CN104208664A - 一种鼻用疫苗组合物液体制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼻用疫苗组合物液体制剂及其制备方法。所述鼻用疫苗组合物液体制剂包括如下原料组分：（1）0.002～0.2%抗原；（2）0.1～15%油相；（3）70～99.7%水相；和（4）0.1～15%表面活性剂；所述百分比表示各组分在每100mL原料总体积中的克数。所述制备方法包括如下步骤：（1）将油相和表面活性剂混合，再与水相混合，得佐剂；（2）将步骤（1）制得的佐剂与抗原混合均匀，即得。本发明的鼻用疫苗组合物液体制剂为经鼻黏膜免疫，其制备方法简单，稳定性高，实际应用过程中操作便捷，能大幅提高接种率，具有非常好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药剂领域，具体涉及一种鼻用疫苗组合物液体制剂及其制备方法。
背景技术
疫苗是预防和治疗病毒感染类疾病最为经济有效的手段。以流感疫苗为例，在发达国家，如果流感疫苗的抗原和正在流行的流感病毒匹配良好，就能够保护70-90%的健康成人免于出现临床疾病。目前，国内主要的免疫手段仍然是传统的注射接种，但是肌肉注射的给药方式存在诸多缺陷，包括注射接种不便、明显的疼痛感（尤其对于婴幼儿和儿童）、注射可能存在的不安全因素等。
口服流感疫苗需克服胃肠道的酸性环境，将敏感的抗原蛋白完整递送至胃肠道黏膜上的微褶细胞（M细胞）。由于胃肠道环境的不适宜及流感抗原蛋白的不稳定性，口服流感疫苗的研究鲜有突破。
鼻喷雾流感疫苗的出现改善了肌注免疫因疼痛感造成的患者顺应性差，并且避免了肌肉注射可能引起的血液感染或疾病传播风险。
专利文献CN1562364A公开了一种含脂肪乳佐剂的鼻用流感疫苗，制剂制备过程需要经历高速搅拌和纳米对撞过程，即通过高速搅拌，混匀流感全病毒悬液与纳米化脂肪乳悬液；通过纳米对撞，使流感病毒脂肪乳混合液裂解为10-12nm微粒。其制备过程控制难度高，且易导致抗原效价降低。
专利文献CN101405027A公开了一种包含流感病毒重构包膜的流感病毒颗粒组合物，而无单独添加的佐剂，用于经鼻免疫；其制备工艺复杂，难以应用于大生产。
因此，为了提高免疫接种的便捷性，降低医护人员的人力成本；避免肌肉注射可能引起的血液感染或疾病传播风险，减少此类原因造成的医疗支出，同时提升接种者的依从性，提高目标人群的接种率，降低疾病的发生概率和死亡率，本领域目前迫切需要发展制备过程更简单、效果更好的鼻用疫苗制剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有的鼻用疫苗制剂制备繁琐、稳定性差的缺陷，而提供一种鼻用疫苗组合物液体制剂。其适用于不同年龄人群、动物的免疫接种，提高免疫系统的黏膜应答和系统应答，改善接种者顺应性。本发明的鼻用疫苗组合物液体制剂，其制备过程不需高压均质或纳米裂解，简化了生产步骤，提高了产品的稳定性。
本发明提供的技术方案之一是：一种鼻用疫苗组合物液体制剂，其包括如下原料组分：
（1）0.002～0.2%抗原；
（2）0.1～15%油相；
（3）70～99.7%水相；和
（4）0.1～15%表面活性剂；
所述百分比表示各组分在每100mL原料总体积中的克数。
在本发明中，如0.1%油相表示在每100mL原料总体积中油相组分的质量为0.1g。
较佳地，所述的鼻用疫苗组合物液体制剂包括如下原料组分：
（1）0.02～0.1%抗原；
（2）0.2～8%油相；
（3）85～99.5%水相；和
（4）0.2～8%表面活性剂；
所述百分比表示各组分在每100mL原料总体积中的克数。
更佳地，所述的鼻用疫苗组合物液体制剂包括如下原料组分：
（1）0.03～0.1%抗原；
（2）0.5～5%油相；
（3）90～98%水相；和
（4）0.5～5%表面活性剂；
所述百分比表示各组分在每100mL原料总体积中的克数。
本发明中，所述抗原可以为本领域常规所述的各类抗原。
从抗原的种类而言，所述抗原可以包括但不局限于流感病毒抗原、SARS病毒抗原、麻疹病毒抗原、人乳头瘤状病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、狂犬病毒抗原以及脊髓灰质炎病毒抗原，更优选流感病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原和破伤风病毒抗原中的任一种；所述的流感病毒抗原包括季节性流感病毒抗原和大流行性流感病毒抗原（如流感病毒抗原H1、H2、H3、H5、H7、H9、B亚型以及HA、NA、M1、M2亚单位抗原等）。
从抗原的来源而言，所述抗原可以包含一种或多种不同来源，即抗原可源自一种或多种不同的病原体或不同的病原体血清型。
从抗原的存在形式和制备方法而言，所述抗原可以为灭活疫苗、减活疫苗、裂解疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗和多肽蛋白疫苗中的一种或多种。
本发明中，所述油相为本领域常规所述油相，较佳地，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷、中链甘油三酸酯、鱼油、橄榄油和大豆油中的一种或多种，更优选角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种。
本发明中，所述水相为本领域常规所述水相，较佳地，所述水相为水，更佳地，所述水相为注射用水。
本发明中，所述表面活性剂为本领域常规所述表面活性剂，较佳地，所述表面活性剂选自吐温、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯（Solutol HS15）、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯（Solutol HS15）和磷脂的混合物，以及吐温与磷脂的混合物中的一种或多种。
所述磷脂为本领域常规，优选可药用的天然磷脂或合成磷脂，或磷脂的衍生物，更优选自大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂和氢化大豆磷脂中的一种或多种。
本发明中，较佳地，所述的原料组分还包括不超过2%的缓冲剂，更优选0.5～1.5%，所述的百分比表示缓冲剂在每100mL原料总体积中的质量（g）。所述缓冲剂较佳地选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、枸橼酸、磷酸盐和醋酸盐中的一种或多种。
本发明中，较佳地，所述的原料组分还包括不超过0.01%的防腐剂，更优选0.005～0.01%，所述的百分比表示防腐剂在每100mL原料总体积中的质量（g）。所述防腐剂较佳地选自硫柳汞、苯扎氯氨、苯酚、苄索氯铵和2-苯氧乙醇中的一种或多种。
