CN104043119A - 一种新型疫苗佐剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种疫苗佐剂组合物及其冻干制剂和制备方法。该疫苗佐剂组合物含有以下质量体积百分含量的各组分：（1）油相0.1-15%，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种；（2）乳化剂0.1-15%，所述乳化剂选自聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、磷脂和吐温中的一种或多种；和（3）水70-99.5%。本发明的新型疫苗佐剂组合物，稳定性良好，在2～8℃与20～25℃下均能长期保存。可作为灭活疫苗、减活疫苗、裂解疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等不同疫苗的佐剂。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种疫苗佐剂组合物及其冻干制剂和制备方法。
背景技术
疫苗是一种特殊的药物，作为免疫学经验、理论和生物技术共同发展而产生的生物制品，它从防范于未然的角度免除了众多传染病对机体的威胁，对人类做出了巨大的贡献。疫苗的基本成分常包括抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂和其他活性成分等。
随着现代生物技术的迅速发展，新的疫苗抗原纯度高，相对分子量小，疫苗的不良反应低，然而这些抗原的免疫原性普遍较弱，为了提高抗原的有效性，必须在抗原中添加佐剂以增强它们诱导免疫反应的能力。理想的佐剂不仅能增强机体的免疫应答，更能使机体获得最佳的保护性免疫。
佐剂可通过以下几种主要作用方式增强或调节抗原的作用，使机体产生持久、高效和记忆性免疫应答。①使机体细胞浸润，出现巨噬细胞、浆细胞聚集，并使这些细胞增殖以期发挥更大的作用；②增加抗原表面积，在特定条件下改变活性基团的构型，使抗原物质降解，因而增加抗原的免疫原性，对相对分子量较低的抗原和半抗原增加抗原性，提高机体抗体产量；③形成抗原储库的作用，将过多的抗原储存以延缓释放；④载体效应；⑤免疫刺激作用，等等。
目前，应用最广泛的佐剂仍然是铝佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝等。自1926年Glenny首次使用铝盐粘附白喉类毒素至今，经过几十年的使用，虽然铝佐剂的有效性和安全性得到了人们的公认，但铝佐剂也有许多不足之处。如主要诱导产生体液免疫应答，诱导细胞免疫应答的能力较弱，抗体以IgG1型为主。不同批次之间产品差异较大，质量难以控制。会引起局部不良反应，形成肉芽肿，甚至发生局部无菌性脓肿。
其它已经批准上市的佐剂中，MF59和AS03均为O/W型亚微乳，AS04则由氢氧化铝和3-O-脱酰单磷酸类脂A（3-O-deacylated monophosphoryl lipidA,3D-MPL）组成。意大利于1997年率先批准含MF59佐剂的流感亚单位疫苗复立达（）上市，该佐剂能同时刺激产生体液免疫应答与细胞免疫应答，从而提高对65岁以上老年人的免疫保护水平。2009年欧盟批准含AS03佐剂的的H1N1疫苗上市，含AS04佐剂的人乳头瘤状病毒（HPV）疫苗也于当年在美国上市。
专利文献WO9014837、EP0399843A2、US6299884B1、US6451325B1、US20090191226A2公开了MF59的处方、制备方法及其用途。该佐剂含4.0%～5.0%角鲨烯、0.5%吐温80、0.5%司盘85，平均粒径约为160nm左右。处方中所含的脂溶性表面活性剂司盘85和水溶性表面活性吐温80，可使乳化剂的HLB值调节至适当水平。MF59在制备过程中需要高压均质，制备过程控制难度高，且如果与疫苗混合后高压均质可导致疫苗部分失活。此外，吐温80具有溶血作用，会导致组胺释放，容易引起过敏反应。
专利文献US2007141078A1、US2010189741A1、US2010183667A1公开了AS03的处方、制备方法及其用途。单个剂量的AS03含角鲨烯10.68mg、DL-α-生育酚11.86mg，吐温804.85mg，平均粒径为150～155nm，配制过程同样需要高压均质。2009～2010年甲型H1N1流行期间，欧洲多个国家报告疫苗接种者出现神经系统不良反应，主要表现为嗜睡和睡眠过度。根据芬兰国家健康与福利研究所公布的一份调查报告显示，4～19岁青少年在接种了疫苗后患嗜睡症的风险比同年龄组未接种疫苗的青少年高出9倍。嗜睡症是一种睡眠失调现象，患者会感到极端疲倦，昏昏欲睡，往往会在毫无预警的情况下睡着，甚至是在活动中途突然入睡。
专利文献CN201010247976.0公开了一种含角鲨烯、聚醚、聚氧乙烯蓖麻油的亚微乳佐剂，但聚氧乙烯蓖麻油在注射给药中具有较大毒性，易引起变态反应、中毒性肾损伤、神经毒性、心脏血管毒性等。
专利文献CN200910193930.2公开了一种水包油型复方疫苗佐剂，但其中的蜂胶组成复杂，含多种不明成分，且制备过程需要用到70%乙醇，易造成溶剂残留，仅适用于兽用疫苗。
专利文献CN02144678.4与201010103495.2公开的均为一种纳米乳佐剂，粒径在10～100nm之间。前者在制备过程中流感疫苗需经历高速搅拌与纳米裂解过程，容易导致抗原效价降低甚至失活。后者所采用的辅料肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、聚氧乙烯蓖麻油在注射给药中具有较大毒性，且佐剂效果差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的疫苗佐剂免疫效果差、制备复杂的问题，而提供一种新型疫苗佐剂组合物及其冻干制剂和制备方法，该新型疫苗佐剂能提高机体免疫应答，降低疫苗用量，增强免疫效果，制备简单，不需要使用高压均质或纳米裂解等步骤，易于工业化生产，有利于疫苗活性的保持。
为此，本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明的技术方案之一：一种疫苗佐剂组合物，其含有以下质量体积百分含量的各组分：
