CN103025351A

CN103025351A - 包含胆固醇和作为唯一的佐剂-载剂分子的cpg的疫苗

Info

Publication number: CN103025351A
Application number: CN2011800369063A
Authority: CN
Inventors: H.L.戴维斯; P.J.多米诺斯基; R.D.维拉特纳
Original assignee: Pfizer Animal Health SA
Current assignee: Zoetis Belgium SA
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: AU2016203611B2; BR112012030337B1; AU2016203611A1; EP2575878A1; NZ603527A; AU2011259718A1; CL2012003299A1; PL2575878T3; JP6133482B2; US20130084306A1; AU2011259718B2; JP2011251963A; JP2017048187A; MX347471B; JP6034285B2; KR101528021B1; ZA201208837B; HUE038894T2; CA2800158A1; EP2575878B1

Abstract

本发明描述了具有一种或多种抗原和胆固醇的疫苗。本发明的各方面涉及具有一种或多种抗原、一种或多种免疫调节分子和胆固醇的疫苗。本发明的各方面涉及本发明的疫苗在用于对人和动物的病症的治疗和/或预防方面的应用。

Description

包含胆固醇和作为唯一的佐剂-载剂分子的CPG的疫苗

本发明要求于2010年5月28日提交的美国临时专利申请第61/349,244号的优先权，本文通过援引并入其全部内容。

技术领域

本发明涉及具有一种或多种抗原和胆固醇的疫苗及其应用。本发明还涉及具有一种或多种抗原和一种或多种免疫调节分子以及胆固醇的疫苗及其应用。

背景技术

已发现胆固醇能增强免疫调节分子的活性，以及因此胆固醇和免疫调节分子的组合可以用在人和动物病症的治疗和/或预防中。本发明描述了包含一种或多种抗原和胆固醇的疫苗，以及包含一种或多种抗原、一种或多种免疫调节分子和胆固醇的疫苗。

发明内容

在某些方面，本发明涉及包含一种或多种抗原和胆固醇的疫苗。在某些方面，所述一种或多种疫苗各自独立地为微生物抗原、自身抗原、肿瘤抗原、过敏原或成瘾性物质。

在某些方面，本发明涉及包含一种或多种抗原和一种或多种免疫调节分子以及胆固醇的疫苗。在某些方面，疫苗还包含药物载剂。在某些方面，所述一种或多种抗原各自独立地为微生物抗原、自身抗原、肿瘤抗原、过敏原或成瘾性物质。

在某些方面，本发明涉及在有需要的受试对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法，其包括以可有效地在所述受试对象中诱导抗原特异性免疫应答的量施用包含一种或多种抗原和胆固醇的疫苗。

在某些方面，本发明涉及在有需要的受试对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法，其包括施用包含一种或多种抗原和一种或多种免疫调节分子以及胆固醇的疫苗。

附图说明

图1：展示在无佐剂存在时或者在CpG或CpG+胆固醇作为佐剂存在时T细胞的抗原特异性细胞因子分泌。图1a：分泌一重或双重细胞因子的CD4+T细胞的图。图1b：分泌三重细胞因子的CD4+T细胞的图。图1c：分泌一重或双重细胞因子的CD8+T细胞的图。图1d：分泌三重细胞因子的CD8+T细胞的图。

图2：在无佐剂、CpG和CpG+胆固醇存在时的IL-2(图2a)和IFN-γ(图2b)产生的图。

图3：在无佐剂存在时或者在CpG或CpG+胆固醇作为佐剂存在时卵清蛋白特异性CD8+T细胞应答的图。图3a～3b：细胞毒性T细胞应答，图3c～3d：抗原特异性CD8+T细胞群。

图4：在无佐剂存在时或者在CpG或CpG+胆固醇作为佐剂存在时卵清蛋白特异性抗体滴度的图。柱形上方的数字表示IgG2c/IgG1之比。

图5：抗原、CpG和胆固醇的透射电子显微镜照片。

图6：描绘在CpG+胆固醇(CpG:胆固醇的比例为1:1或1:10)、Advasure-DEAE/右旋糖苷、QCDCR或QCDCR+CpG存在时用五价的失活病毒疫苗BVDV1&2、IBRV、PI3V和BRSV免疫接种的牛犊的注射位点反应的图。某些动物以商用疫苗进行免疫。安慰剂组动物接受无菌盐水。表1绘制了在CpG+胆固醇(CpG:胆固醇的比例为1:1或1:10)、Advasure-DEAE/右旋糖苷、QCDCR或QCDCR+CpG存在下用五价的失活病毒疫苗BVDV1&2、IBRV、PI3V和BRSV进行接种后，在用BVDV-2激发后具有临床疾病、发烧、白细胞减少症或病毒血症的牛犊的百分比。某些动物以商用疫苗进行免疫。安慰剂组动物接受无菌盐水。

图7：以与各种佐剂(包括CpG+胆固醇)一同配制的百日咳杆菌粘附素(p68)免疫接种的猪中的抗原特异性抗体应答的图。

序列说明

SEQ ID NO:1-CPG79095’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’

SEQ ID NO:2-CpG245555’TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3’

SEQ ID NO:3-CPG101045’TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT3’

SEQ ID NO:4-CPG101015’TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG3’

SEQ ID NO:5-CPG101095’TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTCCCG3’

SEQ ID NO:6-CpG23407

5’T*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’

SEQ ID NO:7-CPG21798

5’T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:8-CPG23430

5’T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:9-CpG24558

5’T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’

SEQ ID NO:10-CPG23871

5’JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:11-CPG23873

5’JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’

SEQ ID NO:12-CPG23874

5’*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’

SEQ ID NO:13-CPG23875

5’EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:14-CpG23877

5’JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T3’

SEQ ID NO:15-CpG23878

5’JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T3’

SEQ ID NO:16-poly I:C ODN1a5′-ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CICIC-3′.

SEQ ID NO:17-5’GGGGACGACGTCGTGGGGGGG3’

SEQ ID NO:18-

5’G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G3’

SEQ ID NO:19-5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’

SEQ ID NO:20-5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA3’

SEQ ID NO:21-

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T3’

SEQ ID NO:22 -

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T3’

SEQ ID NO:23 -

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’

SEQ ID NO:24 -

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’

SEQ ID NO:25 -

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A3’

SEQ ID NO:26 - 5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:27 - 5’TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:28 - 5’TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:29 - 5’TCGGACGTTCGGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:30 - 5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:31 - 5’TCGACGTTCGGCGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:32 - 5’TCGACGTTCGGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:33 - 5’TCGCGTCGTTCGGCGCCG3’

SEQ ID NO:34 - 5’TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:35 - 5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:36 - 5’TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG3’

SEQ ID NO:37 -

5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:38 -

5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:39 -

5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:40 -

5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:41 -

5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:42 -

5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:43 -

5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:44 - 5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:45 - 5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:46-

5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:47-

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:48-

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:49-

5’T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G3’

SEQ ID NO:50-

5’T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’

(*)表示稳定化的核苷酸间连接的存在，而“_”表示磷酸二酯键。J表示碘基修饰的核苷酸而E表示乙基修饰的核苷酸。

具体实施方式

本发明的各方面涉及具有一种或多种抗原和胆固醇的疫苗，以及具有一种或多种抗原和一种或多种免疫调节分子和胆固醇的疫苗。在本发明的各方面中，公开了通过施用本发明的疫苗在有需要的受试对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法。此外还公开了所述疫苗在制备用于治疗病症的药物中的应用。

在本发明的各方面中，一种或多种抗原各自独立地为微生物抗原、自身抗原、肿瘤抗原、过敏原或成瘾性物质。在某些方面，微生物抗原源自细菌、病毒或寄生物。在某些方面，抗原是肽、与载体蛋白缀合的肽、多肽、重组蛋白、纯化蛋白、全灭活病原体、减毒活病毒、减毒活细菌、在病毒或细菌载体内表达的抗原、多糖、与载体蛋白缀合的多糖、与病毒样颗粒缀合的蛋白、半抗原、与载体蛋白缀合的半抗原或小分子。

在本发明的方面中，抗原源自细菌。在某些方面，细菌抗原是全灭活细菌、减毒或细菌或细菌纯化蛋白。

在本发明的各方面中，细菌包括但不限于以下物种及其组合：醋酸钙不动杆菌(Aceinetobacter calcoaceticus)、帕氏醋酸菌(Acetobacterpaseruianus)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、以色列放线菌(Actinomyces israelli)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、富养产碱菌(Alcaliges eutrophus)、酸热耐热杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、闪烁古生球菌(Arhaeglobusfulgidus)、芽孢杆菌属(Bacillus)种、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophillus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、热链形芽孢杆菌(Bacillus thermocatenulatus)、拟杆菌属(Bacteroides)种、博德特菌属(Bordetella)种、支气管败血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、布鲁氏菌属(Brucella)种、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaglumae)、短螺旋体属(Brachyspira)种、猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteria)、肠道短螺旋体(Brachyspira pilosicoli)、弯曲菌属(Camphylobacter)种、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、猪肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、嗜衣原体属(Chlamydophila)种、粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)、(Clostridium species)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、棒状杆菌属(Corynebacterium)种、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、犬艾里西体(Ehrlichia canis)、肠杆菌属(Enterobacter)种、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肠球菌属(Enterococcus)种、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathieae)、埃希氏菌属(Escherichia)种、大肠杆菌(Escherichia coli)、具核梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)、嗜血杆菌属(Haemophilus)种、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、螺杆菌属(Helicobacter)种、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、猪螺杆菌(Helicobacter suis)、克雷伯菌属(Klebsiella)种、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilis)、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)、军团杆菌属(Legionella)种、肺炎军团杆菌(Legionella pneumophilia)、钩端螺旋体属(Leptospira)种(如犬型钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流行性伤寒钩端螺旋体(Leptospiragrippotyposa)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)、博氏哈德焦-牛钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、博氏哈德焦-帕希诺钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagiae)、波蒙娜钩端螺旋体(Leptospira pomona)、钩端螺旋体(Leptospira)、伯拉第斯拉瓦钩端螺旋体(Leptospira bratislava)等)、李斯特菌属(Listeria)种、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、脑膜炎双球菌类细菌(Meningococcal bacteria)、莫拉氏菌属(Moraxella)种、分支杆菌属(Mycobacterium)种、牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、堪萨斯分支杆菌(Mycobacterium kansaii)、戈登氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、支原体属(Mycoplasma)种(如猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、蕈状枝原体(Mycoplasma mycoides)蕈状LC亚种、奈瑟氏菌属(Neisseria)种、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、(Odoribacter denticanis)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)种、溶血性巴斯德氏菌(曼海姆菌)(Pasteurella(Mannheimia)haemolytica)、多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、发光无色杆菌(Photorhabdus luminescens)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、牙周卟啉单胞菌(Porphyromonas gulae)、唾液卟啉单胞菌(Porphyromonas salivosa)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、变形杆菌属(Proteus)种、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、假单胞菌属(Pseudomonas)种、威斯康辛假单胞菌(Pseudomnas wisconsinensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光C9假单胞菌(Pseudomonasfluorescens C9)、荧光SIKW1假单胞菌(Pseudomonas fluorescensSIKW1)、脆弱假单胞菌(Pseudomonas fragi)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、解油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、假单胞菌种B11-1、静止嗜冷杆菌(Psychrobacter immobilis)、立克次体属(Rickettsia spp)、普氏立克氏体(Rickettsia prowazekii)、立克次氏立克次体(Rickettsia rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)种、邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraeuis)、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、新港沙门氏菌(Salmonella newport)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、志贺氏菌属(Shigella)种、钝顶螺旋藻(Spirlina platensis)、葡萄球菌属(Staphylococci)种、金黄葡萄球菌(Staphlyoccocus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphyloccoccus epidermidis)、葡萄球菌(Staphylococcushyicus)、链球菌属(Streptococcus)种、猪葡萄球菌(Streptobacillusmoniliformis)、β-溶血性链球菌(beta-hemolytic Streptococcus)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)、链球菌(viridans组)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、链球菌(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、突变链球菌(Streptococcusmutans)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、血液链球菌(Streptococcussanguis)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、肉桂色链霉菌(Streptomycescinnamoneus)、脱角质链霉菌(Streptomyces exfoliates)、疥链霉菌(Streptomyces scabies)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、集胞藻属(Syechocystis)、密螺旋体属(Treponena)种、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、微小密螺旋体(Treponema minutum)、梅毒密螺旋体(Treponema palladium)、雅司密螺旋体(Treponema pertenue)、蚀疮溃疡密螺旋体(Treponema phagedenis)、屈折密螺旋体(Treponemarefringens)、文氏密螺旋体(Treponema vincentii)、弧菌属(Vibrio)种、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和耶尔森氏菌属(Yersinia)种。

