CN117205174A - 一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117205174A
CN117205174A CN202210994182.3A CN202210994182A CN117205174A CN 117205174 A CN117205174 A CN 117205174A CN 202210994182 A CN202210994182 A CN 202210994182A CN 117205174 A CN117205174 A CN 117205174A
Authority
CN
China
Prior art keywords
adjuvant
lipid
immunoadjuvant
solution
nanoparticle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210994182.3A
Other languages
English (en)
Inventor
刘鸿
陈永明
刘志佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Lide Biopharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Lide Biopharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Lide Biopharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Lide Biopharmaceutical Technology Co ltd
Priority to CN202210994182.3A priority Critical patent/CN117205174A/zh
Priority to PCT/CN2023/113427 priority patent/WO2024037575A1/zh
Publication of CN117205174A publication Critical patent/CN117205174A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A61K39/25—Varicella-zoster virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其应用。所述纳米颗粒佐剂包含可电离脂质、阴离子免疫佐剂和/或疏水性免疫佐剂及辅助脂质，所述辅助脂质包括中性辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。本发明通过可电离脂质材料将不同功能的阴离子佐剂和疏水佐剂包裹制备全新的纳米颗粒佐剂系统，该纳米颗粒佐剂系统突破了传统依靠阳离子脂质负载阴离子佐剂和疏水佐剂的限制；同时本发明制的纳米颗粒佐剂免疫佐剂具有较高的包封率，其施用于动物后，能产生较强的体液免疫，使细胞免疫明显增强，免疫效果优于游离形式的抗原/佐剂混合注射和现有的含铝佐剂的疫苗以及市场上现有的其他VZV疫苗。

Description

一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及采用可电离脂质共负载阴离子免疫佐剂和/或疏水性免疫佐剂形成的脂质纳米佐剂及制备方法，及其配合水痘-带状疱疹病毒(VZV)相关蛋白gE为抗原的疫苗的应用。
背景技术
免疫佐剂也称为免疫激动剂，与抗原同时或者预先免疫机体可增强抗原的免疫原性和改变免疫应答类型的非特异性免疫增强物质。目前被批准用于人类疫苗的佐剂中，铝盐和MF59能够增强体液免疫和Th2免疫应答，但其不能诱导产生足够的细胞毒T淋巴细胞免疫应答。病毒样颗粒制作工艺复杂，成分不明确。肿瘤治疗性疫苗的研发急需结构明确，安全有效，易于生产的新型佐剂。
近年来，一些新型细胞Toll样受体激动剂可产生强烈的细胞免疫应答，比如TLR4激动剂MPLA，TLR9激动剂CpG-ODN，TLR3激动剂Poly(I:C)，TLR7/8激动剂IMQ等分子佐剂已被广泛用于预防和治疗性疫苗上。但由于此类佐剂分子量小，容易引起的全身炎症毒性，容易被快速代谢掉。通过生物材料将分子佐剂包裹形成纳米佐剂(通常小于100nm)，则可以通过靶向淋巴结或者通过抗原呈递细胞携带至引流淋巴结。纳米佐剂可以避免佐剂诱发的全身性毒性，通过靶向淋巴结可以在富含抗原呈递细胞(APC)的淋巴结中长时间滞留并持续激活免疫应答。而且由于包裹佐剂的生物材料可以大大提高佐剂在淋巴结中的密度，可以高效激活TLR通路；另外，由于不同分子佐剂的免疫特点不同，通常会使用两种或者多种分子佐剂共同使用；目前，唯一被临床批准使用的是GSK研发的Shingrix重组疫苗，其使用的AS01佐剂可以激发较强的体液免疫和细胞免疫应答。AS01负载的MPLA和QS21是通过疏水作用嵌插在脂质体囊泡中，该方式对一些具有较好佐剂效应的阴离子佐剂的负载具有局限性。而且，AS01纳米颗粒佐剂的制备时通过传统的膜水化法，其制备过程复杂，可控性较差。即使现有的一些阳离子脂质，如DOTAP、DOTMA等可同时负载阴离子分子佐剂和疏水小分子佐剂，但是其较强的正电荷对阴离子分子佐剂的束缚过强会导致佐剂释放效率低，佐剂效应降低；此外由永久性阳离子脂质颗粒由于其强的正电性会与体液中的血清蛋白结合导致被体液系统快速清除，使得药物半衰期缩短。而且，阳离子脂质组成的脂质体存在热力学不稳定等问题，大大限制了其应用。同时，此类阳离子佐剂的细胞毒性较大使得此类阳离子脂质不能应用在同时输送阴离子佐剂和疏水佐剂上。因此需要可负载不同功能的阴离子佐剂和疏水佐剂且负载效率和免疫效率更好的纳米颗粒佐剂系统。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中使用的，术语“可电离脂质”是指同时具有叔氨或者肿氨和疏水烷基链的亲水基团的类脂质分子，其pKa在5.0～7.4之间。
如本文中使用的，术语“颗粒佐剂”是指负载了相应分子佐剂，并在尺寸范围内具有特定形状的几何体，以离散颗粒、丸粒、珠粒或团粒存在为特征的物质状态，而不管其大小、形状或形态如何。
如本文中使用的，术语“纳米颗粒佐剂”是指在尺寸(即颗粒的最长维度中的直径)一个维度上小于200纳米的颗粒。
如本文中使用的，术语“粒径”即“等效粒径”，是指当被测颗粒的某种物理特性或物理行为与某一直径的同质球体(或组合)最相近时，就把该球体的直径(或组合)作为被测颗粒的等效粒径(或粒度分布)。
如本文中使用的，术语“平均粒径”是指对于一个由大小和形状不相同的粒子组成的实际粒子群，与一个由均一的球形粒子组成的假想粒子群相比，如果两者的粒径全长相同，则称此球形粒子的直径为实际粒子群的平均粒径。平均粒径的测量方法是本领域技术人员已知的，例如光散射法；平均粒径的测量仪器包括但不限于马尔文粒径仪。
如本文中使用的，术语“室温”是指25±5℃。
如本文中使用的，术语“免疫佐剂”是指同抗原一起或预先施用于机体内，能增强免疫原性或改变免疫反应类型的物质。免疫佐剂本身可以具有免疫原性(例如卡介苗)，或不具有免疫原性(例如氢氧化铝佐剂)。所述“阴离子免疫佐剂”，是指将在水中电离后带负电荷的免疫佐剂称为阴离子免疫佐剂；所述“疏水性免疫佐剂”是指不溶于水的，只能溶解在中性和非极性溶液(如有机溶剂)的免疫佐剂。
如本文中使用的，术语“抗原”或“免疫原”是指能够诱导宿主体内的特异性免疫应答的物质。抗原可以包括整个生物体(例如灭活的、减毒的或活的生物体)；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性的插入物的重组载体；在呈递给宿主后能够诱导免疫应答的DNA部分或片段；蛋白、糖蛋白、脂蛋白、多肽、肽、抗原表位、半抗原、毒素、抗毒素或其任何组合。
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种纳米颗粒佐剂。
本发明的另一目的在于提供所述纳米颗粒佐剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述纳米颗粒佐剂的应用。
一种纳米颗粒佐剂，包含可电离脂质、阴离子免疫佐剂和/或疏水性免疫佐剂及辅助脂质，所述辅助脂质包括中性辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇(PEG)化脂质。
可电离脂质为pKa在5～7，其结构具有可电离的叔氨或肿氨，疏水烷基链和功能结构基团的一类物质，其在不同的pH环境中显示不同的带电荷性，现有技术中已被成功用于siRNA和mRNA的递送。而本发明则研究表明该类可电离脂质可以负载疏水分子佐剂，并且在pH大于pKa时带负电，pH小于pKa时带正电。与传统的DOTAP，DOTMA等阳离子脂质不同的是，可电离脂质通过在低pH下可完成对负电性分子佐剂(阴离子免疫佐剂)的包裹后形成脂质纳米颗粒佐剂，在提高缓冲液pH后，该脂质纳米颗粒表面电荷将会降低至不带电或者弱负电。在体液环境中，该脂质纳米颗粒带有微负电，从而使得该脂质纳米颗粒佐剂最终在体液环境中具有良好的生物相容性，并且可以很好的释放免疫佐剂，既保证对弱电荷性佐剂的高效负载又可以避免分子佐剂爆释或者不释放。最终与抗原同时注射引起强的免疫应答。
具体地，可电离脂质生理pH下表现为中性，而在内体的酸性环境中则带正电荷。在pH 4条件中带正电可有效封装带负电的佐剂，注射后在pH 7.4的生理条件下接近中性可防止与血清蛋白的非特异性相互作用并改善循环时间，而且基于可电离脂质形成的粒子经内吞后，细胞内体酸性环境中质子化并与带负电的内源性脂质相互作用导致内体膜失稳从而逃逸至细胞质。可电离脂质大大改善了有效性和毒性特征。
所述中性辅助脂质用于支撑脂质双层结构的形成并稳定其结构排列；具有膜融合性的胆固醇调整脂质膜的完整性和硬度，增强纳米颗粒的稳定性；能改善亲水性的PEG化脂质位于纳米颗粒表面，既可以避免米颗粒被免疫系统快速清除以延长循环时间，又可以防止米颗粒聚集以增加稳定性。脂质成分发生分子间相互作用而自发组织成核壳纳米结构实体，PEG脂质在最外层会形成一个壳结构包裹在核外层。
所述“可电离脂质”并不限于只含有碳、氢、氮元素组成，其基本结构具有可电离的叔氨或肿氨亲水头部和疏水的烷基链尾部，最终pKa在5～7.4，并且不限于含有酯基，醛基，羰基，二硫键，腙键，不饱和键等化学基团。疏水烷基链不限于一条，一种。
优选地，所述可电离脂质选择酸解离常数(pKa)在5.0～7.4之间的脂质，其结构具有叔氨或肿氨，疏水烷基链和功能结构基团。所述可电离脂质选自FDA批准的高生物相容性的4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(Dlin-MC3-DMA)，1-辛基壬基8-[(2-羟乙基)[6-O-6-(十一烷氧基)己基]氨基]-辛酸酯(SM102)，((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC0315)；及本发明自主设计的可电离脂质(10Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9-烯酰{R2-1,N-(3-(dimethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)oleamide},(10Z,12Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9,12-二烯酰胺{R2-2,(9Z,12Z)-N-(3-(dimethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)octadeca-9,12-dienamide},(10Z,12Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9,12-二烯酰胺{R3-1,N-(3-(diethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)oleamide}，(10Z,12Z)-N-[3-(二乙基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9,12-二烯酰胺{R3-2,(9Z,12Z)-N-(3-(diethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)octadeca-9,12-dienamide}中的任意一种或多种。
