CN102293743A - 一种脂质微球组合物 - Google Patents

Abstract

一种脂质微球组合物，其特点是包括脂质微球乳剂和免疫原性组合物，其中脂质微球乳剂重量的1～30％(w/w)为医药级油脂，脂质微球乳剂重量的0.1～10％(w/w)为两性离子/非离子表面活性剂组合，脂质微球乳剂重量的0.01～5％(w/w)为稳定剂，余量为水性溶液；免疫原性组合物是单价至多价，通常为3价组合物，其中包含来自一种或一种以上与大流行流感爆发相关或具有与大流行流感爆发相关的流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂。本发明不仅可作为疫苗优良佐剂，还可作为疫苗的输送系统，适用于疫苗的不同给药途径，增加临床应用的顺应性、多样性和选择性，达到更加广泛、安全、有效的免疫效果。

Description

一种脂质微球组合物

技术领域

本发明涉及一种生物制品，特别是涉及一种可以安全的用于人或其他动物体内的含有疫苗的脂质微球组合物，作为新型的疫苗佐剂和输送系统，特别重要的是本发明所述脂质微球组合物能很好地增强人体对各种抗原的免疫应答，具备优良的免疫调节功能从而达到交叉保护的效果，属于生物医药技术领域。

背景技术

据2010年1月20日的《科学-转化医学》杂志报道说，目前在欧洲版本的针对大流行性的H1N1流感疫苗中所应用的疫苗可彻底地改变身体对流感疫苗的免疫反应，并增强身体产生对多种类型流感的抗体反应的能力。

佐剂是人们经常加入到疫苗之中以增强免疫反应的物质，但它们本身则没有功效；这种现象的确切原因仍然让科学家们感到困惑。通过增强免疫反应，佐剂可让人们仅用较低剂量的疫苗，而疫苗供应在有的时候可能会是非常稀缺的，就像是在2009年秋季所看到的季节性流感疫苗的短缺。这些发现提示，某些佐剂可极大地改善大规模疫苗接种的效果，并对有关的流感病毒产生交叉性的保护。

在这项研究中，Surender Khurana及其同僚对机体在加有或没有加MF59佐剂的情况下对某种禽流感疫苗所产生的免疫反应做了精密的比较。他们发现，将佐剂与疫苗进行混合之后可产生能够识别范围更为广泛的不同流感抗原的抗体，其中包括某些已知的可灭活禽流感病毒的抗体。具体地说，MF59可增加抗禽流感的抗体量，同时也会增加抗体类型的多样性。预计这些多样化的抗体可对多种类型的流感产生涵盖面广泛的保护作用。目前人们正在研发许多新型的疫苗佐剂。通过查明佐剂在疫苗中的作用，这些结果可能会帮助疫苗制造商选择那些最有可能对流感提供更好保护作用的疫苗。

佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

由于流感病毒很容易变异，近年来各国政府和相关企业不得不疲于开发新疫苗，并为民众同时注射新疫苗和季节性流感疫苗。美国药管局的新研究表明，接种含有佐剂的单一流感疫苗有可能使接种者对多种流感病毒产生免疫力。

疫苗佐剂在欧盟国家和加拿大被广泛使用。此前有研究显示，佐剂可以延长疫苗的有效作用时间。美国政府已购买了价值近7亿美元的佐剂，美提供6000万美元资金，供企业和研究人员研制新型佐剂。

2007年在第九届国际呼吸道病毒感染研讨会上披露的两项临床研究数据首次显示，配方以葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司(GSK)专利佐剂系统的大流行强裂解抗原H5N1疫苗，可以提供对预防H5N1型毒株足够水平的交叉免疫力，从而在H5N1型病毒引发人类大流行时，保护接种过疫苗的人群。

第一项研究数据显示，用GSK专利佐剂技术生产的大流行前流感疫苗中，仅含有非常低水平的越南H5N1型抗原，却能够在人体诱导强大的针对印度尼西亚病毒株交叉免疫中和抗体应答。和注射不含佐剂疫苗所得到的实验数据相比，如果在疫苗中添加了佐剂，在第42天的中和性抗体血清阳转率是前者的25倍。这说明，添加了佐剂的疫苗敏感度要大大高于不添加佐剂的疫苗。

第二项研究数据表明，同样在抗原使用量非常低的情况下，GSK专利佐剂大流行前疫苗可以抵抗两种H5N1型流感毒株。临床前的体内研究数据表明，含有越南H5N1毒株的GSK佐剂疫苗，不仅可以抵抗疫苗毒株的攻击，而且可以对发生抗原性漂移的印度尼西亚H5N1毒株的致死性攻击提供96％的交叉保护。这提示给予额外的加强免疫，可以期望接种此种流感疫苗，能够作为流感大流行前的一项应对措施。欧洲专家表示，在世界各种鸟类中呈地方性流行的禽H5N1病毒，最有可能成为大流行的毒株。

目前GSK专利佐剂系统的大流行强裂解抗原H5N1疫苗，已在欧洲生产和使用。

复立达(英文商品名Fluad)是诺华(Novartis)疫苗公司生产的含创新佐剂MF59的亚单位流感疫苗。MF59是一种水包油的乳剂，包含1％鲨烯，0.5％Tween80和0.5％三油酸聚山梨脂的水包油乳液。被用于诺华公司的流感疫苗复立达中，在欧洲它是第一个被批准的添加佐剂的流感疫苗。

经我国药品食品监督管理局(SFDA)批准，2009年，复立达流感佐剂亚单位疫苗已经被允许上市，成为我国目前唯一的老年专用流感疫苗。

最早用于人类的铝佐剂，使用研究已经有近八十年的历史，尽管人们为研究新的佐剂配方付出巨大努力，但具有生产许可的新疫苗佐剂依然很少。1999年ECPI世界疫苗大会认为，“WHO或其他卫生权威部门试图夸大疫苗的绝对安全性的做法是不妥的，任何医药制品的使用都具有危险性，即使是最后的儿童疫苗也可能产生严重的个体与疫苗之间的相互作用”。但无论怎样，如果没有严格的毒性检测，佐剂疫苗是不会被批准使用的，这一原则将始终遵循。美国生物制品评价与研究中心期望继续对佐剂本身、也对佐剂疫苗混合物的毒性进行研究和评价。原因很简单，因为人类将继续面对新感染疾病的危机；面对那些因人类迁移和气候变化带来的原有疾病的威胁；现代人类的旅行活动会向新环境传播疾病。

目前，已有大量关于佐剂选择的研究，但人们仍希望更多的佐剂和输送系统的研究能够尽早成功，并用于开发有效的疫苗。

已经公开的数十篇外企在华申请的佐剂相关专利，分析其权利范围，多数以矿物油、角鲨烯和角鲨烷为油性基质制成的为水包油型的乳化液。其中CN127083.8A，CN1852735、CN10184501和CN101184501专利描述所用的油均为矿物油，这种油注射后，不能被动物经体内代谢和消除，以致它残留下来作为严重的慢性炎症和结痴的来源，因此也绝非能用于制造人类的疫苗佐剂中的组成物；CN1153064、CN10217977A、CN101365485和CN101678096A主要采用了角鲨烯和角鲨烷为油性基质，该油是可代谢的，具备可允许用于注射药品的品质，为了乳化完全由C、H两种元素组成的烷/烯烃类油脂，使用了亲水类和亲油类2种不同的非离子型表面活性剂乳化制成。

MF59与AS03乳状液是目前最成功的疫苗佐剂，然而在使用上仍有其副作用。事实上，MF59与AS03所选用的核心油脂角鲨烯，长久以来即有引起慢性发炎以及自身免疫破坏性疾病的疑虑，例如波湾战争综合病征(Gulf War Syndrome，GWS)，致使美国FDA至今迟迟未核准含有角鲨烯成分的疫苗上市；此外，这些疫苗所选用的乳化剂Span 85与Tween 80，虽然俱备安全性高的特性，且已被长久使用于食品、化妆品或作为体内注射使用，但是此类型乳化剂皆属于多元醇类非离子型界面活性剂，无法有效刺激免疫细胞。因此，经由此制备而得的MF59、AS03均属于疫苗输送系统，虽然可以利用其抗原控制释放的能力来增强由病毒抗原所诱导引发的适应性免疫反应，达到对抗该病毒的效果，却因为缺乏免疫调节功能，无法达到交叉保护的效果。