细菌病原体的多肽或多糖包括但不限于：导致疖病的杀鲑气单胞菌(Aeromonis salmonicida)的铁调节外膜蛋白(IROMP)、外膜蛋白(OMP)和A蛋白；导致细菌性肾病(BKD)的鲑肾杆菌(Renibacteriumsalmoninarum)的p57蛋白；耶森氏菌病的主要表面结合抗原(msa)、表面表达细胞毒素(mpr)、表面表达溶血素(ish)和鞭毛抗原；巴斯德氏菌病的胞外蛋白(ECP)、IROMP和结构蛋白；鳗弧菌(Vibrosis anguillarum)和奥德弧菌(V.ordalii)的OMP和鞭毛蛋白；叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)和迟缓爱德华菌(E.tarda)的OMP蛋白、aroA和purA；小瓜虫(Ichthyophthirius)的表面抗原；柱状嗜纤维菌(Cytophagacolumnaris)的结构蛋白和调节蛋白；以及立克次体的结构蛋白和调节蛋白；来自金黄葡萄球菌的IsdA、ClfA、ClfB、Opp3A、HLA和被膜多糖。

在本发明的各方面中，抗原源自病毒。在某些方面中，病毒抗原是全灭活或失活病毒、活减毒病毒或病毒纯化蛋白或肽。

在某些方面，病毒是感染动物的病毒，包括但不限于以下物种及其组合：禽疱疹病毒、禽流感病毒、禽白血病病毒、禽副粘病毒、边界病病毒、牛冠状病毒、牛流行热病毒、牛疱疹病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛副流感病毒3、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、I型BVDV、II型BVDV、犬腺病毒、犬冠状病毒(CCV)、犬瘟热病毒、犬疱疹病毒、马疱疹病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬细小病毒、犬呼吸道冠状病毒、古典猪瘟病毒、东方马脑炎病毒(EEE)、马传染性贫血病毒、马流感病毒、西尼罗病毒、猫杯状病毒、猫肠冠状病毒、猫免疫缺陷病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫疱疹病毒、猫流感病毒、猫白血病病毒(FeLV)、猫病毒性鼻气管炎病毒、慢病毒、马立克氏病病毒、新城疫病毒、绵羊疱疹病毒、绵羊副流感3型病毒、绵羊进行性肺炎病毒、绵羊肺腺癌病毒、泛热带CCV、I型猪环状病毒(PCV)、II型PCV、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪疱疹病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒、伪狂犬病毒、狂犬病毒、原病毒、鼻病毒、牛瘟病毒、猪流感病毒、传染性肠胃炎病毒、火鸡冠状病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西尼罗病毒和西方马脑炎病毒。

在某些方面，所述病毒是感染人的病毒，包括但不限于：腺病毒科(大多数腺病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；星形病毒科；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒(bunga virus)、白蛉病毒和内罗病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如，导致肠胃炎的毒株)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；纤丝病毒科(例如，埃博拉病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如，丙肝病毒、登革病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；虹彩病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；诺瓦克病毒和相关病毒；正粘病毒科(例如，流感病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；细小病毒科(细小病毒)；微小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；痘病毒科(例如，天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；呼肠孤病毒科(呼肠孤病毒、呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；逆转录病毒(例如，人免疫缺陷病毒如HIV-1或HIV-2(也称HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV)或HIV-III；以及其他分离株，如HIV-LP)；弹状病毒科(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原、丁型肝炎的病原(据认为是乙型肝炎病毒的缺陷性随体(satellite))。

在本发明的各方面，抗原可源自寄生物。在某些方面，所述寄生物是来自无形体属(Anaplasma)的蛋白、钩虫属(钩虫)、蛔虫属、巴贝斯虫属、球虫属、隐孢子虫属、微小隐孢子虫、恶丝虫属(犬恶丝虫)、艾美虫属种、肝片吸虫(肝吸虫)、贾第虫属、哈蒙德虫属、等孢子球虫属(Isopsora)、利什曼原虫属种、犬新孢子虫、肉孢子虫属、血吸虫属、类圆线虫属、绦虫属、刚地弓形虫、毛线虫属种、毛滴虫属种或锥虫属种以及它们的组合。

在某些方面，寄生物是外寄生物。在某些方面，外寄生物包括但不限于蜱类，包括硬蜱属、扇头蜱属、草原革蜱属、微小牛蜱属、璃眼蜱属、嗜群血蜱属的物种以及它们的组合。

在本发明的某些方面，抗原是自身抗原。在某些方面，自身抗原是受试对象的自身细胞或细胞产物的引起受试对象中的免疫应答的抗原。在某些方面，自身抗原包括但不限于：肿瘤抗原、与阿尔茨海默病相关的抗原、针对抗体的抗原或者从人内源性逆转录病毒元件表达的抗原。与阿尔茨海默病相关的抗原可以为τ-淀粉样蛋白或β-淀粉样蛋白。针对抗体的抗原可以为针对人类抗体的抗原，例如在某些实施方式中抗原为IgE。

在本发明的方面中，抗原为肿瘤抗原。在某些方面，肿瘤抗原为以下的一种或多种：WT1、MUC1、LMP2、HPV E6或HPV E7、EGFR或变体形式(例如，EGFRvIII)、HER-2/neu、独特型、MAGE A3、p53非突变体、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、肉瘤异位断点、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、FucosylGM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(动物)、CYP1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、豆球蛋白(Legumain)、Tie2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2或Fos相关抗原1。已根据以下标准对此类肿瘤抗原进行分级，例如，a)治疗功能、b)免疫原性、c)抗原在致肿瘤性中的作用，d)特异性、表达水平和抗原阳性细胞的百分比、g)抗原表位的数目以及h)抗原表达的细胞位置(参见Cheever,M.A.等，Clincal Cancer Research,2009年9月1日,15(17):5323-5337)。在某些实施方式中，肿瘤抗原是存活素、Her-2、EFGRvIII、PSA、PAP或PMSA中的一种或多种。

在本发明的一些方面中，抗原是过敏原。过敏原是指可能在易感受试对象中诱导过敏性或哮喘性响应的物质(抗原)。过敏原的列表巨大且可能包括花粉、昆虫毒液、动物皮毛粉尘、真菌孢子和药物(例如，青霉素)。天然的、动物和植物过敏原的实例包括但不限于对以下种属具特异性的蛋白以及它们的组合：冰草属（例如，匍匐冰草）、剪股颖属（例如，小糠草）、桤木属、赤杨属（赤杨）、链格孢属（链格孢菌）、豚草属（美洲豚草）、黄花茅属（例如，黄花茅）、蜜蜂属（例如，一年生蜜蜂）、燕麦草属（例如，花叶燕麦草）、蒿属（艾草）、燕麦属（例如，燕麦）、桦木属（白桦）、小蠊属（例如，德国小蠊）、雀麦属（例如，无芒雀麦）、犬属（家犬）、扁柏属（例如，日本扁柏）、柳杉属(日本柳杉)、柏木属（例如，丝柏、绿干柏和金冠柏）、鸭茅属（例如，鸭茅）、尘螨属（例如，粉尘螨）、猫属（家猫）、羊茅属（例如，牛尾草）、绒毛草属（例如，绒毛草）、桧属（例如，Juniperus sabinoides、铅笔柏、欧洲刺柏和Juniperus ashei）、黑麦草属（例如，多年生黑麦草和一年生黑麦草）、洋橄榄属（油橄榄）、墙草属（例如，药用墙草和欧蓍草）、雀稗属（例如，百喜草）、大蠊属（例如，美洲大蠊）、虉草属（例如，虉草）、梯牧草属（例如，梯牧草）、车前属（例如，长叶车前草）、早熟禾属（例如，草地早熟禾和加拿大早熟禾）、栎木属（白栎）、黑麦属（例如，黑麦）、高粱属（例如，假高粱）、金钟柏属（例如，东方金钟柏(Thuya orientalis)）和小麦属（例如，小麦）。

在本发明的一些方面，抗原是成瘾性物质。成瘾性物质是致使受试对象发展出对该物质的成瘾性的任何化学或生物物质，包括合成的或人工的物质。在某些方面，成瘾性物质是尼古丁或可卡因。在某些实施方式中，处于针对尼古丁成瘾的疫苗中的抗原是与载剂缀合的尼古丁或尼古丁样半抗原。在某些实施方式中，尼古丁或尼古丁样半抗原所缀合的载剂是白喉类毒素。

在本发明的一些方面，抗原或半抗原与载体蛋白缀合。在某些方面，载体蛋白是细菌类毒素或衍生物、假单胞菌外毒素、KLH或病毒样颗粒。在某些方面，细菌类毒素是白喉类毒素或其衍生物。在某些方面，细菌类毒素是CRM197。在某些方面，病毒样颗粒是HBsAg、HBcAg、大肠杆菌噬菌体Qβ、诺瓦克病毒或流感HA。

本发明的一些方面涉及具有胆固醇的疫苗。胆固醇是化学式为C₂₇H₄₅OH的白色结晶物质。它是被分类为脂质的环状烃类醇。脂质是不溶于水但可溶于非极性有机溶剂、触感油腻且与糖类和蛋白质一起作为活细胞的基本结构材料的任何有机化合物组，包括但不限于脂肪、油、蜡、甾醇和甘油三酯。胆固醇不溶于水但可溶于许多有机溶剂。

在本发明的一些方面中，甾醇是指动物中的由萜类前体通过生物方式产生的化合物。其包含类固醇环结构、具有羟基(OH)。在某些方面，羟基可以与碳-3连接。脂肪酸取代基的烃链在长度上有所不同。在某些方面，烃链可以为16至20个碳原子。在某些方面，烃链可以为饱和的或不饱和的。甾醇可以在环结构中含有一种或多种双键，并且可以包括与环相连的多种取代基。甾醇及其脂肪酸酯可能不溶于水。脂肪酸酯是指对应于无机盐的由缩合反应形成的任何有机化合物类别，在所述缩合反应中一分子有机酸与一分子醇联合并消去一分子水。在某些方面，合成类固醇包括但不限于：糖皮质激素(例如，强的松、地塞米松、去炎松)、盐皮质激素(例如，氟氢可的松)、维生素D(例如，二氢速甾醇)、雄激素(例如，氧雄龙、诺龙、促蛋白合成类固醇)、雌激素(例如，己烯雌酚)和孕激素(例如，炔诺酮、醋酸甲羟孕酮)。在某些方面，可以使用胆酸盐，例如脱氧胆酸钠。

在本发明的一些方面，甾醇包括但不限于诸如β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇等天然类固醇。此类甾醇可商购。例如，胆固醇公开于Merck Index第12版第369页中。

在本发明的一些方面，甾醇可以用作佐剂。在某些方面，甾醇的量可以为约1μg/剂疫苗～约5,000μg/剂疫苗。在某些方面，甾醇的量可以为约1μg/剂疫苗～约4,000μg/剂疫苗、约1μg/剂疫苗～约3,000μg/剂疫苗、约1μg/剂疫苗～约2,000μg/剂疫苗或约1μg/剂疫苗～约1,000μg/剂疫苗。在某些方面，甾醇的量可以为约5μg/剂疫苗～约750μg/剂疫苗、约5μg/剂疫苗～约500μg/剂疫苗、约5μg/剂疫苗～约250μg/剂疫苗、约5μg/剂疫苗～约100μg/剂疫苗、约15μg/剂疫苗～约100μg/剂疫苗或约30μg/剂疫苗～约75μg/剂疫苗。

在本发明的一些方面中，疫苗具有一种或多种抗原和胆固醇。在某些方面，以重量计与抗原的量相比，胆固醇的量高出约0.1倍至约50倍。在某些方面，以重量计，胆固醇的量比抗原的量高出1倍至约10倍。在某些方面，胆固醇的量与抗原在重量上相等。

在本发明的一些方面，疫苗具有一种或多种抗原和一种或多种免疫调节性分子以及胆固醇。在某些方面，疫苗还包含药物载剂。

在本发明的一些方面，“组合”或“与…组合”是指一种或多种抗原的共混物、组合或与之邻近，以及一种或多种抗原和一种或多种免疫调节性分子的共混物或组合或与之邻近。在一些方面，可以借助物理手段经由一种或多种连接子使一种或多种抗原和/或一种或多种免疫调节性分子与胆固醇相连。连接子包括但不限于直接或间接的连接子。在一些方面，可以将一种或多种抗原和/或一种或多种免疫调节性分子与胆固醇一同封装。

在本发明的一些方面，可以使一种或多种抗原与一种或多种免疫调节性分子共混。在一些方面，可以使一种或多种抗原与胆固醇共混。在一些方面，可以使一种或多种免疫调节性分子与胆固醇共混。在一些方面，可以使一种或多种免疫调节性分子与抗原和胆固醇共混。在一些方面，可以使一种或多种免疫调节性分子与胆固醇共混，而可使一种或多种抗原分开。在一些方面，可以使一种或多种抗原与胆固醇共混，而可使一种或多种免疫调节性分子分开。在一些方面，可以使一种或多种抗原和/或一种或多种免疫调节性分子与胆固醇组合。

在本发明的一些方面，相对于抗原量的胆固醇的量大于抗原的量。在某些方面，与抗原的量相比，相对于抗原的量的胆固醇的量高出约0.1重量倍至约50重量倍。在某些方面，以重量计，与抗原的量相比，相对于抗原的量的胆固醇的量高出约10倍至约50倍、约20倍至约40倍、约30倍至约35倍。在某些方面，以重量计，与抗原的量相比，相对于抗原的量的胆固醇的量高出1倍至约10倍。在某些方面，相对于抗原的量的胆固醇的量与抗原在重量上相等。在某些方面，抗原可以为一种或多种抗原，而抗原的重量是所述一种或多种抗原的重量。