进一步优选地，所述可电离脂质为R3-2。
优选地，所述阴离子免疫佐剂选自天然免疫激动剂、植物来源佐剂或细胞因子类佐剂中的一种或多种。
优选地，所述所述天然免疫激动剂为模式识别受体(Pattern recognitionreceptors，PRRs)激动剂。
进一步优选地，所述模式识别受体(PRRs)激动剂选自Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)激动剂、核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)激动剂、视黄酸诱导基因I(RIG-1)样受体(RIG-1like receptors，RLRs RLRs)激动剂、C-型凝集素受体(C-type lectin receptor，CLRs)激动剂或胞内核酸感受器STING激动剂中的一种或多种。
进一步优选地，所述Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)激动剂选自CPGODNs、ssRNA、23S rRNA、Pam2csk4、Pam3csk4、FLA、ssPoly(U)或poly(I:C)中的一种或多种。
进一步优选地，所述CpG ODNs包括但不限于CpG-ODN M362，CpG-ODN 2216，CpG-ODN 1018，CpG-ODN 2006，CpG-ODN 1826，CpG-ODN 2395CpG-ODN 1668，CpG-ODN 2007，CpG-ODN BW006，CpG-ODN SL01，CpG-ODN 1585，CpG-ODN 2336，CpG-ODN SL03等。
进一步优选地，所述核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)激动剂选自C12-iE-DAP、C14-Tri-LAN-Gly、iE-DAP、Tri-DAP、M-TriDAP、Gram-PGNs、MDP或Murabutide中的一种或多种。
进一步优选地，所述视黄酸诱导基因I(RIG-1)样受体(RIG-1like receptors，RLRs RLRs)激动剂选自3p-hpRNA、5'ppp-dsRNA、Poly(dA:dT)、poly(I:C)LyoVec中的一种或多种。
进一步优选地，所述C-型凝集素受体(C-type lectin receptor，CLRs)激动剂选自Beta-glucan peptide或Dectin-I。
进一步优选地，所述胞内核酸感受器STING激动剂选自2'3'-cGAMP、3'3'-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP或cAIMP中的一种或多种。
优选地，所述植物来源佐剂选自QS-21、奎宁或植物凝集素中的一种或多种。
优选地，所述细胞因子类佐剂选自IFN-α、IL-2、TNF、IFN-γ或GM-CSF中的一种或多种。
优选地，所述疏水性免疫佐剂选自咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A，MPLA)、脂多糖(LPS)、胞壁酰二肽(莫拉丁酯)、Loxoribine、Gardiquinod、瑞喹莫德(Resiquimod)；细菌来源佐剂破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)、大肠杆菌不耐热毒素(Heat labile enterotoxin，LT)和沙门菌菌毛蛋白(Flagellin)；角鲨烯、热休克蛋白70或热休克蛋白90中的一种或多种。
优选地，所述中性辅助脂质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，二硬酯酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二肉豆蔻酰基卵磷脂(DMPC)，二月桂酰基卵磷脂(DLPC)，二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)，二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，蛋黄磷脂酰甘油(EPG)，1-棕榈酰基-2油酰基磷脂酰甘油(POPG-Na)，1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG-NA)，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG-Na)，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG-Na)，二硬脂酰磷脂酸(DSPA)，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)中的一种或多种。
优选地，所述聚乙二醇(PEG)化脂质选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)，2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(DPPE-MPEG2000)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000(DPPE-MPEG5000)中的一种或多种。
进一步优选地，所述阴离子免疫佐剂为CpG寡脱氧核苷酸和/或植物来源佐剂QS21；所述疏水性免疫佐剂为单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A，MPLA))和/或咪喹莫特IMQ(Imiquimod，IMQ)。
优选地，所述可电离脂质、阴离子免疫佐剂、疏水性免疫佐剂及辅助脂质的摩尔质量比为35～65：10～30：10～30：35～65。
进一步优选地，所述可电离脂质、阴离子免疫佐剂、疏水性免疫佐剂及辅助脂质的摩尔质量比为3：1：1：3或2：1：1：2。
优选地，所述可电离脂质与每种佐剂质量比为1～2：1～2。
进一步优选地，所述可电离脂质与每种佐剂质量比为1：1或1.5：1或2：1或1.5：2。
优选地，所述可电离脂质、中性辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的摩尔质量比为44～55：9.4～10：38.5～45：1.5～1.6。
进一步优选地，所述可电离脂质、中性辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的摩尔质量比为55：10：38.5：1.5或45.5：10：43：1.5。
具体地，所述纳米颗粒佐剂为脂质体核壳结构，核内为阴离子免疫佐剂，壳为包裹在核上的可电离脂质和辅助脂质以及疏水性免疫佐剂；或核内为部分阴离子免疫佐剂，壳为包裹在核上的可电离脂质和辅助脂质以及疏水性免疫佐剂，颗粒表面负载另外部分阴离子免疫佐剂。
优选地，所述纳米颗粒为近似球形。
优选地，所述纳米颗粒的粒径为30～200nm，例如30～50nm、50～80nm、80～100nm、100～150nm或150～200nm。
优选地，所述纳米颗粒的Zeta电位为-10至+20mV，例如-10至-5mV、-5至-2mV、-2至+2mV、+2至+5mV、+5至+10mV、+10至+15mV、+15至+20mV。
优选地，所述纳米颗粒中，免疫佐剂的包封率为70％～100％，例如70％～75％、75％～80％、80％～85％、85％～90％、90％～95％或95％～100％。
本发明还提供上述任一所述纳米颗粒佐剂的制备方法，包括如下步骤：
S1.提供包含可电离脂质、辅助脂质和疏水性免疫佐剂的溶液，包含阴离子免疫佐剂的溶液；
S2.使包含可电离脂质、辅助脂质和疏水性免疫佐剂的溶液通过第一通道，三管包含阴离子免疫佐剂的溶液分别通过第二通道，第三通道和第四通道，四个通道的溶液到达混合区域中，进行混合，得到纳米颗粒佐剂溶液；
S3.逐级透析溶剂，得到纳米颗粒佐剂水溶液。
优选地，所述包含阴离子免疫佐剂的溶液的pH为3～5。
进一步优选地，所述包含阴离子免疫佐剂的溶液的pH为4。
优选地，所述方法在包含第一通道、第二通道、第三通道、第四通和混合区域的装置中进行。在一个优选的实施方案中，所述装置为多入口涡流混合器，例如四入口涡流混合器。
本发明中的多入口涡流混合器，包括位于上部的第一部件、位于中部的第二部件和位于下部的第三部件，所述第一部件、第二部件和第三部件为具有相同直径的圆柱体。第一部件设置有多个通道，第二部件设置涡流混合区域和多个导流区域，第三部件设置通道。第一部件的通道与第二部件的导流区域流体连通。第二部件的导流区域均与涡流混合区域流体连通。第二部件的涡流混合区域与第三部件的通道流体连通。可使用螺纹连接装置将第一部件、第二部件和第三部件密封连接。
在某些实施方案中，第一部件设置有多个通道，通道的上下两端分别位于第一部件的上表面和下表面。在某些实施方案中，所述多个通道的横截面为圆形。在某些实施方案中，所述多个通道分别通过连接部件与外部管道连接。
在某些实施方案中，第二部件的上表面凹陷设置有多个导流区域和一个涡流混合区域。在某些实施方案中，多个导流区域通过在第二部件的上表面设置的槽与涡流混合区域流体连通。在某些实施方案中，第二部件的涡流混合区域通过平行于第二部件轴向的通道与第三部件的通道流体连通。
在某些实施方案中，涡流混合区域的横截面为圆形，并与第二部件的横截面具有共同的圆心。在某些实施方案中，多个导流区域的横截面为圆形。在某些实施方案中，第二部件的导流区域的数量与第一部件的通道数量相同。在某些实施方案中，第二部件的多个导流区域各自位于第一部件的多个通道的正下方。
在某些实施方案中，第三部件的通道的上下两端分别位于第三部件的上表面和下表面。在某些实施方案中，第三部件的通道的横截面为圆形。在某些实施方案中，第三部件的通道通过连接部件与外部管道连接。
在某些实施方案中，所述多入口涡流混合器由刚性材料(例如不锈钢)制成。
上述装置具有高通量，可控性强等特点，制备的纳米颗粒分布均匀且粒径较小，批次间差异小。
上述技术(FNC)和装置记载在本发明人前期申请号为PCT/US2017/014080的专利中。可以使得制备的纳米粒子的分散更加均一。
优选地，所述各通道的流速相同，为1～40mL/min，例如1mL/min、5mL/min、8mL/min、10mL/min、15mL/min、20mL/min、30mL/min或40mL/min。
更优选地，所述各通道的流速均为10mL/min。
优选地，所述方法还包括步骤S4：对包含纳米颗粒的水溶液进行冻干浓缩，例如通过添加冻干保护剂进行冻干浓缩。