表1 MF59和AS03乳化佐剂的比较

基于以上论述，迄今用于人类的水包油乳剂佐剂，仅有诺华疫苗公司的MF59和葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司的AS03产品获准上市。而上市的这2种产品尽管有着良好的免疫增强作用，并得到临床实验的验证，但由于所使用的非离子表面活性剂，仍然无法有效地刺激免疫细胞，免疫功能调节上的缺失，无法达到更多的交叉保护效果。

因此，面对千变万化的流感病毒侵袭，除了针对每年可能流行的病毒株制成疫苗，将来若能在候选疫苗当中加入足以启动先天免疫反应的免疫调节剂，即可从免疫反应的源头开始做起，进而达到对新、旧流感病毒产生交叉保护的效果，从而根本解决流感威胁，是当前亟待解决的课题。

EMEA于2008年12月颁布的《用于大流行性流感疫苗上市许可申请的模拟疫苗数据档案的结构与内容指南》，内容包括模拟疫苗候选病毒毒株定义，模拟疫苗的生产、模拟疫苗的非临床安全性和免疫学要求，以及临床试验目标人群、临床试验设计、免疫评估标准、疫苗接种时间表和模拟疫苗批准后疫苗生产制造商的义务。还包括在真正流感大流行的情况下，大流行流感变异疫苗申请的审批和批准后对疫苗生产商临床调查研究的要求。

目前有3家公司生产的4种大流行性流感模拟疫苗获得EMEA认可，分别是百特国际有限公司(Baxter AG)生产的Celvapan，葛兰素史克集团生物制品公司(GlaxoSmithKline Biologicals S.A..)生产的Daronrix和Pandemrix，诺华疫苗和诊断公司(Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l.)生产的Focetria；后三种模拟疫苗含有佐剂。

目前常规使用的流感疫苗一般不含佐剂。它们基于活病毒或灭活的病毒，灭活疫苗可以基于完整的病毒、“裂解”病毒或纯化的表面抗原，包括血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。血凝素(HA)在灭活的流感疫苗中是主要免疫原，参考HA水平标准化疫苗剂量，疫苗通常含有约15μg HA/毒株。

流感爆发期需要大量流感疫苗，但难以增加疫苗供应从而满足如此巨大的需求。因此，除了生产更多疫苗抗原，使用较低含量的抗原/毒株，同时使用佐剂来弥补减少的抗原剂量，将有可能能覆盖更多人群而无需提高生产水平。

佐剂制造技术的发展，除了能缩短准备疫苗的时间，还能以较少的抗原得到更完善的免疫效果，有助于安定民心。不过佐剂从研发到上市，还有很长的路要走。本发明在初步完成佐剂的细胞筛选与免疫评估后，预计还将完成毒性与安全性测试、免疫作用机制与动力学研究，再结合临床实验，逐步累积各项人体实验数据，最后完成产品化之后续研究，获得批准上市之目标。

发明内容

本发明的目的在于研制和向临床提供一种安全性高，佐剂作用显着，性质稳定，可以与多种疫苗方便的配合使用，制备工艺简单并且适合工业化生产的脂质微球组合物。该脂质微球组合物，其特点不仅在于脂质微球乳化液作为疫苗佐剂，可通过增强和调节机体免疫反应，让人们仅用较低剂量的疫苗，就可增加抗流感的抗体量，同时也会增加抗体类型的多样性，产生范围更为广泛的不同流感抗原的抗体，这些多样化的抗体可对多种类型的流感产生涵盖面广泛的保护作用，并增强身体产生对多种类型流感的抗体反应的能力；而且作为疫苗的输送系统，还在于不仅保持了脂质微球乳化液的稳定性，还提高了抗原稳定性，改善抗原的免疫原性；此外，还在于本发明应用了已经在临床安全使用多年的，并商品化了的，可用于人体注射的药用辅料组合制得的脂质微球乳化液，具有良好的安全性和稳定性，生理兼容性好，副反应少，适用于疫苗的不同给药途径。

为了达到本发明的目的，本发明申请人的研发团队从油性基质的选择以及表面活性剂的筛选着手，尤其是表面活性剂的选择，首选已经临床上市多年的静脉注射用药品中的油性基质和表面活性剂的组合，通过本发明技术创造，在此基础进一步研究和创新，并基于安全性的充分考虑之下，使本发明给出的脂质微球组合物(疫苗佐剂)表现出显着的免疫调节活性，并通过实验技术揭示免疫调节活性是本发明组合物调节机体免疫应答能力的直接结果。而且，由于这些佐剂组分缺乏产生反应的能力，因此它们用作疫苗佐剂的适应性甚至进一步加强。也应该注意到这些佐剂由已知的可注射物质组成并且在商业渠道购得的注射剂中可见到。

本发明人发现，该技术应用于佐剂的开发能够让现有的疫苗效力更强，也能让过去遭遇瓶颈的疫苗成为可能，不仅可以增强体液和细胞免疫功能，还具备免疫调节功能，更好的达到交叉保护的结果。

本发明给出的技术解决方案是：这种脂质微球组合物，其特征在于包括有脂质微球乳剂和免疫原性组合物两部分，脂质微球乳剂与免疫原性组合物的比例为10∶1至1∶10之间，其中

脂质微球乳剂重量的1～30％(w/w)为医药级油脂，脂质微球乳剂重量的0.1～10％(w/w)为两性离子/非离子表面活性剂组合，脂质微球乳剂重量的0.01～5％(w/w)为稳定剂，余量为水性溶液；

免疫原性组合物是单价至多价，通常为3价组合物，其中包含来自一种或一种以上与大流行流感爆发相关或具有与大流行流感爆发相关的流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂。

为更好的实现本发明的目的，所述脂质微球乳剂为外观带有淡蓝色乳光或乳白状液体并均匀分散于水性介质中的脂质微球乳化液，平均粒径为50～500nm。

为更好的实现本发明的目的，所述脂质微球乳化液，进一步通过固化技术，制成干燥的粉末或块状的脂质微球乳剂，临用前用水性溶液复性瞬即形成乳化液，平均粒径为50～500nm。

为更好的实现本发明的目的，其中

所述医药级油脂为：经过精制的植物油和动物油，天然或人工修饰/全合成的油，优选大豆油、中链甘油三酯、橄榄油、维生素E中的1种或2种以上的特征组合；

所述两性离子/非离子表面活性剂组合，包含天然或人工修饰/全合成的。优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂及其衍生物、天然的D(L)-维生素E琥珀酸脂聚乙二醇衍生物(TPGS)；聚乙二醇660-12-羟基硬脂酸酯(HS-15)、Poloxamer(188)、聚山梨酯类(Tween-80)的1种或2种以上的特征组合；

所述稳定剂，优选油酸、胆酸或脱氧胆酸及其钠盐，甘胆酸钠中的1种或2种以上的特征组合；

所述水性溶液，可以是免疫原性组合物溶液，或纯化水、注射用水、甘油水溶液、缓冲盐水溶液的1种或2种以上的组合、或临床上可用的输液。

为更好的实现本发明的目的，所述的脂质微球组合物，含有下列所述a～d中的一种或2种以上的特征组合：

a、乳化液渗透压在200m Osm/kg-400m Osm/kg之间，优选240-360mOsm/kg之间；

b、pH为3～10，优选pH为5～8；

c、脂质微球的平均粒径在50～500nm之间，优选100～300nm之间；

d、含有单糖、二糖及多糖、甘露醇作为固化脂质微球工艺过程的保护剂，优选二糖。

为更好的实现本发明的目的，所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含来自至少三种流感季节性(大流行间)株的病毒抗原或抗原性制剂，并且任选包含至少一种与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜能的流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂。