（1）油相0.1-15%，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种；
（2）乳化剂0.1-15%，所述乳化剂选自聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、磷脂和吐温中的一种或多种；和
（3）水70-99.5%。
其中，所述的质量体积百分含量（w/v）是指克/100毫升。
其中，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种，优选的所述油相是角鲨烯与中链甘油三酯的组合。所述油相的用量为0.1-15%（w/v），优选0.2-8%（w/v），进一步优选0.5-5%（w/v）。
其中，所述乳化剂选自聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、磷脂和吐温中的一种或多种；优选的，所述乳化剂是聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯和磷脂的组合，或者是吐温和磷脂的组合。所述乳化剂用量为0.1-15%（w/v），优选0.2-8%（w/v），进一步优选0.5-5%（w/v）。
其中，所述磷脂为可药用的天然磷脂或合成磷脂，或其衍生物，所述的天然磷脂优选卵磷脂和/或大豆磷脂，所述的合成磷脂优选氢化大豆磷脂和/或氢化卵磷脂。
其中，所述疫苗佐剂组合物含有水，用量为70-99.5%（w/v），优选90-98%（w/v）。所述的水优选注射用水。
其中，所述的疫苗佐剂组合物还可含有等渗调节剂。所述的等渗调节剂是常规种类，优选氯化钠、氯化镁、氯化钙、葡萄糖和甘油中的一种或多种。所述的等渗调节剂的用量为常规，优选0.1-8%（w/v），进一步优选2-2.5%（w/v）。
其中，优选的，所述的疫苗佐剂组合物还可含有pH调节剂。所述的pH调节剂是常规种类，优选氢氧化钠、氢氧化钾等碱类，或盐酸、枸橼酸、磷酸、醋酸、酒石酸、马来酸、氨基酸（如甘氨酸）等酸或其盐类。所述的pH调节剂的用量是常规，优选不超过1%（w/v）。
其中，优选的，所述疫苗佐剂组合物还可含有防腐剂。所述的防腐剂是常规种类，优选硫柳汞。所述的防腐剂的用量为常规，优选不超过0.1%（w/v）。
其中，优选的，所述新型疫苗佐剂组合物还可含有疫苗，疫苗的用量为常规，优选不超过1%（w/v）。
本发明所述的疫苗佐剂组合物可在临用时与疫苗混合，使用,，或与疫苗在生产时混合，灌封，供临床使用。
本发明所述的疫苗佐剂组合物优选以水针形式存在。
优选的，本发明所述的疫苗佐剂组合物是O/W型微乳溶液，其中微乳的粒径小于150nm，优选小于100nm，进一步优选小于70nm。
本发明的技术方案之二：所述的疫苗佐剂组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）油相制备
将脂溶性乳化剂加入油相中，搅拌均匀作为混合油相，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种，所述脂溶性乳化剂选自磷脂和吐温中的一种或两种；
（2）水相制备
将水溶性原料加入水中，搅拌均匀作为水相，所述的水溶性原料包括水溶性乳化剂聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯；和
（3）两相混合
在搅拌下将步骤（2）所得的水相加入步骤（1）所得的混合油相中，得到带乳光的溶液，加入水搅拌均匀得O/W型微乳溶液，即得。
其中，步骤（1）中将脂溶性乳化剂加入油相中，搅拌均匀作为混合油相。优选的，控温至2-75℃，使脂溶性乳化剂和油相混合均匀，从而获得混合油相。更优选加热至50-70℃。
步骤（2）中将水溶性原料加入水中，搅拌均匀作为水相。其中，所述的水溶性原料包括水溶性乳化剂聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯，优选的还包括pH调节剂、等渗调节剂和防腐剂中的一种或多种。
步骤（3）中在搅拌下将步骤（2）所得的水相加入步骤（1）所得的混合油相中，得到带乳光的溶液，然后加入水搅拌均匀得O/W型微乳溶液，即为所述的疫苗佐剂组合物。其中，将步骤（2）所得的水相加入步骤（1）所得的混合油相在搅拌下进行，所述搅拌的速度为20-10000rpm，优选300-700rpm。所述的搅拌的温度为2-75℃，优选50-70℃。优选的，步骤（3）所述O/W型微乳溶液经0.22μm滤膜过滤。
步骤（1），（2）中所述的搅拌是指常规的搅拌，优选机械搅拌或磁力搅拌，只要使油相或水相体系混合均匀即可。步骤（3）所述的搅拌也是指常规的搅拌，优选机械搅拌、磁力搅拌或者高剪切搅拌。
优选的，在步骤（1）、（2）或（3）中所述的任意步骤中往体系中加入疫苗混合均匀。
步骤（3）所得的O/W型微乳溶液即可灌装，储存或使用。
本发明的技术方案之三：一种疫苗佐剂冻干制剂，其含有以下质量百分比的各组分：
（1）油相0.8-45%，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种；
（2）乳化剂0.8-60%，所述乳化剂选自聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、磷脂和吐温中的一种或多种；和
（3）冻干保护剂5-90%。
其中，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种，优选的所述油相是角鲨烯与中链甘油三酯的组合。所述油相的用量为0.8-45%（wt）。
其中，所述乳化剂选自聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、磷脂和吐温中的一种或多种；优选的，所述乳化剂是聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯和磷脂的组合，或者是吐温和磷脂的组合。所述乳化剂用量为0.8-60%（wt）。
其中，所述磷脂为可药用的天然磷脂或合成磷脂，或其衍生物，所述的天然磷脂优选卵磷脂和或大豆磷脂，所述的合成磷脂优选氢化大豆磷脂和或氢化卵磷脂。
