五批实施例1.1纳米脂质佐剂理化检测结果
如表格2可见，五批纳米脂质佐剂的理化性质较为稳定，提示了这种制备方案的稳定性和可重复性。
将实施例1.1制备所得的纳米脂质佐剂于37℃放置21天，期间每周测定其理化性质，结果如表格 3所示：
表格 3实施例1.1纳米脂质佐剂37℃加速稳定考察结果
从表格3可以看出，采用实施例1.1的配方以及制备方法制备出的纳米脂质佐剂在37℃放置21天时仍然保持较小的粒径和较高的角鲨烯含量，PDI也保持稳定，没有明显的聚集。提示了实施例1.1的配方以及制备方法配制所得佐剂可以稳定存放。
实施例2
一种适合规模生产的疫苗佐剂，包括体积百分比4%-6%的角鲨烯、体积百分比0.5%-1%吐温80和质量百分比0.05%-0.2%的可电离脂质。
采用如下制备方法制备：
步骤S1：制备有机相溶液：按照体积百分比量取4%-6%的角鲨烯和体积百分比0.5%-1%的吐温80，质量百分比0.05%-0.2%的DHA-1或DHA-5(DHA-1和DHA-5均为厦门赛诺邦格生物技术股份有限公司专利产品)溶解于无水乙醇溶液中；
步骤S2：制备水相溶液：制pH值为6.5-7.5之间的20mM的PB溶液作为水相溶液；
步骤S3：制备初乳液：将有机相溶液与水相溶液以1:3-1:30的任意比例混合后即可获得佐剂初乳液；
步骤S4：制备纳米脂质佐剂：将步骤S3获得的佐剂初乳液进行800-1000bar均质10-15个循环即可获得目标粒径的纳米脂质佐剂；
步骤S5：除去无水乙醇：步骤S4的纳米脂质佐剂经300KD膜包超滤浓缩去除无水乙醇；
步骤S6：过滤除菌：经0.22um滤膜过滤除菌后无菌分装保存备用。详细的实验方案及所得纳米脂质颗粒的粒径结果见表格 4：
表格 4不同配制参数下实施例2配制所得纳米脂质颗粒的结果汇总
从表格4可以看出，制备出的纳米脂质颗粒的粒径范围83.05-157.7nm之间，其中角鲨烯的浓度最高能够达到50.11mg/ml，最低为26.25 mg/ml；可依据实际需要通过调节有机相溶液与水相溶液的比例来调整纳米颗粒粒径大小；其中两相比例越大纳米颗粒的粒径越大。此外，还可通过超滤后所得体积来调控角鲨烯含量，如需较大浓度的角鲨烯含量则可根据情况减少超滤后佐剂的体积。
更进一步的，按照实施例2.1的方案配制五批纳米脂质佐剂，制备的结果如表格5所示：
表格 5 五批实施例2.1纳米脂质佐剂理化检测结果
从表格5可见，五批纳米脂质佐剂的理化性质较为稳定且较为接近，提示了这种制备方案的稳定性和可重复性。
将实施例2.1制备所得的纳米脂质佐剂于37℃放置21天，期间每周测定其理化性质，结果如表格 6所示：
表格 6实施例2.1纳米脂质佐剂37℃加速稳定考察结果
从表格6可以看出，采用实施例2.1的配方以及制备方法制备出的纳米脂质佐剂在37℃放置21天时粒径变化较小，仍然保持较小的粒径，但PDI在放置第7天时开始出现双峰，制备出的佐剂稳定性相对较差，保存条件要求更高。
实施例3
一种适合规模生产的疫苗佐剂，包括体积百分比4%-6%角鲨烯、体积百分比0.5%-1%吐温80和质量百分比0.05%-0.2%的可电离脂质以及中性磷脂。
采用如下制备方法制备：
步骤S1：制备有机相溶液：按照体积百分比量取4%-6%的角鲨烯和体积百分比0.5%-1%的吐温80，质量百分比0.05%-0.2%的DHA-1和DSPC溶解于无水乙醇溶液中；