水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)引起的原发感染表现为水痘(varicella)，并在宿主的感觉神经节内潜伏，VZV复发感染时，病毒沿感觉神经轴索下行到达该神经所支配的皮肤细胞内增殖，进而在皮肤上沿着感觉神经的通路发生串联的水疱疹，形似带状，故名带状疱疹。带状疱疹(Herpes zoster,HZ)多见于成年人和老年人。目前还没有针对水痘和带状疱疹的特效治疗性药物，接种疫苗是目前预防和控制VZV的最有效的方式。目前上市的水痘与带状疱疹疫苗除减毒活疫苗之外，还有亚单位疫苗和DNA疫苗。传统的灭活或者减活疫苗的安全以及其引起的全身性免疫风暴在很多疫苗体系中无法避免。亚单位疫苗以较高的安全性备受关注。gE糖蛋白是VZV最重要的结构蛋白之一。其具有丰富的B细胞和T细胞表位，能够刺激机体，在血清免疫水平和细胞免疫水平产生针对VZV的免疫应答，目前己被成功应用于亚单位带状疱疹疫苗，在临床实验上效果良好。
本发明的纳米颗粒能够引起免疫应答，利用本发明上述得到的纳米颗粒佐剂可与VZV抗原相组合，制备预防和/或治疗与水痘-带状疱疹病毒感染相关疾病的免疫原性组合物。在一个方面，本发明请求保护所述的纳米颗粒佐剂在制备与VZV感染相关的疾病的免疫原性组合物中的应用。
优选地，所述与VZV感染相关的疾病为水痘和带状疱疹的一种或多种。
本发明还提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含本发明上述任一所述的纳米颗粒佐剂。
本发明的免疫原性组合物可配制用于任何适当的给药方式，包括例如，局部、口服、鼻内、粘膜﹑静脉内、真皮内、腹膜内、皮下和肌内给药。
优选地，本发明的免疫原性组合物可用于疫苗组合物，任选地与佐剂和/或(其他)合适的载体组合。
优选地，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的辅料，例如赋形剂、防腐剂、抗菌剂和/或额外的免疫佐剂。
优选地，所述免疫原性组合物为疫苗。
优选地，免疫原性组合物还包含VZV抗原，所述抗原为VZV灭活/减活病毒株，VZV糖蛋白如VZV gE糖蛋白、VZV gB糖蛋白、VZV gH糖蛋白、VZV gL糖蛋白等，以及VZV脂蛋白、多肽、肽、抗原表位、半抗原、毒素、抗毒素或其任何组合。
优选地，所选抗原为VZV gE和OKA毒株；
优选地，所述VZV gE糖蛋白为重组蛋白。
其中，VZV抗原的量选择在典型的疫苗中诱导免疫保护性应答而无明显不良副作用的量，抗原的量可随使用的特异性免疫原的改变而改变。一般而言，每一剂疫苗中包含5～1000μg蛋白，例如5～200μg或者20～100μg。对于VZV gE重组蛋白，在小鼠中中使用剂量为1～25μg，优选地为2μg，5μg或者20μg；在人中使用剂量为10～100μg，优选地为20μg，50μg或者80μg。对于OKA毒株，使用剂量为100～100000pfu/0.5mL，优选地为10000pfu/0.5mL，30000pfu/0.5mL，50000pfu/0.5mL，70000pfu/0.5mL，100000pfu/0.5mL。
优选地，所述免疫原性组合物用于预防和/或治疗受试者中与VZV感染相关的疾病，例如水痘、带状疱疹。
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。
优选地，所述免疫原性组合物还包含第二免疫原性物质。例如，所述免疫原性组合物还包含除VZV gE蛋白以外的VZV的其他蛋白。例如，所述免疫原性组合物还包含灭活和减活VZV。例如，所述免疫原性组合物还包含VZV以外的其他致病微生物(包括活的、灭活的或减毒的)。例如，所述免疫原性组合物还包含VZV以外的其他致病微生物的部分。
优选地，本发明的VZV抗原和减毒VZV可以一起用于组合物中以激发对VZV的免疫应答，或单独使用——在激发加强方案中同时或连续使用。可以任何顺序同时或连续递送可使用的疫苗组分。在一个实施方案中，在递送减毒活VZN或全灭活VZV后递送VZV抗原或其免疫原性衍生物。在另一个实施方案中，在递送VZV抗原或其免疫原性衍生物后递送减毒活VZV或全灭活VZV。
优选地，本发明进一步涉及一种预防带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛和/或减少其严重程度的方法，包括递送给处于带状疱疹危险中的个体包含减毒活VZV和VZV抗原的免疫原性组合物。
优选地，在另一个实施方案中，本发明涉及一种预防带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛和/或减少其严重程度的方法，包括连续或同时递送给处于带状疱疹危险中的个体减毒活VZV和VZV抗原。
在一个方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗受试者中与VZV感染相关的疾病的方法，包括给受试者施用本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)。
优选地，所述与VZV感染相关的疾病为水痘、带状疱疹。
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。
在一个方面，本发明提供了一种引发或增强受试者对VZV的免疫应答的方法，包括给受试者施用本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)。
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；所述受试者为所述受试者C57BL/6小鼠。
本发明的纳米颗粒佐剂系统突破了传统依靠阳离子脂质负载阴离子佐剂和疏水佐剂的限制，使得佐剂的负载效率和免疫效率达到最高，在于VZV gE抗原或者VZV减毒/灭毒株配伍使用显示了强的免疫效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过采用可电离脂质材料将不同功能的阴离子佐剂和疏水佐剂包裹制备全新的纳米颗粒佐剂系统。该纳米颗粒佐剂系统系统突破了传统依靠阳离子脂质负载阴离子佐剂和疏水佐剂的限制，使得佐剂释放效率和佐剂效应大大提高。
(2)本发明制备的纳米颗粒，具有高通量，可控性强等特点，制备的纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象；分布均匀且粒径较小(30～200nm)，批次间差异小。
(3)本发明的纳米颗粒中负载的免疫佐剂具有较高的包封率(70％～100％)；所述纳米颗粒佐剂施用于动物后，能产生较强的体液免疫，使细胞免疫明显增强，免疫效果优于游离形式的抗原/佐剂混合注射和现有的含铝佐剂的疫苗以及市场上现有的其他VZV疫苗；与现有GSK研发的AS01及传统阳离子脂质负载阴离子佐剂和疏水佐剂相比，其能产生更高的特异性抗体且能够激发更强的体液疫苗和细胞免疫。
(4)本发明的纳米颗粒具有靶向淋巴结的功能，提高了疫苗在淋巴结内的富集以及抗原提呈细胞的摄取；
(5)本发明的纳米颗粒佐剂能够通过简单的方法连续制备，品质稳定，易于产业化生产。
附图说明
图1为本发明纳米佐剂的免疫方案示意图。
图2为免疫D01-D11纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的D01-D11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图3为免疫S01-S11纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的S01-S11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图4为免疫R3201-R3211纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的R3201-R3211纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图5为免疫A01-A11纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的A01-A11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图6为免疫R2101-R2111纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的R2101-R2111纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图7为免疫R2201-R2211纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的R2201-R2211纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图8为免疫R3101-R3111纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的R3101-R3111纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图9为免疫F00-F11后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+,TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，游离佐剂对小鼠免疫后，能够一定程度增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，但是与图2-图8所示的纳米佐剂相比，游离佐剂对于T细胞介导的细胞免疫增强效果不如纳米佐剂。
图10为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫D01-D11纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的D01-D11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图11为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫S01-S11纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的S01-S11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图12为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫R3201-R3211纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的R3201-R3211纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图13为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫A01-A11纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的A01-A11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图14为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫R2101-R2111纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的R2101-R2111纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图15为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫R2201-R2211纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的R2201-R221纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图16为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫R3101-R3111纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的R3101-R3111纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图17为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫F00-F11的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，游离佐剂对小鼠免疫后能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，但是与图10-图16所示的纳米佐剂相比，游离佐剂对于T细胞介导的细胞免疫增强效果不如纳米佐剂。