为更好的实现本发明的目的，免疫原性组合物中所述大流行流感病毒株选自人类流感病毒中A、B、C型中包含H1N1，H2N2，H3N2，H5N1，H7N7，H1N2，H9N2，H7N3，H10N7；以及猪型流感病毒H1N1，H1N2，H3N1，H3N2；狗或马型流感病毒H7N7，H3N8；或禽流感病毒H5N1，H7N2，H1N7，H7N3，H13N6，H5N9，H11N6，H3N8，H9N2，H5N2，H4N8，H10N7，H2N2，H8N4，H14N5，H6N5和H12N5中的一种或一种以上的流感病毒组合。

为更好的实现本发明的目的，所述免疫原性组合物中的流感病毒抗原或其抗原性制剂来自在卵或细胞培养物上生长的流感病毒，或重组基因表达，合成的免疫原性组合物：包括完整病毒、裂解病毒、病毒体或选自HA.NA，M 1.M2的一种或多种纯化的抗原。

为更好的实现本发明的目的，所述免疫原组合物中的抗原包括但不限于人类抗原，非人类动物抗原，植物抗原，细菌抗原，真菌抗原，病毒抗原，寄生虫抗原或是癌肿抗原。

为更好的实现本发明的目的，所述脂质微球组合物，其特征在于：作为佐剂的脂质微球乳剂与抗原的比例为10∶1至1∶10之间，其中所述病毒抗原或抗原性制剂是每种流感病毒株每个人类剂量15μg或少于15μg HA，优选2～7.5μg HA。

为更好的实现本发明的目的，所述免疫原组合物可独立包装，也可与乳化液混合后包装或混合后进一步固化得到干燥的脂质微球组合物。

为更好的实现本发明的目的，所述含有免疫原性组合物的脂质微球组合物还可作为疫苗的输送系统，包括静脉注射、脊椎腔注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、经呼吸道喷入或吸入、腹腔给药、经鼻给药、经眼给药、经口给药、直肠给药、阴道给药、局部给药、透皮给药。

为更好的实现本发明的目的，所述疫苗的输送系统，临床用于人类宿主或人群的季节性或大流行流感感染之一或这两者，所述人类宿主或人群年龄为65岁或以上的老年人、年龄为0～18岁的儿童及青少年，以及年龄为18岁以上的成年人。

本发明所用的佐剂处方组成分析：

1、表面活性剂的组成分析：

两性离子表面活性剂：已有的研究数据表明，两性离子表面活性剂的分子结构中同时具有正、负电荷基团，在不同pH值介质中可表现出阳离子或阴离子表面活性剂的性质。卵磷脂、氨基酸型和甜菜碱型局属于这类表面活性剂，具有这样的特质：在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，具有很好的起泡、去污作用；在酸性溶液中则呈阳离子表面活性剂的性质，具有很强的杀菌能力。

卵磷脂是天然的两性离子表面活性剂。其主要来源是大豆和蛋黄。卵磷脂的组成十分复杂，包括各种甘油磷脂，如脑磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、丝氨酸磷脂、肌醇磷脂、磷脂酸等，还有糖脂、中性脂、胆固醇和神经鞘脂等等；此外还包括了合成磷脂、PEG化磷脂。

卵磷脂既有表面活性，又有生物活性，是生物膜的重要组成，是特种表面活性剂，还是各国制备注射用乳剂及脂质微粒制剂的主要辅料。其应用领域已延伸到食品、医药、化妆品和多种工业助剂。

人体所有细胞中都含有磷脂，它是维持生命活动的基础物质。磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。

本发明优选的卵磷脂，包括已经有商品化注射用磷脂出售的S100、E-80、EPCS、PC-98T、PL-100M等等。

非离子型表面活性剂：

(1)脂肪酸甘油酯：单硬脂酸甘油酯；

HLB为3～4，主要用作W/O型乳剂辅助乳化剂。

(2)多元醇：

蔗糖酯：HLB(5～13)O/W乳化剂、分散剂

脂肪酸山梨坦(Span)：W/O乳化剂

聚山梨酯(Tween)：O/W乳化剂

(3)聚氧乙烯型：Myrij(长链脂肪酸酯)；Brij(脂肪醇酯)

(4)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物：Poloxamer，能耐受热压灭菌和低温冰冻，可用于静脉乳剂的乳化剂。

本发明优选这类表面活性剂中的Tween系列和Poloxamer系列，尤其优选已经在上市注射用乳液有过应用的Tween 80和Poloxamer 188。

此外，属于该类的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)，聚乙二醇660-12-羟基硬脂酸酯(HS-15)，也在本发明的实施例中有着优良的表现。

阴离子型表面活性剂：高级脂肪酸及其盐，通式为(rcoo-)nmn+。本发明所述的稳定剂，即属此类表面活性剂，优选油酸、胆酸或脱氧胆酸及其钠盐，甘胆酸钠中的1种或2种以上。

从辅料药用的应用安全性上看，卵磷脂类、Tween-80、Poloxamer 188、HS-15是被全球各国药品管理机构批准可以应用于静脉注射乳剂及脂质微粒制剂的主要辅料。同时，磷脂又是生物膜的重要组分，是人体内源性物质，具有良好的生理功能和安全性。

2、油性基质的组成分析：

本发明所述的脂质微球水包油型乳剂佐剂组合物，其中油基质为人体内可以代谢转化并彻底清除，长期应用无毒性及蓄积作用的植物油、动物油，天然或人工合成/半合成的油脂。

具体包括大豆油，米格列醇(Miglyol 812)，中链油，鱼油，维生素E，维生素E琥珀酸酯，维生素E醋酸酯，红花油，玉米油，沙棘油，亚麻子油，花生油，茶油，葵花籽油，杏仁油，薏仁油，月见草油，芝麻油，棉籽油，蓖麻油，低芥酸菜子油，油酸乙酯，油酸，亚油酸乙酯，月桂酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，丁酸乙酯，乳酸乙酯，辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯中的一种或一种以上组合物。

本发明的油基质优选为大豆油，中链油，辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯的混和物，橄榄油，维生素E各类酸酯等这些组分，均是临床应用的注射用营养脂肪乳剂、载药乳/亚微乳注射液中的主要油基质，其安全性是显而易见的。

处方中的其他组分选择，基于体液内环境而考虑的调节渗透压、pH值，固化脂质微球乳剂所需的保护剂，以及需要时所添加的免疫增效剂。这些组成，优选甘油水溶液、缓冲盐水溶液或组合、或临床上可用的输液，单糖、二糖及多糖、甘露醇，葡聚糖，维生素，微量元素等等。可以使疫苗与脂质微球组合后的抗原免疫原性有提高，补充，助长，调节，扩增或延长作用的物质，且所述免疫增效剂在人体免疫接种途径可以安全耐受。

通过上述分析，本发明脂质微球组合物所用组分均为临床应用中作为静脉营养脂肪乳剂中，以及其他活性药物成分载体已经安全使用多年，经由本发明的技术创造，在此基础进一步研究和创新，并基于安全性的充分考虑之下，使本发明的脂质微球组合物(疫苗佐剂)表现出显著的免疫调节活性。

具体的产品还可以从以下部分产品的数据中看到，其处方组成中的辅料可以从已经公开的基本处方手册中查阅到。

脂肪乳注射液(国药准字H19999502北京费森尤斯卡比医药有限公司)

结构脂肪乳注射液(C6～24)(国药准字H20103083华瑞制药有限公司)

脂肪乳注射液(C14-24)(国药准字19993680广州百特侨光医疗用品有限公司)

脂肪乳氨基酸(18)注射液(国药准字H20103067四川科伦药业股份有限公司)

中/长链脂肪乳注射液(C6-24)(国药准字H20030609华瑞制药有限公司

康莱特注射液(国药准字Z10970091浙江康莱特药业有限公司)

鸦胆子油乳注射液(国药准字Z19993152浙江九旭药业有限公司)

榄香烯注射液(国药准字H10960115大连华立金港药业有限公司)

前列地尔注射液(国药准字H10980024北京泰德制药有限公司)

丙泊酚注射液(国药准字H19990282西安力邦制药有限公司)

丙泊酚注射液(国药准字J20030039德国费森尤斯卡比股份有限公司)

丙泊酚中/长链脂肪乳注射液(H20060287 Fresenius Kabi DeutschlandGmbH)

ω-3鱼油脂肪乳注射液(H20100179 Fresenius Kabi Austria GmbH)