其中，所述的疫苗佐剂冻干制剂含有冻干保护剂。所述的冻干保护剂是常规的种类，优选甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、海藻糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种。更优选的是甘露醇、葡萄糖、山梨醇、海藻糖和蔗糖中的一种或多种。所述的冻干保护剂是的用量也是常规的，优选5-90%（wt）。
其中，优选的，所述的疫苗佐剂冻干制剂还可含有pH调节剂。所述的pH调节剂是常规种类，优选氢氧化钠、氢氧化钾等碱类，或盐酸、枸橼酸、磷酸、醋酸、酒石酸、马来酸、氨基酸（如甘氨酸）等酸或其盐类。所述的pH调节剂的用量是常规，优选不超过1%（wt）。
所述的疫苗佐剂冻干制剂可在临用时与疫苗混合，使用。优选的，所述的疫苗佐剂冻干制剂还可含有疫苗，疫苗的用量为常规，优选不超过1%（wt）。
本发明所述的疫苗佐剂冻干制剂以冻干形式存在。
本发明所述的疫苗佐剂冻干制剂复溶后粒径小于150nm，优选小于100nm，进一步优选小于70nm。
本发明的技术方案之四：所述的疫苗佐剂冻干制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）油相制备
将脂溶性乳化剂加入油相中，搅拌均匀作为混合油相，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种，所述脂溶性乳化剂选自磷脂和吐温中的一种或两种；
（2）水相制备
将水溶性原料加入水中，搅拌均匀作为水相，所述的水溶性原料包括水溶性乳化剂聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯；
（3）两相混合
在搅拌下将步骤（2）所得的水相加入步骤（1）所得的混合油相中，得到带乳光的溶液，加入水搅拌均匀得O/W型微乳溶液；和
（4）冻干
将步骤（3）所得的O/W型微乳溶液冻干，即得。
其中，步骤（1）-（3）及其优选方式如上文所述。
其中，步骤（4）将步骤（3）所得的O/W型微乳溶液冻干，即得所述的疫苗佐剂冻干制剂。其中，所述的冻干的方法是常规的。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供多种应用方法，包括但不限于：(1)独立包装，临用前与疫苗混匀后使用；(2)组合包装，与疫苗混匀后，灌封，贮藏于2～8℃，直至临床使用；(3)冻干疫苗产品，与疫苗混匀后，冻干，贮藏于2～8℃，临床使用前复溶；(4)冻干疫苗产品，临床使用前复溶，与疫苗混匀后使用。
本发明的新型疫苗佐剂组合物，可使抗原靶向至淋巴细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞（APC），提高APC对抗原的捕获能力。
本发明的新型疫苗佐剂组合物，稳定性良好，在2-8℃与20-25℃下均能长期保存。与MF59、AS03只能采用过滤除菌不同，该佐剂既能采用过滤除菌，也能经受终端热压灭菌（不含疫苗时）。
本发明的新型疫苗佐剂组合物，可作为灭活疫苗、减活疫苗、裂解疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等不同疫苗的佐剂，包括但不限于季节性与大流行流感疫苗（包括H1、H2、H3、H5、H7、H9、B亚型以及HA、NA、M1、M2亚单位抗原）、人乳头瘤状病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗等。
本发明的新型疫苗佐剂组合物用于不同年龄人群、动物的免疫接种，提高机体免疫应答，降低疫苗用量。该佐剂较已有的乳剂型佐剂制备简单，不需要使用高压均质或纳米裂解等步骤，易于工业化生产，有利于疫苗活性的保持，且能更大的增强疫苗的免疫效果。该方法工艺简单，质量可控，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
称取角鲨烯1g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS151.5g，卵磷脂0.5g，混合后加热至70℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，枸橼酸0.132g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在500rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例2
称取角鲨烯2.5g，中链甘油三酸酯2.5g，Solutol HS154g，卵磷脂1g，混合后加热至60℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在300rpm机械搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.45μm滤膜滤过，灌封至安瓿，热压灭菌，即得。
实施例3
称取角鲨烯0.5g，中链甘油三酸酯0.5g，Solutol HS152g，卵磷脂0.5g，混合后加热至50℃，搅拌，得到油相；称取硫柳汞0.01g，枸橼酸0.132g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7.4作为水相；在700rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加入三价流感疫苗（血凝素含量各6mg），加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例4
称取角鲨烯0.5g，Solutol HS154g，混合后控温至2℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在200rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加入三价流感疫苗（血凝素含量各0.1mg），加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例5