本发明中，较佳地，所述的原料组分还包括不超过0.2%的等渗调节剂，更优选0.05～0.15%，所述的百分比表示等渗调节剂在每100mL原料总体积中的质量（g）。所述等渗调节剂较佳地选自甘油、氯化钠和葡萄糖中的一种或多种。
本发明中，所述鼻用疫苗组合物液体制剂的规格可以为本领域常规，较佳地为0.05～0.3ml/剂。
本发明的鼻用疫苗组合物液体制剂的制备方法同本领域常规，其只需要将油相和表面活性剂混合，搅拌并加入水相，得到带乳光的溶液后加入抗原混匀即可。所述鼻用疫苗组合物液体制剂以液体形式存在，灌装于本领域常规的给药装置（如常规的鼻喷雾装置）中，做鼻喷雾剂备用。
较佳地，所述的鼻用疫苗组合物液体制剂的制备方法包括如下步骤：
（1）将油相和表面活性剂混合，再与水相混合，得佐剂；
（2）将步骤（1）制得的佐剂与抗原混合均匀，即得。
其中，所述油相、表面活性剂和水相的用量如前所述。
在本发明中，在步骤（2）之后较佳地还包括步骤（3）：将步骤（2）所得的混合物过滤后分装，然后低温保存，优选于2～8℃保存。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的鼻用疫苗组合物液体制剂为经鼻黏膜免疫，可同时诱导包括体液免疫和细胞免疫在内的系统免疫应答和黏膜免疫应答；经由呼吸道黏膜入侵人体而引发疾病的病原体在感染部位即时得到有效抵抗；可通过共同黏膜免疫系统引起消化道和生殖道的远端黏膜免疫应答；可使抗原经黏膜特有的褶皱细胞（M细胞）转运至树突状细胞（DC）等抗原提呈细胞（APC），提高APC对抗原的摄取和提呈能力。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
称取角鲨烯1g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS151.5g，蛋黄卵磷脂0.5g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取枸橼酸2g，硫柳汞0.01g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将上述水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入7500μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例2
称取角鲨烯4g，中链甘油三酸酯4g，Solutol HS156g，蛋黄卵磷脂2g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取磷酸二氢钾0.2g，苯酚0.01g，加入60mL注射用水中；在搅拌下，将上述水溶液慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入50000μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入0.01g氯化钠，调节为鼻腔黏液等渗溶液搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即100μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例3
称取角鲨烯3g，中链甘油三酸酯7g，Solutol HS1515g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取苯扎氯胺0.016g，加入60mL注射用水中；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入30000μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.05ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例4
称取角鲨烷0.5g，中链甘油三酸酯0.5g，Solutol HS153g，大豆磷脂1g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取枸橼酸0.3g，苄索氯铵0.004g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入30000μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入0.2甘油，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.05ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例5
称取角鲨烯0.2g，中链甘油三酸酯0.2g，Solutol HS150.5g，氢化卵磷脂0.1g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取磷酸二氢钾1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入7500μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入0.1g葡萄糖，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例6
称取角鲨烯2g，中链甘油三酸酯2g，Solutol HS154.5g，氢化大豆磷脂0.5g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取枸橼酸1g，苯酚0.01g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入25000μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入0.05g甘油，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即50μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例7
称取角鲨烯5g，中链甘油三酸酯10g，吐温8012g，蛋黄卵磷脂3g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取HEPES1g，苄索氯胺0.002g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入250μg重组乙型肝炎疫苗（由酿酒酵母表达并纯化）加水至100mL；加入0.2g葡萄糖，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即5μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例8
