BR112021013241A2 - Cepas atenuadas de bordetella bronchiseptica, vacinas orais contendo as cepas atenuadas e métodos de preparação e uso das mesmas - Google Patents

Abstract

cepas atenuadas de bordetella bronchiseptica, vacinas orais contendo as cepas atenuadas e métodos de preparação e uso das mesmas. a presente invenção fornece cepas de b. bronchiseptica mutantes aroa atenuadas que são eficazes para induzir uma resposta imune em um animal contra b. bronchiseptica. também são fornecidas composições imunogênicas e vacinas que incluem as cepas de b. bronchiseptica mutantes aroa atenuadas. também são fornecidos kits para uso com tais composições e vacinas. também são fornecidos métodos de administração oral de cepas, composições e vacinas atenuadas de b. bronchiseptica mutante de aroa.

Description

CEPAS ATENUADAS DE BORDETELLA BRONCHISEPTICA, VACINAS ORAIS CONTENDO AS CEPAS ATENUADAS E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO E USO DAS MESMAS REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório US 62/788,764 depositado em 4 de janeiro de 2019, todo o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[002] Todas as referências citadas neste relatório descritivo são incorporadas por referência neste relatório descritivo em sua totalidade.

DECLARAÇÃO SOBRE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] A Listagem de Sequências associada a este pedido é fornecida em formato de texto, em vez de uma cópia em papel, e, é incorporada por meio deste por referência no relatório descritvo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequência é MER 17-336_ST25 (listagem de sequência).txt. O arquivo de texto tem 22 KB; foi criado em 20 de dezembro de 2019; e está sendo submetido eletronicamente via EFS-Web, concomitantemente com o depósito do relatório descritivo.

CAMPO DE INVENÇÃO

[004] A presente invenção se refere, de uma forma geral, a cepas bacterianas de Bordetella bronchiseptica, composições e vacinas, e métodos de fabricação e uso das mesmas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[005] Na medicina veterinária, B. bronchiseptica leva a uma variedade de patologias determinadas pelo hospedeiro e causa doenças graves em caninos, suínos e coelhos. Em suínos, B. bronchiseptica e P. multocida se combinam para causar rinite atrófica. Em caninos, B. bronchiseptica causa traqueobronquite aguda, caracterizada por uma tosse áspera e estridente do tipo “canil”. Essa tosse também pode ser causada pelo adenovírus-2 canino (cAV2) e / ou vírus da parainfluenza canina (cPI2). Em felinos, a infecção por B. bronchiseptica está associada a traqueobronquite, conjuntivite e rinite (denominada “infecção do trato respiratório superior” ou “URI”), linfadenopatia mandibular e pneumonia. No entanto, a URI felina também pode ser causada por herpesvírus, calicivírus, Mycoplasma spp. E / ou Chlamydia psittaci.

[006] B. bronchiseptica é bem conhecida pela variação de fase de alta frequência e modulação antigênica (Monack, DM, et al., "Variantes de Fase de Bordetella bronchiseptica surgem por deletões espontâneas no Locus Vir." 1989, pp. 1719-1728). Portanto, de uma cepa para outra, e dependendo das condições de cultura, o nível de expressão dos determinantes antigênicos pode variar e impactar a imunogenicidade de preparações de vacinas inativadas. Classicamente, as cepas de B. bronchiseptica (por exemplo, RB50) cultivadas a 37° C produzem proteínas que estão envolvidas na virulência e são conhecidas por serem importantes determinantes antigênicos, incluindo adenilato ciclase-hemolisina (Ac-Hly), efetor do sistema de secreção tipo III (BteA), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina (PRN) e Fimbriae (FIM; codificado pelos genes ativados pela virulência chamados vag). No entanto, a bactéria reprime a produção desses fatores de virulência quando é cultivada a 25 ° C ou a 37° C na presença de MgSO4 ou ácido nicotínico. Além disso, a expressão de genes reprimidos de virulência denominados vrg, como aqueles que codificam o flagelo, é ativada nessas condições.