图18为负载MPLA及CpG的各组纳米佐剂颗粒及其对应的游离佐剂组F02的小鼠淋巴结中荧光信号强度。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
下列实施例45-77采用本发明自主设计的4种可电离脂质，其化学结构和制备方法如下所示：
1.可电离脂质R21：(10Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9-烯酰{R2-1,N-(3-(dimethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)oleamide}的制备方法；
室温下分别将1.0mmol的2-乙基己醛和1.0mmol的N,N-二甲基-1,3-丙二胺加入到0.5mL甲醇溶液中，室温反应60min后加入1.0mmol油酸，室温反应60min后加入0.5mmol十八烷基异腈，40℃反应24h，反应结束后经层析色谱柱分离提纯产物，其中，流动相采用甲醇和二氯甲烷的混液。
2.可电离脂质R22：(10Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9-烯酰{R2-1,N-(3-(dimethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)oleamide}的制备方法；
室温下分别将1.0mmol的2-乙基己醛和1.0mmol的N,N-二甲基-1,3-丙二胺加入到0.5mL甲醇溶液中，室温反应60min后加入1.0mmol亚油酸，室温反应60min后加入0.5mmol十八烷基异腈，40℃反应24h，反应结束后经层析色谱柱分离提纯产物，其中，流动相采用甲醇和二氯甲烷的混液。
3.可电离脂质R31：(10Z,12Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9,12-二烯酰胺{R3-1,N-(3-(diethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)oleamide}的制备方法；
室温下分别将1.0mmol的2-乙基己醛和1.0mmol的N,N-二乙基-1,3-丙二胺加入到0.5mL甲醇溶液中，室温反应60min后加入1.0mmol油酸，室温反应60min后加入0.5mmol十八烷基异腈，40℃反应24h，反应结束后经层析色谱柱分离提纯产物，其中，流动相采用甲醇和二氯甲烷的混液。
4.可电离脂质R32：(10Z,12Z)-N-[3-(二乙基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9,12-二烯酰胺{R3-2,(9Z,12Z)-N-(3-(diethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)octadeca-9,12-dienamide}的制备方法；
室温下分别将1.0mmol的2-乙基己醛和1.0mmol的N,N-二乙基-1,3-丙二胺加入到0.5mL甲醇溶液中，室温反应60min后加入1.0mmol亚油酸，室温反应60min后加入0.5mmol十八烷基异腈，40℃反应24h，反应结束后经层析色谱柱分离提纯产物，其中，流动相采用甲醇和二氯甲烷的混液。
另外，本发明下列实施例中，如无特殊说明，对于多种佐剂的组合，每一种佐剂的最终质量都相同，任意两种佐剂之间质量比为1：1。
本发明下列实施例中采用的CpG为CpG ODN。所述CpG ODN为CpG-ODN 1826。
实施例1佐剂D01的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例2佐剂D02的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
/>
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例3佐剂D03的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA、IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液和1mg/mL的IMQ乙醇溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA和IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入pH＝4的50mM CA缓冲溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例4佐剂D04的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例5佐剂D05的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例6佐剂D06的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例7佐剂D07的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。
(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例8佐剂D08的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例9佐剂D09的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例10佐剂D10的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA,IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例11佐剂D11的制备
(1)将可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的DLin-MC3-DMA乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，S21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照DLin-MC3-DMA:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质DLin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA,IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例12佐剂S01的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例13佐剂S02的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、免疫佐剂MPLA分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
/>
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例14佐剂S03的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA、IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液和1mg/mL的IMQ乙醇溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA和IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入pH＝4的50mM CA缓冲溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例15佐剂S04的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例16佐剂S05的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例17佐剂S06的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例18佐剂S07的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例19佐剂S08的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例20佐剂S09的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例21佐剂S10的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例22佐剂SM11的制备