称取中链甘油三酸酯0.1g，吐温800.075g，卵磷脂0.025g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；量取60mL注射用水，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液，加入20000IU破伤风疫苗，加水至100mL；加入0.1g氯化钠，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即40IU/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例9
称取角鲨烯1g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS152g，卵磷脂0.5g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取枸橼酸0.1g，加入60mL注射用水中；在搅拌下，将无菌注射用水缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入11250μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入0.05g甘油，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.3ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例10
称取角鲨烯2.5g，中链甘油三酸酯2.5g，Solutol HS154g，蛋黄卵磷脂1g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取HEPES0.2g，硫柳汞1g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入15000μg HA的流感抗原（A/California/7/2009），加水至100mL；加入0.01g氯化钠，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.1ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例11
称取角鲨烯0.5g，中链甘油三酸酯0.5g，Solutol HS152g，蛋黄卵磷脂0.5g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取枸橼酸0.2g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入25000μg HA的流感抗原（A/California/7/2009），加水至100mL，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.1ml/剂（即25μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例12
称取角鲨烯0.5g，Solutol HS154g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取磷酸二氢钾2g，硫柳汞0.002g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入10000μg HA的流感抗原（A/California/7/2009），加水至100mL；加入0.15g甘油，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即20μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例13
称取角鲨烯0.3g，Solutol HS152g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取枸橼酸0.5g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入25000μg HA的流感抗原（A/California/7/2009），加水至100mL；加入0.05g氯化钠，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即50μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例14
称取角鲨烯0.2g，Solutol HS150.4g，蛋黄卵磷脂0.1g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取HEPES0.8g，2-苯氧乙醇0.006g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入250μg重组乙型肝炎疫苗（由酿酒酵母表达并纯化）加水至100mL；加入0.1g氯化钠，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即5μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例15
称取角鲨烯3g，中链甘油三酸酯5g，吐温806g，蛋黄卵磷脂2g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取HEPES1.5g，苯酚0.005g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液，加入30000IU破伤风疫苗，加水至100mL；加入0.12g葡萄糖，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即60IU/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例16
称取角鲨烯5g，中链甘油三酸酯10g，Solutol HS1511g，蛋黄卵磷脂4g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取HEPES0.5g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将无菌注射用水缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入7500μg HA的流感抗原（A/Perth/16/2009），加水至100mL；加入0.08g甘油，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例17