[007] A vacinação intranasal tem sido geralmente considerada como o único método aceitável no estado da técnica para vacinar animais contra B. bronchiseptica. A administração sistêmica de vacinas vivas de B. bronchiseptica não foi considerada uma opção segura, pois se sabe que a administração sistêmica de B. bronchiseptica viva, mesmo quando atenuada, pode levar à formação de abscesso grave [ver, por exemplo, Toshach et al., J Am Anim Hosp Assoc 33: 126-128 (1997)]. Da mesma forma, estudos demonstraram que a vacinação intranasal foi muito superior à vacinação oral (Ellis JA, et al. “Eficácia comparativa das vacinas intranasais e orais contra Bordetella bronchiseptica em cães.” The Veterinary Journal, vol. 212, 2016, pp. 71– 77).

[008] Foi demonstrado que uma cepa de Bordetella bronchiseptica viva atenuada / avirulenta fornece forte proteção contra tosse de canil em cães (Bey, RF, et al., "Intranasal Vaccination of Dogs with Liver Avirulent Bordetella bronchiseptica: Correlation of Serum Agglutination Titer and the Formation of Secretory IgA with Protection Against Experimentally Induced Infectious Tracheobronchitis” American Journal of Veterinary Research, vol. 42, no. 7, 1981, pp. 1130-1132) quando administrado por via intranasal a cães em uma formulação de vacina. Após a administração nasal, foi demonstrada uma correlação entre o título de agutinação sérica e a formação de IgA secretora com proteção contra traqueobronquite infecciosa induzida experimentalmente. Esta proteção foi observada 48 horas após a vacinação. A vacinação intranasal com B. bronchiseptica viva atenuada também demonstrou proteger contra a rinite atrófica em leitões de dois dias de idade (De Jong, MF “Prevention of Atrophic Rhinitis in Piglets by Means of Intranasal Administration of a Live Non ‐ AR ‐ PathogenicBordetella Bronchisepticavaccine. ”Veterinary Quarterly, vol. 9, no. 2, 1987, pp. 123-133). A prevenção da rinite atrófica em leitões por meio da administração intranasal de uma vacina viva de Bordetella bronchiseptica não patogênica para AR indica que, em uma forma atenuada viva, as vacinas de Bordetella podem ser ativas em animais recém-nascidos.

[009] Uma cepa aroA deletante de B. bronchiseptica também foi construída e empregada apenas em uma vacina intranasal (Stevenson e Roberts, Vaccine 20, 2325-2335 (2002)). No entanto, a inativação do gene aroA atenua fortemente B. bronchiseptica, prejudicando gravemente sua capacidade de colonizar e sobreviver no trato respiratório. Isso é consistente com estudos semelhantes em que uma B. pertussis com deleção de aroA foi altamente atenuada, mas também perdeu sua capacidade de colonizar o trato respiratório dos animais vacinados por via intranasal e induziu imunidade protetora apenas após administrações repetidas de altas doses (Roberts, et al. “Construction and Characterization in Vivo of Bordetella Pertussis AroA Mutants”; Infection and Immunity, American Society for

Microbiology Journals, 1 de março de 1990, iai.asm.org/content/58/3/732.short).

[0010] As vacinas intranasais são inconvenientes para administrar, especialmente para animais que muitas vezes resistem à administração de qualquer substância em suas narinas, como caninos ou felinos. A administração de vacinas por via intransal também cria o risco de que a quantidade de vacina ingerida pelo animal seja significativamente menor do que a dose que demonstrou ser protetora, caso o animal espirre durante a administração.

[0011] Além das limitações acima das vacinas e métodos existentes de B. bronchiseptica, os esforços para fornecer vacinas multivalentes usando cepas de B. bronchiseptica existentes combinadas com outras cepas bacterianas e virais tiveram sucesso limitado. Por exemplo, Skibinski et al., descreveram vários desafios associados ao desenvolvimento de vacinas de combinação, incluindo uma resposta reduzida a um dos antígenos. Skibinski, David AG, et al., "Combination Vaccines". Journal of Global Infectious Diseases, vol. 3, No. 1, 2011, p. 63., doi: 10.4103 / 0974- 777x.77298.