依托咪酯注射用乳剂(H20090131 B.Braun Melsungen AG)

注射用两性霉素B脂质体(H20090963 Three Rivers Pharmaceuticals，LLC)

盐酸多柔比星脂质体注射液(H20040012 ALZA Corporation)

注射用脂质体两性霉素B(X20000445 Alza Corporation)

注射用紫杉醇脂质体(国药准字H20030357南京思科药业有限公司)

盐酸多柔比星脂质体注射液(国药准H20084432上海复旦张江生物医药股份有限公司)

疫苗配伍禁忌和剂型的考虑原则

需要考虑的三个原则：

A、对疫苗的抗原成分的免疫功能、免疫原性的长期保持；

B、使用后对人的安全性，不良反应越低越好；

C、使用方便、经济。

由于疫苗需要在严苛的环境下，才能得以保持优良的免疫活性，产生集体保护所需的足够抗体的生成。尽管已经上市的脂质乳剂的处方组成具有如此优越的安全性和临床验证结果，但是，基于疫苗配伍和剂型的考虑原则，已有的这些产品由于不能持久保持疫苗的活性和足够的佐剂效应，因而影响了上述处方组合作为上市佐剂的产品的优选方案。

这种原则的考虑，可以从葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司(GSK)AS03佐剂和诺华疫苗公司生产的含创新佐剂MF59的组合物中分析得到。2家著名的佐剂开发机构不约而同的选择了角鲨烯(三十碳六烯，squalene，C₃₀H₅₀，410.72)或角鲨烷(异三十烷，squalane，C₃₀H₆₂，422.81)作为油性基质。

其一，与本发明所不同的是，MF59和AS03使用了角鲨烯和角鲨烷结构简单，属于烷烃/烯的直链结构，都不含有脂肪酸中羧酸官能团，以及脂肪酸甘油酯中的酯基官能团。由于众所周知的原因，脂肪酸甘油酯在存储中易水解为脂肪酸和甘油醇，而脂肪酸的存在，使得脂质微球乳液长期存放中，体系的pH不断下降，最终将导致疫苗失活，或刺激性增加。这些因素的存在，影响了这类佐剂的开发。

其二，与本发明所不同的是，MF59和AS03使用了亲水的非离子型表面活性剂(TW-80)和亲脂的非离子型表面活性剂(Span-80)中的一种或全部。而公知的卵磷脂是一类含有磷元素的脂肪化合物，通常是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、丝氨酸磷脂(PS)等的混合物，其中最典型的是前三种。卵磷脂是一种成分复杂的甘油脂，水解后可以得到甘油、脂肪酸、磷酸、胆碱、胆胺、肌醇等带有荷电性化合物。一般大豆卵磷脂分子中的脂肪酸为软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和花生烯酸。即使是高纯的精制卵磷脂也含有少量此类物质；蛋黄卵磷脂中对人体有益的磷脂酞胆碱含量远远高于大豆磷脂.并含有大量胆固醇和甘油三酯；卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒，这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用，而不会使血浆中的胆固醇增加。

在不同来源和不同制备过程的卵磷脂中各组分的比例可发生很大的变化，从而影响其使用性能。卵磷脂外观为透明或半透明淡黄色至黄褐色油脂状物质，对热十分敏感，在60℃以上数天内即变为不透明褐色，在酸性和碱性条件以及酯酶作用下容易水解。

因此卵磷脂组分的复杂性和不确定性，影响了多家疫苗佐剂开发公司的对卵磷脂的选择。

然而，正如前述内容，作为非离子型界面活性剂的TW-80和Span-85，无法使疫苗佐剂有效刺激免疫细胞，缺乏免疫调节功能，因而无法达到交叉保护的效果。这种缺陷使发明人认识到，卵磷脂作为天然的两性离子表面活性剂，足以启动先天免疫反应的免疫调节剂，即可从免疫反应的源头开始做起，进而达到对新、旧流感病毒产生交叉保护的效果，从而根本解决流感威胁。

而且，应用先进的制备工艺技术和仪器设备，已经足以使卵磷脂的组分可控，形成磷脂酰胆碱纯度达到80％，甚或98％以上的精制卵磷脂，并且，已经有多种商品化的注射剂磷脂可供优选，因此，本发明中的主要表面活性剂既立足于此，优选了S100、E-80、EPCS、PC-98T、PL-100M其中的1种或一种以上组合。

其三、与本发明所不同的是，多家公司并非没有尝试这样的油基质和表面活性剂的选择，在过往的专利中看到过，但迄今没有针对上述缺陷，尤其是放置过程中导致体系周围环境的pH变化，提出很好阐述并找到解决的方法。本发明立足于本申请人多年疫苗研发和生产技术实力，和有着多年开发载药纳米制剂的研发团队，通过具有完整自主知识产权的，具有强大pH耐受范围的缓冲体系，并将这样的缓冲体系引入和应用于佐剂的分散体系中，同时克服和解决了非均相体系在电解质溶液中的聚集倾向这样或那样的问题。为本发明提供了研究数据支持。

在上述难题攻关后，以EMEA“用于大流行性流感疫苗上市许可申请的模拟疫苗(mock-up vaccine)的数据档案的结构与内容指南”指导开发过程，本发明的疫苗佐剂，基于疫苗配伍禁忌和剂型的考虑原则，在流感疫苗领域的应用具有以下优势：

A、配方中的佐剂成分有助于减少抗原需求的一次剂量和/或激发达到具保护性的免疫反应的用药次数；

B、在效期内长期保持了疫苗的抗原成分的免疫功能、免疫原性，与抗原和佐剂的即时混合控制一致；

C、使用后对人的安全性，不良反应发生几率更低，安全性更好；

D、使用方便、经济。

此外，本发明佐剂对于以下疫苗的领域的应用，同样具有上述优势：

1、灭活菌体和/或灭活病毒颗粒悬浮液组成的灭活疫苗

例如伤寒、副伤甲乙疫苗(或三价联合疫苗)、百日咳菌体菌、霍乱灭活疫苗、钧端螺旋体疫苗、乙型脑炎灭活疫苗、森林脑炎灭活疫苗、出血热灭活疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗等。

2、全颗粒的减毒菌体或病毒颗粒减毒疫苗

如卡介苗、鼠疫、布鲁氏杆菌等细菌疫苗、乙脑、麻疹、风疹、甲肝、流脑等减毒的病毒疫苗。

3、化学成分明确的疫苗

包括由致病微生物提纯的和基因重组后提纯的以及化学合成的抗原：蛋白质、多糖、多糖-蛋白质结合疫苗、多肽、核酸等等。

本发明的佐剂均能能明显提高上述疫苗的抗体效价和维持时效，动物实验表明，这些增强作用不仅个体间差异小、使局部炎症反应降低，还能刺激淋巴细胞、巨噬细胞增殖，增强其吞噬功能和容量，增强免疫细胞功能活动，加强免疫反应，是较理想的免疫佐剂。

脂质微球乳化液的药剂学表征

脂质微球乳化液是一种以油性基质，如脂肪油，通过卵磷脂等表面活性合外力做功的作用，使油性基质被磷脂膜包封后，均匀分散于另一不相容的水性溶液介质中，并稳定地以微小脂质微球悬浮于其中的分散系，其平均粒径200nm，简称为脂质微球(Lipid Microsphere)。这种分散体系同时包容了油相(内相)、水相(外相)、油/水界面膜(表面活性剂)三相均一共存状态。

首次提出脂质微球的定义，并被作为药物载体应用于临床治疗疾病药品，见于北京泰德制药有限公司的前列地尔注射液(商品名：凯

，国药准字H10980024)，由该公司首席科学家也是日本著名药学专家——水岛裕教授提出并定义。该公司是中外合资的靶向药物生产企业。

如附图1所示，脂质微球的外膜为卵磷脂，内层为软基质油，其中包裹着脂溶性药物，形成了粒径约为200nm的水包油型的脂质微球，载药脂质微球可以将药物活性成分靶向聚集于病变部位实现了药物的“靶向治疗”。