称取中链甘油三酸酯0.1g，Solutol HS150.15g，蛋黄卵磷脂0.05g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取磷酸二氢钾0.5g，苄索氯铵0.008g，加入60mL注射用水中；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入7500μg HA的流感抗原（A/Perth/16/2009），加水至100mL，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.1ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例18
称取中链甘油三酸酯5g，Solutol HS157g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；量取60mL注射用水，用氢氧化钠溶液调节pH至7；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入30000μg HA的流感抗原（A/Perth/16/2009），加水至100mL；加入0.06甘油，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.05ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例19
称取角鲨烯0.2g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS155g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取2-苯氧乙醇0.018g，加入60mL注射用水，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入45000μg HA的流感抗原（A/Perth/16/2009），加水至100mL，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.1ml/剂（即45μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例20
称取角鲨烯5g，Solutol HS1512g，蛋黄卵磷脂3g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取磷酸二氢钾1.5g，2-苯氧乙醇0.002g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入2500μg重组乙型肝炎疫苗（由酿酒酵母表达并纯化）加水至100mL；加入0.1g葡萄糖，调节为鼻腔黏液渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即50μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例21
称取鱼油1g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS151.5g，蛋黄卵磷脂0.5g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取甘油2g，枸橼酸2g，硫柳汞0.01g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，；在搅拌下，将无菌注射用水缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入7500μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例22
称取大豆油4g，中链甘油三酸酯4g，Solutol HS156g，蛋黄卵磷脂2g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取磷酸二氢钾0.2g，苯酚0.01g，加入60mL注射用水中，搅拌，；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入15000μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入0.2g氯化钠，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.1ml/剂（即15μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例23
称取鱼油3g，中链甘油三酸酯5g，吐温806g，蛋黄卵磷脂2g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取HEPES1.5g，苯酚0.005g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液，加入30000IU破伤风疫苗，加水至100mL；加入0.1g葡萄糖，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即60IU/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例24
称取大豆油0.5g，中链甘油三酸酯0.5g，Solutol HS153g，大豆磷脂1g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取枸橼酸0.3g，苄索氯铵0.004g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入22500μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入0.05g甘油，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即45μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
实施例25
称取橄榄油0.2g，Solutol HS150.4g，蛋黄卵磷脂0.1g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取HEPES0.8g，苯扎氯胺0.006g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入250μg重组乙型肝炎疫苗（由酿酒酵母表达并纯化）加水至100mL；加入0.01g氯化钠，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照0.2ml/剂（即10μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