称取角鲨烯0.3g，Solutol HS152g，混合后加热至40℃，搅拌，得到油相；称取氯化钠0.6g，磷酸二氢钾0.2g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至6作为水相；在800rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加入三价流感疫苗（血凝素含量各1.5mg），加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例6
称取角鲨烯0.2g，Solutol HS150.4g，卵磷脂0.1g，混合后加热至75℃，搅拌，得到油相；称取氯化钠0.9g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，作为水相；在100rpm机械搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例7
称取角鲨烯4g，中链甘油三酸酯4g，Solutol HS156g，卵磷脂2g，混合后加热至55℃，搅拌，得到油相；量取60mL注射用水作为水相；在300rpm机械搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例8
称取角鲨烯3g，中链甘油三酸酯7g，Solutol HS1515g，混合后加热至45℃，搅拌，得到油相；称取甘油2.5g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在400rpm机械搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例9
称取角鲨烷5g，中链甘油三酸酯10g，Solutol HS1511g，卵磷脂4g，混合后加热至55℃，搅拌，得到油相；称取甘油2.0g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在400rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例10
称取中链甘油三酸酯0.1g，Solutol HS150.15g，卵磷脂0.05g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取磷酸二氢钠0.142g、磷酸二氢钾0.027g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钾溶液调节pH至7作为水相；在10000rpm高剪切搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例11
称取中链甘油三酸酯5g，Solutol HS157g，混合后加热至35℃，搅拌，得到油相；称取甘油2.0g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在500rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例12
称取角鲨烯0.2g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS155g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取磷酸二氢钠0.142g、磷酸二氢钾0.027g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在500rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加入狂犬疫苗250IU，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例13
称取角鲨烯5g，Solutol HS1512g，卵磷脂3g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取氯化钠0.1g，枸橼酸0.2g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在500rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例14
称取角鲨烷0.5g，中链甘油三酸酯0.5g，Solutol HS153g，大豆磷脂1g，混合后加热至75℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，枸橼酸0.3g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在10000rpm高剪切搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，热压灭菌，即得。
实施例15
称取中链甘油三酸酯0.1g，Solutol HS150.1g，混合后加热至55℃，搅拌，得到油相；称取氯化钠0.4g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在10000rpm高剪切搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例16
称取角鲨烯0.2g，中链甘油三酸酯0.2g，Solutol HS150.5g，氢化卵磷脂0.1g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取葡萄糖8g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，作为水相；在500rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例17
称取角鲨烯2g，中链甘油三酸酯2g，Solutol HS154.5g，氢化大豆磷脂0.5g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，枸橼酸0.1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在700rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例18
