CN116139266B - 长链不饱和脂肪酸在制备用于灭活疫苗的免疫增强剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链不饱和脂肪酸在制备用于灭活疫苗的免疫增强剂中的用途。本发明提供了花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯在制备用于灭活疫苗的免疫增强剂中的应用。本发明提出了将花生四烯酸作为一种安全、有效的新型免疫增强剂，可使狂犬疫苗等灭活疫苗免疫后，在机体中的抗体效价快速显著提高，增强疫苗保护效果。

Description

长链不饱和脂肪酸在制备用于灭活疫苗的免疫增强剂中的 用途

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体涉及长链不饱和脂肪酸在制备用于灭活疫苗的免疫增强剂中的用途。

背景技术

随着人类社会的发展，人类的生活水平有了极大地提高，但是近年来病原性传染病也有增长趋势，给人类的健康带来极大威胁。就目前而言，接种疫苗仍然是预防和控制传染病的重要方法，可以说疫苗的发展极大地提高了人类的健康水平。

常用的疫苗种类包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗、抗独特型抗体疫苗、核酸疫苗以及近年来新发展起来的多肽疫苗等。其中，灭活疫苗、重组亚单位疫苗以及多肽疫苗都存在蛋白或多肽抗原免疫原性弱，诱导的免疫保护力不足等缺陷。因此，需要加入免疫增强剂（例如，佐剂）来增强人体对抗原的适应性免疫应答强度，包含提升抗体和细胞免疫应答水平等，以诱导有效的免疫保护。并且，有些疫苗接种后抗体效价并不能达到或者不能短时间内达到有效水平，有病原暴露风险的人群还是有较大的健康威胁。因此开发一种能够快速增强抗体产生的制剂，使得疫苗接种后特异性抗体快速产生或者在较少接种次数条件下仍然能够产生有效的保护性抗体很有必要。

花生四烯酸（Arachidonic acid, 简称AA或ARA）是5，8，11，14-二十碳四烯酸，属于ω-6系列的长链多不饱和脂肪酸(或称为长链不饱和脂肪酸)。ARA是哺乳动物体内含量最多、分布最广的多不饱和脂肪酸之一，也是人体一种重要的必需脂肪酸。ARA在体内可通过环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素P450分别调控的三条代谢途径，其代谢产物如前列腺素、血栓素、脂氧素、白三烯、羟基二十碳四烯酸、环氧二十碳四烯酸二醇等广泛参与到器官功能维持、炎症反应、药物代谢等生理过程，因此花生四烯酸一直备受生命科学和医学领域关注。引用文献1公开了花生四烯酸在制备抗HIV疫苗或药物中的应用，具体公开了花生四烯酸通过与HIV gp41 N末端重复序列的结合，抑制HIVgp41六螺旋束结构形成，从而具有抗HIV活性。引用文献2公开了脂质和一氧化二氮组合作为用于增强疫苗功效的佐剂，具体公开了一氧化二氮在免疫应答的刺激中的必需作用，且一氧化二氮与脂肪酸的组合显示对只基于脂肪酸的佐剂的显著差异。然而ARA在作为疫苗的免疫增效剂、增强疫苗接种抗体产生中的作用还是未知的。

引用文献

引用文献1：CN104127400A

引用文献2：CN101123982A

发明内容

发明要解决的问题

针对接种疫苗(尤其是灭活疫苗)后或者接种较少次数后特异性抗体水平较差的问题，虽然引用文献2公开了可以将脂质和一氧化二氮组合作为用于增强疫苗功效的佐剂，然而其也明确教导了发挥功效的为一氧化二氮，且单独的脂肪酸的佐剂效果不理想，并且其采用的是不同脂肪酸的组合。可见，花生四烯酸对于疫苗尤其是灭活疫苗的免疫增强作用仍未知。

本发明提出了花生四烯酸可以作为一种安全、有效、作用广泛的增强灭活疫苗免疫保护效果的免疫增效剂。在一些实施方案中，花生四烯酸可使狂犬病毒灭活疫苗接种一针后就能在体内产生高滴度的保护性抗体，显著提高疫苗的保护性效果，有很好的应用前景。

用于解决问题的方案

在本发明的第一方面中，提供了花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯在制备用于灭活疫苗的免疫增强剂中的应用。