效果实施例1本发明液体制剂的粒径测定
将实施例1-25制备的鼻用疫苗组合物液体制剂以注射用水作适当稀释，采用Malvern Nano-ZS90动态光散射粒径电位测定仪测定其粒径。结果记录与表1中：
表1液体制剂粒径测定结果
由表1的结果可知，所制得的疫苗组合物液体制剂粒径在20-100nm范围内，适用于经鼻给药。
效果实施例2鼻用疫苗组合物液体制剂的动物体内试验I
本效果实施例取专利200410021296.1中公开的鼻腔喷雾流感疫苗与本发明流感疫苗组合物液体制剂进行动物体内试验效果的比较。
疫苗原液：流感裂解疫苗（B/Brisbane/60/2008），血凝素（HA）浓度为300μg/ml
疫苗配制：
（1）疫苗免疫对照组（即专利200410021296.1中公开的鼻腔喷雾流感疫苗）：专利200410021296.1中实施例4-5公开的鼻腔喷雾流感疫苗的配制，具体如下。
以精制大豆油250g、精制大豆磷脂20g、吐温150g、甘油30g、注射用水加至800ml，制备脂肪乳悬液；与含血凝素9万微克的裂解疫苗（B/Brisbane/60/2008，血凝素浓度为300μg/ml）一起置于纳米对撞机，使流感病毒脂肪乳混合液瞬间裂解为10-12nm微粒，裂解、乳化、分散、催化与合成同步完成，得到微粒悬液。
（2）单纯疫苗对照组：以生理盐水将疫苗溶液稀释至适当浓度，作为单纯疫苗免疫组。
（3）本发明鼻用疫苗组合物液体制剂：取实施例1制备的疫苗组合物调整规格为4μg/10μl/剂。即称取角鲨烯1g，中链甘油三酸酯1g，Solutol HS151.5g，蛋黄卵磷脂0.5g，搅拌，得到油相；称取枸橼酸2g，硫柳汞0.01g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7作为水溶液；在搅拌下，将无菌注射用水缓慢加入油相中，得到带乳光的溶液；加入40000μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入适量甘油，使与鼻腔黏液等渗；搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照10μl/剂（即4μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。用于动物体内免疫研究。
动物免疫方案：
将24只6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只，鼻喷雾给药。
方案如下：
第1组：单纯疫苗对照组，单纯给予同体积流感疫苗，4μg HA/只；
第2组：本发明鼻用疫苗组合物液体制剂组，4μg HA/只；
第3组：疫苗免疫对照组，4μg HA/只；
第4组：空白对照组，单纯给予不含疫苗的组合物。
免疫效果检测：
免疫后第14天、28天，小鼠眼眶取血，分离血清；第28天冲洗气管、鼻咽部和鼻腔，得到黏膜洗液。通过HI试验，测定血清中的血凝抑制滴度。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG和黏膜IgA滴度。结果如下（见表2和表3）：
表2HI试验结果
表3ELISA试验结果
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p<0.05。从统计分析可知，本发明免疫组合物流感疫苗在小鼠体内诱导产生的免疫应答水平优于对照组。
效果实施例3鼻用疫苗组合物液体制剂的动物体内试验II
本效果实施例将含自制MF59佐剂的鼻腔喷雾流感疫苗组合物与本发明的流感疫苗组合物液体制剂进行动物体内试验的效果比较。
疫苗原液：流感裂解疫苗（B/Brisbane/60/2008），血凝素浓度为300μg/ml
疫苗配制：
（1）含自制MF59免疫组合物组：含自制MF59佐剂的鼻腔喷雾流感疫苗组合物的配制（MF59佐剂根据文献Seubert A,Monaci E,Pizza M,et al.The adjuvants aluminum hydroxide and MF59induce monocyte and granulocytechemoattractants and enhance monocyte differentiation toward dendritic cells[J].J Immunol,2008,180(8):5402-5412.公布的配方进行配制），具体如下：
称取角鲨烯4.3g，吐温800.5g，司盘850.5g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；量取60mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH6.5，10mM）60mL；在搅拌下，将缓冲液缓慢加入油相中，进行高压均质，得到平均粒径为157nm的乳剂；加入一定量流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL，搅匀；按照10μl/剂（即4μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得含MF59的疫苗组合物。
（2）单纯疫苗对照组：流感裂解疫苗（B/Brisbane/60/2008），血凝素（HA）浓度为300μg/ml。以生理盐水将疫苗溶液稀释至适当浓度，作为单纯疫苗免疫组。
（3）本发明鼻用疫苗组合物液体制剂：取实施例2制备的疫苗组合物，调整规格为4μg/10μl。称取角鲨烯4g，中链甘油三酸酯4g，Solutol HS156g，蛋黄卵磷脂2g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取磷酸二氢钾0.2g，苯酚0.01g，加入60mL注射用水中；在搅拌下，将上述水溶液慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入4000μg HA的流感抗原（B/Brisbane/60/2008），加水至100mL；加入0.01g氯化钠，调节为鼻腔黏液等渗溶液搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照10μl/剂（即40μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
动物免疫方案：
将24只6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只，鼻喷雾给药。
方案如下：
第1组：单纯疫苗对照组，单纯给予同体积流感疫苗，4μg HA/只；
第2组：含自制MF59免疫组合物组，4μg HA/只；
第3组：本发明鼻用疫苗组合物液体制剂组，4μg HA/只；
第4组：空白对照组，单纯给予不含疫苗的组合物。
免疫效果检测：