称取角鲨烯0.1g，中链甘油三酸酯0.2g，吐温804.5g，卵磷脂0.1g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取磷酸二氢钠0.142g、磷酸二氢钾0.027g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在600rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例19
称取中链甘油三酸酯0.2g，吐温200.15g，卵磷脂0.05g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取氯化钠、氯化镁、氯化钙各0.2g，枸橼酸0.1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在700rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例20
称取中链甘油三酸酯0.1g，吐温800.075g，卵磷脂0.025g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，枸橼酸1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在700rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加入乙肝疫苗50μg，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例21
称取角鲨烯3g，中链甘油三酸酯5g，吐温806g，卵磷脂2g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，甘氨酸0.1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至8作为水相；在700rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加入乙肝疫苗500μg，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例22
称取角鲨烯5g，中链甘油三酸酯10g，吐温8012g，卵磷脂3g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，枸橼酸0.1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7.4作为水相；在500rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加入H1N1流感疫苗150μg，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例23
称取角鲨烯2g，Solutol HS155g，卵磷脂1g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，枸橼酸0.1g，硫柳汞0.01g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在700rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加入乙肝疫苗5000μg，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例24
称取角鲨烯2g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS152g，卵磷脂0.5g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取甘油2g，枸橼酸0.1g，硫柳汞0.1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在700rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加入H1N1流感疫苗5000μg，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，灌封至安瓿，即得。
实施例25
制备方法：称取角鲨烯1g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS151.5g，卵磷脂0.5g，混合后加热至70℃，搅拌，得到油相；称取甘露醇4g，枸橼酸0.132g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在500rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例26
称取角鲨烯2.5g，中链甘油三酸酯2.5g，Solutol HS154g，大豆磷脂1g，混合后加热至60℃，搅拌，得到油相；称取葡萄糖5g，甘氨酸0.1g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在300rpm机械搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.45μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例27
称取角鲨烯4g，中链甘油三酸酯4g，Solutol HS156g，卵磷脂2g，混合后加热至55℃，搅拌，得到油相；称取甘露醇4g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在300rpm机械搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例28