(1)将可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的SM102乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照SM102:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例23佐剂R3201的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例24佐剂R3202的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、免疫佐剂MPLA分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质SM102、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例25佐剂R3203的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA、IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液和1mg/mL的IMQ乙醇溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA和IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入pH＝4的50mM CA缓冲溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例26佐剂R3204的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例27佐剂R3205的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照R322:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例28佐剂R3206的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例29佐剂R3207的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例30佐剂R3208的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照R322:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例31佐剂R3209的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例32佐剂R3210的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例33佐剂R3211的制备
(1)将可电离脂质R32、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R32乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照R32:DSPC:Chol:DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R32、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000、疏水佐剂MPLA,IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例34佐剂A01的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000/ALC0159，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL:的DMG-PEG2000/ALC0159乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照不同比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例35佐剂A02的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC、Chol、PEG2000、免疫佐剂MPLA分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例36佐剂A03的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC、Chol、PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA、IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液和1mg/mL的IMQ乙醇溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂MPLA和IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入pH＝4的50mM CA缓冲溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例37佐剂A04的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC、Chol、PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例38佐剂A05的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC、Chol、PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例39佐剂A06的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC、Chol、PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例40佐剂A07的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水性免疫佐剂IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例41佐剂A08的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂MPLA的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例42佐剂A09的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例43佐剂A10的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的QS21溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例44佐剂A11的制备
(1)将可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水性免疫佐剂MPLA和IMQ，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的ALC0315乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的PEG2000乙醇溶液以及1mg/mL的MPLA和IMQ乙醇溶液。将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照ALC0315:DSPC:Chol:PEG2000＝45.5：10：43：1.5比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质ALC0315、辅助脂质DSPC，Chol，PEG2000、疏水佐剂MPLA，IMQ的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
实施例45-55佐剂R2101-R2111的制备
(1)将可电离脂质R21、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R21乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液。将疏水性免疫佐剂MPLA/IMQ溶于乙醇得到1mg/mL的MPLA/IMQ，将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照不同比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R21、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000，疏水佐剂的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
(佐剂R2101-R2111纳米佐剂中的制备方式，可电离脂质与佐剂的配比，佐剂的成分与S01-S11中类似)
实施例56-66佐剂R2201-R2211的制备
(1)将可电离脂质R22、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R22乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液。将疏水性免疫佐剂MPLA/IMQ溶于乙醇得到1mg/mL的MPLA/IMQ，将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照不同比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R22、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000，疏水佐剂的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
(佐剂R2201-R2211纳米佐剂中的制备方式，可电离脂质与佐剂的配比，佐剂的成分与S01-S11中类似)
实施例67-77佐剂R3101-R3111的制备
(1)将可电离脂质R31、辅助脂质DSPC、Chol、DMG-PEG2000，分别溶解于乙醇中得到50mg/mL的R31乙醇溶液、10mg/mL的DSPC，Chol乙醇溶液，5mg/mL的DMG-PEG2000乙醇溶液。将疏水性免疫佐剂MPLA/IMQ溶于乙醇得到1mg/mL的MPLA/IMQ，将免疫佐剂CpG，QS21溶于pH＝4的50mM的CA溶液中得到200μg/mL的CpG/QS21溶液。
(2)按照不同比例配置，加入乙醇溶液补足成1mL的混合磷脂溶液。
(3)将包含可电离脂质R31、辅助脂质DSPC，Chol，DMG-PEG2000，疏水佐剂的混合磷脂溶液装入一号注射器中，其他三只注射器中加入CpG/QS21溶液，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道，获得纳米颗粒佐剂。(使用5mL注射器，除去气泡，流速设置为10mL/min)
(4)静置2-3min后进行梯度透析：
1)将得到的纳米佐剂加于1000D的透析袋中(详细记录体积)，放于pH＝6.7±0.1的50mM CA缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析4小时。
2)将纳米佐剂转移到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(1000体积)，400rpm 4℃透析6小时。
(5)静置2-3min后再次测定粒径。
(佐剂R3101-R3111纳米佐剂中的制备方式，可电离脂质与佐剂的配比，佐剂的成分与S01-S11中类似)。
测试例1粒径测试
利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对实施例1-实施例77的纳米佐剂的粒径进行测试，其结果如表1-7所示，(每个实施例仅展示最优比例的佐剂粒径数据，最优比例通过纳米颗粒的粒径及分散系数判定，其中CLP为可电离磷脂)。
表1 D01-D11纳米佐剂的理化特性
Results are presented as mean±SD(n＝3)
*Polydispersity index.