在本发明的一些方面，免疫调节性分子(一种或多种免疫调节性分子)是调节受试对象中的免疫细胞的分子。该效应可以例如通过受体而被直接介导，或例如通过由受到直接调节的另一个免疫细胞释放的细胞因子或趋化因子而被间接介导。对免疫应答的诱导是指免疫细胞的数目或活性的任何增加，或如细胞因子等免疫因子的表达或绝对水平的增加。免疫细胞包括但不限于NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞和其它抗原呈递细胞。细胞因子包括但不限于白细胞介素、TNF-α、IFN-α、IFN-β和IFN-γ。在一些方面，免疫调节剂是在与抗原一同使用时增强抗原特异性体液(例如，抗体)免疫应答和/或细胞(例如T细胞)免疫应答。

在某些方面，免疫调节性分子是TLR激动剂、抗微生物肽、细胞因子、趋化因子、NOD配体或寡核苷酸。在某些方面，TLR激动剂是寡核糖核苷酸(ORN)或活化TLR7和/或TLR8的小分子。在某些方面，TLR激动剂是通过TLR9活化的寡脱氧核苷酸(ODN)。在某些方面，TLR9激动剂是含有未甲基化的CpG基序、B类寡脱氧核苷酸、C类寡脱氧核苷酸或P类脱氧核苷酸的ODN。在某些方面，TLR9激动剂是IMO-2055、IMO-2125或IMO-2134(QAX935)。在其它方面，TLR激动剂是活化TLR3的聚(I:C)。在某些方面，聚(I:C)是具有序列5′-ICI CICICI CIC ICI CIC ICI CIC IC-3′(SEQ ID NO:16)的ODN1a。

在本发明的一些方面，寡核苷酸可以涵盖各种化学修饰和取代(相比天然RNA和DNA)，这涉及磷酸二酯核苷间桥键、β-D-核糖单元和/或天然核苷碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰的实例是本领域技术人员已知的，且如Uhlmann E等，(1990)ChemRev90:543;“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis andProperties&Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal,Ed,Humana Press,Totowa,USA1993;Crooke ST等，(1996)Annu RevPharmacol Toxicol36:107-129；和Hunziker J等，(1995)Mod SynthMethods7:331-417中所述。在某些方面，寡核苷酸可以具有一种或多种修饰，其中每种修饰相对于由天然DNA或RNA组成的相同序列的寡核苷酸位于特定的磷酸二酯核苷间桥键和/或特定的β-D-核糖单元和/或特定的天然核苷碱基的位置。

在某些方面，寡核苷酸可以包含一种或多种修饰，且其中每种修饰独立地选自：

a)位于核苷的3’和/或5’端的磷酸二酯核苷间桥键被经修饰的核苷间桥键替代，

b)位于核苷的3’和/或5’端的磷酸二酯桥键被去磷酸桥键替代，

c)来自糖磷酸酯主链的糖磷酸酯单元被另一单元所替代，

d)β-D-核糖单元被经修饰的糖单元替代，和

e)天然核苷碱基被经修饰的核苷碱基所替代。

在本发明的一些方面，寡核苷酸可以包含经修饰的核苷酸间连接，如上文a)或b)中所述那些。这些经修饰的连接可以部分地抵抗降解(即，是稳定化的)。“稳定化的寡核苷酸分子”是因此类修饰所产生的相对可抵抗体内降解(例如，经由核酸外切酶或核酸内切酶)的寡核苷酸。在某些方面，具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸可以提供最大的活性并保护该寡核苷酸不受细胞内的核酸外切酶和核酸内切酶的降解。

位于核苷的3’和/或5’端的磷酸二酯核苷间桥键可以由经修饰的核苷间桥键替代，其中所述经修饰的核苷间桥键例如选自：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR¹R²-氨基磷酸酯、硼磷酸酯(boranophosphate)、α-羟基苄基膦酸酯、磷酸-(C₁～C₂₁)-O-烷基酯、磷酸-[(C₆～C₁₂)芳基-(C₁～C₂₁)-O-烷基]酯、(C₁～C₈)烷基膦酸酯和/或(C₆～C₁₂)芳基磷酸酯桥键、(C₇～C₁₂)-α-羟甲基芳基(例如，如WO95/01363中所述)，其中(C₆-C₁₂)芳基、(C₆-C₂₀)芳基和(C₆-C₁₄)芳基可选地由卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R¹和R²各自独立地为氢、(C₁～C₁₈)烷基、(C₆～C₂₀)芳基、(C₆～C₁₄)芳基-(C₁～C₈)烷基，优选为氢、(C₁～C₈)烷基，优选为(C₁～C₄)烷基和/或甲氧基乙基，或R¹和R²与携带它们的氮原子一起形成五至六元杂环，其可以额外含有选自O、S和N的组的其它杂原子。

位于核苷的3’和/或5’端的磷酸二酯桥键被去磷酸桥键(去磷酸桥)的替代如例如Uhlmann E和Peyman A在“Methods in MolecularBiology”,第20卷,“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”,S.Agrawal,Ed.,Humana Press,Totowa1993,第16章，第355页起所述，其中去磷酸桥键例如选自去磷酸桥甲乙缩醛(formacetal)、3’-硫代甲乙缩醛、甲基羟基胺、亚甲基二甲基肼基、二甲亚砜和/或甲硅烷基。

来自糖磷酸酯主链(即，糖磷酸酯主链由糖磷酸酯单元组成)的糖磷酸酯单元(即，共同形成糖磷酸酯单元的β-D-核糖和磷酸二酯核苷间桥键)可以被另一单元取代，其中所述另一单元可以例如适于构建“吗啉衍生物”寡聚物(例如，Stirchak EP等，(1989)Nucleic Acids Res17:6129-41中所述)，即，例如，由吗啉衍生物单元替代；或其适于构建聚酰胺核酸(“PNA”；例如，Nielsen PE等，(1994)Bioconjug Chem5:3-7中所述)，即，例如，由PNA主链单元替代(例如由2-氨基乙基甘氨酸替代)。寡核苷酸可以具有其它糖主链修饰和替代，如具有磷酸酯基的肽核酸(PHONA)、锁核酸(LNA)以及具有带烷基连接子或氨基连接子的主链部分的寡核苷酸。烷基连接子可以为支化或未支化的、取代或未取代的以及手性纯的或外消旋混合物。

β-核糖单元或β-D-2′-脱氧核糖单元可以由经修饰的糖单元替代，其中所述经修饰的糖单元选自例如β-D-核糖、α-D-2′-脱氧核糖、L-2′-脱氧核糖、2′-F-2′-脱氧核糖、2′-F-阿拉伯糖、2′-O-(C₁～C₆)烷基核糖(2′-O-(C₁～C₆)烷基核糖优选为2′-O-甲基核糖、2′-O-(C₂～C₆)烯基核糖、2′-[O-(C₁～C₆)烷基-O-(C₁～C₆)烷基]核糖)、2′-NH₂-2′-脱氧核糖、β-D-呋喃木糖、α-阿拉伯呋喃糖、2,4-二脱氧-β-D-赤型吡喃己糖以及碳环型糖类似物(例如，Froehler J(1992)Am Chem Soc114:8320中所述)和/或开链糖类似物(例如，Vandendriessche等，(1993)Tetrahedron49:7223中所述)和/或二环糖类似物(例如，Tarkov M等，(1993)Helv Chim Acta76:481中所述)。

在某些方面，对于由磷酸二酯或磷酸二酯样核苷间连接键所连接的核苷酸中的一个或两个而言，糖为2’-O-甲基核糖。

核酸还可以包含但不限于取代的嘌呤和嘧啶，如C-5丙炔嘧啶和7-脱氮-7-取代嘌呤修饰的碱基(Wagner RW等，(1996)Nat Biotechnol14:840-4)。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶以及其它天然和非天然存在的核碱基、取代和未取代的芳香部分。

修饰的碱基是在化学上不同于通常见于DNA和RNA中的天然存在碱基(如T、C、G、A和U)的任何碱基，但其与上述天然存在的碱基共享基本的化学结构。修饰的核苷碱基可以例如选自次黄嘌呤、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C₁～C₆)烷基尿嘧啶、5-(C₂～C₆)烯基尿嘧啶、5-(C₂～C₆)炔基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C₁～C₆)烷基胞嘧啶、5-(C₂～C₆)烯基胞嘧啶、5-(C₂～C₆)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N²-二甲基鸟嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤(优选为7-脱氮-7-取代嘌呤和/或7-脱氮-8-取代嘌呤)、5-羟甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶(例如，N4-乙基胞嘧啶)、5-羟基脱氧胞苷、5-羟甲基脱氧胞苷、N4-烷基脱氧胞苷(例如，N4-乙基脱氧胞苷)、6-硫代脱氧鸟苷、硝基吡咯的脱氧核糖核苷酸、C5-丙炔基嘧啶以及二氨基嘌呤(例如，2,6-二氨基嘌呤)、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤或天然核苷碱基的其他修饰物。本列举仅作为示例性而不应认为具有限制性。

在本发明的一些方面，对于本文所述的某些化学式，限定了一组修饰的碱基。例如，字母Y被用于指代含有胞嘧啶或修饰的胞嘧啶的核苷酸。修饰的胞嘧啶是天然存在的或非天然存在的嘧啶碱基胞嘧啶类似物，其可以在不损害寡核苷酸的免疫刺激或免疫调节活性的情况下取代该碱基(胞嘧啶)。修饰的胞嘧啶包括但不限于5-取代胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶以及未经取代的或取代的5-炔基胞嘧啶)、6-取代胞嘧啶、N4-取代胞嘧啶(例如，N4-乙基胞嘧啶)、5-氮杂胞嘧啶、2-巯基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有稠环体系的胞嘧啶类似物(例如，N,N’-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)以及尿嘧啶及其衍生物(例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶)。在某些方面，胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶和N4-乙基胞嘧啶。在某些方面，胞嘧啶碱基由通用碱基(例如，3-硝基吡咯、P-碱基)、芳环体系(例如，氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)所取代。

字母R用于指代鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤碱基。修饰的鸟嘌呤是天然存在的或非天然存在的嘌呤碱基鸟嘌呤类似物，其可以在不损害寡核苷酸的免疫刺激或免疫调节活性的情况下取代该碱基(鸟嘌呤)。修饰的鸟嘌呤包括但不限于7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代鸟嘌呤(例如，7-脱氮-7-(C2～C6)炔基嘌呤)、7-脱氮-8-取代鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代鸟嘌呤(例如，N2-甲基鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如，N6-甲基腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤)、8-取代鸟嘌呤(例如，8-羟基鸟嘌呤和8-溴鸟嘌呤)和6-硫代鸟嘌呤。在某些方面，鸟嘌呤碱基由通用碱基(例如，4-甲基吲哚、5-硝基吲哚和K-碱基)、芳环体系(例如，苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基1H-[1,2,4]三唑-3-甲酰胺)或氢原子(dSpacer)所取代。

在某些方面，还可以考虑其它的碱基修饰。例如，在寡核苷酸的任意一端的末端T残基可以由脱氧尿苷(U)替代，一个或多个CpG基序的G可以由脱氧肌苷(I)替代，以及G残基被修饰为7-脱氮脱氧鸟苷。在某些方面，寡核苷酸的5’末端T可以包含卤素取代。在某些方面，卤素取代是乙基尿苷、溴代尿苷、氯代尿苷或碘代尿苷。

在本发明的一些方面，可以使用本领域公知的许多程序从头合成寡核苷酸。例如，b-氰基乙基亚磷酰胺法(Beaucage,S.L.和Caruthers,M.H.,Tet.Let.22:1859,1981);核苷H-膦酸酯法(Garegg等，Tet.Let.27:4051-4054,1986;Froehler et al.,Nucl.Acid.Res.14:5399-5407,1986,;Garegg等，Tet.Let.27:4055-4058,1986,Gaffney等，Tet.Let.29:2619-2622,1988)。这些化学方法可以通过可从市场上获得的各种自动核酸合成仪来进行。这些寡核苷酸被称为合成寡核苷酸。分离的寡核苷酸通常是指与其在自然中通常所关联的组分分离开的寡核苷酸。举例而言，分离的寡核苷酸可以为分离自细胞、细胞核、线粒体或染色质的寡核苷酸。

在本发明的某些方面，核苷酸间连接可以为非稳定化连接或稳定化连接(针对核酸酶)、磷酸二酯(非稳定化)、硫代磷酸酯(稳定化)或另一种带电荷主链或磷酸二酯连接。在某些方面，如果Y-R处的核苷酸间连接是硫代磷酸酯，则该连接的手性可以是随机的，或优选具有Rp构型的硫代磷酸酯连接。

在本发明的一些方面，修饰的主链(如硫代磷酸酯)可以使用采用亚磷酰胺或H-磷酸酯化学的自动化技术来合成。芳基磷酸酯和烷基磷酸酯可以例如美国专利第4,469,863号所述制备；而烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分被烷基化，如美国专利第5,023,243号和欧洲专利第0,092,574号所述)可以通过采用商购试剂的自动化固相合成来制备。已对制备其它DNA主链修饰物和取代物的方法进行过描述(例如，Uhlmann,E.和Peyman,A.,Chem.Rev.90:544,1990;Goodchild,J.,Bioconjugate Chem.1:165,1990)。符号“*”是指稳定化的核苷酸间连接的存在，而“_”是指磷酸二酯键的存在。在一些方面，一种或多种免疫调节性分子可以各自独立地具有完全天然的磷酸二酯主链。