称取角鲨烯3g，中链甘油三酸酯7g，Solutol HS1515g，混合后加热至45℃，搅拌，得到油相；称取甘露醇2g，醋酸钠0.05g，加入60mL注射用水中，用氢氧化钠溶液调节pH至6-8作为水相；在400rpm机械搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例29
称取角鲨烷5g，中链甘油三酸酯10g，Solutol HS1511g，卵磷脂4g，混合后加热至55℃，搅拌，得到油相；称取海藻糖6g，磷酸二氢钠0.1g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在400rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例30
称取角鲨烯5g，Solutol HS1512g，卵磷脂3g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取枸橼酸0.2g，蔗糖5g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7.4作为水相；在500rpm磁力搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例31
称取中链甘油三酸酯0.1g，Solutol HS150.1g，混合后控温至2℃，搅拌，得到油相；称取酒石酸0.1g，山梨醇5g，加入60mL注射用水中，搅拌，作为水相；在10000rpm高剪切搅拌下，将水相加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例32
称取角鲨烯2g，中链甘油三酸酯2g，Solutol HS154.5g，氢化大豆磷脂0.5g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取枸橼酸0.1g，葡萄糖2g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至6作为水相；在700rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例33
称取角鲨烯0.1g，中链甘油三酸酯0.2g，吐温804.5g，卵磷脂0.1g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取甘露醇2g、磷酸二氢钠0.142g、磷酸二氢钾0.027g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7.5作为水相；在20rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
实施例34
称取中链甘油三酸酯0.1g，吐温800.075g，卵磷脂0.025g，混合后加热至65℃，搅拌，得到油相；称取甘露醇10g，枸橼酸1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水相；在70rpm磁力搅拌下，将水相缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液，加水至100mL，搅拌均匀，0.22μm滤膜滤过，冻干，封口，即得。
下述试验例进一步证明本发明的创造性与新颖性，但所列举的试验例并不代表本发明的全部应用范畴。
试验例1佐剂粒径测定
将实施例1-24制备的佐剂以注射用水稀释5倍，采用Malvern Nano-ZS90动态光散射粒径电位测定仪测定其粒径（结果见下表）。
表1.佐剂粒径测定结果
| 实施例 | 平均粒径（nm） |
| 1 | 32.1 |
| 2 | 36.3 |
| 3 | 21.5 |
| 4 | 45.6 |
| 5 | 57.3 |
| 6 | 46.4 |
| 7 | 40.4 |
| 8 | 50.5 |
| 9 | 36.6 |
| 10 | 20.0 |
| 11 | 89.1 |
| 12 | 16.9 |
| 13 | 67.8 |
| 14 | 16.7 |
| 15 | 80.2 |
| 16 | 40.0 |
| 17 | 69.9 |
| 18 | 29.6 |
| 19 | 50.4 |
| 20 | 48.4 |
| 21 | 109.3 |
| 22 | 78.2 |
| 23 | 90.0 |
| 24 | 45.9 |
| 25 | 43.1 |
| 26 | 50.2 |
| 27 | 112.0 |
| 28 | 70.3 |
| 29 | 52.1 |
| 30 | 87.0 |
| 31 | 76.4 |
| 32 | 98.6 |
| 33 | 16.3 |
| 34 | 65.1 |
结果表明，所有实施例样品平均粒径均小于150nm，大部分样品平均粒径小于100nm。
试验例2本发明佐剂、MF59佐剂的长期稳定性
MF59佐剂的制备：根据专利文献WO9014837、EP0399843A2、US6299884B1、US6451325B1、US20090191226A2所述，通过以下方法制备MF59佐剂：（1）处方将0.5%司盘85（Span85）与5.0%角鲨烯搅拌混合均匀，作为油相；将0.5%吐温80（Tween80）加至适量柠檬酸缓冲液中，搅拌混合均匀，作为水相。（2）制备将油相加至水相中，10000转/分钟（rpm）剪切5min，形成初乳。将初乳转至高压乳匀机中，12000psi乳匀5次。过滤除去大粒子后，灌装，0.22μm过滤除菌，即得。
将实施例1制备的佐剂、MF59佐剂分别于2～8℃与20～25℃下放置1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样，观察外观，测定粒径，测定方法如试验例1。结果见下表：
表2.实施例1佐剂稳定性结果
表3.MF59佐剂稳定性结果
本发明佐剂在2～8℃与20～25℃下放置24个月，无变色分层现象，
粒径大小基本不变，表明本佐剂性质稳定。MF59佐剂在2～8℃与20～25℃下放置24个月后粒径均有较明显增大，稳定性不如本发明的佐剂。