步骤S2：制备水相溶液：制pH值为6.5-7.5之间的20mM的PB溶液作为水相溶液；
步骤S3：制备初乳液：将有机相溶液与水相溶液以1:3-1:30的任意比例混合后即可获得佐剂初乳液；
步骤S4：制备纳米脂质佐剂：将步骤S3获得的佐剂初乳液进行800-1000bar均质10-15个循环即可获得目标粒径的纳米脂质佐剂；
步骤S5：除去无水乙醇：步骤S4的纳米脂质佐剂经300KD膜包超滤浓缩去除无水乙醇；
步骤S6：过滤除菌：经0.22um滤膜过滤除菌后无菌分装保存备用。详细的实验方案及所得纳米脂质颗粒的粒径结果见表格 7：
表格7不同配制参数下实施例3配制所得纳米脂质颗粒的结果汇总
从表格7可以看出，制备出的纳米脂质颗粒的粒径范围86.06-158.1nm之间，其中角鲨烯的浓度最高能够达到50.01mg/ml，最低为26.66 mg/ml；可依据实际需要通过调节有机相溶液与水相溶液的比例来调整纳米颗粒粒径大小；其中两相比例越大纳米颗粒的粒径越大。此外，还可通过超滤后所得体积来调控角鲨烯含量，如需较大浓度的角鲨烯含量则可根据情况减少超滤后佐剂的体积。
更进一步的，按照实施例3.1的方案配制五批纳米脂质佐剂，制备的结果如表格8所示：
表格 8 五批实施例3.1纳米脂质佐剂理化检测结果
从表格8可见，五批纳米脂质佐剂的理化性质较为稳定且接近，提示了这种制备方案的稳定性和可重复性。
将实施例3.1制备所得的纳米脂质佐剂于37℃放置21天，期间每周测定其理化性质，结果如表格9所示：
表格 9实施例3.1纳米脂质佐剂37℃加速稳定考察结果
从表格9可以看出，采用实施例3.1的配方以及制备方法制备出的纳米脂质佐剂在37℃放置21天时粒径变化较小，粒径未检测到明显改变，PDI也保持稳定，没有出现明显聚集，角鲨烯含量亦未发生明显改变。以上结果提示，实施例3.1的配方以及制备方法配制所得佐剂在37℃可放置21天以上。
对比例1
一种适合规模生产的疫苗佐剂，包括体积百分比4%角鲨烯和体积百分比0.5%吐温80。
采用如下制备方法制备：
步骤S1：制备有机相溶液：按照体积百分比称取4%的角鲨烯和体积百分比0.5%的吐温80溶解于无水乙醇溶液中；
步骤S2：制备水相溶液：制pH值为7.0的20mM的PB溶液作为水相溶液；
步骤S3：制备初乳液：将有机相溶液与水相溶液以1:5的任意比例混合后即可获得佐剂初乳液；
步骤S4：制备纳米脂质佐剂：将步骤S3获得的佐剂初乳液进行800-1000bar均质10-15个循环即可获得目标粒径的纳米脂质佐剂；
步骤S5：除去无水乙醇：步骤S4的纳米脂质佐剂经300KD膜包超滤浓缩去除无水乙醇；
步骤S6：过滤除菌：经0.22um滤膜过滤除菌后无菌分装保存备用。
将对照实施例所得纳米脂质佐剂于37℃放置21天，期间每周测定其理化性质，结果如表格 10所示，本对比例制备所得佐剂在37℃放置21天后虽然脂质颗粒的粒径以及角鲨烯含量未发生明显改变，但是纳米颗粒出现了轻微的聚集，粒径测定时出现了双峰。以上结果提示，对照实施例的配方以及制备方法配制所得佐剂在37℃可放置21天后纳米颗粒出现了轻微聚集现象。
表格 10对照实施例纳米脂质佐剂37℃加速稳定考察结果