在本发明的一些方面，一种或多种免疫调节性分子是包含至少一个未甲基化的cpG二核苷酸的寡核苷酸。含有至少一个未甲基化的cpG二核苷酸的寡核苷酸是含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即，含有其后为3’鸟嘌呤且以磷酸酯键连接的5’胞嘧啶的“CpG DNA”或DNA)并且活化免疫系统的核酸分子。整个CpG寡核苷酸可以未经甲基化，或某些部分可以未经甲基化，但至少5′CG3′的必须未甲基化。CpG除非另外指明，本文所用的术语CpG寡核苷酸或CpG核酸是指免疫刺激性CpG寡核苷酸或核酸。

在本发明的一些方面，免疫调节性分子包括但不限于作为A类、B类、C类、T类、P类或具有E修饰的任何类的寡核苷酸。

A类寡核苷酸可有力诱导IFN-α和NK细胞活化，但在刺激B细胞方面相对较弱。A类寡核苷酸通常在5’和3’端具有稳定化的聚G序列以及至少6个核苷酸的含回文磷酸二酯CpG二核苷酸的序列，并且形成多聚体结构。A类寡核苷酸已在2005年9月27日授予的美国专利第6,949,520号和公布于2001年4月5日的PCT申请第PCT/US00/26527(WO01/22990)号公报中有所描述。A类寡核苷酸不一定含有六聚体回文序列GACGTC、AGCGCT或AACGTT，如Yamamoto等所述(Yamamoto S等，J Immunol148:4072-6(1992))。在一些方面，“A类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’GGGGACGACGTCGTGGGGGGG3’(SEQ ID NO:17)。在一些方面，A类寡核苷酸包括但不限于5’G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G3’(SEQ IDNO:18)；其中“*”是指硫代磷酸酯键，而“_”是指磷酸二酯键。

B类寡核苷酸可有力活化B细胞，但在诱导IFN-α和NK细胞活化方面相对较弱。B类寡核苷酸为单聚体，且可以由完全的硫代磷酸酯主链所完全稳定化。B类寡核苷酸还可以具有一些天然磷酸二酯键，例如，在CpG的C和G之间，在这种情况下，其被称作半软性(semi-soft)寡核苷酸。在某些方面，B类CpG寡核苷酸可以由至少下式表示：5′X₁X₂CGX₃X₄3’，其中X₁、X₂、X₃和X₄是核苷酸。在一些方面，X₂是腺苷、鸟苷或胸苷。在一些方面，X₃是胞苷、腺苷或胸苷。在一些方面，B类CpG寡核苷酸可以由至少下式表示：5’N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂3′，其中X₁、X₂、X₃和X₄是核苷酸，而N是任何核苷酸，且N₁和N₂是各由约0～25个N组成的核酸序列。在一些方面，X₁X₂是选自GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG的二核苷酸；X₃X₄是选自TpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA和CpA的二核苷酸。在某些方面，X₁X₂是GpA或GpT，且X3X4是TpT。在一些方面，X₁和/或X₂是嘌呤且X₃和/或X₄是嘧啶，或者X₁X₂是GpA且X₃和/或X₄是嘧啶。在某些方面，X₁X₂是选自TpA、ApA、ApC、ApG和GpG的二核苷酸。在某些方面，X₃X₄是选自TpT、TpA、TpG、ApA、ApG、GpA和CpA的二核苷酸。在某些方面，X₁X₂是选自TpT、TpG、ApT、GpC、CpC、CpT、TpC、GpT和CpG的二核苷酸；X₃是选自A和T的核苷酸，而X₄是核苷酸，但当X₁X₂是TpC、GpT或CpG时，X₃X₄不是TpC、ApT或ApC。在一些方面，CpG寡核苷酸具有序列5′TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄3’。本发明的CpG寡核苷酸可以包含例如选自GpT、GpG、GpA和ApA的X₁X₂以及选自TpT、CpT和TpC的X₃X₄。

B类寡核苷酸已在分别于2001年2月27日和2001年5月29日授予的美国专利第6,194,388B1号和第6,239,116B1号以及公布于1996年2月1日的PCT申请第WO/1996/002555号公报和公布于1998年5月7日的PCT申请第WO/1998/018810号公报中有所描述。在某些方面，B类寡核苷酸为：

CPG79095’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’(SEQ ID NO:1)，

CpG245555’TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3’(SEQ ID NO:2)，

CPG10104TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:3)，

5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’(SEQ ID NO:19),

5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA3’(SEQ ID NO:20)，

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T3’(SEQ IDNO:21)，

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T3’(SEQ IDNO:22)，

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO:23)，

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO:24)，

或

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A3’(SEQ ID NO:25)，

其中“*”是指硫代磷酸酯键。

C类寡核苷酸既有传统的“刺激性”CpG序列也有“富GC”或“B细胞中和性”基序。C类CpG寡核苷酸具有介于A类和B类之间的性质，因此其活化B细胞和NK细胞并诱导IFN-α(Krieg AM等，(1995)Nature374:546-9;Ballas ZK等，(1996)J Immunol157:1840-5;Yamamoto S等，(1992)J Immunol148:4072-6)。C类寡核苷酸含有单个回文序列，从而其可以形成如茎环结构等二级结构或者如二聚体等三级结构。C类寡核苷酸的主链可具有完全稳定化的、嵌合的或半软性的主链。C类寡核苷酸包含B类类型的序列和富GC的回文序列或近回文序列。此类已在公布于2003年8月7日的美国申请第20030148976号公报和公布于2008年6月12日的PCT申请第WO2008/068638号公报。在某些方面，C类寡核苷酸是：

CPG101015’TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG3’(SEQ ID NO:4)，

CPG101095’TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTCCCG3’(SEQ ID NO:5，其中短横线代表半软性磷酸二酯键)，

CpG234075’TC-GTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT3’(SEQ ID NO:6，其中短横线代表半软性磷酸二酯键)，

5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:26)，

5’TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:27)，

5’TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:28),

5’TCGGACGTTCGGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:29)，

5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:30),

5’TCGACGTTCGGCGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:31)，

5’TCGACGTTCGGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:32)，

5’TCGCGTCGTTCGGCGCCG3’(SEQ ID NO:33),

5’TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:34)，或

5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG3’(SEQ ID NO:35)。

在一些方面，C类CpG寡核苷酸为：

5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQID NO:38)，

5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO:39),

5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQ IDNO:40),

5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3’(SEQ IDNO:41),

5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3’(SEQ IDNO:42),

5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQ IDNO:43),

5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO:44),

5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO:45),

5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQID NO:46),

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3’(SEQID NO:47),

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G3’(SEQID NO:48),

5’T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G3’(SEQ ID NO:49)或

5’T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’(SEQ ID NO:50)，

其中“*”是指硫代磷酸酯键，而“_”是指磷酸二酯键。在这些序列的任一个中，乙基尿苷或卤素可以取代5’T；卤素取代的实例包括但不限于溴代尿苷或碘代尿苷取代。

P类寡核苷酸在某些情形中能够比C类寡核苷酸诱导水平高得多的IFN-α分泌。P类寡核苷酸能够在体外和/或在体内自发地自组装成为串联体(concatamer)。P类寡核苷酸进一步公开在公布于2008年6月12日的PCT申请第WO2008/068638号公报中。在某些方面，P类寡核苷酸是：

CpG21798

5’T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G3’(SEQID NO:7)，

CpG23430

5’T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO:8)，

CpG24558

5’T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’(SEQ ID NO:9)，

CpG23871

5’JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO:10)，

CpG23873

5’JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’(SEQ ID NO:11)，

CpG23874

5’JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3’(SEQ ID NO:12)，

CpG23875

5’EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO:13)，

CpG23877

5’JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T3’(SEQ ID NO:14)，

CpG23878

5’JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T3’(SEQ ID NO:15)或

5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO:37)。

相比之B类或C类寡核苷酸，T类寡核苷酸诱导更低水平的IFN-α以及IFN相关细胞因子和趋化因子的分泌，同时保持与B类寡核苷酸类似的诱导IL-10的水平的能力。T类寡核苷酸进一步公开在公布于2008年6月12日的PCT申请第WO2008/068638号公报中。

可以在任何类别的CpG寡核苷酸上进行E修饰。这是在CpG基序以外具有亲脂性的取代的核苷酸类似物的寡核苷酸，且其具有增强的刺激干扰素α(IFN-α)产生和诱导TLR9活化的能力。E修饰的寡核苷酸进一步公开在公布于2008年6月12日的PCT申请第WO2008/068638号公报中。

在本发明的一些方面，一种或多种免疫调节性分子处于可诱导或增强抗原特异性免疫应答的有效量。在某些方面，所增强的抗原特异性免疫应答是Th1免疫应答。在某些方面，Th1免疫应答导致对IFN-γ的抗原特异性诱导，或对分泌两种以上的细胞因子的多功能T细胞的诱导。在某些方面，上述细胞因子包括但不限于IL-2和IFN-γ或者IFN-γ、TNF-α和IL-2。

在本发明的一些方面，免疫调节性分子的量为约1μg/剂疫苗～约5mg/剂疫苗。在某些方面，免疫调节性分子的量为约1μg/剂疫苗～约4mg/剂疫苗、约1μg/剂疫苗～约3mg/剂疫苗、约1μg/剂疫苗～约2mg/剂疫苗或约1μg/剂疫苗～约1mg/剂疫苗。在某些方面，免疫调节性分子的量为约10μg/剂疫苗～约750μg/剂疫苗、约10μg/剂疫苗～约500μg/剂疫苗、约10μg/剂疫苗～约250μg/剂疫苗、约10μg/剂疫苗～约100μg/剂疫苗、约20μg/剂疫苗～约100μg/剂疫苗或约30μg/剂疫苗～约100μg/剂疫苗。在某些方面，免疫调节性分子的量为约500μg/剂疫苗。在某些方面，免疫调节性分子的量为约250μg/剂疫苗。

在本发明的一些方面，相对于胆固醇的量的免疫调节性分子的量大于胆固醇的量。在本发明的一些方面，免疫调节性分子的量与胆固醇的量的比例以重量计为约100:1、或约75:1、或约50:1、或约25:1、或约15:1、或约10:1或约5:1。在本发明的一些方面，相对于胆固醇的量的免疫调节性分子的量与胆固醇的量大致相同。即，免疫调节性分子的量与胆固醇的量的比例以重量计为1:1。在本发明的一些方面，相对于胆固醇的量的免疫调节性分子的量小于胆固醇的量。在本发明的一些方面，免疫调节性分子的量与胆固醇的量的比例以重量计为约1:100、或约1:75、或约1:50、或约1:25、或约1:15、或约1:10或约1:5。在一方面，免疫调节性分子的量与胆固醇的量的比例以重量计为1:10。本领域技术人员可以认识到所给出的比例可以如上所示或大致如上所示。

如本文所用，术语“病症”、“病况”和“疾病”可互换使用。

在本发明的一些方面，疫苗可用作用于预防感染(例如，传染病)、与自身抗原相关的病症或与成瘾性物质相关的病症的预防性疫苗。优选地，在尚未诊断出疫苗所针对的病况的受试对象中使用预防性疫苗接种，且更优选地，对被认为处于发展出这些病况中的一种的风险的受试对象中使用预防性疫苗接种。例如，受试对象可以是处在发展出对感染性生物体的感染、对与自身抗原相关的病症易感、或对与成瘾性物质相关的病症易感的受试对象。

本文所用的“处于风险的受试对象”是具有任何的暴露于致感染性病原体的风险的受试对象、具有或处于发展出慢性或抵抗治疗的传染病的风险的受试对象、具有或处于发展出癌症的风险的受试对象、具有或处于发展出过敏的风险的受试对象、具有或处于发展出哮喘的风险的受试对象、具有或处于发展出与成瘾性物质相关的病症的风险的受试对象、具有或处于发展出与异常蛋白折叠有关的病症的风险的受试对象或者具有或处于发展出自身免疫病症的风险的受试对象。处于风险的受试对象还包括具有发展出此类病症的易感性的受试对象。某些易感性可能具有遗传性(并且由此科通过遗传分析或通过家族史来鉴定)。某些易感性具有环境性(例如，此前暴露于感染原、自身抗原或成瘾性物质)。对于处于发展出感染的风险的受试对象，这类受试对象的一个实例是生活在其中发现或已发现有特定类型的感染原的地区或预期要旅行至该地区的受试对象，或可以是通过生活方式或医疗程序会暴露于生物体(通过与可能含有感染性生物体的体液直接或间接地接触)的受试对象。处于发展出感染的风险的受试对象还包括医疗机构推荐针对特定的感染性生物体进行疫苗接种的普通人群。

受试对象是人或由兽医药物治疗的非人动物。非人动物受试对象包括但不限于狗、猫、鸟、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、非人灵长目(例如，猴、猩猩)和鱼(水生物种，例如，鲑鱼)。