试验例3中国专利申请201010103495.2公开的纳米乳佐剂以及本发明的佐剂对流感疫苗的佐剂作用比较
对照佐剂组配制
在中国专利申请201010103495.2的实施例1中公开的纳米乳佐剂的制备：
称取1,2-丙二醇20g，吐温8020g，60℃温度下持续搅拌，转速为50转/分钟，加入肉豆蔻酸异丙酯50g，得到混合溶液，加入下述流感疫苗溶液（流感裂解疫苗（B/Brisbane/60/2008）（上海生物制品所提供，血凝素（HA）浓度为30μg/ml）10g，搅拌至透明，即得，作为对照佐剂组。
其它疫苗组配制
疫苗溶液：流感裂解疫苗（B/Brisbane/60/2008），血凝素（HA）浓度为300μg/ml。（这是购买的吗？若是，请给出供应商。）
本发明佐剂溶液：实施例1制备的佐剂。
以pH7.4PBS将疫苗溶液稀释至3μg/ml，作为单纯疫苗免疫组。将实施例1制备的佐剂与以pH7.4PBS稀释至6μg/ml后的疫苗溶液等体积混合，作为疫苗+本发明佐剂免疫组。
动物免疫方案
将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组，单纯给予流感疫苗，0.3μg HA/只；
第2组：疫苗+对照佐剂免疫组，0.3μg HA/只；
第3组：疫苗+本发明佐剂免疫组，0.3μg HA/只；
第4组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水。
免疫效果检测
免疫后第14天、28天，小鼠眼眶取血，分离血清。通过HI试验，测定血清中的血凝抑制滴度。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表：
表4.HI试验结果
表5.ELISA试验结果
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p<0.05。从统计分析可知，本发明佐剂提高流感疫苗免疫应答水平的作用高于对照佐剂。
试验例4本发明佐剂对灭活脊髓灰质炎疫苗的佐剂作用
疫苗溶液：SabinⅡ型灭活脊髓灰质炎疫苗（购自中生集团）。
佐剂溶液：实施例1制备的佐剂。
以pH7.0PBS将疫苗溶液稀释至5μg/ml，作为单纯疫苗免疫组。将实施例1佐剂与以pH7.0PBS稀释至10μg/ml后的疫苗溶液等体积混合，作为疫苗+本发明佐剂免疫组。
动物免疫方案
将18只雌性BALB/c小鼠随机分为3组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组，单纯给予灭活脊髓灰质炎疫苗，1.0μg/只；
第2组：疫苗+佐剂免疫组，1.0μg/只；
第3组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水。
免疫效果检测
免疫后第28天，小鼠眼眶取血，分离血清。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表：
表6.本发明佐剂对灭活脊髓灰质炎疫苗的佐剂作用ELISA实验结果
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p<0.05。从数据分析可知，本发明佐剂能使抗体滴度增加约4倍，显著高于单纯疫苗免疫组。
试验例5佐剂对狂犬疫苗的佐剂作用
疫苗溶液：人用狂犬疫苗（地肾鼠细胞，购自中生集团），效价为3.5IU/ml。
佐剂溶液：实施例1制备的佐剂。
以生理盐水将疫苗溶液稀释至1.75IU/ml，作为单独疫苗免疫组，将佐剂与疫苗溶液等体积混合，作为疫苗+佐剂免疫组。
动物免疫方案
将42只雌性BALB/c小鼠随机分为7组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组Ⅰ，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0天免疫1次；
第2组：疫苗免疫组Ⅱ，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0、3天各免疫1次；
第3组：疫苗免疫组Ⅲ，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0、3、7天各免疫1次；
第4组：疫苗免疫组Ⅳ，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0、3、7、14天各免疫1次；
第5组：疫苗免疫组Ⅴ，单纯给予狂犬疫苗，0.25IU/只，第0、3、7、14、28天各免疫1次；
第6组：疫苗+佐剂免疫组，0.25IU/只，第0天免疫1次；
第7组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水，第0天免疫1次。
免疫效果检测
初次免疫后第4、8、12、16周，小鼠眼眶取血，分离血清。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表：
表7.本发明佐剂对狂犬疫苗的佐剂作用ELISA实验结果
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p<0.05。从数据分析可知，在免疫后初期（4～8周），疫苗+佐剂免疫组的抗体滴度虽然低于疫苗免疫组Ⅴ，但高于疫苗免疫组Ⅰ～Ⅳ。在免疫后中后期（8～16周），疫苗免疫组Ⅰ～Ⅳ的抗体滴度先下降，然后上升至较低水平；而疫苗+佐剂免疫组与疫苗免疫组Ⅴ的抗体滴度先下降，然后上升并维持在一个较高的水平。研究结果表明，本发明的佐剂能显著提高狂犬疫苗的免疫应答，在免疫后中后期的抗体滴度与传统免疫方法（5针法）基本相当，但可减少免疫次数。
试验例6O/W型微乳佐剂对乙型肝炎疫苗的佐剂作用
疫苗溶液：重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母，购自中生集团）。
佐剂溶液：实施例1制备的佐剂。
以生理盐水将疫苗溶液稀释至25.0μg HBsAg/mL，作为单纯疫苗免疫组。将佐剂与以生理盐水稀释至50μg HBsAg/mL后的疫苗溶液等体积混合，作为疫苗+佐剂免疫组。
动物免疫方案
将18只雌性BALB/c小鼠随机分为3组，每组6只，大腿四头肌肌肉注射。方案如下：