凯

是经过多年临床验证并具有很好的安全性新剂型。其药剂学特征为：水包油型乳剂(O/W)，平均粒径可自由调控至100～500nm之间。脂质微球颗粒表面由单层的磷脂膜包被着植物油，分散相为水，药物因其亲水或疏水性质的不同，可包覆在单层脂质膜中，或包封于内层的油性基质中。经由两型表面活性剂的卵磷脂乳化后形成的脂质微球，其表面电性可通过辅料调整为正电或负电荷，在脂肪酸作为阴离子表面活性剂，使得脂质微球一般为表面荷负电。

脂质微球乳化液的佐剂作用机理探讨

1、病毒结构解析：

病毒包膜(viral envelope)是包绕在病毒核衣壳外面的双层膜。主要成分是蛋白质、多糖及类脂(卵磷脂)，常以糖蛋白或脂蛋白形式存在。蛋白质是由病毒基因编码，多糖、脂类来自宿主细胞膜、核膜或空泡膜。当有包膜病毒成熟并以“出芽”方式释放时，穿过并获得胞膜此部位的脂类、多糖成分和少许蛋白质从而形成包膜。有些病毒其包膜表面有突起，称为包膜子粒或刺突，赋予病毒一些特殊功能。例如，流感病毒(附图2)包膜上有血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neurominidase，NA)两种刺突。HA对呼吸道上皮细胞和红细胞有特殊的亲和力；NA能破坏易感细胞表面受体，便于病毒从细胞内释放。有包膜病毒对脂溶剂(如乙醚、氯仿和胆汁)敏感，乙醚因其能破坏包膜而灭活病毒，常被用于鉴定病毒有无包膜。有包膜病毒(如呼吸道病毒)因可被胆汁灭活，故一般不能经消化道感染。

2、免疫佐剂的作用

佐剂是非特异性的免疫增强剂，有些物质与抗原一起或预先注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。其作用表现在：

(1)延缓抗原的释放，保护抗原不被水解，佐剂可延长抗原在体内滞留时间，避免频繁注射，有利于高亲和力抗体的产生；

(2)活化巨噬细胞并促进巨噬细胞与T和B细胞的相互作用，从而对淋巴细胞有特异性加强刺激的作用；

(3)佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；

(4)佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；

(5)可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；

(6)可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度；

(7)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。

3、纳米粒子免疫佐剂可能有的作用机制

Cox和Coulter[1]将佐剂的作用机制分为五类：

免疫调节作用；促进抗原呈递作用；促进细胞毒性T细胞产生；靶向作用；抗原储库作用。根据已发表的文献资料统计的佐剂大约有数百种，这些其中较为被人们熟悉的有铝佐剂、钙佐剂、乳剂型佐剂、颗粒佐剂等。[1]Cox J C，Coulter A R.Adjuvants-a classification and review of their modes ofaction.Vaccine，1997，15(3)：248～256.

一般佐剂均具有多种机制，例如QS-21能诱导细胞因子(IL-2，IFN-γ)产生，能激活抗原特异性的CTL，还可产生IgG2a促进体液免疫。而纳米佐剂增强疫苗免疫应答的作用机制尚未清楚，可能与以下机制有关：

(1)纳米粒子与疫苗抗原的结合方式、结合比例等对疫苗抗原有保护性作用，保护抗原免受机体各种酶的降解；

(2)抗原物质与纳米粒子结合后更有利于被APC靶向摄取(纳米佐剂和抗原组成的超小体积的微粒是巨噬细胞、树突状细胞的首选吞噬目标)；

(3)长效缓释(随着纳米佐剂粒子的降解，抗原可持续释放)。

对于纳米佐剂的作用机制需进一步研究，因为只有弄清作用机制后，才能根据其机制找到佐剂最大免疫刺激作用和最小不良反应的平衡点，将纳米佐剂安全有效地应用于人体。

4、脂质微球乳化液的佐剂作用机理初探和疫苗输送系统评价

亲脂性或亲水性的抗原，与本发明的脂质微球乳化液混合后，会出现不同的融合模式。亲脂性抗原，可组合在脂质微球界面膜(磷脂单分子层)或内部的油性基质中，亲水性抗原则分散于外部的水性分散介质中，其中一部分还可以共价键或非特异性嵌入磷脂单分子层中。

如果包被在界面膜表层或内部油性基质中的抗原，那么，脂质微球乳化液将可以形成抗原储库，将可以长久刺激免疫系统，引发B、T细胞的相互作用。

如果分散于外部的水性分散介质中，小部分以共价键或非特异性嵌入磷脂单分子层中的抗原，则不能形成显著的药物贮库效应。

以流感病毒为例，流感病毒(附图2)包膜上有血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neurominidase，NA)两种刺突。这样的刺突可以附着在脂质微球的界面膜的薄片状结构，称之为微毒粒，使得分散体系中增多了类似于流感病毒颗粒，增强了抗原表面面积。本发明实施例里，这种疫苗在动物实验中已经被证实了能引起理想的体液和细胞免疫反应。

本发明所述的脂质微球乳化液，脂质微球的平均微粒直径为100～200nm，电子显微镜下观察到的脂质微球(20万倍，附图三)，每1ml脂质微球乳液中含有650亿个脂质微球。显而易见的是，抗原组合物在此环境下，无论是包被于脂质微球中，还是分散于脂质微球外部，或者以共价键或非特异性的吸附于有水界面膜上，即使是以较低比例(佐剂1：疫苗9，含5μg HA)与抗原组合应用，抗原组合物都将无疑地被脂质微球体系放大到数以亿倍的比表面积，数以亿计的“假病毒”脂质微球在肌内或皮下游弋，也将使疫苗在注射部位的局部组织中有着更好的亲和力，使病毒抗原可以更好地被吸附，刺激巨噬细胞的吞噬，快速产生应答；还有缓慢释放作用，可以作为疫苗的贮库。

不仅如此，本发明所述的脂质微球乳化液，还是抗原组合物的药物转运系统(DDS)。而在化学药领域中，DDS具有公知的三大优点：跨越生理屏障技术(吸收促进)、控制释放技术(控释)和靶向技术(药物导弹)，如附图四所示。

因此，本发明既可作为疫苗的给药载体，又可作为疫苗的佐剂，从而发挥提高疫苗的免疫应答又能发挥疫苗先进的输送系统的效力，达到最佳的佐剂效应。这是因为，一方面在注入部位强烈吸引巨噬细胞、树突状胞、朗汉氏细胞等识别与内吞，另一方面作为输送系统，在局部缓慢放抗原，延长了抗原提呈细胞与T淋巴细胞相互作用时间，可显着增强体液免疫应答。

综上所述，可以认为，本发明的佐剂作用主要机制有：

(1)免疫调节作用，加强Th1和Th2的作用；

(2)改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长抗原在体内潴留时间；

(3)刺激单核-巨噬细胞系统，增强其对抗原的处理和提呈能力；

(4)刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次将卵磷脂乳化的油性基质形成的脂质微球乳化液，应用于疫苗佐剂的开发领域，并试图经由卵磷脂两性离子型表面活性剂优于非离子型表面活性剂，能够更加有效地刺激人体免疫细胞，激发人体免疫调节功能，达到交叉保护的效果；同时，脂质微球乳化液还可以作为免疫原性组合物的运送载体，利用其抗原控制释放的能力来增强由病毒抗原所诱导引发的适应性免疫反应，达到对抗该病毒的效果，还可以形成多种疫苗给药方式的输送系统。

附图说明

图1：脂质微球结构图；

图2：流感病毒结构图；

图3：电子显微镜下观察到的脂质微球；

图4：疫苗输送系统三大优势图；

图5：实施例1中水包油型乳剂佐剂粒径测定图；

图6：实施例1中水包油型乳剂佐剂与流感灭活全病毒疫苗混合后粒径测定图；

图7：实施例5中注射用脂质微球乳化液型佐剂冻干前粒径测定图；

图8：实施例5中注射用脂质微球乳化液型佐剂冻干复性后粒径测定图；

图9：血凝素抗体试验结果曲线图。

具体实施方式

本发明可以通过以下实施例实现，但不受以下实施例中比例、组成、方法、步骤的限制。应该理解，这里讨论的实施例和实施方案只是为了说明，对熟悉该领域的人可以提出各种改进和变化，这些改进和变化将包括在本申请的精神实质和范围以及所附的权利要求范围内。

实施例1：

脂质微球乳化液型佐剂的制备

(1)称取大豆油20g，中链油50g，大豆磷脂18g，维生素E 0.1g，置水浴中加热搅拌混合均匀，保持温度70℃，作为油相；(2)称聚山梨酯80(Tween80)2g加入到适量注射用水中，加热搅拌使其溶解，保持温度70℃，作为水相。

在搅拌下将油水两相混合，继续搅拌，形成初乳；(3)初乳以注射用水定容至1000mL，经750bar高压乳匀6次，用氢氧化钠调pH为7.5，即可得到脂质微球乳化液型佐剂。

实施例2：

脂质微球乳化液型佐剂的制备

(1)称取中链油60g，大豆磷脂10g，氢化溶血磷脂3g，油酸0.5g，置水浴中加热搅拌混合均匀，保持温度75℃，为油相；(2)称泊洛沙姆1881.5g，甘油2.25g加入到pH为7.8的枸橼酸盐缓冲液中，加热搅拌使其溶解，保持温度75℃，作为水相。

在搅拌下将油水两相混合，继续搅拌，形成初乳；(3)初乳以缓冲液定容至1000mL，经800bar高压乳匀4次，即可得到脂质微球乳化液型佐剂。

实施例3：

脂质微球乳化液型佐剂的制备

(1)称取花生油60g，蛋黄磷脂15g，置于水浴中加热搅拌至磷脂溶解，保持温度70℃，作为油相；(2)称取脱氧胆酸钠5.0g加入到适量注射用水中，加热搅拌使其溶解，保持温度70℃，作为水相。在搅拌下将油水两相混合，继续搅拌，形成初乳；(3)初乳以注射用水定容至1000mL，经1000bar高压乳匀5次，以碳酸氢钠调节pH7.0。即可得到脂质微球乳化液型佐剂。

实施例4：

脂质微球乳化液型佐剂粉针的制备

(1)称取橄榄油120g，大豆磷脂25g，TPGS 5g，置于水浴中加热搅拌至磷脂溶解，保持温度70℃，作为油相；(2)称取泊洛沙姆1.0g，甘油2.25g加入到适量pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，加热搅拌使其溶解，保持温度70℃，作为水相。在搅拌下将油水两相混合，继续搅拌，形成初乳；(3)初乳以缓冲液定容至1000mL，经800bar高压乳匀6次，以氢氧化钠调节pH7.0，即可得到脂质微球乳化液型佐剂。(4)在上述佐剂中加入15％(w/v)甘露醇，经喷雾干燥即得脂质微球乳化液型佐剂固体粉末，喷雾干燥条件：入口温度160℃，出口温度91℃，风量100％，流速0.01％，产率85.8％。(5)该脂质微球乳化液型佐剂固体粉末可作为粉雾剂，经呼吸道喷入或经鼻粘膜吸入给药。(6)或临用前用水性溶液复性瞬即形成乳状液，可用于静脉注射、脊椎腔注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、口服及腹腔给药。

实施例5：

脂质微球乳化液型佐剂冻干粉针的制备

(1)称取大豆油50g，中链油50g，蛋黄磷脂10g，油酸0.3g，置水浴中加热搅拌混合均匀，作为油相；(2)称聚乙二醇660-12-羟基硬脂酸酯(HS-15)5g加入到适量pH为7.8的枸橼酸盐缓冲液中，加热搅拌使其溶解，作为水相。

在搅拌下将油水两相混合，继续搅拌，形成初乳；(3)初乳以缓冲液定容至1000mL，经750bar高压乳匀5次，即可得到脂质微球乳化液型佐剂。(4)在上述乳剂佐剂中加入15％(w/v)蔗糖，在-80℃预冻8h后，真空冷冻干燥36h，即得脂质微球乳化液型佐剂冻干粉针，临用前用水性溶液复性瞬即形成乳状液。

实施例6：

脂质微球乳化液型佐剂与流感灭活病毒疫苗组合物的制备

将流感灭活全病毒疫苗按照1∶1的比例加入到实施例1中的佐剂，室温下搅拌混合均匀，过滤，灌封并贮藏于4℃，直至注射为止。

实施例7：

脂质微球乳化液型佐剂与流感灭活病毒疫苗组合物冻干粉针的制备

(1)将流感灭活全病毒疫苗按照1∶2的比例加入到实施例2中的佐剂后，室温下搅拌10分钟。(2)在上述混合溶液中加入15％(w/v)蔗糖，在-80℃预冻8h后，真空冷冻干燥48h，即得脂质微球乳化液型佐剂与流感灭活病毒疫苗组合物冻干粉针，临用前用水性溶液复性瞬即形成乳状液。

实施例8：

透皮免疫贴剂的制备

将实施例6中的佐剂疫苗组合物采用生物相容聚合物微针技术，可以避开皮肤角质层而将疫苗注入机体内，使用者几乎无不适感。疫苗这种大分子药物很难通过传统的透皮给药途径进入机体，而这种微针透皮贴剂可在30秒内完成给药，其生物利用度与皮下注射相当。

实施例9：

溶血磷脂酰胆碱(LPC)对体液和细胞免疫应答的诱导作用

(1)诱导体内细胞毒性T细胞(CTL)应答：分别以完全弗氏佐剂(CFA)、铝佐剂或LPC加卵清蛋白(OVA)免疫C57BL/6小鼠，收集淋巴结，以OVA再刺激，用51Cr释放试验检测CTL活性。结果显示OVA+LPC组能产生OVA特异性CTL应答，应答率与OVA+CFA组相似，而单纯OVA或OVA+铝佐剂免疫则不能产生CTL应答。(2)诱导抗原特异性抗体应答：分别以LPC、CFA或铝佐剂加HEL免疫BALB/c小鼠，用ELISA测定HEL特异性抗体。结果显示，3组皆能产生较高滴度的HEL特异性抗体，LPC与铝佐剂的效力相似，只诱导IgG1型抗体，而CFA还可诱导IgG2a型抗体。

综上所述，LPC作为磷脂酰胆碱的降解产物，与抗原共同免疫时可起佐剂作用，诱导体液和细胞免疫应答。因此，本发明使用的两性离子型表面活性剂——卵磷脂对活化细胞，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。

实施例10：

脂质微球乳化液型佐剂及佐剂与流感灭活全病毒疫苗混合物的粒径及粒度分布测定

将以实施例1中方法制备的脂质微球乳化液型佐剂10μl以注射用水稀释至10mL作为供试液。采用Nicomp 380ZLS激光粒度仪测定其粒度。

将实施例1中佐剂与流感灭活全病毒疫苗按照1∶1的比例混合，混合后室温静置一段时间，照佐剂粒度测定方法相同操作测定混合物的粒度。

测定结果显示佐剂及疫苗佐剂混合物中的粒子小而均匀，混合后粒径没有明显改变。粒度测定结果附图所示。

实施例11：

脂质微球乳化液型佐剂中乳粒的形态观察。

取实施例1中的脂质微球乳化液型佐剂1滴，用铜网沾取，待未完全干燥前，用1％磷钨酸负染，至透射电镜下观察粒子的微观形态。结果显示佐剂乳粒外形圆整，电镜结果如图3所示。

实施例12：

疫苗与脂质微球乳化液型佐剂组合物中抗原的包封率(结合率)测定。

将实施例5中方法制得的脂质微球乳化液型佐剂与流感病毒表面抗原组成的疫苗佐剂组合物1.0mL采用sepharose CL-2B凝胶柱(1.6×20.0cm)以PBS作为洗脱液进行洗脱，以分离游离的流感病毒表面抗原及与佐剂中乳粒结合的抗原。得到的两个洗脱峰中，第一峰为佐剂乳粒与表面抗原蛋白的结合物(分子量大)，第二峰为未结合的游离表面抗原。测定佐剂疫苗组合物中总的血凝素含量及两个洗脱峰中血凝素的含量即可依下式计算佐剂疫苗组合物的表面抗原包封率。测定结果，脂质微球乳化液型佐剂与流感表面抗原组合物中表面抗原的包封率分别为90.1％，抗原包封率高。产生高包封率的原因可能是流感病毒的表面抗原蛋白对与细胞膜主要组分相一致的乳粒磷脂膜有极强的亲和力，主动结合在乳粒上所致。