综合以上三种实施例以及对照实施例所得纳米脂质颗粒的粒径、理化检测结果和37℃加速稳定性考察结果，我们可以初步得出结论：实施例1.1和实施例3.1所得纳米脂质颗粒较为稳定，其在37℃放置21天后粒径未发生明显变化，仅加入可电离脂质的实施例2.1所得佐剂在放置1周后纳米脂质颗粒出现了轻微的聚集，粒径分布出现了双峰；而同时加入了可电离脂质和中性磷脂的实施例3.1则在37℃放置21天后粒径未发生明显变化。对比例1则是在放置21天后出现了轻微的聚集，粒径分布出现了双峰。以上结果表明，中性磷脂的加入可以提高纳米脂质颗粒的稳定性。
进一步的，我们在小鼠模型中对实施例1.1、实施例2.1和实施例3.1所得纳米佐剂进行了异常毒性的考察。我们分别取实施例1.1、实施例2.1和实施例3.1所得纳米佐剂（角鲨烯含量为8mg）配伍gE 50ug后经腹腔注射小鼠，注射前小鼠体重为18-20g，注射后每日监测小鼠体重并记录直至注射后7天。结果如图1A所示，实施例1.1组佐剂注射小鼠后的前3天未出现明显的体重下降情况，体重在7天内呈现缓慢上升的趋势。如图1B和1C所示，与实施例2.1相比，实施例3.1可能由于中性磷脂的加入，在一定程度上减弱了佐剂的毒性。因而，我们可以初步推测，中性磷脂在佐剂配制中的作用是稳定佐剂结构和包裹佐剂颗粒以降低其异常毒性的作用。
与此同时，我们将上述实施例1.1、实施例2.1、实施例3.1和对照实施例所得佐剂与gE配伍（佐剂中角鲨烯的含量为1mg，蛋白量为50ug）后以肌肉注射0,14天间隔的方式免疫小鼠，并于初次免疫后14天、两次免疫后14天和28天采集小鼠血清进行gE特异性IgG抗体检测，于两次免疫后28天采集小鼠脾脏进行IFN-γ特异性ELISpot检测。结果显示，优选的实施例1.1、实施例2.1和实施例3.1所得纳米脂质佐剂均能够增强gE蛋白诱导体液免疫反应（图2A）和细胞免疫反应（图2B）的效应，且其免疫增强效果均非劣效于对照佐剂组。值得注意的是，实施例2.1和实施例3.1所得纳米脂质佐剂在诱导细胞免疫反应方面具有更显著的增强作用。
综合以上结果，我们可以初步得出结论，如实验例1.1所示，在角鲨烯和吐温80中加入中性磷脂可以提高纳米脂质颗粒的稳定性，且加入中性磷脂可以在很大程度上降低纳米脂质颗粒的毒性。然而，可电离脂质的加入虽然可以显著增强体液免疫和细胞免疫反应，但是单独加入可电离脂质的实施例2.1毒性较大，且纳米颗粒存在轻微聚集的情况，而同时加入可电离脂质和中性磷脂的实施例3.1制备出的疫苗佐剂的稳定性和异常毒性均得到了改善，并且不影响可电离脂质增强体液免疫和细胞免疫反应的效果。
对比例2
超声-高压均质法
步骤一：制备乳相溶液：取4%角鲨烯，0.5%吐温80 以及0.05%DSPC震荡混匀；步骤二：制备水相溶液：配制pH值为7.0的20mM PB溶液作为水相溶液；步骤三：将乳相溶液与水相溶液混合后经探头式超声处理，设置程序为超声10s，停5s，总时长10min进行处理即可获得佐剂初乳液；步骤四：佐剂初乳液经1000bar均质15个循环即可获得目标粒径的纳米脂质佐剂；步骤五：纳米脂质佐剂经0.22um滤膜过滤除菌后无菌分装保存备用。
对比例3
分散-高压均质法
步骤一：制备乳相溶液：取4%角鲨烯，0.5%吐温80 以及0.05%DSPC震荡混匀；步骤二：制备水相溶液：配制pH值为7.0的20mM PB溶液作为水相溶液；步骤三：将乳相溶液与水相溶液混合后经分散机10000rpm分散处理60min即可获得佐剂初乳液；步骤四：佐剂初乳液经1000bar均质15个循环即可获得目标粒径的纳米脂质佐剂；步骤五：纳米脂质佐剂经0.22um滤膜过滤除菌后无菌分装保存备用。
对比例4
微流控法