表2 S01-S11纳米佐剂的理化特性
表3 R3201-R3211纳米佐剂的理化特性
表4 A01-A11纳米佐剂的理化特性
表5 R2101-R2111纳米佐剂的理化特性
表6 R2201-R2211纳米佐剂的理化特性
表7 R3101-R3111纳米佐剂的理化特性
从表1-7的结果可以看出，本发明通过采用可电离脂质材料将不同功能的阴离子佐剂和/或疏水佐剂包裹制备全新的纳米颗粒佐剂系统，制备的纳米颗粒，具有高通量，可控性强等特点，分布均匀且粒径较小(30～200nm)，批次间差异小。
测试例2纳米颗粒中免疫佐剂的包封率的计算
取1mL纳米颗粒佐剂溶液到300kDa的超滤管中，在4℃、3000rpm条件下离心30min，取下面滤出液，采用鲎试剂盒检测滤出液中游离MPLA的含量，采用Quant-iTTM OliGreenTMssDNA Assay Kit检测滤出液中CpG的含量，通过HPLC检测滤出液中QS21，IMQ的含量，按照如下公式计算纳米颗粒中佐剂的包封率。佐剂的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的佐剂的总量；w1为滤出液中游离的佐剂的总量。
实施例1-实施77的纳米颗粒中免疫佐剂的包封率的测定结果如表8-14所示。(此处包封率为表1-表7中最优比例筛选做出的纳米佐剂的包封率)
表8 D01-D11纳米颗粒佐剂中佐剂的包封率
表9 S01-S11纳米颗粒佐剂中佐剂的包封率
表10 R3201-R3211纳米颗粒佐剂中佐剂的包封率
表11 A01-A11纳米颗粒佐剂中佐剂的包封率
表12 R2101-R2111纳米颗粒佐剂中佐剂的包封率
表13 R2201-R2211纳米颗粒佐剂中佐剂的包封率
表14 R3101-R3111纳米颗粒佐剂中佐剂的包封率
从表8-14的结果可以看出，本发明通过采用可电离脂质材料将不同功能的阴离子佐剂和/或疏水佐剂包裹制备全新的纳米颗粒佐剂系统，该纳米颗粒佐剂系统系统突破了传统依靠阳离子脂质负载阴离子佐剂和疏水佐剂的限制。本发明的上述多种纳米颗粒中，各种佐剂的包封率较高，达70％～100％，有利于纳米颗粒引起强的免疫效果。
测试例3纳米颗粒在小鼠体内的免疫效果评价
1、免疫方式
将5～8周雌性C57BL/6小鼠随机分组，每组5只。先将佐剂与VZV gE抗原混合，采用尾根部皮下注射/肌肉注射方式(剂量：VZV gE＝5μg/只，每一种佐剂＝5μg/只)，按照图1中的免疫方案对小鼠进行免疫，并4周加强免疫一次，共免疫2次。铝佐剂和游离佐剂作为对照，组别如表15所述。类似地，每一组佐剂与VZV gE抗原混合后按照图1中的免疫方案对小鼠免疫两次(剂量：VZV gE＝5μg/只，每一种佐剂＝5μg/只)。
表15铝佐剂以及其他游离佐剂命名列表
2、体液免疫效果评价
(1)小鼠血清中IgG检测
分别在第一次免疫后的第28、42天进行眼眶采血，分离血清，Elisa检测血清中IgG的滴度。
检测过程：
1)将5μg/mL的VZV gE重组蛋白抗原包被在96孔板中，每孔100μL，4℃过夜包被。
2)过夜包被的板，用PBST洗3次，每次200μL，用200μL 3％BSA在37℃封闭2h。
3)取2μL免疫血清或阴性对照血清，稀释至200μL，再依次倍比稀释，加入到包被抗原的孔中，室温下孵育2h。
4)清洗5次，加工作浓度的IgG-HRP，每孔100μL，室温孵育2h。
5)清洗5次，每孔加100μL TMB底物，黑暗下孵育20min，用200μL 2M H2SO4终止反应，450nm处检测OD值。
6)计算滴度，若标本孔的平均吸收值(P)与阴性对照(A组)平均吸收值(N)的比值(即P/N)大于2.1，则判定标本孔为阳性。
(2)小鼠血清中IgG1检测
分别在第一次免疫后的第28、42天进行眼眶采血，分离血清，Elisa检测血清中IgG1的滴度。
(3)小鼠血清中IgG2c检测
分别在第一次免疫后的第28、42天进行眼眶采血，分离血清，Elisa检测血清中IgG2c的滴度。
实施例1-实施77所述纳米颗粒佐剂的体液免疫效果如表16-22所示；Al佐剂及其他游离佐剂的体液免疫效果如表23所示。
表16第一次免疫D01-D11纳米颗粒佐剂后的第28天以及第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
表17第一次免疫S01-S11纳米颗粒佐剂后的第28天以及第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
表18第一次免疫R3201-R3211纳米颗粒佐剂后的第28天以及第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
表19第一次免疫A01-A11纳米颗粒佐剂后的第28天以及第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
表20第一次免疫R2101-R2111纳米颗粒佐剂后的第28天以及第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
表21第一次免疫R2201-R2211纳米颗粒佐剂后的第28天以及第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
表22第一次免疫R3101-R3111纳米颗粒佐剂后的第28天以及第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
表23第一次免疫铝佐剂及游离佐剂(F01-F11)后的第28天以及第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
同时，以阳离子脂质溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)替代可电离脂质+胆固醇制备负载不同佐剂的阳离子纳米佐剂及GSK研发的AS01佐剂作为对比，与D01-D04纳米颗粒佐剂进行免疫效果比较，其结果如表24所示：
表24第42天各组小鼠的血清中VZV gE特异性IgG抗体滴度
从表15-23的结果可以看出，免疫了本发明的上述多种纳米颗粒佐剂施用于动物后，能产生较强的体液免疫，产生足够强的VZV gE特异性抗体；且免疫效果优于游离形式的抗原/佐剂混合注射和含铝佐剂的疫苗。
同时，从表24的结果可以看出，本发明的纳米颗粒佐剂与现有GSK研发的AS01相比其能产生更高的特异性抗体(AS01在42天产生的滴度均值为9.8×105)；与传统阳离子脂质负载不同佐剂的阳离子纳米佐剂相比，能产生更高的特异性抗体。
3、细胞免疫效果评价
(1)在第一次免疫后的第34天进行眼眶采血，培养，做流式，测INF-gamma,TNF-alpha等细胞因子。
(2)在第一次免疫后的第42天，使小鼠安乐死，取脾脏分离淋巴细胞，加药刺激，elispot检测脾脏中淋巴细胞分泌INF-gamma的能力。
所述纳米颗粒佐剂的细胞免疫效果如图2-17所示：
图2为免疫D01-D11纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的D01-D11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图3为免疫S01-S11纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的S01-S11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图4为免疫R3201-R3211纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的R3201-R3211纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图5为免疫A01-A11纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的A01-A11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图6为免疫R2101-R2111纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的R2101-R2111纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图7为免疫R2201-R2211纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的R2201-R2211纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图8为免疫R3101-R3111纳米佐剂后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+/TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，本发明的R3101-R3111纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图9为免疫F00-F11后外周血中CD4+T细胞以及CD8+T细胞中IFN-γ+,TNF-α+的百分比(第34天)。实验结果表明，游离佐剂对小鼠免疫后，能够一定程度增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，但是与图2-图8所示的纳米佐剂相比，游离佐剂对于T细胞介导的细胞免疫增强效果不如纳米佐剂。
图10为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫D01-D11纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的D01-D11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图11为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫S01-S11纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的S01-S11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图12为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫R3201-R3211纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的R3201-R3211纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图13为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫A01-A11纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的A01-A11纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图14为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫R2101-R2111纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的R2101-R2111纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图15为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫R2201-R2211纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的R2201-R221纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图16为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫R3101-R3111纳米佐剂的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，本发明的R3101-R3111纳米佐剂对小鼠免疫后，能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图17为ELISPOT检测用VZV gE刺激免疫F00-F11的脾细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数(第42天)。实验结果表明，游离佐剂对小鼠免疫后能够增加淋巴细胞IFN-γ的表达量，但是与图10-图16所示的纳米佐剂相比，游离佐剂对于T细胞介导的细胞免疫增强效果不如纳米佐剂。