在一些的实施方案中，所述灭活疫苗是细菌灭活疫苗或病毒灭活疫苗。

在一些的实施方案中，所述病毒灭活疫苗是狂犬病毒灭活疫苗或禽流感病毒灭活疫苗。

在一些的实施方案中，所述免疫增强剂在受试者中施用。

在一些的实施方案中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗之前开始施用至所述受试者。

在一些的实施方案中，所述施用的途径为口服、静脉内、皮内、经皮、经鼻、皮下或肛门。

在一些的实施方案中，相对于在施用灭活疫苗之前未施用所述免疫增强剂的受试者，在施用灭活疫苗之前施用所述免疫增强剂的受试者中，产生更高滴度水平的中和抗体、缩短将受试者的组织中的病毒载量清零的时间。

在一些的实施方案中，所述受试者是哺乳动物。

在一些的实施方案中，所述受试者是小鼠、鸡或人。

在本发明的第二方面提供了花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯作为用于灭活疫苗的免疫增强剂的应用。

在本发明的第三方面提供了花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯作为膳食补充剂的用途，所述膳食补充剂可以达到促进抗体产生的效果，尤其在受试者接种疫苗后。

发明的效果

本发明提出了将花生四烯酸作为一种安全、有效的新型免疫增强剂，可使狂犬疫苗等灭活疫苗免疫后，在机体中的抗体效价显著提高，增强疫苗保护效果。

在一些实施方案中，应用花生四烯酸后，采用疫苗免疫受试者，受试者的各项实验数据结果表明，免疫一次即可产生高水平的中和抗体，显著促进了疫苗的效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中的6种长链多不饱和脂肪酸促进抗体产生作用的筛选结果示意图。纵轴表示抗OVA特异性抗体滴度（anti-OVA IgG titer）。

图2A~图2B为本发明实施例2中的不同剂量ARA（图2A）以及提前饲喂时间（图2B）条件的探索的结果示意图。纵轴表示抗OVA特异性抗体滴度（anti-OVA IgG titer）。

图3A~图3D为本发明实施例3中的在实施例2探索好的条件下，验证ARA对狂犬疫苗抗体产生的效果的示意图；其中，图3A为免疫后第一周到第三周中和抗体水平的变化、图3B为实验小鼠临床症状评分、图3C为小鼠体重变化以及图3D为小鼠的存活曲线。图3A纵轴表示病毒中和抗体(virus neutralizing antibodies, VNA)滴度；组别为仅打疫苗组(疫苗)和补充花生四烯酸组(疫苗+ARA)。图3B纵轴表示小鼠体重变化率(Body weight change%)；组别包括不打疫苗组(PBS)、仅打抗犬疫苗组（RABV）和打抗犬疫苗并补充花生四烯酸组（RABV+ARA）；横轴表示感染狂犬病毒后的天数（Days post infection）。图3C纵轴表示小鼠的存活率，组别包括不打疫苗组(PBS)、仅打疫苗组(疫苗)和补充花生四烯酸组(疫苗+ARA)。横轴表示感染狂犬病毒后的天数（Days post infection）。图3D纵轴表示小鼠感染狂犬病毒后的临床症状评分，组别包括不打疫苗组(PBS)、仅打抗犬疫苗组（RABV）和打抗犬疫苗并补充花生四烯酸组（RABV+ARA）；横轴表示感染狂犬病毒后的天数（Days postinfection）。

图4为本发明实施例4中的用狂犬病毒的G蛋白对实验小鼠脑部进行的免疫荧光实验的结果示意图。组别包括不打疫苗组(RABV)、仅打抗犬疫苗组(疫苗+RABV）和打抗犬疫苗并补充花生四烯酸组（疫苗+ARA+RABV）；观察小鼠的脑的部位包括大脑皮层（Cerebralcortex）、脑干（Brain stem）、小脑(Cerebellum)和海马（Hippocampus）。

图5为实施例5中免疫后不同时间各组抗体效价值示意图。纵轴表示抗体的血凝抑制滴度（效价，数值取log2表示）；横轴表示免疫后的天数；组别包括对照组（Control）、每天补充7.2mg组（ARA-7.2mg）和每天补充14.4mg组（ARA-14.4mg）。

具体实施方式

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本说明书中，使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5%、优选为3%、更优选为1%范围以内。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