步骤一：制备有机相溶液：4%角鲨烯，0.5%吐温80 以及0.05%DSPC震荡混匀；步骤二：制备水相溶液：配制pH值为7.0的20mM PB溶液作为水相溶液；步骤三：将有机相溶液与水相溶液以1:5经微流控处理即可获得目标粒径的纳米脂质佐剂；步骤四：纳米脂质佐剂经300KD膜包超滤浓缩去除无水乙醇；步骤五：纳米脂质佐剂经0.22um滤膜过滤除菌后无菌分装保存备用。
对比例2-4的实验结果表格11所示：
表格 11不同纳米脂质佐剂配制方案所得纳米脂质佐剂参数
在实验的摸索过程中，发明人发现替代方案虽然也能够实现配制纳米佐剂的目的，但是对比例2-4的技术方案在放大生产过程中存在诸多不稳定因素，例如，对比例2在大规模生产中的超声探头大小、超声探头放置的深度、溶液的深度和体积均会影响其超声效果而导致最终的粒径大小不受控制；对比例3虽然可在一定程度上实现放大生产，但是其生产的颗粒目标粒径不能随意调控，而一般均在160nm左右；对比例4的方法虽然目前已经在mRNA领域广泛使用，但是其也存在生产成本高和生产难度大的缺点，而本申请的制备方法使用成本低，制备简单，工艺稳定，适宜规模化放大生产。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (7)
1.一种适合规模生产的疫苗佐剂，其特征在于，包括体积百分比4%-6%的角鲨烯和0.5%-1%的吐温80，还包括质量百分比0.05%-0.2%的可电离脂质和中性磷脂中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的一种适合规模生产的疫苗佐剂，其特征在于，所述可电离脂质包括DHA-1或DHA-5。
3.根据权利要求2所述的一种适合规模生产的疫苗佐剂，其特征在于，所述可电离脂质为DHA-1。
4.根据权利要求1所述的一种适合规模生产的疫苗佐剂，其特征在于，所述中性磷脂包括DOPE或DSPC。
5.根据权利要求4所述的一种适合规模生产的疫苗佐剂，其特征在于，所述中性磷脂为DSPC。
6.如权利要求1-5任一项所述的一种适合规模生产的疫苗佐剂的配制工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：制备有机相溶液：按照体积百分比量取4%-6%的角鲨烯和体积百分比0.5%-1%的吐温80，质量百分比0.05%-0.2%的可电离脂质和中性磷脂中的一个或多个溶解于无水乙醇溶液中；
步骤S2：制备水相溶液：水相溶液的pH值介于6.5-7.5之间；
步骤S3：制备佐剂初乳液：将步骤S1制备的有机相溶液与步骤S2制备的水相溶液以1:3-1:30的比例混合后获得佐剂初乳液；
步骤S4：制备纳米脂质佐剂：佐剂初乳液经800-1000bar压力均质10-15个循环；
步骤S5：超滤去除无水乙醇；
步骤S6：过滤除菌，分装保存备用。
7.根据权利要求6所述的一种适合规模生产的疫苗佐剂的配制工艺，其特征在于，所述水相溶液为20mM的PB溶液。
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2024
- 2024-02-05 CN CN202410163518.0A patent/CN118078983A/zh active Pending
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