从以上图2-17的结果可以看出，免疫了本发明的上述多种纳米颗粒佐剂施用于动物后，细胞免疫明显增强，能表达更多IFN-γ和TNF-α，免疫效果优于游离形式的抗原/佐剂混合注射和含铝佐剂的疫苗。另外，而且通过eslispot实验证实本发明制备的负载MPLA和QS21的纳米佐剂能表达更多IFN-γ，这表明本发明制备的纳米颗粒佐剂比起AS01佐剂及传统的阳离子纳米佐剂，能够激发更强的细胞免疫。
4、淋巴结成像分析
为了研究不同佐剂组在淋巴结中的积累行为，将小鼠随机分组(每组3只)，并将佐剂和抗原混合后皮下注射到尾巴根部皮下(每只小鼠剂量等量：VZV gE＝5μg/只，每组佐剂＝5μg/只)。各组动物分别在特定的时间点进行安乐死，并切除腹股沟和腋窝淋巴结进行体外显像。随后对各种动物在不同时间点淋巴结的荧光强度作图。
图18展示了注射了负载MPLA及CpG的各组纳米佐剂颗粒及其对应的游离佐剂组F02的小鼠淋巴结中荧光信号强度。从图18的结果可以看出，本发明的纳米颗粒具有靶向淋巴结的功能，提高了疫苗在淋巴结内的富集。

Claims (34)

1.一种纳米颗粒佐剂，其特征在于，包含可电离脂质、阴离子免疫佐剂和/或疏水性免疫佐剂及辅助脂质，所述辅助脂质包括中性辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。
2.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述可电离脂质为酸解离常数pKa在5.0～7.4之间的脂质。
3.根据权利要求2所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述可电离脂质选自4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯，1-辛基壬基8-[(2-羟乙基)[6-O-6-(十一烷氧基)己基]氨基]-辛酸酯，((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)，(10Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9-烯酰{R2-1,N-(3-(dimethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)oleamide}，(10Z,12Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9,12-二烯酰胺{R2-2,(9Z,12Z)-N-(3-(dimethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)octadeca-9,12-dienamide}，(10Z,12Z)-N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9,12-二烯酰胺{R3-1,N-(3-(diethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)oleamide}，(10Z,12Z)-N-[3-(二乙基氨基)丙基]-N-[3-乙基-1-(十八烷基氨基)-1-氧亚基庚-2-基]十八-9,12-二烯酰胺{R3-2,(9Z,12Z)-N-(3-(diethylamino)propyl)-N-(3-ethyl-1-(octadecylamino)-1-oxoheptan-2-yl)octadeca-9,12-dienamide}中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述阴离子免疫佐剂选自天然免疫激动剂、植物来源佐剂或细胞因子类佐剂中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述天然免疫激动剂为模式识别受体激动剂。
6.根据权利要求5所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述模式识别受体激动剂选自Toll样受体激动剂、核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体激动剂、视黄酸诱导基因I样受体激动剂、C-型凝集素受体激动剂或胞内核酸感受器STING激动剂中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述Toll样受体激动剂选自CPGODNs、ssRNA、23S rRNA、Pam2csk4、Pam3csk4、FLA、ssPoly(U)或poly(I:C)中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体激动剂选自C12-iE-DAP、C14-Tri-LAN-Gly、iE-DAP、Tri-DAP、M-TriDAP、Gram-PGNs、MDP或Murabutide中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述视黄酸诱导基因I样受体激动剂选自3p-hpRNA、5'ppp-dsRNA、Poly(dA:dT)、poly(I:C)LyoVec中的一种或多种。
10.根据权利要求6所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述C-型凝集素受体激动剂选自Beta-glucan peptide或Dectin-I。
11.根据权利要求6所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述胞内核酸感受器STING激动剂选自2'3'-cGAMP、3'3'-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP或cAIMP中的一种或多种。
12.根据权利要求4所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述植物来源佐剂选自QS-21、奎宁或植物凝集素中的一种或多种。
13.根据权利要求4所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述细胞因子类佐剂选自IFN-α、IL-2、TNF、IFN-γ或GM-CSF中的一种或多种。
14.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述疏水性免疫佐剂选自咪喹莫特、单磷酰脂质A、脂多糖、胞壁酰二肽、Loxoribine、Gardiquinod、瑞喹莫德；细菌来源佐剂破伤风类毒素、大肠杆菌不耐热毒素和沙门菌菌毛蛋白；角鲨烯、热休克蛋白70或热休克蛋白90中的一种或多种。
15.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述中性辅助脂质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，二硬酯酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰基卵磷脂，二油酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰基卵磷脂，二月桂酰基卵磷脂，二芥酰磷脂酰胆碱，1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂，二硬脂酰基磷脂酰胆碱，棕榈酰磷脂酰丝氨酸，二油酰基磷脂酰丝氨酸，二油酰磷脂酰甘油，蛋黄磷脂酰甘油，1-棕榈酰基-2油酰基磷脂酰甘油，1,2-棕榈酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酸，二棕榈酰磷脂酸中的一种或多种。
16.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述聚乙二醇化脂质选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000，2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000中的一种或多种。
17.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述阴离子免疫佐剂为CpG寡脱氧核苷酸和/或植物来源佐剂QS21；所述疏水性免疫佐剂为单磷酰脂质A和/或咪喹莫特。
18.根据权利要求1～17任一所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述可电离脂质、阴离子免疫佐剂、疏水性免疫佐剂及辅助脂质的摩尔质量比为35～65：10～30：10～30：35～65。
19.根据权利要求18所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述可电离脂质、阴离子免疫佐剂、疏水性免疫佐剂及辅助脂质的摩尔质量比为3：1：1：3或2：1：1：2。
20.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述可电离脂质、中性辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的摩尔质量比为44～55：9.4～10：38.5～45:1.5～1.6。
21.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述包含阴离子免疫佐剂的溶液的pH为3～5。
22.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述纳米颗粒佐剂为脂质体核壳结构，核内为阴离子免疫佐剂，壳为包裹在核上的可电离脂质和辅助脂质以及疏水性免疫佐剂；或核内为部分阴离子免疫佐剂，壳为包裹在核上的可电离脂质和辅助脂质以及疏水性免疫佐剂，颗粒表面负载另外部分阴离子免疫佐剂。
23.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述纳米颗粒佐剂为近似球形。
24.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述纳米颗粒佐剂的粒径为30～200nm。