第1组：疫苗免疫组，单纯给予乙型肝炎疫苗，5.0μg HBsAg/只，第0、1、6月各免疫1次；
第2组：疫苗+佐剂免疫组，5.0μg HBsAg/只，第0、1、6月各免疫1次；
第3组：空白对照组，单纯给予同体积的生理盐水，第0、1、6月各注射1次。
免疫效果检测
初次免疫后第4、8、16、24、32周，小鼠眼眶取血，分离血清。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下.：
表8.本发明佐剂对乙型肝炎疫苗的佐剂作用ELISA实验结果
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p<0.05。从数据分析可知，单纯给予乙型肝炎疫苗时，产生的IgG滴度较低，加入佐剂后，IgG滴度显著提高。
Claims (10)
1.一种疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述的疫苗佐剂组合物含有以下质量体积百分含量的各组分：
（1）油相0.1-15%，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种；
（2）乳化剂0.1-15%，所述乳化剂选自聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、磷脂和吐温中的一种或多种；和
（3）水70-99.5%。
2.如权利要求1所述的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述油相是角鲨烯与中链甘油三酯的组合；所述油相为0.2-8%（w/v）；所述乳化剂是聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯和磷脂的组合，或者是吐温和磷脂的组合；所述乳化剂为0.2-8%（w/v）。
3.如权利要求1所述的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆磷脂和氢化卵磷脂中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述的疫苗佐剂组合物还含有等渗调节剂，所述的等渗调节剂为0.1-8%（w/v）；所述的疫苗佐剂组合物还含有pH调节剂，所述的pH调节剂不超过1%（w/v）；所述疫苗佐剂组合物还含有防腐剂，所述的防腐剂不超过0.1%（w/v）；或者，所述新型疫苗佐剂组合物还含有疫苗，所述的疫苗不超过1%（w/v）。
5.如权利要求1所述的疫苗佐剂组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）油相制备
将脂溶性乳化剂加入油相中，搅拌均匀作为混合油相，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种，所述脂溶性乳化剂选自磷脂和吐温中的一种或两种；
（2）水相制备
将水溶性原料加入水中，搅拌均匀作为水相，所述的水溶性原料包括水溶性乳化剂聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯；和
（3）两相混合
在搅拌下将步骤（2）所得的水相加入步骤（1）所得的混合油相中，得到带乳光的溶液，加入水搅拌均匀得O/W型微乳溶液，即得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中控温至2-75℃，使所述的脂溶性乳化剂和所述油相混合均匀，从而获得混合油相；
步骤（2）中所述的水溶性原料包括水溶性乳化剂还包括pH调节剂、等渗调节剂和防腐剂中的一种或多种；
步骤（3）中将步骤（2）所得的水相加入步骤（1）所得的混合油相在搅拌下进行，所述搅拌的速度为20-10000rpm，所述的搅拌的温度为2-75℃；
步骤（3）所述O/W型微乳溶液经0.22μm滤膜过滤；
步骤（3）所述的搅拌是机械搅拌、磁力搅拌或者高剪切搅拌；或者，
在步骤（1）、（2）或（3）中所述的任意步骤中往体系中加入疫苗混合均匀。
7.一种疫苗佐剂冻干制剂，其特征在于，所述的疫苗佐剂冻干制剂含有以下质量百分比的各组分：
（1）油相0.8-45%，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种；
（2）乳化剂0.8-60%，所述乳化剂选自聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、磷脂和吐温中的一种或多种；和
（3）冻干保护剂5-90%。
8.如权利要求7所述的疫苗冻干制剂，其特征在于，所述的冻干保护剂是选自甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、海藻糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种。
9.如权利要求7所述的疫苗冻干制剂，其特征在于，所述的疫苗佐剂冻干制剂还含有pH调节剂，所述的pH调节剂不超过1%（wt）；所述的疫苗佐剂冻干制剂还含有疫苗，所述的疫苗不超过1%（wt）。
10.如权利要求7所述的疫苗佐剂冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）油相制备
将脂溶性乳化剂加入油相中，搅拌均匀作为混合油相，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种，所述脂溶性乳化剂选自磷脂和吐温中的一种或两种；
（2）水相制备
将水溶性原料加入水中，搅拌均匀作为水相，所述的水溶性原料包括水溶性乳化剂聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯；
（3）两相混合
在搅拌下将步骤（2）所得的水相加入步骤（1）所得的混合油相中，得到带乳光的溶液，加入水搅拌均匀得O/W型微乳溶液；和
（4）冻干
将步骤（3）所得的O/W型微乳溶液冻干，即得。
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