本文所用的“传染病”是因体内外来微生物体(例如，细菌、病毒、寄生物或真菌)的存在而产生的疾病。

在本发明的一些方面，细菌包括但不限于以下物种及其组合：醋酸钙不动杆菌(Aceinetobacter calcoaceticus)、帕氏醋酸菌(Acetobacterpaseruianus)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、以色列放线菌(Actinomyces israelli)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、富养产碱菌(Alcaliges eutrophus)、酸热耐热杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、闪烁古生球菌(Arhaeglobusfulgidus)、芽孢杆菌属(Bacillus)种、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophillus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、热链形芽孢杆菌(Bacillus thermocatenulatus)、拟杆菌属(Bacteroides)种、博德特菌属(Bordetella)种、支气管败血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、布鲁氏菌属(Brucella)种、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaglumae)、短螺旋体属(Brachyspira)种、猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteria)、肠道短螺旋体(Brachyspira pilosicoli)、弯曲菌属(Camphylobacter)种、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、猪肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、嗜衣原体属(Chlamydophila)种、粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)、(Clostridium species)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、棒状杆菌属(Corynebacterium)种、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、犬艾里西体(Ehrlichia canis)、肠杆菌属(Enterobacter)种、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肠球菌属(Enterococcus)种、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathieae)、埃希氏菌属(Escherichia)种、大肠杆菌(Escherichia coli)、具核梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)、嗜血杆菌属(Haemophilus)种、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、螺杆菌属(Helicobacter)种、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、猪螺杆菌(Helicobacter suis)、克雷伯菌属(Klebsiella)种、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilis)、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)、军团杆菌属(Legionella)种、肺炎军团杆菌(Legionella pneumophilia)、钩端螺旋体属(Leptospira)种(如犬型钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流行性伤寒钩端螺旋体(Leptospiragrippotyposa)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)、博氏哈德焦-牛钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、博氏哈德焦-帕希诺钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagiae)、波蒙娜钩端螺旋体(Leptospira pomona)、钩端螺旋体(Leptospira)、伯拉第斯拉瓦钩端螺旋体(Leptospira bratislava)等)、李斯特菌属(Listeria)种、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、脑膜炎双球菌类细菌(Meningococcal bacteria)、莫拉氏菌属(Moraxella)种、分支杆菌属(Mycobacterium)种、牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、堪萨斯分支杆菌(Mycobacterium kansaii)、戈登氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、支原体属(Mycoplasma)种(如猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、蕈状枝原体(Mycoplasma mycoides)蕈状LC亚种、奈瑟氏菌属(Neisseria)种、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、(Odoribacter denticanis)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)种、溶血性巴斯德氏菌(曼海姆菌)(Pasteurella(Mannheimia)haemolytica)、多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、发光无色杆菌(Photorhabdus luminescens)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、牙周卟啉单胞菌(Porphyromonas gulae)、唾液卟啉单胞菌(Porphyromonas salivosa)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、变形杆菌属(Proteus)种、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、假单胞菌属(Pseudomonas)种、威斯康辛假单胞菌(Pseudomnas wisconsinensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光C9假单胞菌(Pseudomonasfluorescens C9)、荧光SIKW1假单胞菌(Pseudomonas fluorescensSIKW1)、脆弱假单胞菌(Pseudomonas fragi)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、解油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、假单胞菌种B11-1、静止嗜冷杆菌(Psychrobacter immobilis)、立克次体属(Rickettsia spp)、普氏立克氏体(Rickettsia prowazekii)、立克次氏立克次体(Rickettsia rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)种、邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraeuis)、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、新港沙门氏菌(Salmonella newport)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、志贺氏菌属(Shigella)种、钝顶螺旋藻(Spirlina platensis)、葡萄球菌属(Staphylococci)种、金黄葡萄球菌(Staphlyoccocus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphyloccoccus epidermidis)、葡萄球菌(Staphylococcushyicus)、链球菌属(Streptococcus)种、猪葡萄球菌(Streptobacillusmoniliformis)、β-溶血性链球菌(beta-hemolytic Streptococcus)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)、链球菌(viridans组)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、链球菌(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、突变链球菌(Streptococcusmutans)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、血液链球菌(Streptococcussanguis)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、肉桂色链霉菌(Streptomycescinnamoneus)、脱角质链霉菌(Streptomyces exfoliates)、疥链霉菌(Streptomyces scabies)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、集胞藻属(Syechocystis)、密螺旋体属(Treponena)种、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、微小密螺旋体(Treponema minutum)、梅毒密螺旋体(Treponema palladium)、雅司密螺旋体(Treponema pertenue)、蚀疮溃疡密螺旋体(Treponema phagedenis)、屈折密螺旋体(Treponemarefringens)、文氏密螺旋体(Treponema vincentii)、弧菌属(Vibrio)种、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和耶尔森氏菌属(Yersinia)种。

在本发明的一些方面，病毒包括但不限于以下物种及其组合：禽疱疹病毒、禽流感病毒、禽白血病病毒、禽副粘病毒、边界病病毒、牛冠状病毒、牛流行热病毒、牛疱疹病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛副流感病毒3、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、I型BVDV、II型BVDV、犬腺病毒、犬冠状病毒(CCV)、犬瘟热病毒、犬疱疹病毒、马疱疹病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬细小病毒、犬呼吸道冠状病毒、古典猪瘟病毒、东方马脑炎病毒(EEE)、马传染性贫血病毒、马流感病毒、西尼罗病毒、猫杯状病毒、猫肠冠状病毒、猫免疫缺陷病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫疱疹病毒、猫流感病毒、猫白血病病毒(FeLV)、猫病毒性鼻气管炎病毒、慢病毒、马立克氏病病毒、新城疫病毒、绵羊疱疹病毒、绵羊副流感3型病毒、绵羊进行性肺炎病毒、绵羊肺腺癌病毒、泛热带CCV、I型猪环状病毒(PCV)、II型PCV、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪疱疹病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒、伪狂犬病毒、狂犬病毒、原病毒、鼻病毒、牛瘟病毒、猪流感病毒、传染性肠胃炎病毒、火鸡冠状病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西尼罗病毒和西方马脑炎病毒。

在本发明的一些方面，寄生物包括但不限于以下物种及其组合：来自无形体属(Anaplasma)的蛋白、肝片吸虫(肝吸虫)、球虫属、艾美虫属种、犬新孢子虫、刚地弓形虫、贾第虫属、恶丝虫属(犬恶丝虫)、钩虫属(钩虫)、锥虫属种、利什曼原虫属种、毛滴虫属种、微小隐孢子虫、巴贝斯虫属、血吸虫属、绦虫属、类圆线虫属、蛔虫属、毛线虫属、肉孢子虫属、哈蒙德虫属、等孢子球虫属(Isopsora)。在某些方面，寄生物是外寄生物。在某些方面，外寄生物包括但不限于蜱类，包括硬蜱属、扇头蜱属、草原革蜱属、微小牛蜱属、璃眼蜱属、嗜群血蜱属的物种以及它们的组合。

在本发明的一些方面，真菌包括但不限于孢子、霉菌和酵母(例如，念珠菌物种)。

本文所用的慢性或治疗抵抗性传染病是具有延长的感染期(有时持续数周、数月甚至终身)的疾病或者抵抗通常可成功的其它治疗的感染。在某些方面，慢性或治疗抵抗性的病毒感染包括但不限于HBV、HCV、HIV、HPV、HSV-1或HSV-2。

在本发明的一些方面，具有癌症的受试对象可以是具有可检测的癌性细胞的受试对象。癌症可以是恶性或非恶性的癌症。癌症或肿瘤包括但不限于：胆道癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌;成胶质细胞瘤、上皮内赘生瘤、淋巴瘤(例如、滤泡性淋巴瘤)、肝癌、肺癌(例如、小细胞和非小细胞肺癌)、白血病(例如、毛发细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤T细胞白血病)、黑色素瘤(例如、恶性黑色素瘤)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌、肾癌、以及其他恶性瘤和肉瘤(例如、鳞状细胞瘤、肾细胞瘤、前列腺瘤、膀胱瘤或结肠瘤)。

在本发明的一些方面，患有过敏症的受试对象是具有或处于发展出相应于过敏原的过敏反应的受试对象。过敏原是指对于物质(过敏原)的获得性超敏反应。过敏病况包括但不限于湿疹、过敏性鼻炎或鼻炎、花粉症、结膜炎、支气管哮喘、荨麻疹(风疹块)和食物过敏症以及其它特应性病况。

目前，通常通过注射小剂量的抗原继以后续递增剂量的抗原来治疗过敏性疾病。据信这一程序会诱导对过敏原的耐受性以预防进一步的过敏反应。然而，这些方法将需要数年起效并且还涉及到副作用的风险，如过敏性休克。

过敏症通常由针对无害的过敏原的IgE抗体产生所导致。占主导的由系统性或粘膜施用免疫刺激性核酸而诱导的细胞因子为一类叫做Th1的细胞因子(其实例为IL-12和IFN-γ)，且它们同时诱导体液和细胞免疫应答。与Th1应答相关的抗体类型通常更具保护性，因为其具有高度的中和和调理能力。另一类主要的免疫应答类型(其与IL-4、IL-5和IL-10细胞因子的产生相关)是Th2免疫应答。Th2应答主要涉及抗体，且其具有更低的针对感染的保护效应，并且某些Th2同种型(例如，IgE)与过敏症相关。一般而言，过敏性疾病似乎由Th2型免疫应答所介导，而Th1应答提供针对感染的最好保护，但过量的Th1应答与自体免疫疾病相关。给予一种或多种免疫调节性分子使受试对象中的免疫应答从Th2(其与IgE抗体的产生和过敏症相关)转换为Th1应答(其可保护抵抗过敏反应)的能力，可以对受试对象施用用于诱导免疫调节性分子的免疫应答的有效剂量以治疗或预防过敏症。

在本发明的一些方面，过敏原是指能在易感受试对象中诱导过敏性或哮喘性应答的物质(例如，抗原)。过敏原包括但不限于花粉、昆虫毒液、动物皮屑、真菌孢子和药物(例如，青霉素)。天然的、动物和植物过敏原的实例包括但不限于对以下种属具有特异性的蛋白：犬属(家犬)、尘螨属(例如，粉尘螨)、猫属(家猫)、豚草属(美洲豚草)、黑麦草属(例如，多年生黑麦草或一年生黑麦草)、柳杉属(日本柳杉)、链格孢属(链格孢菌)、桤木属、赤杨属(赤杨)、桦木属(疣皮桦)、栎属(美洲白栎)、洋橄榄属（油橄榄）、蒿属(艾蒿)、车前属(例如，长叶车前)、墙草属(例如，药用墙草(Parietaria officinalis)或欧蓍草)、小蠊属(例如，德国小蠊)、蜜蜂属(例如，一年生蜜蜂)、柏木属(例如，丝柏、绿干柏和大果柏)、桧属(例如，Juniperus sabinoides、铅笔柏、欧洲刺柏或Juniperus ashei)、金钟柏属(例如，东方金钟柏(Thuya orientalis))、扁柏属(例如，日本扁柏)、大蠊属(例如，美洲大蠊)、冰草属(例如，匍匐冰草)、黑麦属(例如，黑麦)、小麦属(例如，小麦)、鸭茅属(例如，鸭茅)、羊茅属(例如，牛尾草)、早熟禾属(例如，草地早熟禾或加拿大早熟禾)、燕麦属(例如，燕麦)、绒毛草属(例如，绒毛草)、黄花茅属(例如，黄花茅)、燕麦草属(例如，花叶燕麦草)、剪股颖属(例如，小糠草)、梯牧草属(例如，梯牧草)、虉草属(例如，虉草)、雀稗属(例如，百喜草)、高粱属(例如，假高粱)和雀麦属(例如，无芒雀麦)。

在本发明的一些方面，哮喘是指由炎症、气道变窄和气道对吸入物的反应性增加所表征的呼吸系统病症。Th2细胞因子(例如，IL-4和IL-5)在哮喘受试对象的气道中升高。这些细胞因子促成了哮喘炎性应答的重要方面，包括IgE同种型转换、嗜酸性粒细胞趋化和活化以及肥大细胞的生长。Th1细胞因子、尤其是IFN-γ和IL-12能够抑制Th2克隆无的形成和Th2细胞因子的产生。哮喘往往与特应性或过敏性症状相关，虽然并非仅仅如此。

在本发明的一些方面，与异常蛋白折叠相关的病症是由错误折叠(misfolding)或受试对象的DNA中的错误导致蛋白的不正确折叠的相关蛋白所引起的病症。在一些方面，与异常蛋白折叠相关的病症是淀粉样变形病症(例如，阿尔茨海默病、MS)或朊蛋白病症(例如，传染性海绵状脑病(TSE)，其包括但不限于牛海绵状脑病(BSE，疯牛病)和人中的克罗伊茨费尔特氏病(Creutzfeld Jakob disease(CJD)))。在一些方面，涉及导致蛋白非正确折叠的受试对象DNA错误的病症包括但不限于囊性纤维化和与p53蛋白相关的癌症。

在本发明的一些方面，自身免疫病症是任何涉及受试对象的身体对于该受试对象体内通常存在的物质和组织(例如，自身抗原)的过度活性的免疫应答的病症。在某些方面，自身免疫病症是类风湿性关节炎(RA)、红斑狼疮或克罗恩病。

在本发明的一些方面，与自身抗原相关的病症是任何由受试对象的自身细胞或细胞产物的会导致所述受试对象中的免疫应答的抗原所引起的病症。例如，在某些实施方式中，自身抗原是肿瘤抗原、与阿尔茨海默病相关的抗原、针对抗体的抗原或由人内源性逆转录病毒元件表达的抗原。在某些方面，肿瘤抗原是以下中的一种或多种：WT1、MUC1、LMP2、HPV E6或HPV E7、EGFR或其变体形式(例如，EGFRvIII)、HER-2/neu、独特型、MAGE A3、p5非突变体、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、肉瘤异位断点、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2ETS融合蛋白)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、Fucosyl GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(动物)、CYP1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、豆球蛋白(Legumain)、Tie2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2或Fos相关抗原1。与阿尔茨海默病相关的抗原可以是τ-淀粉样蛋白或β-淀粉样蛋白。针对抗体的抗原可以为针对人类抗体的抗原，例如在某些实施方式中抗原为IgE。

在本发明的一些方面，疫苗可以用于预防动物中的呼吸道病毒感染。在某些方面，所述呼吸道病毒感染是BVDV1、BVDV2、IBRV、P13V或BRSV。

在本发明的一些方面，与成瘾性物质相关的病症是涉及发展出对成瘾性化学品或生物物质的成瘾性的受试对象的任何病症。例如，在某些实施方式中，成瘾性物质可以是尼古丁或可卡因。在某些实施方式中，预防或治疗成瘾的疫苗含有与载剂缀合的尼古丁或尼古丁样半抗原。在某些实施方式中，尼古丁或尼古丁样半抗原所缀合的载剂是细菌类毒素或衍生物、假单胞菌外毒素、KLH或病毒样颗粒。在某些实施方式中，细菌类毒素是白喉类毒素或其衍生物，例如，CRM₁₉₇。在某些方面，病毒样颗粒是HBsAg、HBcAg、大肠杆菌噬菌体Qβ、诺瓦克病毒或流感HA。

如本文所述，术语“治疗”、“已治疗”或“正在治疗”在对于传染病使用时是指增加受试对象(处于感染风险的受试对象)对受病原体感染的抵抗性、或换言之减少受试对象受该病原体感染的可能性的预防性治疗，以及在受试对象(已被感染的受试对象)已经被感染后为了抗击感染(例如，减少或消除感染或者避免其恶化)的治疗。

术语“治疗”、“已治疗”或“正在治疗”在对于癌症使用时是指增加受试对象(处于发展出癌症的风险的受试对象)对癌症的抵抗性或减少受试对象会发展出癌症的可能性的预防性治疗，以及在受试对象(已经或刚诊断出癌症的受试对象)已发展出此类病症或开始发展出发展此类病症的体征或症状后为减低该病症的影响(例如，减少或消除与该病症相关的体征或症状或避免其恶化)的治疗。

术语“治疗”、“已治疗”或“正在治疗”在对于哮喘或过敏症使用时是指增加受试对象(处于发展出哮喘或过敏症的风险的受试对象)对发展出此类病症的抵抗性或减少受试对象会发展出哮喘或过敏症的可能性的预防性治疗，以及在受试对象(已经或刚诊断出哮喘或过敏症的受试对象)已发展出此类病症或开始发展出发展此类病症的体征或症状后为减低该病症的影响(例如，减少或消除与该病症相关的体征或症状或避免其恶化)的治疗。

术语“治疗”、“已治疗”或“正在治疗”在对于与成瘾性物质相关的病症使用时是指增加受试对象(处于与成瘾性物质相关的病症的风险的受试对象)对发展出此类病症的抵抗性或减少受试对象会发展出与成瘾性物质相关的病症的可能性的预防性治疗，以及在受试对象(已经或刚诊断出与成瘾性物质相关的病症的受试对象)已发展出此类病症或开始发展出发展此类病症的体征或症状后为减低该病症的影响(例如，减少或消除与该病症相关的体征或症状或避免其恶化)的治疗。

术语“治疗”、“已治疗”或“正在治疗”在对于与异常蛋白折叠相关的病症使用时是指增加受试对象(处于与异常蛋白折叠相关的病症的风险的受试对象)对发展出此类病症的抵抗性或减少受试对象会发展出与异常蛋白折叠相关的病症的可能性的预防性治疗，以及在受试对象(已经或刚诊断出与异常蛋白折叠相关的病症的受试对象)已发展出此类病症或开始发展出发展此类病症的体征或症状后为减低该病症的影响(例如，减少或消除与该病症相关的体征或症状或避免其恶化)的治疗。

术语“治疗”、“已治疗”或“正在治疗”在对于自身免疫病症使用时是指增加受试对象(处于自身免疫病症的风险的受试对象)对发展出此类病症的抵抗性或减少受试对象会发展出自身免疫病症的可能性的预防性治疗，以及在受试对象(已经或刚诊断出自身免疫病症的受试对象)已发展出此类病症或开始发展出发展此类病症的体征或症状后为减低该病症的影响(例如，减少或消除与该病症相关的体征或症状或避免其恶化)的治疗。

术语“治疗”、“已治疗”或“正在治疗”在对于与自身抗原相关的病症使用时是指增加受试对象(处于与自身抗原相关的病症的风险的受试对象)对发展出此类病症的抵抗性或减少受试对象会发展出与自身抗原相关的病症的可能性的预防性治疗，以及在受试对象(已经或刚诊断出与自身抗原相关的病症的受试对象)已发展出此类病症或开始发展出发展此类病症的体征或症状后为减低该病症的影响(例如，减少或消除与该病症相关的体征或症状或避免其恶化)的治疗。

采用本文所述的疫苗对受试对象的治疗导致感染的减少或感染的完全消除、与自身抗原相关的病症所关联的体征/症状的减少或该病症的完全消除，或者与成瘾性物质相关的病症所关联的体征/症状的减少或该病症的完全消除。如果与传染病、癌症、过敏症、哮喘、与异常蛋白折叠相关的病症、自身免疫病症、与自身抗原相关的病症或与成瘾性物质相关的病症所涉及的症状因上述治疗而得到减少、得到控制或被消除，则认为受试对象已得到治疗。对于传染病，所述治疗还涵盖了受试对象中存在的感染原的量的减少(例如，所述量可以本领域普通技术人员已知的标准测试(如ELISA)来进行测量)。对于癌症，所述治疗还涵盖了癌性细胞或组织的减少和/或与该癌症相关的体征/症状的减少。对于过敏症，所述治疗还涵盖了与该过敏症相关的体征/症状的减少。对于哮喘，所述治疗还涵盖了与该哮喘相关的体征/症状的减少。对于自身免疫病症，所述治疗还涵盖了针对所述自身免疫病症的免疫应答的减少和/或与该病症相关的体征/症状的减少。对于与异常蛋白折叠相关的病症，所述治疗还涵盖了异常蛋白的量的减少和/或与该病症相关的体征/症状的减少或逆转。对于与自身抗原相关的病症，所述治疗还涵盖了受试对象中存在的自身抗原的量的减少或因该自身抗原而诱导的免疫应答的减少。对于与成瘾性物质相关的病症，所述治疗还涵盖了与对成瘾性物质的成瘾性相关的体征/症状的减少。

本发明的剂型在药物可接受溶液中进行施用，后者在常规上含有药物可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载剂、佐剂和可选的其它治疗成分。对于使用胆固醇的某些疫苗剂型，可以用药物可接受的表面活性剂和水溶液来替代乙醇，以使胆固醇溶剂化为水性制剂。

为用于治疗，可以通过将免疫调节性分子输送至所需表面的任何模式来将有效量的一种或多种免疫调节性分子施用于受试对象。本发明的药物组合物的施用可以通过本领域技术人员已知的任何方式来实现。优选的施用途径包括但不限于胃肠外(例如，肌内、皮下、皮内、静脉内注射)、对皮肤的局部(例如，透皮)或粘膜(例如，口服、鼻内、阴道内、直肠内、透颊、眼内或舌下)。在癌症治疗的情形中，其可以包括肿瘤内施用。

在本发明的一些方面，免疫调节性分子的“有效量”是指对于实现所需的生物学效果而言必须或足够的量。例如，对于治疗病症的免疫调节性分子的有效量可以是消除微生物感染或肿瘤所必需的量。用作疫苗佐剂的有效量可以是可用于加强受试对象对于疫苗的免疫应答的量。用于治疗传染病、癌症、过敏症、哮喘、自身免疫病症、与异常蛋白折叠相关的病症、与自身抗原相关的病症或与成瘾性物质相关的病症的“有效量”可以是可用于诱导抗原特异性免疫应答的量。对于任何特定的应用，有效量可能根据如下参数而有所不同：待治疗的疾病或病况、所施用的特定免疫调节性分子、受试对象的大小或者疾病或病况的严重性。本领域普通技术人员可以无需过度实验而通过经验确定特定的免疫调节性分子的有效量。

用于局部输送的本文所述化合物的受试对象剂量通常为约0.1μg/次施用～约50mg/次施用，这根据应用情况可以每日、每周或每月和以其间的任何其它时间量给予。更一般而言，局部剂量为约10μg/次施用～约10mg/次施用，且可选地为约100μg～约1mg且每日或每周施用2～4次。更一般地，免疫刺激物剂量为约1μg/次施用～约10mg/次施用，且最通常为约10μg～约1mg，每日或每周施用。出于诱导抗原特异性免疫应答的目的的用于胃肠外施用的本文所述化合物的受试对象剂量通常比用于疫苗佐剂或免疫刺激物施用的有效局部剂量高出约5倍至约10,000倍，且更通常高出约10倍至约1,000倍，最通常为约20倍至约100倍，其中所述化合物与抗原一起但不与其它治疗剂一起输送。用于胃肠外输送的本文所述化合物在一种或多种免疫调节性分子与其它治疗剂组合施用时或在专门的输送载具中施用时，例如，用于诱导天然免疫应答、用于增加ADCC、用于诱导抗原特异性免疫应答，其剂量通常为约0.1μg/次施用～约10mg/次施用，这根据应用情况可以每日、每周或每月和以其间的任何其它时间量给予。更一般地，用于此类目的的胃肠外剂量为约10μg/次施用～约5mg/次施用，且最通常为约100μg～约1mg且每日或每周施用2～4次。然而，在某些实施方式中，用于上述目的的胃肠外剂量可以在比上述典型剂量高出约5倍至约10,000倍的范围内使用。

对于本文所述的任何化合物，治疗有效量最初可以从动物模型确定。对于已在人类中进行测试的免疫调节性分子和对于已知展示出类似的药理学活性的化合物(如其它佐剂(例如LT)和用于疫苗接种目的的其它抗原)，治疗有效性剂量还可以从人类数据确定。对于胃肠外施用可能需要更高的剂量。可以基于相对的生物利用率和所施用化合物的效力来调节应用的剂量。基于上述方法和其它方法对剂量进行调节以实现最大效力是本领域中公知的，且本领域普通技术人员完全有能力进行。

可以经由本文所述的任何途径来单独施用一种或多种免疫调节性分子，或将其与一种或多种抗原、胆固醇或其它治疗剂一同施用。

当希望将一种或多种免疫调节性分子系统性输送时，可以将其配制用于通过注射(例如，药团注射或连续输注)的胃肠外施用。注射用制剂可以以单元剂型呈现，例如，与添加的防腐剂处于安瓿瓶中或处于多剂量容器中。组合物可以采取如处于油性或水性载具中的悬浮液、溶液剂或乳化液的形式，并且可以包含配方剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于胃肠外施用的药物制剂包括水溶形式的免疫调节性分子水溶液。另外，可以制备免疫调节性分子的悬浮液作为合适的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或载具包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)，或者脂质体。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋葡聚糖。可选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加免疫调节性分子的溶解性的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。

可以用惰性材料稀释治疗剂或增加其体积。这些稀释剂可以包括糖，尤其是甘露糖醇、a-乳糖、无水乳糖、纤维素、这趟、改性右旋葡聚糖和/或淀粉。也可将某些无机盐用作填料，包括三磷酸钙、碳酸镁和/或氯化钠。一些可商购的稀释剂有Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。

为辅助治疗剂溶解在水性环境中，可以添加表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可以包括阴离子洗涤剂，包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和/或二辛基磺酸钠。可以使用阳离子洗涤剂，其可包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可被包括在制剂内的潜在非离子型洗涤剂的列表有：聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和/或60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨醇酯40、60、65和/或80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。在一些方面，非离子型洗涤剂包括但不限于：辛苯昔醇(octoxynol)(例如，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100^TM))、聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯聚山梨糖醇单油酸酯(TWEEN80^TM))、胆酸盐和胆酸衍生物(例如，脱氧胆酸钠或牛磺脱氧胆酸盐)。在一些方面，制剂可以包含3D-MPL、Laureth9、TRITONX-100^TM、TWEEN80^TM和脱氧胆酸钠。这些表面活性剂可以单独或作为不同比例的混合物存在于免疫调节性分子的制剂中。

替代性地，免疫调节性分子可以处于粉末形式，以便在使用前与合适的载具(如，无菌无热原水)重建。

对于口服施用，可以将化合物(例如，仅免疫调节性分子，或其与一种或多种抗原、胆固醇和/或治疗剂)方便地通过将免疫调节性分子与本领域公知的药物可接受载剂混合来进行配制。此类载剂使得本发明的免疫调节性分子可以被配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和悬浮剂等，以便待治疗的受试对象口服吞食。用于口服应用的药物制品可以作为固体赋形剂获得，可选地通过研磨所得混合物并在必要时添加合适的助剂后加工颗粒混合物来获得片剂或糖锭核。合适的赋形剂具体有：填料，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制品，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。必要时，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。可选地，口服制剂还可以配制在盐水或缓冲液(即EDTA)中以便中和体内酸性条件，或可以在没有任何载剂的情况下施用。

本发明还考虑了上述试剂或制剂的口服剂型。可以对所述试剂或制剂进行化学修饰从而可高效进行衍生物的口服输送。通常，所考虑的化学修饰是将至少一个部分连接至该试剂或制剂自身，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃或小肠被摄取至血流中。此外还需要增加试剂或制剂的整体稳定性并增加在体内的循环时间。上述部分的实例包括：聚乙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸(Abuchowski和Davis,1981,“Enzymes as Drugs”中的″Soluble Polymer-Enzyme Adducts″,Hocenberg和Roberts编著,Wiley-Interscience,New York,N.Y.,第367-383页;Newmark等，1982,J.Appl.Biochem.4:185-189)。可以使用的其它聚合物有聚1,3-二氧杂环戊烷和聚1,3,6-三氧杂环辛烷。如上文所指出，优选用作药物用途的是聚乙二醇部分。

此外还考虑了本发明的药物组合物的鼻内输送。鼻内输送使得在将治疗性产品施用于鼻后，本发明的药物组合物能直接递送至血流，而无需使产品沉积在肺中。用于鼻内输送的制剂包括采用右旋葡聚糖或环糊精的那些制剂。在一些方面，用于鼻内输送(或粘膜输送)的制剂可以包含3D-MPL、Laureth9、TRITON X-100^TM、TWEEN80^TM和脱氧胆酸盐。在一些方面，此类制剂可以与抗原(例如，流感病毒抗原)组合。

对于鼻内施用，有用的是附接有计量剂量喷雾器的小型硬瓶。在一些方面，通过将本发明溶液的药物组合物吸入体积限定的腔室来输送经计量的剂量，所述腔室具有孔隙，该孔隙具有可通过在腔室内液体受压缩时形成喷雾来使气溶胶制剂气雾化的尺寸。压缩腔室以施用本发明的药物组合物。在一些方面，所述腔室为活塞安置方式。此类装置可以商购获得。

替代性地，可以使用具有孔隙或开口的塑料挤压瓶，所述孔隙或开口具有可通过当瓶受挤压时形成喷雾来使气溶胶制剂气雾化的尺寸。所述开口通常见于瓶的顶部，而该顶部通常经改造以部分适配于鼻部通道内，以便有效施用所述气溶胶制剂。在一些方面，鼻部吸入器回提供计量的气溶胶制剂，以便施用经计量的药物剂量。

对于透颊施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

还可以将化合物配制为直肠或阴道组合物，如栓剂或保留灌肠剂(例如，其含有常规栓剂底料，如可可脂或其它甘油酯)。

除所述制剂以外，还可以将化合物配制为贮存制剂。这种长期作用型制剂可以用合适的聚合性或疏水性材料(例如，作为可接受油中的乳化液)或离子交换树脂来配制，或者作为微溶性衍生物(例如，作为微溶盐)来配制。

药物组合物还可以包含合适的固相或凝胶相载剂或赋形剂。此类载剂或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钠、磷酸钠、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶以及如聚乙二醇等聚合物。

合适的液体或固体药物制剂形式有例如：用于吸入的水性或盐水溶液；或被微胶囊封装、螺旋封装(encochleated)或者涂布于微细金颗粒上；容纳在脂质体中；被气雾化；气溶胶；用于植入皮肤的颗粒剂；或干燥于尖锐物体上以便被挠入皮肤内。药物组合物还包括颗粒剂、粉末剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮剂、乳霜剂、滴剂或者具有延长释放的活性化合物的制剂，在这些制剂中如上所述根据惯例使用赋形剂和添加剂和/或助剂，如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、增味剂、甜味剂或增溶剂等。所述药物组合物适用于各种药物输送体系中。对于药物输送方法的简要综述参见Langer,Science249:1527-1533,1990。

可以将免疫调节性分子和可选的其它治疗剂和/或抗原原样(neat)施用或以药物可接受盐的形式施用，当在医药中使用时，所述药应该在药学上可接受，但可以使用非药物可接受盐来方便地制备其药物可接受盐。此类盐包括但不限于从以下的酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，此类盐还可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如，所述羧酸基团的钠、钾或钙盐。

在本发明的一些方面，所述制剂还可以包含胆酸或其衍生物。在一些方面，其可以为盐的形式。在一些方面，衍生物包括但不限于胆酸及其盐的衍生物。在一些方面，考虑了胆酸或胆酸衍生物的钠盐。在一些方面，胆酸及其衍生物包括但不限于：胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸、胆烷酸、猪脱氧胆酸和衍生物，例如，上述胆酸的甘氨酸基、牛磺基、酰胺基丙基-1-丙磺基、酰胺基丙基-2-羟基-1-丙磺基衍生物，或者N,N-二(3D-葡萄糖酰氨基丙基)脱氧胆酰胺。在一些方面，在本发明的疫苗中可以存在脱氧胆酸钠(NaDOC)。

合适的缓冲剂包括：乙酸和盐(1%～2%，重量/体积比)；柠檬酸及盐(1%～3%，重量/体积比)；硼酸及盐(0.5%～2.5%，重量/体积比)；和磷酸及盐(0.8%～2%，重量/体积比)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003%～0.03%，重量/体积比)；氯丁醇(0.3%～0.9%，重量/体积比)；对羟基苯甲酸酯(0.01%～0.25%，重量/体积比)和硫柳汞(0.004%～0.02%，重量/体积比)。

本发明的药物组合物含有可选地包含在药物可接受载剂中的、有效量的一种或多种免疫调节分子和可选的一种或多种抗原、胆固醇和/或其它治疗剂。术语“药物可接受载剂”是指一种或多种相容性固体或液体的填料、稀释剂或封装物质，其适于对人或其它脊椎动物施用。术语“载剂”是指天然或合成的有机或无机成分，将其与活性成分混合以促进施用。此外，药物组合物的组分还可以以不存在会显著损害所需药物效能的相互作用的方式与本发明的化合物一起掺混，或互相掺混。

通过以下实施例对本发明进行进一步说明，但这些实施例不应被视作进一步限定。本申请通篇引用的所用参考文献(包括文献参考资料、授权专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容通过援引而特别在此全部并入。

实施例

实施例1.作为CpG ODN的输送载具的胆固醇的免疫原性和效力数据

使用含带胆固醇的阳离子脂质的脂质体显示出CpG ODN效力增强。作为提高细胞免疫的佐剂，测试了胆固醇微球(不添加其它脂质)的使用。于第0、14和21天对C57BI/6小鼠(每组n=5)用卵白蛋白(10μg)、仅CpG(CPG24555,10μg)以及CpG(CpG24555,10μg)+胆固醇(1μg)进行肌内免疫接种。在第28天使用流式细胞术测定分泌一重、多重或三重细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)的抗原特异性T细胞(CD4+和CD8+)。

结果与讨论

与仅CpG相比，CpG+胆固醇提高了多功能CD8+细胞的群体。仅CpG和CpG+胆固醇产生了产一重细胞因子和产双重细胞因子的CD4+细胞(图1a)。CpG+胆固醇产生了产三重细胞因子的CD4+细胞(图1b)。仅CpG和CpG+胆固醇产生了产一重细胞因子、产双重细胞因子和产三重细胞因子的CD8+细胞(图1c和1d)。

CpG+胆固醇显示出抗原特异性IL-2(图2a)和IFN-γ(图2b)(偏向Th1的细胞因子)的分泌的增强。未显示出促炎性或偏向Th2的细胞因子的增强。

测定了细胞毒性T淋巴细胞对仅CpG和CpG+胆固醇的应答。CpG+胆固醇增强了卵白蛋白特异性细胞毒性T细胞应答(图3a和3b)，并且与仅CpG相比，抗原特异性CD8T细胞群增加(图3c和3d)。仅胆固醇显示出与无佐剂对照相似的水平。

测定了对仅CpG和CpG+胆固醇的体液应答。相比仅CpG，CpG+胆固醇显示出提高的卵白蛋白特异性抗体滴度和Th1偏向(图4)。每个条形上方的数字代表IgG2c/IgG1之比。在小鼠中，更高的IgG2a或2c表明偏向Th1的免疫应答，而更高的IgG1滴度表明偏向Th2的免疫应答。对于CpG和CpG+胆固醇，IgG2c的量高于IgG1的量(分别为2.04和4.66)，这表明偏向Th1的免疫应答。

在任一种情况下，仅胆固醇未显示出显著的佐剂活性。

抗原与CpG以及抗原与CpG+胆固醇的共同输送未显示出CpG在电泳中移动性的减缓。与游离CpG相比，在用UV定量时在CpG+胆固醇的上清液中观察到相同量的CpG。这表明在CpG与胆固醇之间不存在强的结合。

皮下免疫不如肌内注射有效，从而没有提供任何共输送证据。然而，共同输送似乎在展示出最强的应答的抗原与CpG的共同制剂中起着某种作用。

不欲受限于特定的理论，透射电子显微镜(TEM)表明，胆固醇形成不溶性螺旋微束(micelle)，其可能与细胞膜相互作用以允许CpG的输送(图5)。

实施例2.五价(IBR、BRSV、PI3、BVDV1&2)失活疫苗在牛犊中针对BVDV-2激发的免疫原性、安全性和效力

测定了用五价失活病毒疫苗(牛病毒性腹泻(BVDV1&2)、传染性牛鼻支气管炎(IBRV)、3型副流感病毒(PI3V)和牛呼吸道合胞病毒(BRSV))(各病毒抗原在2ml剂量中为15%)在存在佐剂时进行免疫接种的牛犊的注射位点反应。施用了佐剂CpG+胆固醇(CpG:胆固醇之比为1:1或1:10)、Advasure-DEAE/右旋葡聚糖、QCDCR(皂苷载剂复合物)或QCDCR+CpG。对一些动物用商购疫苗进行免疫。安慰剂组动物接受无菌盐水。在第0天和第22天于皮下用失活的2ml BVDV1&2、IBRV、PI3V和BRSV对牛犊(7/组；9至12月龄)进行疫苗接种，并在第42天于鼻内用4ml BVDV-2(非细胞病变性2型牛病毒性腹泻病毒2;毒株24515)激发。

在每个治疗组的疫苗中使用的佐剂如下：治疗组T01接受无菌盐水(无佐剂)。治疗组T02接受其中佐剂为包含在商业疫苗中的油类乳化液的疫苗。治疗组T03接受其中佐剂为CpG-23877(250μg)/胆固醇(250μg)的疫苗，由此提供比例为1:1的CpG:胆固醇。治疗组T04接受其中佐剂为CpG-23877(250μg)/胆固醇(2500μg)的疫苗，由此提供比例为1:10的CpG:胆固醇。治疗组T05接受其中佐剂为AdvaSure?(其为含有DEAE-DEXTRAN(100mg)和ISC(800μg)的油类乳化液)的疫苗。治疗组T06接受其中佐剂为Quil A(250μg)、胆固醇(250μg)、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA;100μg)、Carbopol

(0.0375μg)以及N-(2-脱氧-2-L-亮氨基-b-D-吡喃葡萄糖苷基)-N-十八烷基十二碳酰胺氢乙酸盐(也以其商品名Bay R1005

相称)(1,000μg)的疫苗。这种组分组合在本文中称为QCDCR。治疗组T07接受其中佐剂为QCDCR(以T06中所给的量)和CpG23877(250μg)的疫苗。

在第0、22、42和56天收集血液样品，并使用ELISA对IgG抗体滴度进行分析。开发了BVDV ELISA并使用BVDV的p67H片段作为抗原在PAH优化。简言之，用0.2ug/ml的重组p67H片段BVDV抗原的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(PH9.6)溶液涂布NUNC Maxisorp板，并在4℃过夜温育。然后弃去涂布用抗原，使用1%的卵白蛋白的PBS-Tween溶液将该板在37℃浸湿并封闭1小时(300μl/孔)。然后移除封闭缓冲液，添加稀释的血清样品(七次5倍连续稀释液；以1:50起始)并将板在37℃温育1小时。将板在PBS-T(0.05%Tween20)中洗涤4次，其后添加100μl的处于阻断缓冲液中的绵羊抗牛IgG-h+l-HRP缀合物(1:4000)并在暗处于室温温育1小时。将板再次如上所述在PBS-T中洗涤，并添加TMB底物(100μl/孔)。温育5至10分钟后，用2N硫酸终止反应(50μl/孔)并测定在450nM的光学密度(OD)。结果以几何平均滴度表达。