25.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述纳米颗粒佐剂的Zeta电位为-10至+20mV。
26.根据权利要求1所述纳米颗粒佐剂，其特征在于，所述阴离子免疫佐剂和/或疏水性免疫佐剂的包封率为70％～100％。
27.权利要求1～26任一所述纳米颗粒佐剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提供包含可电离脂质、辅助脂质和疏水性免疫佐剂的溶液，包含阴离子免疫佐剂的溶液；
S2.使包含可电离脂质、辅助脂质和疏水性免疫佐剂的溶液通过第一通道，包含阴离子免疫佐剂的溶液分别通过第二通道，第三通道和第四通道，四个通道的溶液到达混合区域中，进行混合，得到纳米颗粒佐剂溶液；
S3.逐级透析溶剂，得到纳米颗粒佐剂水溶液。
28.根据权利要求27所述纳米颗粒佐剂的制备方法，其特征在于，所述各通道的流速相同，为1～40mL/min。
29.根据权利要求27所述纳米颗粒佐剂的制备方法，其特征在于，所述各通道的流速均为10mL/min。
30.权利要求1～26任一所述纳米颗粒佐剂在制备与水痘-带状疱疹病毒感染相关疾病的免疫原性组合物中的应用。
31.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物包含权利要求1～26任一所述纳米颗粒佐剂。
32.根据权利要求31所述免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的辅料。
33.根据权利要求31所述免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物为疫苗。
34.根据权利要求31所述免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还包含VZV抗原和减毒VZV。
CN202210994182.3A 2022-08-18 2022-08-18 一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用 Pending CN117205174A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210994182.3A CN117205174A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用
PCT/CN2023/113427 WO2024037575A1 (zh) 2022-08-18 2023-08-17 一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210994182.3A CN117205174A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117205174A true CN117205174A (zh) 2023-12-12

Family

ID=89044934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210994182.3A Pending CN117205174A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN117205174A (zh)
WO (1) WO2024037575A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118078983A (zh) * 2024-02-05 2024-05-28 昆明超启生物科技有限公司 一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014202674B2 (en) * 2007-05-04 2014-08-14 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
EP3556353A3 (en) * 2014-02-25 2020-03-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
US20230132397A9 (en) * 2018-07-27 2023-04-27 Children's Medical Center Corporation Use of toll-like receptor 2 (tlr-2) agonist for modulating human immune response
CN112137958A (zh) * 2020-06-03 2020-12-29 上海舜纳生物科技有限公司 一种含阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体及其制备方法
CN113827546A (zh) * 2020-06-22 2021-12-24 上海大学 一种含阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体的注射用水凝胶及其制备方法
CN116554125B (zh) * 2022-01-27 2024-04-05 广州立得生物医药科技有限公司 一种阳离子脂质类似物、其组合物及应用
CN114767844A (zh) * 2022-04-28 2022-07-22 泰州拜奥生物技术有限公司 一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其应用
CN116407625A (zh) * 2022-10-24 2023-07-11 四川大学华西医院 一种用于增强核酸免疫效力的脂质纳米颗粒及其制备方法和用途

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118078983A (zh) * 2024-02-05 2024-05-28 昆明超启生物科技有限公司 一种适合规模生产的疫苗佐剂及其配制工艺

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024037575A1 (zh) 2024-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6625587B2 (ja) Ｔｌｒ２を活性化するか、またはその活性を増加させるアジュバントを含むリポソーム組成物およびその使用
Watson et al. Design considerations for liposomal vaccines: influence of formulation parameters on antibody and cell-mediated immune responses to liposome associated antigens
Slütter et al. Adjuvant effect of cationic liposomes and CpG depends on administration route
JP5971945B2 (ja) カチオン性脂質の鏡像異性体による免疫応答の刺激
Dey et al. Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses induced by immunogens
US20190275145A1 (en) Particulate vaccine formulations
JP2014528955A5 (zh)
JP2000513352A (ja) リポソームインフルエンザワクチンの組成物および方法
CN108324938B (zh) 一种颗粒型佐剂及其制备方法和应用
US7767658B2 (en) Vaccine composition
WO2024037575A1 (zh) 一种共负载阴离子和疏水性免疫佐剂的纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用
JPH04210925A (ja) 鼻腔内または吸入投与用ワクチン製剤およびその製造方法
Yazdani et al. Stimulation of tumor-specific immunity by p5 HER-2/neu generated peptide encapsulated in nano-liposomes with high phase transition temperature phospholipids
WO2007039583A1 (en) Liposomal vaccine compositions comprising a polysaccharide antigen and a protein adjuvant
He et al. Cistanche deserticola polysaccharide-functionalized dendritic fibrous nano-silica as oral vaccine adjuvant delivery enhancing both the mucosal and systemic immunity
EP2514410B1 (en) Liposome composition, preparation method thereof, and usage of the composition as pneumonia vaccine
Myschik et al. Immunostimulatory lipid implants containing Quil-A and DC-cholesterol
WO1990001947A1 (en) Affinity associated vaccine
WO2017220099A1 (en) Adjuvants with modified drainage properties
Watson et al. Corrigendum to “Design considerations for liposomal vaccines: Influence of formulation parameters on antibody and cell-mediated immune responses to liposome associated antigens”[Vaccine 30 (13)(2012) 2256–2272]
Matsuo et al. Application of Poly (γ‐Glutamic Acid)‐Based Nanoparticles as Antigen Delivery Carriers in Cancer Immunotherapy
KR101498275B1 (ko) 리포좀 조성물, 그 제조방법, 및 폐렴 백신으로서의 그 용도
CN117731767A (zh) 一种双抗原展示纳米疫苗及其制备方法和应用
Bal et al. Adjuvant effect of cationic liposomes and CpG depends on administration route: intranodal, intradermal, transcutaneous and nasal immunisation in mice
Heuts et al. Efficient tumor control by vaccination with MHC class I and class II neoepitopes formulated in cationic liposomes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination