ES2577716T3

ES2577716T3 - Vacuna viva avirulenta con un adyuvante contra Mycoplasma hyopneumoniae

Info

Publication number: ES2577716T3
Application number: ES08847411.9
Authority: ES
Inventors: Hsien-Jue Chu; Zhichang Xu; Wumin Li; Nicole Rae Gibson
Original assignee: Zoetis Services LLC
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2007-11-06
Filing date: 2008-11-05
Publication date: 2016-07-18
Anticipated expiration: 2028-11-05

Description

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Tal como se utiliza en la presente memoria, "virulento" se refiere a la capacidad de una cepa de Mycoplasma hyopneumoniae para producir la enfermedad asociada con infección por Mycoplasma hyopneumoniae. La virulencia puede ser evaluada observando la progresión de la enfermedad en el animal. Un ejemplo de una cepa "virulenta" de Mycoplasma hyopneumoniae es la ejemplificada por la cepa de carga de Mycoplasma 5 hyopneumoniae, tal como se describe y utiliza en la presente invención. Otras cepas virulentas de Mycoplasma hyopneumoniae están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), designada como cepa No. 25617 o 25095. El término “avirulento" se refiere a cepas de Mycoplasma hyopneumoniae que carecen de virulencia. Esto es, cepas, aislados o constructos avirulentos son no patogénicos y son incapaces de producir enfermedad. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "avirulento" se utiliza como sinónimo con el término "no virulento." Se ejemplifican en la presente memoria composiciones que emplean la cepa J de cultivo vivo avirulento de M. hyopneumoniae (línea 1 de FCX3, la cual está disponible del American Type Culture Collection (ATCC) como cepa No. 27715). Otra cepa "avirulenta" que también está disponible de la ATCC está designada como cepa No. 25934. La cepa J designada como número de acceso ATCC 27715 fue clonada a partir de la cepa J original designada con el número de acceso

15 ATCC 25934, tal como se describe en el catálogo de la ATCC.

Descripción general

La presente divulgación se basa en el descubrimiento de que regímenes de una o dos dosis de una composición de Mycoplasma hyopneumoniae, incluyendo una composición inmunogénica o una composición de vacuna, utilizando uno o más Mycoplasma hyopneumoniae avirulentos vivos, tales como, por ejemplo, la cepa J (línea 1 de FCX3; nº de acceso a ATCC 27715) y uno o más adyuvantes, típicamente un adyuvante biológicamente aceptable, son efectivos en la protección contra y/o prevención o mejora de la enfermedad asociada con infección con Mycoplasma hyopneumoniae virulenta.

En una realización, otras cepas avirulentas vivas de Mycoplasma hyopneumoniae, que incluyen, pero no se limitan a, cepas J, cuyo genoma comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tienen al menos

25 aproximadamente 95% de homología, o al menos aproximadamente 99% de homología, con una referencia de cepa J, se contemplan para uso en las composiciones para uso en los métodos de tratamiento de la presente invención.

La cepa J de referencia puede ser seleccionada de las cepas de Mycoplasma hyopneumoniae designadas con los números de acceso ATCC 25934 o 27715.

La cepa J avirulenta viva utilizada en las composiciones para uso en los métodos de tratamiento de la presente invención es una cepa J designada con los números de acceso ATCC 25934 o 27715.

La cepa J avirulenta viva usada en las composiciones para uso en los métodos de tratamiento de la presente invención es una cepa J designada con el número de acceso ATCC 27715.

También se divulgan en la presente memoria que las composiciones, que incluyen composiciones de vacuna,

35 que emplean una o más cepas avirulentas vivas de Mycoplasma hyopneumoniae en combinación adicional con la vacuna viva modificada de quimera Tipo 1-Tipo 2 de circovirus porcino (cPCV1-2) (Véase Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0170270 y número 2004/0253270) también son efectivas en la protección contra y/o prevención o mejora de la enfermedad asociada con infección por Mycoplasma hyopneumoniae virulenta y/o infección por circovirus porcino virulento.

En ciertas realizaciones, las composiciones para uso de la invención comprenden adicionalmente una o más bacterias vivas, bacterinas y/o uno o más toxoides purificados seleccionados del grupo consistente de

Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, y bacterias leptospira.

En ciertas realizaciones, las composiciones para uso de la invención comprenden adicionalmente uno o más

45 antígenos virales seleccionados del grupo consistente de un antígeno del virus de influenza porcino (SIV), un antígeno del virus del síndrome reproductivo respiratorio porcino (PRRSV), PRRS que expresa virus de viruela de mapache u otros antígenos, PRRS que expresa TGEV u otros antígenos, y un antígeno de circovirus porcino (PCV).

Dentro de ciertas realizaciones, la presente divulgación se describe de en la presente memoria en adelante con referencia a la protección contra la infección con un homogenizado de pulmón designado como LI-34 que contiene la cepa 11 de Mycoplasma hyopneumoniae virulenta (véase J. Clin. Microbiol. 1999 Mar; 37(3):6207). Sin embargo, se contempla que las composiciones divulgadas en la presente memoria serán efectivas en la protección contra y/o prevención o mejora de la enfermedad o al menos un síntoma asociado con la enfermedad que está asociada con un amplio rango de infecciones por Mycoplasma hyopneumoniae

55 virulenta. Numerosos aislados virulentos de Mycoplasma hyopneumoniae son conocidos en la técnica y están disponibles de diversas fuentes incluyendo la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852. Ejemplos de estas cepas virulentas incluyen, pero no se limitan a, los números de acceso ATCC 25095, 27714 y 25617.

Las composiciones, en particular las composiciones inmunogénicas o composiciones de vacuna, de la presente divulgación pueden prepararse a partir de cultivos liofilizados o recién recolectados de Mycoplasma hyopneumoniae virulento vivo por una o más metodologías que están fácilmente disponibles en la técnica. Se ejemplifican en la presente memoria composiciones que comprenden la cepa J de M. hyopneumoniae

5 virulenta viva (línea 1 de FCX3) la cual está disponible como ATCC número 27715 (un aislado filtrado y clonado 3 veces del número ATCC 25934).

El Mycoplasma hyopneumoniae avirulento vivo puede ser cultivado por la metodología descrita en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.338.543 y 5.565.205. Más específicamente, el Mycoplasma hyopneumoniae puede ser propagado en medio de cultivo tal como medio PPLO completo (organismo similar 10 a pleuroneumonía) (Difco; Becton Dickinson and Company, San José, California). El crecimiento del organismo es monitorizado por técnicas estándar tales como la determinación de las unidades de cambio de color (CCU), y recolectado cuando se haya alcanzado un título suficientemente alto. Las preparaciones de reserva pueden ser concentradas o liofilizadas posteriormente, por métodos convencionales antes de la inclusión en las formulaciones de la composición. También pueden emplearse otros métodos, tales como los

15 descritos en Thomas et al., Agri-Practice 7(5):26-30.

Las condiciones bajo las cuales se cultiva un aislado de Mycoplasma hyopneumoniae pueden variar dependiendo de la composición precisa del medio y del aislado específico que está siendo cultivado. Los aislados de Mycoplasma hyopneumoniae son cultivados típicamente desde aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 144 horas, medidas desde el tiempo de incubación hasta el momento de la recolección.

20 Dependiendo de la composición precisa que va ser formulada, el Mycoplasma hyopneumoniae puede ser concentrado por ejemplo, por ultracentrifugación o ultrafiltración. El Mycoplasma hyopneumoniae concentrado puede ser recuperado por la metodología conocida en la técnica y puede ser mezclado con un portador adecuado fisiológicamente aceptable –típicamente un medio acuoso tal como, por ejemplo, solución salina, solución salina regulada con fosfato (PBS), medio esencial mínimo (MEM) o MEM con regulador HEPES.

25 Puede ser combinado adicionalmente con un adyuvante apropiado para proveer la concentración deseada en una base de volumen por volumen (v/v). Las composiciones pueden comprender adicionalmente uno o más quelantes, tales como EDTA, típicamente a una concentración de aproximadamente 0,05% hasta aproximadamente 0,20% (p/v). Alternativamente, la cepa de Mycoplasma hyopneumoniae que va a ser utilizada en las composiciones inmunogénicas o de vacuna puede ser concentrada como se describió más

30 arriba, o liofilizada y resuspendida en un adyuvante apropiado a la concentración deseada en una base de peso por volumen (p/v).

Como se indicó anteriormente, las composiciones, incluyendo las composiciones inmunogénicas o composiciones de vacuna, de la presente divulgación comprenden en general una cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae en combinación con uno o más adyuvantes, al menos un adyuvante que es el

35 adyuvante de Aceite SP biológicamente aceptable.

Para la administración en una dosis, las composiciones pueden contener una cantidad del Mycoplasma pneunomoniae avirulento vivo correspondiente a aproximadamente 1 x 108 hasta aproximadamente 3 x 1011 MHDCE/ml. Alternativamente, las composiciones pueden contener una cantidad de Mycoplasma pneunomoniae avirulento vivo correspondiente a aproximadamente 1 x 109 hasta aproximadamente 3 x 109

40 MHDCE/ml. Las composiciones se formulan de tal manera que cada dosis de administración estará entre aproximadamente un (1) ml y aproximadamente cinco (5) ml, o entre aproximadamente dos (2) ml, por animal para administración intramuscular, subcutánea o intraperitoneal y entre aproximadamente uno (1) y aproximadamente diez (10) ml, o entre aproximadamente dos (2) y aproximadamente cinco (5) ml, para administración oral o intranasal.

45 Para una administración en dos dosis, las composiciones contienen típicamente una cantidad de Mycoplasma pneunomoniae avirulento vivo de aproximadamente 1 x 108 hasta aproximadamente 3 x 1011 MHDCE/ml, más típicamente aproximadamente 1 x 109 hasta aproximadamente 3 x 109 MHDCE/ml. En ciertas realizaciones para la administración en dos dosis, las composiciones pueden contener una cantidad de Mycoplasma pneumoniae avirulento vivo que contiene aproximadamente 103 CFU/ml hasta 1011 CFU/ml. Las

50 composiciones se formulan de tal manera que cada dosis de administración estará entre aproximadamente un (1) ml y aproximadamente cinco (5) ml, preferiblemente aproximadamente dos (2) ml por animal para administración intramuscular, subcutánea o intraperitoneal y entre aproximadamente uno (1) y aproximadamente diez (10) ml, típicamente entre aproximadamente dos (2) y aproximadamente cinco (5) ml para administración oral o intranasal.

55 La mezcla adyuvante para uso en las composiciones inmunogénicas y composiciones de vacuna de la presente invención potencia la respuesta inmune estimulando las respuestas inmunes mediadas por células y/o locales (IgA secretado). El adyuvante biológicamente aceptable consiste de Aceite SP.

La concentración de adyuvante empleado en las composiciones descritas en la presente memoria dependerá de la naturaleza del adyuvante. Los adyuvantes están presentes típicamente en las composiciones en la

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memoria en combinación adicional con (a) una o más bacterias vivas tales como, por ejemplo, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, y bacterias de leptospira; (b) una o más bacterinas; (c) uno o más toxoides purificados de uno o más patógenos tales como, por ejemplo,

5 Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bacterias leptospira; y/o (d) uno o más antígenos virales en el que el virus es seleccionado del grupo consistente de virus de influenza porcina (SIV; tal como cepas de SIV H1N1, H1N2, y H3N2), virus del síndrome reproductivo respiratorio (PRRSV), PRRS que expresa virus de viruela de mapache y/o otros antígenos, PRRS que expresa TGEV y/o otros antígenos, y circovirus porcino (PCV). Se ejemplifican en la presente memoria composiciones, que incluyen composiciones de vacunas, las cuales emplean una o más cepas de Mycoplasma hyopneumoniae avirulentas vivas en combinación con vacunas vivas modificadas con quimeras Tipo 1-Tipo 2 de circovirus porcino (cPCV1-2) (véanse Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos 2003/0170270 y 2004/0253270).

15 Las composiciones, incluyendo composiciones de vacuna, pueden incluir adicional u opcionalmente un conservante, tal como por ejemplo, timerosol y/o EDTA. Véanse también las publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. 2002/0131980 y 2003/0017171.

La concentración de tales otras bacterias vivas, bacterinas, toxoides y/o antígenos virales empleados en las composiciones descritas en la presente memoria dependerán de la naturaleza de la bacterina, toxoide y/o antígeno viral y están presentes típicamente en las composiciones descritas en la presente memoria a una concentración final de entre aproximadamente 0,5 x 105 hasta 0,5 x 1010 por ml. Alternativamente, las bacterias están presentes en una concentración final de entre aproximadamente 0,5 x 106 a 0,5 x 109 por ml o entre aproximadamente 0,5 x 107 a 0,5 x 108 por ml.

Las composiciones de la presente divulgación se utilizan para proteger un animal contra una enfermedad

25 causada por Mycoplasma hyopneumoniae y/o para prevenir o mejorar una aparición de tal enfermedad entre poblaciones animales por administración de una composición de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva con adyuvante como se describe en la presente memoria. Las composiciones descritas en la presente memoria también pueden ser empleadas ventajosamente para potenciar en un animal una respuesta inmune, tal como una respuesta inmune mediada por células y/o humoral, al Mycoplasma hyopneumoniae. Tales métodos comprenden las etapas de administrar a un animal, típicamente un cerdo, en una o dos dosis, una composición que comprende una o más cepas de Mycoplasma hyopneumoniae avirulentas vivas con adyuvante. Dependiendo de la aplicación precisa contemplada, las composiciones pueden ser administradas por vía intramuscular, subcutánea, oral, por aerosol o intranasal.

De acuerdo con los métodos de la presente divulgación, un régimen de dosificación deseable involucra la

35 administración de una o más dosis de la composición de vacunas deseada al cerdo. Típicamente, cuando se administran dos dosis al animal, las dosis son administradas con una separación de aproximadamente una

(1) semana y aproximadamente cuatro (4) semanas, más típicamente entre aproximadamente dos (2) semanas y aproximadamente tres (3) semanas de separación

Ejemplos

La presente divulgación será mejor entendida con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes:

Ejemplo 1: Preparación de una vacuna viva con adyuvante de M. hyopneumoniae avirulenta

Este ejemplo divulga la preparación de una composición de M. hyopneumoniae avirulenta viva con adyuvante de ejemplo de acuerdo con la presente divulgación junto con composiciones de referencia también descritas en la presente memoria.

45 El Mycoplasma hyopneumoniae puede ser obtenido de cualquier número de fuentes fácilmente disponibles. En una realización descrita en la presente memoria, la cepa J de cultivo vivo avirulento de M. hyopneumoniae (línea 1 de FCX3), fue obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) como cepa ATCC No. 27715. Cualquier otra cepa avirulenta de M. hyopneumoniae puede ser utilizada para la preparación de las composiciones, tales como, por ejemplo, la cepa J original designada como número de acceso ATCC 25934. En ciertas otras realizaciones, se prevé que cualquier cepa virulenta viva de Mycoplasma pneumoniae, puede ser modulada, atenuada o mutada hasta que se establezca de que el cultivo es avirulento, según se determina por pruebas in vitro o in vivo, utilizando procedimientos conocidos para los experimentados en la técnica. La secuencia genómica completa de la cepa J ATCC 25934 ha sido publicada por Vasconcelos et al (J. Bacteriol. (2005), 187(16): 5568-5577) y ha sido asignada con el número de acceso

55 AE017243 asignado a GenBank. Varias de las secuencias asociadas con la cepa 25934 de ATCC pueden encontrarse en PubMed y tienen números de acceso de GenBank AY737012 (gen ARN ribosómico de 16S), y AY512905 (gen de adesina, AF013714 (gen de prolipoproteína p65), U02538 (gen ARNr 23S) y como genes homólogos de proteína con resistencia a multifármacos U02537).

Cada composición de vacuna para el ensayo bactericida fue preparada a partir de un vial liofilizado de un cultivo de M. hyopneumoniae rehidratado con 20 ml de solución salina normal. Las composiciones de vacuna incluyeron la combinación de 5 ml del cultivo rehidratado y adyuvante suficiente para adquirir la concentración de adyuvante específico en un volumen final de 10 ml. Se mezclaron todas las composiciones durante 5 minutos antes del muestreo. También se preparó una composición de control combinando 5 ml de cultivo deshidratado con 5 ml de solución salina normal. Se tomaron muestras de todas las composiciones a los 5 minutos (0 hora), 3 horas, y 7 horas después de la mezcla. La viabilidad de cada vacuna fue determinada por las Unidades Formadoras de Colonia (CFU) en cada punto de muestreo (véase Tabla 1).

Tabla 1

CFU/ml: MPN/ml

Adyuvante: 0 horas 3 horas 7 horas 0 horas 3 horas 7 horas

30% SL-CD: 1,44E+07 0 0 1,15E+07 0 0

10% SL-CD: 1,48E+07 6,40E+05 5,2E+03 2,87E+07 8,42E+05 0,00E+00

Control: 8,30E+07 1,06E+08 9,00E+07 3,62E+07 6,22E+07 3,62E+07

5% Aceite SP: 9,46E+07 7,60E+07 2,55E+07 4,67E+07 9,40E+07 6,22E+06

5% Aceite SP/0,2%: 1,50E+08 5,61E+07 4,53E+07 4,27E+08 7,74E+07 2,84E+06

Control: 2,17E+08 1,41E+08 9,86E+07 1,91E+08 8,42E+07 4,67E+07

10% Aceite SP: 1,09E+07 1,07E+07 7,13E+06 3,40E+06 7,74E+06 3,62E+06

Control: 3,50E+07 4,75E+07 7,20E+07 1,03E+07 3,42E+07 3,14E+07

10% Aceite SP+0,2% carbopol: 5,20E+07 1,30E+07 8,13E+06 5,50E+07 1,91E+07 2,26E+06

0,2% Carbopol: 6,80E+07 6,67E+07 6,60E+07 1,63E+08 1,38E+08 4,45E+07

Control: 2,90E+07 Sin prueba 5,54E+07 1,23E+08 Sin prueba 1,38E+07

10 La viabilidad promedio del cultivo de reserva fue determinada promediando todas las viabilidades de control a la hora 0, promedio 9,09 x 107 CFU/ml. En comparación, el número más probable (MPN) fue determinado para los cultivos de reserva dando como resultado 1,85 x 108 MPN/ml. La mezcla de la vacuna y la vacuna tiene lugar típicamente en menos de 3 horas; por lo tanto, cuando se ven el efecto bactericida de los adyuvantes, el punto de tiempo de 3 horas es el más importante. La tendencia del Aceite SP al 5% y 10% en

15 el muestreo de 3 horas en comparación con el control es una diferencia de 2 veces y una diferencia de 4 veces, respectivamente.

La vacuna A fue preparada rehidratando viales de cultivo liofilizado con diluyente que contenía 10% (v/v) de concentración final de Aceite SP. La vacuna de placebo fue solución salina normal estéril.

Ejemplo 2: Eficacia in vivo de vacunas vivas con adyuvante avirulentas de M. hyopneumoniae en cerdos

20 Este ejemplo demuestra la eficacia in vivo de composiciones de vacuna avirulentas vivas con adyuvante de ejemplo de M. hyopneumoniae.

Un total de 30 cerdos, de cuatro a seis semanas de edad, fueron adquiridos de un rebaño de Fort Dodge Animal Health´s SPF en Charles City, Iowa. Los cerdos fueron mantenidos con alimentación sin antibióticos o promotores de crecimiento y recibieron agua y alimento ad libitum. Los animales que recibieron

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Los cerdos fueron sometidos a necropsia. Se utilizó pentobarbital para inducir anestesia profunda antes del desangrado. Los pulmones fueron retirados y se registraron las lesiones sobre diagramas de pulmón estándar. Se recolecto el suero de todos los cerdos y fue analizado por ELISA en cuanto a anticuerpos para

M. hyopneumoniae. Todos los cerdos fueron o positivos o seronegativos para M. hyopneumoniae sugiriendo

5 que no hubo una exposición previa a M. hyopneumoniae antes de la llegada. Se recolectaron frotis de tráquea asépticamente de todos los cerdos. Se aislaron Pasteurella multocida y Haemophilus parasuis de cuatro y tres cerdos respectivamente. La M. hyopneumoniae fue aislada de todos los cerdos cargados. Los esquemas de pulmón fueron evaluados con un sistema de análisis de imágenes Zeiss para determinar el porcentaje de lesiones pulmonares de neumonía.

10 Conclusiones

La carga de los cerdos fue exitosa y una dilución de 1:100 sería la dilución óptima para usar. El porcentaje promedio de neumonía inducida fue de 10,17 +/-6,6, la cual es más alta que la normal, lo cual sin embargo puede ser atribuido a la presencia de Pasteurella multocida y/o parasuis en los cerdos. Además, 100% de los cerdos inoculados con el inoculo de carga tuvieron lesiones pulmonares significativas. Globalmente, estos 15 resultados son bastantes típicos con respecto a los que se observaron en nuestros estudios de M. hyopneumoniae, en cuanto a que si hay otros patógenos presentes, hay un incremento en la neumonía. Esto puede ser debido a la interacción entre los patógenos y el sistema inmune. Produjimos 1,600 ml de inoculo de pulmón de M. hyopneumoniae para uso en experimentos de carga experimentales. El inoculo producirá al menos 8% o más de lesiones pulmonares por neumonía en un mínimo del 80% de los cerdos inoculados

20 cuando se utilizó una dilución 1: 100 por vía intratraqueal.

La vacuna fue titulada antes del día de vacunación y se llevaron a cabo ensayos bactericidas para determinar los sistemas adyuvantes apropiados para ser usados (véase Ejemplo 1). A partir de estos datos, se seleccionó un sistema de adyuvante de Aceite SP al 10% para estudio posterior. La viabilidad promedio por vial de cultivo de reserva fue de 3,64 x 109 CFU/Botella.

25 En el día de la primera administración, se prepararon composiciones de vacuna como sigue: Vacuna A – cada uno de los tres viales de cultivo liofilizado avirulento de M. hyopneumoniae fue rehidratado con 10 ml de diluyente de Aceite SP al 10%. Los tres viales de composición de vacuna para cada tipo de diluyente fueron reunidos y se dejaron en mezcla durante 20 minutos sobre una placa con agitación con una barra de agitación. El placebo fue solución salina normal dividida en alícuotas en una botella estéril para

30 administración. Las composiciones permanecieron sobre hielo durante el transcurso de la vacunación durante 2 horas.

En el día de la segunda administración, las composiciones de vacuna fueron preparadas como sigue: Vacuna A -cada una de los tres viales de cultivo liofilizado avirulento de M. hyopneumoniae fue rehidratado con 10 ml de diluyente Aceite SP al 10%. Los tres viales fueron rehidratados para cada tipo de diluyente y reunidos y

35 dejados en mezcla durante 20 minutos en una placa de agitación con una barra de agitación. El placebo fue solución salina normal dividida en alícuotas en una botella estéril para administración. Las composiciones permanecieron sobre hielo durante el curso de la vacunación durante 2 horas.

La concentración de M. hyopneumoniae viable en cada composición fue determinada antes y después de la administración. La viabilidad fue evaluada determinando las unidades formadoras de colonia (CFU/ml). Un

40 vial de cultivo de reserva liofilizado fue rehidratado con 10 ml de solución salina normal, se dejo en mezcla durante 20 minutos y sirvió como control para el ensayo de viabilidad. Puesto que la primera viabilidad de control fue inferior que la viabilidad de vacuna de prueba, durante la segunda administración, se rehidrataron dos viales y se reunieron para servir como control. (Véase Tabla 3 para las viabilidades de vacuna de prueba y viabilidades de control).

45 Tabla 3

Vacuna: Primera vacunación CFU/ml Segunda vacunación CFU/ml

Grupo 1: Adyuvante Aceite SP al 10%: 2,79E+08 2,27E+08

Control de viabilidad: 1,29+08 2,69E+08

Todos los cerdos fueron observados diariamente en cuanto a temperaturas y síntomas clínicos partiendo dos días antes de cada administración y continuaron durante siete días después de cada administración. Los cerdos fueron observados en cuanto a sus síntomas clínicos, los cuales incluían, pero no se limitaban a, tos, estornudo, descarga nasal, depresión, inapetencia y respiración dificultosa.

50 Catorce días después de la segunda administración, los cerdos en el grupo 1 fueron cargados por vía transtraqueal con una cepa virulenta de M. hyopneumoniae.

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ml/fosa nasal) de vacuna viva PCV/MH por vía intranasal dos veces (con separación de dos semanas) y fueron cargados (Grupo 3); 15 cerdos no recibieron administración de la vacuna PCV/MH y fueron cargados (Grupo 4); y 5 cerdos sirvieron como controles ambientales (Grupo 5).

La vacuna usada en el estudio divulgado en la presente memoria fue una combinación del antígeno vivo

5 liofilizado MH (lote #1744-56) y un diluyente que contenía vacuna viva PCV (Lote C108-56). En el día de la vacunación, la torta MH viva liofilizada fue rehidratada con diluyente que contenía virus vivo PCV (4,0Log10FAID50/mL con la adición de adyuvante con Aceite SP al 10%). A la vacuna final se asignó el lote # 2315-30. La viabilidad para la fracción MH fue determinada antes y después de la vacunación, 3,18 x 108 CFU/mL (antes) y 1,65 x 108 CFU/mL (después), respectivamente. El título en PCV para la vacuna pre y post

10 vacunación fue de 4,09 Log10FAID50 y 3,7 Log10FAID50, respectivamente. La vacuna para la segunda vacunación fue preparada como se indicó anteriormente y recibió la asignación de lote # 2315-32. La viabilidad para la fracción MH fue de 1,24 x 108 CFU/mL y 1,5 x 108 CFU/mL pre y post vacunación respectivamente. La viabilidad para la fracción PCV fue de 4,36 Log10FAID50 y 3,83 Log10FAID50, respectivamente.

15 Los cerdos fueron observados durante 7 días después de la vacunación para cualquier reacción adversa a la vacuna. Tres cerdos murieron durante el período de observación postvacunación debido a causas no relacionadas con MH o PCV. En la Tabla 5 se encuentra un resumen de las observaciones clínicas para el período postvacunación.

Tabla 5

Grupo: # de cerdos Tratamiento Ruta Dosificación Observación después de la vacunación

1: 16 Vacunación IM 1 dosis Se notó que un cerdo tenia temperatura elevada (40,6-41,2ºC) durante 7 días consecutivos partiendo en el día quince después de la primera vacunación. Se anotó que otro cerdo tuvo temperatura elevada, inapetencia y depresión durante 4 días consecutivos comenzando 18 días después de la primera vacunación

2: 15 Vacunación IM 2 dosis Un cerdo murió el día antes de la segunda vacunación debido a posible infección por HPS o S. suis. Los signos clínicos de depresión y delgadez fueron notados antes de la vacunación. Un cerdo tuvo 3 días consecutivos de temperatura elevada (40,5-41-5ºC) comenzando 5 días después de la primera vacunación.

3: 15 Vacunación IN 2 dosis Dos días antes de la segunda vacunación un cerdo murió debido a perforación intestinal. Dos cerdos tuvieron articulaciones inflamadas y tos durante 8 días consecutivos, lo cual se había originado antes de la primera vacunación. Se notó que otros dos cerdos un día antes de la segunda vacunación tenían corvejones inflamados durante 7 días consecutivos en los cuales uno de ellos dio como resultado un absceso, y el otro sanó.

4: 15 Solución salina IM 2 dosis Se notó que un cerdo tenía corvejones inflamados a lo largo del estudio anotado antes de la primera vacunación. Otro cerdo tuvo también corvejones inflamados durante varios días durante el estudio. Un cerdo tuvo dos días de temperatura elevada durante dos días consecutivos 40,6ºC y 41,3ºC comenzando 6 días después de la segunda vacunación.

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5: Sin vacunación NA NA Alojado con grupo de 4 cerdos durante la vacunación. No se notaron reacciones adversas.

NA: No aplicable IN: Intranasal IM: Intramuscular

Todos los cerdos en los grupos 1-4 fueron cargados con una cepa virulenta de M. hyopneumoniae (homogenizado de pulmón de cerdo que contenía MH virulento (LI-34)). Los cerdos del Grupo 1 fueron cargados 4 semanas después de la primera vacunación. Los cerdos en los Grupos 2-4 fueron cargados 2

5 semanas después de la segunda vacunación. A las 4 semanas después de la carga, todos los cerdos en los Grupos 1-5 fueron sometidos a necropsia y se evaluaron las lesiones pulmonares.

La vacuna fue titulada antes del día de vacunación. El cultivo liofilizado de M. hyopneumoniae avirulento fue rehidratado en el día de la vacunación. La concentración de organismos de M. hyopneumoniae en la vacuna fue de aproximadamente 2 x 108 CFU/ml. Se retuvo una muestra de vacuna y se llevó a cabo un ensayo de

10 viabilidad antes y después de la vacunación para confirmar los CFU/ml reales. La vacuna fue mantenida sobre hielo durante el curso de la vacunación.

Todos los cerdos fueron observados diariamente en cuanto a temperatura y signos clínicos comenzando dos días antes de cada vacunación y continuando siete días después de cada vacunación. Los cerdos fueron observados en cuanto a síntomas clínicos, los cuales incluían, pero no se limitaron a, tos, estornudo,

15 descarga nasal, depresión, inapetencia, y respiración laboriosa. 14 días después de la segunda vacunación, los cerdos en los Grupos 1-4 fueron cargados por vía transtraqueal con una cepa virulenta de M. hyopneumoniae.

En el día de la carga, la solución de reserva de carga virulenta de M. hyopneumoniae, un homogenizado de pulmón (LI-34) congelado (-70ºC) fue descongelado rápidamente bajo agua tibia y diluido (dilución 1:100)

20 utilizando medio de cultivo estéril para M. hyopneumoniae. Los cerdos fueron sedados con una mezcla de Xilazina, Ketamina, Telazol® que comprendía 50 mg/ml de Xilazina, 50 mg/ml de Ketamina y 100 mg/ml de Telazol. Cada cerdo recibió 10 ml del material de carga por vía transtraqueal. Para asegurar la colocación de la aguja, se introdujo aire dentro de la jeringa antes de la administración del material de carga.

Todos los cerdos fueron observados de manera general en cuanto a sus signos clínicos después de la carga.

25 La observación fue llevada a cabo diariamente en cuanto a cualquier signo clínico anormal. Los cerdos fueron sangrados para obtener suero (no más de 13 ml de sangre entera) en los días 0, 14, 28 y 56 del estudio. Se recolectó el suero, pero no se evalúa. Se puede llevar a cabo ELISA para evaluar la respuesta serológica de los cerdos usando el suero recolectado durante el período de estudio en el futuro.

Cuatro semanas después de la carga, todos los cerdos de los Grupos 1-5 fueron sometidos a eutanasia y se

30 retiraron los pulmones. Las lesiones por M. hyopneumoniae y atípicas fueron fijadas con formalina y las muestras fueron examinadas para histopatología. Las muestras de frote de los pulmones afectados fueron recolectadas para aislamiento bacteriano. Los cerdos que murieron después de la carga fueron sometidos a necropsia y se recolectaron muestras como se describió más arriba. La eficacia de la vacuna fue definida como una calificación de lesiones pulmonares promedio combinadas de los vacunados que fue 50% menos

que la calificación de lesiones pulmonares promedio combinadas de los controles.

En el día de la necropsia todos los cerdos fueron sometidos a eutanasia, se calificaron las lesiones pulmonares y se hicieron frotis para aislamiento bacteriano. Las bacterias aisladas de los frotis consistían de las siguientes: Staphylococcus heamolyticus, Streptococcus suis (P322), Staphylococcus epidermis, A. pyogenes, aerococus species, S. uberis, Bordetella bronchiseptica (P344) y Microbacteria. El análisis estadístico para las calificaciones de lesiones pulmonares está en la Tabla 6.

Tabla 6

Grupo: Proporción de protección MF de camada ajustado MF nivel de confidencia inferior Calificación de lesión pulmonar Porcentaje ajustado camada Calificación de lesión pulmonar LCL Desviación estándar de lesión pulmonar Percentil medio para lesiones

Vacunado por vía IM dosis individual: 1/15 52,9% 19,6% 6,30% 3,86% 4,41 0,37

Vacunado IM dosis doble: 3/15 63,8% 33,8% 5,03% 2,39% 4,59 0,31

Vacunado IN dosis individual: 0/14 -8,6% -51,8% 12,86% 8,59% 7,38 0,65

Control: 0/15 NA NA 11,46% 8,41% 5,5 0,62

LCL = Nivel de confidencia inferior MF = Fracción mitigada

El análisis estadístico de los datos satisfizo los criterios para la fracción mitigada (<50%, con LCL >30%) para la reducción en lesiones pulmonares. Este ejemplo demuestra (a) la eficacia de la vacuna de MH/PCV para la

10 fracción MH con dos dosis de 2 mL administradas por vía IM, a 3,18 x 108 CFU/mL y (b) la seguridad de la vacuna MH/PCV debida a la carencia de signos clínicos relacionados con MH o PCV después de la vacunación.

Ejemplo 4: Estudio de inmunogenicidad de la vacuna de combinación de la fracción de Mycoplasma hyopneumoniae en la cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae –quimera viva modificada Tipo 1

15 Tipo 2 de circovirus porcino en cerdos de 3-4 semanas de edad.

Este ejemplo divulga un estudio de inmunogenicidad que soporta los resultados del estudio presentado en el Ejemplo 4 y confirma la eficacia de la vacuna combinada de la fracción de M. hyopneumoniae de la cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae -vacuna viva modificada de quimera Tipo 1 – Tipo 2 de circovirus porcino (cPCV1-2) (MH/PCV) cuando se administra por vía intramuscular. La vacuna MH/PCV 20 divulgada en la presente memoria puede ser empleada de manera adecuada para la vacunación de cerdos saludables y como auxiliar en la prevención y/o minimización de la severidad de la enfermedad causada por

M. hyopneumoniae y circovirus porcino.

Los cerdos utilizados en el presente estudio fueron seronegativos a M. hyopneumoniae según se determinó por ELISA.

25 Un total de 79 cerdos de tres a cuatro semanas de edad fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos. 24 cerdos, Grupo 1 fueron vacunados con una dosis individual de una combinación de vacuna viva PCV/MH. 24 cerdos, Grupo 2, fueron vacunados con la vacuna de combinación dos veces con dos semanas de separación. 24 cerdos, Grupo 3, fueron vacunados con solución salina normal dos veces con separación de dos semanas para servir como controles de carga. Todas las vacunas fueron administradas por vía

30 intramuscular. Cuatro cerdos, Grupo 4, no fueron vacunados ni cargados y sirvieron como controles ambientales.

La vacuna utilizada en el estudio fue una combinación de antígeno vivo liofilizado de MH (Lote 1744-66) y diluyente que contenía vacuna viva PCV (cPCV1-2 Lote C108-56). En el día de la vacunación, la torta de MH vivo fue rehidratada con diluyente que contenía el virus vivo PCV (3,5Log10FAID50/mL con adyuvante de Aceite SP al 10%). La vacuna final recibió la denominación Lote 2315-40. La viabilidad de la fracción MH fue

5 determinada antes y después de la vacunación, 2,09 x 108 CFU/mL y 1,56 x 108 CFU/mL respectivamente. La vacuna placebo fue solución salina normal estéril.

La vacuna para la segunda vacunación fue preparada como se indicó más arriba y recibió el nombre de Lote # 2315-42. La viabilidad de la fracción de MH fue de 1,05 x 108 CFU/mL y 6,72 x 107 CFU/mL pre y post vacunación respectivamente. La viabilidad para el diluyente de la fracción PCV fue de 3,44 Log10FAID50.

10 La vacuna fue titulada antes del día de la vacunación. El cultivo liofilizado de M. hyopneumoniae virulento fue rehidratado en el día de la vacunación. Una muestra de vacuna fue retenida y se llevó a cabo un ensayo de viabilidad y después de la vacunación para determinar CFU/ml. La vacuna permaneció sobre hielo durante el transcurso de la vacunación.

Todos los cerdos fueron observados diariamente en cuanto a temperaturas y signos clínicos empezando dos

15 días antes de cada vacunación y continuando durante 7 días después de cada vacunación. Se observaron los cerdos en cuanto a sus síntomas clínicos, los cuales incluían, pero no se limitaban a, tos, estornudo, descarga nasal, depresión, inapetencia y respiración laboriosa.

Los cerdos fueron observados durante 7 días después de la vacunación en cuanto a cualquier reacción adversa a la vacuna. Tres cerdos murieron durante el período de observación postvacunación debido a

20 causas no relacionadas con MH o PCV. Un resumen de las observaciones clínicas del período de postvacunación se encuentra en la Tabla 7.

Tabla 7

Grupo: # de cerdos Tratamiento Dosificación Observaciones después de la vacunación

1: 24 Vacunación 1 dosis No se notaron reacciones adversas debidas a la vacunación

2: 24 Vacunación 2 dosis Un cerdo murió en este grupo debido a perforación intestinal. En el día 5 después de la primera vacunación un cerdo tenía una temperatura de 105,5ºF y se notó respiración laboriosa durante un día.

3: 24 Vacunación con solución salina NA En el día 6 después de la vacunación se notó un cerdo con respiración laboriosa durante solo un día

4
4: Sin vacunación NA Alojado con 3 cerdos durante la vacunación. No se anotaron reacciones adversas.

NA: No aplicable

Todos los cerdos en los Grupos 1-3 fueron cargados con una cepa virulenta de M. hyopneumoniae a las aproximadamente 7 semanas de edad. Los cerdos del Grupo 1 fueron cargados dos veces después de la 25 primera vacunación. Los cerdos en los Grupos 2 y 3 fueron cargados dos semanas después de la segunda vacunación. La reserva virulenta de M. hyopneumoniae cargada, un homogenizado de pulmón (LI-34) congelado (-70ºC) fue descongelado rápidamente bajo agua tibia y diluida (dilución 1:100) utilizando medio de cultivo estéril para M. hyopneumoniae. Los cerdos fueron sedados con una mezcla de Xilazina-Ketamina-Telazol™ que comprendía 50 mg/ml de Xilazina, 50 mg/ml de Ketamina, y 100 mg/ml de Telazol. Cada cerdo

30 recibió 10 ml de material de carga por vía transtraqueal.

Los cerdos fueron sangrados para obtener suero en los días 0, 14, 28, y 56 del estudio. Las muestras de suero recolectadas de este estudio pudieron ser probadas para evaluar la respuesta serológica del animal a

M. hyopneumoniae y PCV2 utilizando métodos de ELISA bien conocidos en la técnica. Las muestras de

suero recolectadas desde el día 0 después de la vacunación (0DPV) y día cero postcarga (0DPC) pueden ser 35 probados en cuanto a anticuerpos para M. hyopneumoniae, influenza porcina (H1N1), y síndrome reproductor

imagen11

Tabla 8

Vacunado por vía IM dosis individual: 1/23 58,4 31% 8,84% 6,68% 4,99 0,38

Vacunado IM dosis doble: 4/19 71,2% 48,7% 6,62% 4,37% 4,67 0,3

Control: 0/23 NA NA 19,27% 14,62% 10,76 0,69

LCL = Nivel de confidencia inferior MF = Fracción mitigada

El análisis estadístico de los datos satisface los criterios para la fracción mitigada (<50%, con LCL >30%) para reducción en las lesiones pulmonares. La vacuna se considera eficaz para la fracción MH con una dosis de 2 mL administrada IM, bien sea dosis sencilla o dosis doble a 2,09 x 108 CFU/ml. Además la vacuna es considerada segura debido a la carencia de signos clínicos relacionados con MH o PCV después de la vacunación.

Tabla 9

Resultados de serología para el Ejemplo 2

ID del cerdo: Grupo ODPV1 ODPV2 ODPC Necropsia Calificación pulmonar

730: 1 <50 100 400 400 9,5

733: 1 <50 <50 100 >400 35,5

735: 1 <50 <50 100 200 5,5

740: 1 <50 <50 200 400 5,5

742: 1 <50 <50 200 200 0,5

745: 1 <50 <50 200 100 0,9

754: 1 <50 <50 400 400 6,8

755: 1 <50 <50 400 >400 0,0

761: 1 <50 <50 200 200 4,5

762: 1 <50 <50 >400 200 0,5

763: 1 <50 <50 400 200 2,7

771: 1 <50 <50 >400 >400 5,5

774: 1 <50 <50 >400 >400 0,0

732: 2 <50 <50 <50 <50 1,8

738: 2 <50 <50 <50 <50 5,9

739: 2 <50 <50 <50 50 18,2

Resultados de serología para el Ejemplo 2

ID del cerdo: Grupo ODPV1 ODPV2 ODPC Necropsia Calificación pulmonar

743: 2 <50 <50 <50 50 19,1

747: 2 <50 <50 <50 200 0,5

749: 2 <50 <50 <50 50 21,4

752: 2 <50 <50 <50 <50 9,5

759: 2 <50 <50 <50 <50 15,9

764: 2 <50 <50 <50 <50 26,4

768: 2 <50 <50 <50 <50 31,8

769: 2 <50 <50 <50 <50 16,8

773: 2 <50 <50 <50 <50 10,0

726: 3 <50 <50 <50 <50 0,0

744: 3 <50 <50 <50 <50 0,0

750: 3 <50 <50 <50 <50 0,0

767: 3 <50 <50 <50 <50 1,4

770: 3 <50 <50 <50 <50 0,5

Grupo 1: Vacuna con Aceite SP (vacunado y cargado) Grupo 2: Control/carga (no vacunado y cargado) Grupo 3: Control no cargado (no vacunado y no cargado)

ODPV1 y ODPV2: Los números indican la dilución más alta que fue positiva en la prueba de ELISA después de la primera dosis de vacuna (ODPV1) o después de la segunda dosis de vacuna (ODPV2).

ODPC: Los números indican los resultados de ELISA postcarga. El número más alto indica seroconversión.

Calificación pulmonar: El número indica el porcentaje de lesiones en los pulmones de los animales. El número más alto indica un número mayor de lesiones pulmonares debido a una carencia de inmunidad protectora. El número más bajo indica un cerdo más saludable con menores lesiones debido a la inducción de una respuesta inmune protectora.

Claims

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