实施例13：

脂质微球乳化液型佐剂与抗原分别接种时接种顺序对产生抗体滴度的影响。

将照实施例1中方法制得的佐剂分别于流感灭活全病毒疫苗小鼠腹腔注射抗原免疫前后不同时间点进行相近部位的腹腔注射，观察小鼠免疫抗体滴度变化。结果显示在抗原接种前24小时至抗原接种后1小时这一时间范围内，脂质微球乳化液型佐剂均能发挥良好的佐剂效应，实验动物体内产生较高水平的IL-2、IL-4、IL-5、IL-6四型细胞因子。而在脂质微球乳化液型佐剂注射24小时以上再接种抗原，或是在抗原注射后24小时以上再注射佐剂，则不能产生理想的抗体滴度，且只激活低水平的IL-5、IL-6。这一结果说明脂质微球乳化液型佐剂本身可以刺激激活免疫系统，提高机体免疫系统对抗原的应答反应强度，产生增强免疫的作用，这种激活作用可以持续24小时。

实施例14：

脂质微球乳化液型佐剂的佐剂效应强度及局部不良反应试验。

实施例1中脂质微球乳化液型佐剂、氢氧化铝佐剂及MF59分别与流感灭活全病毒疫苗按照体积比1∶1的比例混合制成疫苗佐剂组合物，组合物中血凝素浓度为15μg·mL-1，每剂0.5mL。另取血凝素浓度15μg·mL-1的灭活全病毒疫苗作为对照。分别将等体积上述三种疫苗佐剂组合物及对照疫苗小鼠肌内注射免疫接种，免疫接种后不同时间检测在小鼠体内产生的血凝素抗体滴度。观察小鼠免疫接种后的局部不良反应情况。具体的血清抗体稀释度检测结果见表1。结果表明，本发明脂质微球乳化液型佐剂可以显著提高机体对流感灭活全病毒疫苗的免疫应答水平。脂质微球乳化液型佐剂对流感疫苗的佐剂效应与MF59基本相当，高于氢氧化铝佐剂，三者均高于不加佐剂的疫苗。氢氧化铝佐剂实验组部位小鼠注射局部出现红肿，硬结，有搔扒现象。脂质微球乳化液型佐剂组及MF59组未观察到局部不良反应。

实施例15：

脂质微球乳化液型佐剂对不同形式流感疫苗的佐剂作用。

分别将实施例1中方法制备的脂质微球乳化液型佐剂与流感灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗组成血凝素浓度为7.5μg·mL-1的疫苗佐剂组合物。以上述两种疫苗佐剂组合物及同样血凝素浓度的两种不含佐剂疫苗腹腔接种免疫小鼠，于免疫后不同时间测定小鼠体内产生的血凝素抗体滴度，血清抗体稀释度结果见表2。结果显示本发明的脂质微球乳化液型佐剂对流感的灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗均有良好的佐剂作用。表明脂质微球乳化液型佐剂可以提高机体对一般认为免疫原性较弱的裂解、纯化、亚单位疫苗的免疫应答反应强度。

实施例16：

将按照实施例2中方法制得的脂质微球乳化液型佐剂与流感灭活全病毒疫苗以2∶1、1∶1、1∶2、1∶4等不同比例混合组成疫苗佐剂组合物，其中的血凝素浓度均为7.5μg·mL-1，每剂0.5mL。以上述疫苗佐剂组合物对小鼠腹腔注射接种。与接种后不同时间测定在小鼠体内产生的血凝素抗体滴度，结果见表3。结果表明，提高疫苗佐剂组合物中佐剂比例，可以增强定量抗原产生的免疫应答水平，佐剂剂量与佐剂作用强度正相关。

实施例17：

不同血凝素浓度的疫苗及佐剂疫苗对细胞免疫应答强度的影响

将按照实施例3中方法制得的脂质微球乳化液型乳剂佐剂与流感灭活全病毒疫苗组成血凝素浓度为0.5μg·mL-1和5.0μg·mL-1的疫苗佐剂组合物，每剂均为0.5mL。以上述两种疫苗佐剂组合物及同样血凝素浓度的两种不含佐剂疫苗经腹腔接种免疫小鼠，于免疫后不同时间测定小鼠体内产生的血清抗体稀释度，结果见附图九。结果表明，本发明的脂质微球乳化液型乳剂型佐剂对流感灭活全病毒疫苗具有良好的佐剂作用，与相同血凝素浓度的不含佐剂疫苗相比，佐剂疫苗能够明显提高小鼠体内免疫应答强度。

实施例18：

本发明脂质微球乳化液与MF59、AS03引起免疫反应的部分作用机理(局部致炎作用)

为观察MF59、AS03与本发明的脂质微球乳化液这三种不同乳剂型疫苗佐剂所引发的免疫反应，将鸡卵白蛋白(OVA)或细胞培养物上生长的流感病毒，或重组基因表达，合成的免疫原性组合物作为抗原与三种乳剂型疫苗佐剂混合制成佐剂疫苗组合物。将上述佐剂疫苗组合物经小鼠肌内注射接种免疫。于免疫后不同时间点取血清测量抗鸡卵白蛋白的抗体效价及IgG亚型。同时，为观察三种乳剂型疫苗佐剂引起细胞死亡的情况，将小鼠注射部位组织切片，以H&E、TUNEL两种方法对切片组织进行染色，观察三种乳剂型疫苗佐剂在体内引起的炎症反应及细胞死亡情况。结果显示，与不加佐剂的单纯流感病毒抗原相比，三种乳剂型疫苗佐剂均能提高小鼠体内免疫应答强度，产生更高的抗HA抗体水平。局部组织切片观察显示，三种乳剂型疫苗佐剂均能同时造成细胞的凋亡、坏死。根据以上结果，本发明脂质微球乳化液增强免疫的佐剂作用途径之一应与MF59及AS03相类似，是以引起注射部位组织细胞凋亡坏死，造成轻微炎症反应来达到激活免疫系统，提高免疫应答强度的目的。

实施例19：

抗原递呈细胞吞噬抗原的机制及佐剂与佐剂造成的死亡细胞对抗原吞噬量的影响。

以小鼠的巨噬细胞株RAW264.7作为抗原递呈细胞，以鸡卵白蛋白(OVA)或细胞培养物上生长的流感病毒，或重组基因表达，合成的免疫原性组合物作为抗原进行体外细胞实验，探讨抗原递呈细胞摄取佐剂所含抗原的主要机制，以及抗原递呈细胞对所摄入抗原的处理方式。同时考察脂质微球乳化液佐剂及由佐剂造成的死亡细胞对抗原递呈细胞吞噬抗原量的影响。分别以布雷菲德菌素A(brefeldin A)、阿米洛利(amiloride)及细胞松弛素B(cytochalasinB)三种抑制剂抑制抗原递呈细胞的内吞作用(endocytosis)、巨胞饮(macropinocytosis)、吞噬作用(phagocytosis)，探讨抗原递呈细胞吞噬抗原的机制。结果显示，佐剂所含抗原是通过巨胞饮及吞噬作用进入抗原递呈细胞内的。佐剂及佐剂造成的死亡细胞可以增加RAW264.7细胞吞噬抗原的量。同时，通过细胞器染色的方法探讨佐剂所含抗原在抗原递呈细胞内处理的过程。在抗原递呈细胞内，抗原被溶酶体、内皮系统、高尔基等细胞器分解成肽片段。

实施例20：

脂质微球乳化液佐剂对树突细胞吞噬抗原及进入成熟期的作用。

将以本发明脂质微球乳化液佐剂处理过的EL4小鼠淋巴瘤细胞与树突细胞共同培养，观察树突细胞对佐剂造成的死亡细胞的吞噬情况，同时考察吞噬死亡细胞后树突细胞的成熟及活化情况。结果表明，本发明脂质微球乳化液佐剂处理过的EL4细胞可被树突细胞所吞噬，造成树突细胞的MHC class II、CD40、CD80、CD86等表面共刺激分子的表达，促使树突状细胞进入成熟期。该结果显示，脂质微球乳化液佐剂造成的细胞死亡在疫苗引起的免疫反应上扮演重要的角色，是其发挥佐剂效用的一个重要途径。

实施例21

脂质微球乳化液佐剂疫苗对淋巴结细胞的影响

树突状细胞在未成熟期可吞噬抗原，吞噬抗原后则进入成熟期，成熟期的树突状细胞可将抗原递呈给下游的淋巴细胞。为了考察本发明的脂质微球乳化液型佐剂对淋巴结细胞的影响，将按照实施例5中的方法制得的脂质微球乳化液佐剂经肺部灌注接种免疫小鼠，于7天后将小鼠的淋巴结取出，再用氚标记胸腺嘧啶核苷(methyl-[3H]thymidine)标定，以观察淋巴结T细胞的增生情形；同时以ELISPOT的方法来观察经脂质微球乳化液型疫苗佐剂处理后的小鼠淋巴结B细胞是否会产生HA抗体。结果表明，打入脂质微球乳化液型疫苗佐剂会造成小鼠淋巴结T细胞增生，并造成淋巴结B细胞产生HA抗体。

实施例22

本发明脂质微球乳化液与MF59、AS03佐剂疫苗对细胞免疫反应的影响

为观察MF59、AS03与本发明的脂质微球乳化液这三种不同乳剂型疫苗佐剂是否能够引起细胞免疫反应。将流感全病毒灭活疫苗作为抗原与三种乳剂型疫苗佐剂混合制成佐剂疫苗组合物，将上述佐剂疫苗组合物经小鼠皮下注射接种免疫。因为毒杀细胞毒杀标的细胞时会产生粒酶B(granzyme B)，因此，我们通过观察小鼠脾脏T细胞的细胞毒杀情形，同时利用一种会对H A引起MHCclass I反应的B3Z T细胞，在活体外观察乳剂型疫苗佐剂是否会引起细胞免疫。结果表明，除了本发明的脂质微球乳化液外，MF59与AS03之乳剂型疫苗佐剂并无产生明显的细胞毒杀作用，在体外实验中，也没有造成B3Z T细胞的活化。因此，本发明的脂质微球乳化液与MF59和AS03相比，能够引起显著的细胞免疫反应。

实施例23

安全性实验

1.血管刺激性试验

将实施例1和实施例2于家兔耳静脉注射给药，每日一次，连续给药3天。结果：家兔耳静脉给药部位肉眼观察无明显变化；组织病理切片显微镜检显示距注射部位1cm处血管、5cm处血管内皮连续、完整，未见增生、肿胀；血管周围组织未见炎性细胞浸润及坏死；管腔内无血栓形成。显示本品对家兔耳静脉血管未见明显刺激作用。

2.溶血与凝聚试验

采用常规体外试管法(肉眼观察法)，将本品与2％红细胞混悬液混合，3小时内未见溶血与红细胞凝聚现象。

3.肌肉刺激性试验

实施例1和实施例2，用于家兔股四头肌注射给药，每侧给药1mL。48小时后取给药部位肉眼观察并作病理组织学检查。结果表明，本品对家兔股四头肌无刺激性。

附表1实施例14中血清抗体稀释度检测结果

附表2实施例15中血清抗体稀释度检测结果

附表3接种后不同时间测定在小鼠体内产生的血凝素抗体滴度结果

Claims (13)

1.一种脂质微球组合物，其特征在于包括有脂质微球乳剂和免疫原性组合物两部分，脂质微球乳剂与免疫原性组合物的比例为10∶1至1∶10之间，其中

脂质微球乳剂重量的1～30％(w/w)为医药级油脂，脂质微球乳剂重量的0.1～10％(w/w)为两性离子/非离子表面活性剂组合，脂质微球乳剂重量的0.01～5％(w/w)为稳定剂，余量为水性溶液；

免疫原性组合物是单价至多价，通常为3价组合物，其中包含来自一种或一种以上与大流行流感爆发相关或具有与大流行流感爆发相关的流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂。

2.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于所述脂质微球乳剂为外观带有淡蓝色乳光或乳白状液体并均匀分散于水性介质中，平均粒径为50～500nm。

3.权利要求2所述的脂质微球组合物，其特征在于所述的液体，进一步通过固化技术，制成干燥的粉末或块状的脂质微球乳剂，临用前用水性溶液复性瞬即形成乳化液，平均粒径为50～500nm。

4.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于

所述医药级油脂为：至少为经过精制的植物油和动物油、天然或人工修饰/全合成的油中的一种，优选大豆油、中链甘油三酯、橄榄油、维生素E中的1种或2种以上的特征组合；

所述两性离子/非离子表面活性剂组合，包含天然或人工修饰/全合成的，优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂及其衍生物、天然的D(L)-维生素E琥珀酸脂聚乙二醇衍生物(TPGS)、聚乙二醇660-12-羟基硬脂酸酯(HS-15)、Poloxamer(188)、聚山梨酯类(Tween-80)的1种或2种以上的特征组合；

所述稳定剂，优选油酸、胆酸或脱氧胆酸及其钠盐，甘胆酸钠中的1种或2种以上的特征组合；

所述水性溶液，是免疫原性组合物溶液，或纯化水、注射用水、甘油水溶液、缓冲盐水溶液的1种或2种以上的组合，或临床上可用的输液。

5.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于含有下列所述a～d中的一种或2种以上的特征组合：

a、乳化液渗透压在200m Osm/kg-400m Osm/kg之间，优选240-360mOsm/kg之间；

b、pH为3～10，优选pH为5～8；

c、脂质微球的平均粒径在50～500nm之间，优选100～300nm之间；

d、含有单糖、二糖及多糖、甘露醇作为固化脂质微球工艺过程的保护剂，优选二糖。

6.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于所述免疫原性组合物包含来自至少三种季节性流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂，并且任选包含至少一种与大流行流感爆发相关或具有与大流行流感爆发相关的流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂。

7.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于所述大流行流感病毒株选自

人类流感病毒中A、B、C型，包含H1N1，H2N2，H3N2，H5N1，H7N7，H1N2，H9N2，H7N3，H10N7；

猪型流感病毒H1N1，H1N2，H3N1，H3N2；

以及狗或马型流感病毒H7N7，H3N8；

或禽流感病毒H5N1，H7N2，H1N7，H7N3，H13N6，H5N9，H11N6，H3N8，H9N2，H5N2，H4N8，H10N7，H2N2，H8N4，H14N5，H6N5和H12N5中的一种或一种以上的流感病毒组合。

8.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于所述流感病毒抗原或其抗原性制剂来自于在卵(鸡胚)或细胞培养物上生长的流感病毒，或重组基因表达，合成的免疫原性组合物：包括完整病毒、裂解病毒、病毒体或选自HA，NA，M1，M2的一种或多种纯化的抗原。

9.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于所述的抗原包括但不限于人类抗原，非人类动物抗原，植物抗原，细菌抗原，真菌抗原，病毒抗原，寄生虫抗原或是癌肿抗原。

10.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于所述病毒抗原或抗原性制剂是每种流感病毒株每个人用剂量15μg或少于15μg HA，优选每剂2～7.5μg HA。

11.根据权利要求1所述的脂质微球组合物，其特征在于所述免疫原组合物可独立包装，也可与乳化液混合后包装或混合后进一步固化得到干燥的脂质微球组合物。

12.权利要求1所述的脂质微球组合物的用途，其特征在于含有免疫原性组合物的脂质微球组合物的用途为作为疫苗的输送系统使用，包括静脉注射、脊椎腔注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、经呼吸道喷入或吸入、腹腔给药、经鼻给药、经眼给药、经口给药、直肠给药、阴道给药、局部给药、透皮给药。

13.根据权利要求12所述的脂质微球组合物，其特征在于所述疫苗的输送系统，临床用于预防人类宿主或人群的季节性或大流行流感感染之一或这两者，所述人类宿主或人群年龄为65岁或以上的老年人、年龄为0～18岁的儿童及青少年，以及年龄为18岁以上的成年人。

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