术语“疫苗”是被施用以产生或人工增加对特定抗原的免疫反应的组合物。

术语“灭活疫苗”是指先对病毒或细菌进行培养，然后用加热或化学剂（通常是β-丙内酯或福尔马林）将其灭活所形成的疫苗。灭活疫苗可由整个病毒或细菌组成。示例性的灭活疫苗包括脊髓灰质炎灭活疫苗、乙型脑炎灭活疫苗、流行性感冒疫苗、禽流感疫苗、狂犬病疫苗、甲肝灭活疫苗、EV71型手足口病疫苗、新型冠状病毒灭活疫苗等。

本文所用的术语“花生四烯酸”是具有以下结构的5,8,11,14-二十碳四烯酸或者其药学或生理学可接受的盐、酯或衍生物：

在本说明书中，术语“药学上可接受的盐”是指化合物的盐形式，其中所述盐是无毒的并包括源自合适的无机及有机酸和碱的此类盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的酸加成盐的非限制性实例包括氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲磺酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐和抗坏血酸盐。合适的药学上可接受的碱加成盐的非限制性实例包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐(被取代和未被取代)、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐和铝盐。药学上可接受的盐的非限制性实例包括衍生自适宜的碱的药学上可接受的盐并包括碱+金属盐、碱土金属盐、铵盐和N⁺(C_1-4烷基)₄盐。药学上可接受的盐可例如使用药物领域中公知的标准程序获得。本领域普通技术人员应认识到，本文所陈述的组分的不同药学上可接受的盐的稳定性和其他性质可能不同并在选择合适的药学上可接受的盐时将考虑这些差异。

在本说明书中，花生四烯酸的“药学上可接受的酯”示例性的包括花生四烯酸的醇酯，或包括花生四烯酸作为其一部分或所有的组成的脂肪酸的甘油三酯、磷脂或糖脂，但不限于此。

在本说明书中，术语“免疫增强剂”是指能够提高动物机体免疫功能的物质，其主要用于增强机体的抗肿瘤作用、抗感染能力，纠正免疫缺陷，其能够激活一种或多种免疫活性细胞，增强机体特异性和非特异性免疫功能，使低下的免疫功能恢复正常，或具有佐剂作用，增强与之合用的抗原的免疫原性，加速诱导免疫应答反应；或替代体内缺乏的免疫活性成分，产生免疫代替作用；或对机体的免疫功能产生双向调节作用，使过高或过低的免疫功能趋于正常。临床上主要用于免疫缺陷疾病、恶性肿瘤的辅助治疗，以及难治性细菌或病毒感染。

用于灭活疫苗的免疫增强剂是指，可以在施用灭活疫苗之前、同时或之后施用，能够提高受试者对于该灭活疫苗免疫应答能力，例如增强免疫原性、增强抗体的滴度、减少疫苗接种次数、促进抗体产生等的免疫增强剂。促进抗体产生具体指产生高滴度水平的中和抗体、有效中和组织中的病毒。

在本说明书中，术语“受试者”是指人(即，任何年龄段的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童或青少年)或成人受试者(例如，年轻人、中年人或老年人))或非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴)、商业相关的哺乳动物(例如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或鸟。非人动物可以是处于任何发育阶段的雄性或雌性。非人动物可以是转基因动物或基因工程化动物。

术语“施用”是指将药物或试剂植入、吸收、摄取、注射、吸入或以其它方式引入受试者体内或受试者上。

术语“药学上可接受的”学或“药理学上可接受的”理是指适当时在施用于动物或人时不产生不利反应，过敏反应或其他不良反应的分子实体及组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包含可以使用作为药学可接受物质之介质的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂及吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。

以下对于本发明的技术方案在进行详细说明。

<花生四烯酸的应用>

在本发明的一些方面中，提供了花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯在制备用于灭活疫苗的免疫增强剂的应用。

在本发明的另一些方面中，提供了花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯作为用于灭活疫苗的免疫增强剂的应用。

在一些具体的实施方案中，花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯是免疫增强剂的唯一活性成分。

在本发明中，对于所述灭活疫苗的种类没有特别的限制，例如，在一些可选的实施方案中，所述灭活疫苗是细菌灭活疫苗。在另一些可选的实施方案中，所述灭活疫苗是病毒灭活疫苗。

在一些具体的实施方案中，所述的病毒灭活疫苗可以是狂犬病毒灭活疫苗、禽流感病毒灭活疫苗、流行性乙型脑炎病毒灭活疫苗、流行性感冒病毒灭活疫苗、甲肝病毒灭活疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗等，但不限于此。

在一些优选的实施方案中，所述的病毒灭活疫苗是狂犬病毒灭活疫苗。在另一些优选的实施方案中，所述的病毒灭活疫苗是禽流感病毒灭活疫苗。

在本发明的一些实施方案中，所述免疫增强剂在受试者中施用。

在一些实施方案中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗之前开始施用至所述受试者。在一些具体的实施方案中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗之前1~20天开始施用至所述受试者。在一些优选的实施方案中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗之前1~15天、1~10天或1~7天开始施用至所述受试者。在一些更优选的实施方案中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗之前2~7天、2~6天、3~5天（例如3天、4天、5天）开始施用至所述受试者。

在本发明中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗之前1~20天开始施用至所述受试者，并持续施用到向受试者施用灭活疫苗；优选持续施用到向受试者施用灭活疫苗后1~30天，优选7~21天，例如7天、14天、21天。

在一些实施方案中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗同时施用至所述受试者。在一些实施方案中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗之后施用至所述受试者。

在一些实施方案中，相对于在施用灭活疫苗之前未施用所述免疫增强剂的受试者，在施用灭活疫苗之前施用所述免疫增强剂的受试者中，产生更高滴度水平的中和抗体、缩短将组织中的病毒载量清零的时间。

本发明的免疫增强剂可以以药学上的有效量施用至受试者。

“药学上的有效量”是指足以以适用于医疗的合理效益/风险比率治疗疾病的量，并且有效剂量的水平可由以下因素决定，包括：受试者的种类、疾病的严重程度、年龄、性别，药物活性、药物敏感性、给药时间、给药途径和溶解速率、治疗时间、包括联合用药在内的因素，以及其他医学领域众所周知的因素。

在一些实施方案中，本发明的免疫增强剂施用至受试者的施用途径为口服、静脉内、皮内、经皮、经鼻、皮下或肛门。在一些优选的实施方案中，施用途径为口服施用。在另一些优选的实施方案中，施用途径为皮下施用，例如采用在受试者的皮下埋（植入）渗透压泵的方式。

在本发明的一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在本发明的一些具体实施方案中，所述受试者是小鼠。在本发明的一些具体实施方案中，所述受试者是鸡。在本发明的一些具体实施方案中，所述受试者是人。

<免疫增强剂>

在本发明的一些方面中，提供了一种用于灭活疫苗的免疫增强剂，其包含花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯。

在一些实施方案中，花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯作为免疫增强剂的活性成分。在一些具体实施方案中，花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯作为免疫增强剂的唯一活性成分。

在一些实施方案中，所述免疫增强剂中还包含药学上可接受的载体。

<提高灭活疫苗接种效果的方法>

在本发明的一些方面中，提供了一种提高受试者中灭活疫苗接种效果的方法，所述方法包括向受试者中施用药学上的有效量的本发明所述的免疫增强剂。

实施例

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中，首先使用模式抗原卵清蛋白(OVA)免疫小鼠，通过ELISA方法检测抗体滴度，从6种长链多不饱和脂肪酸中筛选出促进抗体产生效果最好的ARA。探索了ARA饲喂的最佳条件。按照最佳条件，通过口服的方式给小鼠补充ARA，免疫狂犬疫苗后中和抗体水平显著提高，攻毒实验表明，补充ARA组小鼠的临床评分、病理变化等指标均显著高于对照组。对于禽流感疫苗的施用也获得了类似的效果。

实施例1~5中所用实验动物与试剂耗材如下：

8周龄BALB/c小鼠42只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司；聚乙二醇（PEG400）购自Sigma，货号：202398-250G；植入式胶囊渗透压泵购自Alzet，货号：2006；所用的脂肪酸如花生四烯酸（ARA，货号 C4223）、亚油酸（LA，货号：C3108）、γ-次亚麻油酸（GLA,货号:C5518）、二十碳五烯酸（EPA货号：B3464）、二十二碳六烯酸（DHA货号C4188）和α-亚麻酸（ALA，货号C3934）均购自ApexBio。鸡卵清蛋白（OVA）购自Sigma，货号：A5503-1G；酶标板购自康宁，货号3690；HRP-山羊抗鼠二抗购自Proteintech，货号：SA00001-1；包被液购自索来宝，货号：C1055；单组分TMB显色液购自索莱宝，货号PR1200；终止液购自索莱宝，货号：C1058；铝佐剂购自Sigma，239186-500G；PBS购自索来宝，货号：P1020。脱脂奶粉购自索来宝，货号：D8340；Tween 20购自翰隆，货号9005-64-5。

实施例1、6种长链多不饱和脂肪酸免疫增效作用的筛选

将42只Balb/c老鼠分为7组，一组6只，分别埋泵40mg聚乙二醇（PEG，对照组）、ARA、亚油酸（LA）、γ-次亚麻油酸（GLA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和α-亚麻酸（ALA）（在每个植入式胶囊渗透压泵装入40mg上述脂肪酸，其余用PEG400来填满，植入皮下），1周后每只小鼠免疫20μg OVA，免疫OVA后第2至周第4周采集血清，ELISA法检测OVA特异性IgG抗体滴度。

ELISA步骤：用0.5%的脱脂奶粉稀释小鼠血清，起始稀释倍数是30倍，然后进行3倍倍比稀释，一共做10个稀释梯度。4摄氏度过夜孵育，用0.1%PBST清洗5遍，每孔加50μL HRP-山羊抗鼠二抗，37摄氏度孵育40分钟，用0.1%PBST清洗5遍，每孔加入50μL显色液，37摄氏度孵育5分钟，每孔加入50μL终止液，在酶标仪OD450进行测定。

图1为6种长链多不饱和脂肪酸免疫增效作用的筛选结果。结果显示，补充ARA的小鼠血清抗体滴度显著高于其他各组，筛选出ARA作为具有潜在的免疫增效作用。

实施例2、优化ARA饲喂条件

为了增强ARA的实用性，取66只Balb/c，其中30只用于探索饲喂剂量（每组小鼠6只，一共5组，每组每次施用ARA的剂量分别为：0mg（作为对照组），0.6mg，1.2mg，2.5mg，5mg；免疫前施用7天，每天施用两次，第8天注射OVA进行免疫，免疫后继续施用7天）；30只用于探索提前饲喂时间（每组小鼠6只，一共5组，每组分别提前1天、3天、5天、7天饲喂，每次2.5mg，每天两次，免疫后各组均以每次2.5mg，每天两次，继续施用7天）；余下6只作为不免疫组（未采用OVA免疫、未施用ARA）。免疫组小鼠每只肌肉注射20μg OVA，分别在免疫OVA后第2周和第3周采血，ELISA法检测特异性抗体水平。

图2A~图2B显示最佳的条件是提前饲喂3天，每次饲喂的剂量是2.5mg，每天饲喂2次，免疫后按相同剂量、次数继续饲喂7天。

实施例3、ARA对狂犬疫苗抗体的促进作用

按照实施例2探索的饲喂条件给小鼠补充ARA，免疫狂犬病毒疫苗（由华中农业大学提供，免疫方式为肌肉注射）。组别包括不打疫苗组(未免疫疫苗，未施用ARA；表示为PBS)、仅打抗犬疫苗组（表示为RABV或疫苗）和打抗犬疫苗并补充花生四烯酸组（表示为RABV+ARA或疫苗+ARA），每组10只小鼠，分别在免疫后第1、2、3周采血，采用实施例2相同的方法，检测中和抗体，并在第三周进行狂犬病毒（由华中农业大学提供）感染（肌肉注射，感染剂量为100×半数致死量LD₅₀/只），感染期间记录小鼠体重、临床症状变化特征（评分标准参考Faber, Milosz et al. “Dominance of a nonpathogenic glycoprotein gene overa pathogenic glycoprotein gene in rabies virus.” Journal of virology vol. 81,13 (2007): 7041-7. doi:10.1128/JVI.00357-07；简要地，临床症状采用0至5的评分标准进行评分：0分，无临床症状；1分，运动紊乱；2分，褶皱的毛皮、驼背；3分，颤抖；4分，完全丧失运动能力（完全瘫痪）；5分，死亡；用二氧化碳对体重减轻超过25%的小鼠实施安乐死）以及存活、死亡情况。

图3A~图3D分别显示补充ARA后狂犬病毒疫苗的中和抗体显著提升，攻毒后小鼠体重变化较小，几乎没有临床症状，最终死亡率为10%。未补充ARA的小鼠体重有较大幅度下降，临床症状较为明显，最终死亡率为50%。

实施例4、补充ARA对小鼠脑部病毒载量的作用

将实施例3中的各组实验小鼠选取5只，取脑组织做免疫荧光实验，观察病毒载量，检测各组小鼠大脑的感染情况。

图4结果显示，未免疫的小鼠荧光信号最强，即脑部各部位病毒载量最大，补充ARA后小鼠各脑部位病毒载量最轻。

可见，补充花生四烯酸后免疫小鼠，在3周内即可产生高滴度水平的中和抗体，小鼠组织内病毒载量清零，在免疫次数最低的前提下达到了最好的免疫保护效果，做到了“一针保护”，具有广泛的应用前景。

实施例5、ARA增强禽流感疫苗免疫效果

一、试验方案

1. 试验动物与病毒毒株

7日龄SPF雏鸡50只，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。H9亚型禽流感毒株由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室分离鉴定保存。H9疫苗选用齐鲁动保的新城疫流感腺病毒三联灭活疫苗（3周龄以内鸡每只注射0.3mL，21天后产生免疫效力）。H9亚型禽流感荧光定量检测试剂盒为北京森康产品（Q02-005-211208）。

2. H9亚型AIV EID50的测定

将病毒10倍系列稀释，从10^-1-10^-9，分别接种9日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5个。记录死亡个数，计算半数感染量（EID50）为10^-8/0.2 mL，备用。

3. 动物实验

将7日龄雏鸡随机分为3组，每组5只，ARA以剂量区分共2组。对照组自由采食，口服等体积的水。

按照分组饲喂5天后采集外周血分离血清，测定抗体效价（12日龄），并于当天进行免疫，各组均进行免疫。继续按照分组饲喂直至攻毒（即，ARA组免疫后继续饲喂相应剂量ARA；对照组饲喂等体积水，3周后进行攻毒），免疫后每隔7天测定抗体效价，直至免疫后第3周（33日龄）。

二、试验结果

1. H9-AIV HI抗体效价

分别于免疫后0、7、14、21天采集了各组鸡的外周血，分离血清，测定了H9-AIV的HI抗体效价。结果如图5所示，各组随免疫时间的增加，抗体效价逐步升高，其中对照组第14天的HI效价为6，补充ARA组平均效价分别为7.6和8.6；到21天时，补充ARA组平均效价分别为10和10.8，均显著高于对照组。

对补充ARA组进行了每个时间段抗体效价增值的分析，如图5所示，ARA-14.4mg组在各个时间段内效价均有明显的增加，特别是在0-7天范围内，效价增值明显高于对照组。

因为到14天时，对照组的HI平均效价为6.0，补充ARA组平均效价分别达到了7.6和8.6，即补充ARA能有效缩短鸡的免疫空窗期（有效保护效价≥6.0），对鸡的保护至关重要。

Claims (9)

1.花生四烯酸或其药学上可接受的盐或酯作为唯一活性成分在制备用于灭活疫苗的免疫增强剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述灭活疫苗是细菌灭活疫苗或病毒灭活疫苗。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述病毒灭活疫苗是狂犬病毒灭活疫苗或禽流感病毒灭活疫苗。

4.根据权利要求1~3中任一项所述的应用，其中，所述免疫增强剂在受试者中施用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述免疫增强剂在向受试者施用灭活疫苗之前开始施用至所述受试者。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述施用的途径为口服、静脉内、皮内、经皮、经鼻、皮下或肛门。

7.根据权利要求5所述的应用，其中，相对于在施用灭活疫苗之前未施用所述免疫增强剂的受试者，在施用灭活疫苗之前施用所述免疫增强剂的受试者中，产生更高滴度水平的中和抗体、缩短将受试者的组织中的病毒载量清零的时间。

8.根据权利要求4所述的应用，其中，所述受试者是哺乳动物。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述受试者是小鼠、鸡或人。

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