结果和讨论

BVDV-2激发的症状是激发和免疫调节后3至12天发烧、白细胞减少(WBC计数比激发前的平均WBC计数减少约40%)，以及血小板减少、呼吸窘迫、压抑、繁殖障碍(流产)和腹泻。针对BVDV的保护性免疫是Th1型免疫应答。细胞介导的免疫由CD4+T细胞所介导。CD8+T细胞对于病毒和记忆应答的清楚至关重要。IFN-α和IFN-γ针对BVDV具保护性。疫苗通常应该诱导针对BVDV的CMI和体液免疫。表1描述了在用BVDV-2激发后具有临床疾病、发烧、白细胞减少症或病毒血症的牛犊的百分比，所述激发在存在CpG+胆固醇(CpG:胆固醇比例为1:1(T03)或1:10(T04))、Advasure-DEAE/Dextran(T05)、QCDCR(T06)、QCDCR+CpG(T07)、商购疫苗(T02)或无菌盐水(T01)时用五价失活的病毒疫苗BVDV1&2、IBRV、PI3V和BRSV进行疫苗接种后进行。

表1.具有临床疾病、发烧、白细胞减少症或病毒血症的牛犊的百分比

与盐水对照相比，施用于T02(商用疫苗)、T03(CpG:胆固醇为1:1)、T04(CpG:胆固醇为1:10)，T05(Advasure-DEAE/右旋葡聚糖)、T06(QCDCR)和T07(QCDCR+CpG)组中的牛犊的疫苗在抑制发烧方面较优异。与商用疫苗(T02)和盐水组(T01)相比，施用于T03(CpG:胆固醇为1:1)、T04(CpG:胆固醇为1:10)、T05(Advasure-DEAE/右旋葡聚糖)、T06(QCDCR)和T07(QCDCR+CpG)组中的牛犊的疫苗在抑制病毒血症方面较优异。T04和T07完全抑制病毒血症，而商用疫苗(T02)组牛犊比对照在更短的时间出现病毒血症。虽然未在任何疫苗接种组中完全避免白细胞减少，与对照和商用疫苗(T02)组相比，在T03(CpG:胆固醇为1:1)、T04(CpG:胆固醇为1:10)、T05(Advasure-DEAE/右旋葡聚糖)、T06(QCDCR)和T07(QCDCR+CpG)中在多日观察到疫苗效应。T03和T04组的牛犊与其它组相比经历更少的临床疾病。综上，数据表明含有CpG(如E修饰的P类CpG)的疫苗(T03、T04和T07)展示出增强的效力且这些疫苗比商用疫苗更具效能。

在施用佐剂后发展出的注射位点反应如图6a所示。商用疫苗(T02)和Advasure-DEAE/右旋葡聚糖(T05)疫苗比受测的其它疫苗更具反应性。含QCDCR+CpG(T07)和CpG+胆固醇(T03和T04)的疫苗是最安全的。在用CpG+胆固醇免疫接种的牛犊中，BVDV-2激发的所有症状与未疫苗接种的对照动物相比都得到减少。

所施用的第一剂疫苗诱导了低水平的血清中和性抗体滴度。到第42天，所有受测疫苗诱导了100%的向BVDV1和IBRV抗原的血清转化。到第42天，除Advasure-DEAE/右旋葡聚糖(T05)疫苗以外的所有受测疫苗诱导了100%的向BVDV2的血清转化。在激发后，BVDV1和BVDV2抗体应答在所有组中都被加强至显著更高的水平(表2)。

表2，A部分

表2，B部分

SN–血清中和

各个初次接种(T02～T07)引发了BVDV特异性IgG抗原应答，后者由加强接种和BVDV2激发所提高。在各组间的IgG滴度之间没有显著差异。

所有疫苗制剂均具有免疫原性并诱导血清中和(BVDV1和BVDV2)以及由再次接种和激发所加强的IgG BVDV特异性抗体。针对BVDV激发的保护通过细胞介导的免疫实现(CMI;IFNγ分泌以及BVDV特异性CD4+和CD8+T细胞的活化)，但抗体能中和游离病毒并因而如果以高水平存在时(例如，在出生时喂给牛犊的初乳中)其可保护抵抗激发。通过IFNγ细胞因子在体外的分泌科检测到CMI(Th-1型)应答，而通过检测IL-4可以确定体液(Th-2型)应答。

BVDV1和BVDV2抗原诱导低水平的IFNγ应答并且在治疗组之间(数据未显示)没有显著差异(P>0.1)。BSRV抗原在除T01组(盐水)和T03组(CpG:胆固醇为1:1)的所有组中诱导IFNγ应答。IBR抗原在疫苗接种后的所有天中在T05(Advasure-DEAE/右旋葡聚糖)和T06(QCDCR)中诱导最强的IFNγ应答，且在T02(商用疫苗)、T04(CpG:胆固醇为1:10)和T07(QCDCR+CpG)中诱导虽弱但为阳性的应答。PI3抗原在T02(商用疫苗)、T05(Advasure-DEAE/右旋葡聚糖)、T06(QCDCR)和T07(QCDCR+CpG)。

实施例3.采用不同佐剂配制的亚基(百日咳杆菌粘附素)支气管败血性博德特菌疫苗在猪中的免疫原性

对用包括CpG+胆固醇在内的各种佐剂配制的百日咳杆菌粘附素(p68)进行免疫接种的猪的抗原特异性免疫应答进行了评估。

研究中所用的研究用兽医产品(IVP)如下：以1-mL剂量施用疫苗。治疗组T01接受20mM磷酸盐缓冲盐水。治疗组T02接受其中佐剂为Quil A(250μg)、胆固醇(250μg)、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA;100μg)、Carbopol

(0.075%)以及N-(2-脱氧-2-L-亮氨基-b-D-吡喃葡萄糖苷基)-N-十八烷基十二碳酰胺氢乙酸盐(也以其商品名Bay R1005

相称)(1,000μg)的疫苗。这种组分组合在本文中称为QCDCR。所述组合物还含有CpG23878(250μg)和百日咳杆菌粘附素(10μg)。治疗组T03接受含有胆固醇(2,500μg)、CpG23877(250μg)和百日咳杆菌粘附素(10μg)的疫苗。治疗组T04接受含有胆固醇(2,500μg)、CpG23878(250μg)和百日咳杆菌粘附素(10μg)的疫苗。治疗组T05接受含有6%的作为Al(OH)₃的铝和百日咳杆菌粘附素(10μg)的疫苗。

在研究中使用了六十四(64)只包括两种性别的临床健康的高健康状态的猪。猪或其围圈(dam)没有针对支气管败血性博德特菌(B.bronchiseptica)的疫苗接种或与其接触的历史。从在源农场采集的血清看或在第1天，没有猪具有阳性百日咳杆菌粘附素滴度(定义为>200)。

在第0天，在猪的左颈内接种通过静脉内(IM)注射给予的1.0mL剂量疫苗。在第21天，采用与之前相同的IVP和剂量对猪进行再次接种并施用于右颈。在每次接种的一小时内，由研究者或合格技术人员观察与接种有关的即时副作用事件。

首要结果变量是血清百日咳杆菌粘附素抗体滴度(总IgG)。使用ELISA对血清样品进行百日咳杆菌粘附素抗体测试。将Nunc Maxisorp板用50ng/孔的百日咳杆菌粘附素的碳酸盐缓冲液(pH9.1)溶液涂布。将板用带有0.05%Tween20和1%脱脂奶粉的1x PBS洗涤和封闭(1小时，室温)。将稀释于封闭缓冲液中的血清样品添加至板，温育(1小时，室温)、洗涤并与以1:1250稀释在封闭缓冲液中的HRP缀合物(Bethyl山羊抗猪IgG(h+l))一起温育(1小时，室温)。在最终洗涤后，添加ABTS(KPL50-62-00)底物并在于室温温育12分钟后读取OD值。基于阳性对照血清库的1:1000稀释液的OD值的20%的截留值来计算滴度。

此外还使用ELISA测试了来自T01、T03、T04、T05和T08的血清样品的百日咳杆菌粘附素特异性IgG1和IgG2抗体。将NuncMaxisorp板用50ng/孔的百日咳杆菌粘附素的碳酸盐缓冲液(pH9.1)溶液涂布。将板用带有0.05%Tween20和1%脱脂奶粉的1x PBS洗涤和封闭(1小时，室温)。将稀释于封闭缓冲液中的血清样品添加至板，温育(1小时，室温)、洗涤并与以1:100稀释在封闭缓冲液中的单克隆抗体(IgG1-Serotec MCA635或IgG2-Sertec MCA636)一起温育(1小时，室温)。在最终洗涤后，添加ABTS(KPL50-62-00)底物并在于室温温育20分钟后读取OD值。基于阳性对照血清库的1:1000稀释液的OD值的50%的截留值来计算IgG1滴度。基于0.2的OD的截留值来计算IgG2滴度。

对收集自肝素血液样品的PBMC测试了抗原特异性IFN-γ产生。通过ELISPOT测试了IFN-γ应答(Th1)，以确定INF-γ分泌性细胞的频率/百万细胞SFC/来自PBMC的10⁶(在扣除培养基对照的背景后)。另外，基于与培养基对照相比的百日咳杆菌粘附素刺激的细胞的刺激指数(SI)来调节IFN-γ应答。对于样品的刺激指数必须至少为2X以使其被认为是阳性。

结果和讨论

在第0天和第21天对猪接种，且疫苗如表3所示。

表3

疫苗组	佐剂(剂量)	载剂
			T01	无	无
T02	CpG23878(250μg)	QCDCR
			T03	CpG23877(1:10)	胆固醇
T04	CpG23878(1:10)	胆固醇
			T05	铝胶	无

在第1天、第7天、第20天、第28天和第35天取得来自PBMC分离物的血液样品和血清样品并进行分析。对血清样品使用针对纯化无LPS的重组百日咳杆菌粘附素的ELISA测试了总IgG、IgG1和IgG2抗体。从Bethyl Labs或AbD Serotec获取同种型抗体。

与其它受测疫苗相比，在T02(CpG+QCDCR)、T03(CpG23877+胆固醇;1:10)和T04(CpG23878+胆固醇;1:10)组中，百日咳杆菌粘附素特异性IgG水平增加。

在接种后即刻的观察时间内没有报道接种后副作用事件。没有记录到对因接种引起的反应的观察。治疗组T01中的猪在整个研究中仍对百日咳杆菌粘附素ELISA抗体保持阴性。

所有猪在第1天具有阴性的百日咳杆菌粘附素特异性ELISA滴度(≤200)。在接种后曾经经历血清转化的猪的百分比为：T01为0%，T02、T03、T04和T08为100%。采用CpG#23878佐剂和QCDCR载剂的治疗组(T02)在第20天和第35天分别具有906.0和24728.5的GMT；而这两天的GMT比所有其它治疗组显著更高(P≤.10)(表4和5)。阴性对照T01在第20天和第35天具有比其它组显著更低的平均值。在两个接种后时间点，T08(配制有氢氧化铝)的GMT比采用QCDCR或胆固醇载剂的用CpG配制的百日咳杆菌粘附素疫苗(T02、T03、T04)的GMT明显更低。图7中呈现了用配制有包括CpG+胆固醇在内的各种佐剂的百日咳杆菌粘附素(p68)免疫接种的猪中的抗原特异性抗体应答的图。

表4.百日咳杆菌粘附素特异性总IgG ELISA滴度(第20天)

来自施用IVP的第20天后的猪的抗体滴度的几何最小方差平均值、标准误差以及范围

^a,b,c,d带有不同上标的几何平均值显著不同(P≤0.10)

表5.百日咳杆菌粘附素特异性总IgG ELISA滴度(第35天)

来自施用IVP的第35天后的猪的抗体滴度的几何最小方差平均值、标准误差以及范围

^a,b,c,d,e带有不同上标的几何平均值显著不同(P≤0.10)

仅测试了来自所选的治疗组的样品的同种型特异性百日咳杆菌粘附素血清抗体滴度(表6)。T03(CpG23878，配制有QCDCR)的IgG2/IgG1比值为0.40，(CpG23878，配制有胆固醇)为2.64。

表6.同种型特异性百日咳杆菌粘附素血清抗体滴度

通过刺激指数(SI)和成斑细胞(SFC/10⁶)来测定了平均百日咳杆菌粘附素特异性IFN-γ应答。在不同组内和时间点之间存在相当的猪的百日咳杆菌粘附素特异性IFN-γ应答的变化性，这部分是因为每组仅有8个受试对象。在包括接种前(第1天)的所有时间点的治疗之间存在显著差异(P≤0.10)。对于所有接种后时间点(第7、20、28和35天)，T02的平均SI显著高于T01和T03。相比之下，T05的SI与T01在任何的接种后时间点都没有差异。在第20天和第35天，T04的SI显著高于T01。在4个接种后时间点的3个中，T02的SFC/10⁶平均显著高于T01和T05。在任何接种后时间点，T03和T08的IFN-γ(SI和SFC/10⁶)应答与T01没有差异。

本领域技术人员可以认识到或者确信的是，可以使用不超过常规实验而得到本文所述的方面的具体实施方式的许多等价方式。这些等价方式也应该被本发明的权利要求所涵盖。