免疫后第14天、28天，小鼠眼眶取血，分离血清；第28天冲洗气管、鼻咽部和鼻腔，得到黏膜洗液。通过HI试验，测定血清中的血凝抑制滴度。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG和黏膜IgA滴度。结果如下（见表4和表5）：
表4HI试验结果
表5ELISA试验结果
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p<0.05。从统计分析可知，本发明免疫组合物流感疫苗在小鼠体内诱导产生的免疫应答水平优于对照组。
效果实施例4鼻用疫苗组合物液体制剂的动物体内试验III
本效果实施例对乙型肝炎疫苗组合物以本发明的液体制剂形式进行动物体内的免疫试验研究。
疫苗原液：重组乙肝疫苗（由酵母表达并纯化），浓度为180μg/ml。
疫苗配制：
（1）单纯疫苗对照组：取重组乙肝疫苗（由酵母表达并纯化），用生理盐水稀释为5μg/10μl；
（2）本发明鼻用疫苗组合物液体制剂组：按照实施例7的方法，调整规格。即称取角鲨烯5g，中链甘油三酸酯10g，吐温8012g，蛋黄卵磷脂3g，搅拌，得到油相/表面活性剂混合物；称取HEPES1g，苄索氯胺0.002g，加入60mL注射用水中，搅拌使溶解；在搅拌下，将水溶液缓慢加入油相/表面活性剂混合物中，得到带乳光的溶液；加入一定量重组乙型肝炎疫苗（由酿酒酵母表达并纯化）加水至100mL；加入0.2g葡萄糖，调节为鼻腔黏液等渗溶液，搅匀，0.22μm滤膜滤过；按照10μl/剂（即5μg/剂）灌装于鼻用喷雾剂装置中，即得疫苗组合物。
（3）空白对照组：10μl生理盐水。
动物免疫方案：
将24只6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只，鼻喷雾给药。
方案如下：
第1组：单纯疫苗对照组，单纯给予乙肝疫苗，5μg/只；
第2组：本发明鼻用疫苗组合物液体制剂组，5μg只；
第3组：空白对照组，单纯给予同体积生理盐水。
免疫效果检测：
初次免疫后第2、4、6、8周，小鼠眼眶取血，分离血清。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表（见表6）：
表6重组乙肝免疫组合物液体制剂的ELISA实验结果
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p<0.05。从数据分析可知，本组合物能使抗体滴度显著增加，显著高于单纯疫苗对照组。
效果实施例5鼻用疫苗组合物液体制剂的动物体内试验IV
本效果实施例将破伤风病毒疫苗以本发明鼻用疫苗组合物液体制剂的形式进行动物体内的免疫研究试验。
疫苗原液：200IU/ml破伤风类毒素
疫苗配制：
（1）单纯疫苗对照组：取疫苗原液，用生理盐水稀释为40IU/10μl。
（2）本发明鼻用疫苗组合物液体制剂组：按照实施例8，将制剂调整规格为40IU/10μl。
（3）空白对照组：取等体积生理盐水。
动物免疫方案：
将24只6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只，鼻喷雾给药。
方案如下：
第1组：单纯疫苗对照组，单纯给予破伤风类毒素，40IU/只；
第2组：本发明鼻用疫苗组合物液体制剂组，40IU/只；
第3组：空白对照组，单纯给予等体积生理盐水。
免疫效果检测：
免疫后第28天，小鼠眼眶取血，分离血清。采用间接ELISA方法，检测血清中的总IgG滴度。结果见下表（见表7）：
表7破伤风疫苗组合物液体制剂的ELISA实验结果
不同组别间的差异采用单因素方差分析进行比较，设定显著性水平为p<0.05。从数据分析可知，本组合物能使抗体滴度显著增加，显著高于单纯疫苗对照组。
Claims (10)
1.一种鼻用疫苗组合物液体制剂，其特征在于，其包括如下原料组分：
（1）0.002～0.2%抗原；
（2）0.1～15%油相；
（3）70～99.7%水相；和
（4）0.1～15%表面活性剂；
所述百分比表示各组分在每100mL原料总体积中的克数。
2.如权利要求1所述的鼻用疫苗组合物液体制剂，其特征在于，所述抗原选自流感病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原和破伤风病毒抗原中的任一种。
3.如权利要求1所述的鼻用疫苗组合物液体制剂，其特征在于，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷、中链甘油三酸酯、鱼油、橄榄油和大豆油中的一种或多种；所述表面活性剂选自吐温、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯和磷脂的混合物以及吐温与磷脂的混合物中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的鼻用疫苗组合物液体制剂，其特征在于，所述油相选自角鲨烯、角鲨烷和中链甘油三酸酯中的一种或多种；所述磷脂选自大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂和氢化大豆磷脂中的一种或多种；所述水相为水。
5.如权利要求1所述的鼻用疫苗组合物液体制剂，其特征在于，所述的原料组分还包括不超过2%的缓冲剂，所述的百分比表示缓冲剂在每100mL原料总体积中的毫克数；所述缓冲剂选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸、枸橼酸和磷酸盐中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的鼻用疫苗组合物液体制剂，其特征在于，所述的原料组分还包括不超过0.01%的防腐剂，所述的百分比表示防腐剂在每100mL原料总体积中的毫克数；所述防腐剂选自硫柳汞、苯扎氯氨、苯酚、苄索氯铵和2-苯氧乙醇中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的鼻用疫苗组合物液体制剂，其特征在于，所述的原料组分还包括不超过0.2%的等渗调节剂，所述的百分比表示等渗调节剂在每100mL原料总体积中的毫克数；所述等渗调节剂选自甘油、氯化钠和葡萄糖中的一种或多种。
8.如权利要求1～7任一项所述的鼻用疫苗组合物液体制剂，其特征在于，所述鼻用疫苗组合物液体制剂的规格为0.05～0.3ml/剂。
9.如权利要求1～7任一项所述的鼻用疫苗组合物液体制剂的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）将油相和表面活性剂混合，再与水相混合，得佐剂；
（2）将步骤（1）制得的佐剂与抗原混合均匀，即得。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）之后还包括步骤（3）：将步骤（2）所得的混合物过滤后分装，然后于2～8℃保存。
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