[0012] As vacinas de B. bronchiseptica existentes também sofrem de outras limitações, como efeitos colaterais indesejados de excipientes de vacina essenciais para as formulações de vacinas existentes. Os adjuvantes usados para aumentar a eficácia da vacina aumentam as reações locais (como vermelhidão, inchaço e dor no local da injeção) e reações sistêmicas (como febre, calafrios e dores no corpo) (“Segurança da vacina”. Centros de Controle e Prevenção de

Doenças, Centros for Disease Control and Prevention, 22 de outubro de 2018, www.cdc.gov/vaccinesafety/concerns/adjuvants.html). O soro usado nas vacinas existentes é rico em proteínas e aumenta o risco de reações alérgicas. Por exemplo, soro fetal de bezerro (FCS) é uma substância típica de origem animal (SAO) que pode causar uma reação alérgica (Ohmori, Keitaro, et al. “Reatividade de IgE a componentes de vacina em cães que desenvolveram reações alérgicas de tipo imediato após vacinação. ”Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 104, no. 3-4, 2005, pp. 249–256., Doi:

10.1016/j.vetimm.2004.12.003).

[0013] Portanto, o que é necessário são vacinas aprimoradas de B. bronchiseptica que sejam seguras, eficazes e adequadas para administração não intranasal.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] São fornecidas aqui cepas de B. bronchiseptica mutantes de aroA atenuadas capazes de induzir imunidade protetora contra infecção por B. bronchiseptica em um animal quando administradas por via oral ao animal. Em concretizações, a cepa mutante de aroA atenuada B. bronchiseptica tem um gene aroA parcialmente deletado. Em concretizações, a cepa mutante aroA atenuada de B. bronchiseptica tem uma deleção completa de seu gene aroA. Em concretizações, a cepa mutante aroA atenuada de B. bronchiseptica compreende um polinucleotídeo com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Em concretizações, a cepa mutante de aroA atenuada B. bronchiseptica é depositada sob o Depósito CNCM nº I-5391.

[0015] Também são fornecidas aqui composições imunogênicas que compreendem uma cepa de B. bronchiseptica mutante aroA atenuada capaz de induzir uma resposta imune quando administrada por via oral a um animal. Em concretizações, a composição imunogênica compreende ainda um carreador, adjuvante, veículo e / ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em concretizações, a composição imunogênica é livre de adjuvante. Nas concretizações, a composição imunogênica é uma formulação de dose única para administração oral. Em concretizações, a formulação de dose única tem entre 1 x 103 CFU a 1 x 1010 CFU da cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada. Em concretizações, a formulação de dose única tem entre 1 x 108 CFU a 1 x 1010 CFU da cepa mutante de aroA atenuada B. bronchiseptica. Em concretizações, a composição imunogênica compreende ainda um antígeno do vírus parainfluenza canino. Em concretizações, a composição imunogênica compreende ainda um antígeno de adenovírus canino. Nas concretizações, a composição imunogênica é isenta de substâncias de origem animal. Nas concretizações, a composição imunogênica é uma vacina.

[0016] Também são fornecidos aqui métodos para induzir uma resposta imune protetora contra B. bronchiseptica em um animal, compreendendo administrar ao animal uma vacina oral compreendendo uma quantidade eficaz de uma cepa de bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA. Nas concretizações, o animal é um canino ou felino. Em concretizações, a resposta imune protetora é eficaz para fornecer ao animal proteção contra infecção por B.

bronchiseptica virulenta, doença clínica associada a infecção por B. bronchiseptica virulenta e / ou sintomas clínicos associados à infecção por B. bronchiseptica virulenta. Nas concretizações, o método emprega um regime de administração inicial-reforço. Nas concretizações, o animal tem entre 0 a 6 meses de idade.

[0017] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] A FIG. 1 mostra um mapa do plasmídeo de DNA pBP1070.

[0019] A FIG. 2 é um diagrama de fluxo que esquematiza a integração do plasmídeo suicida pPB1070 no cromossomo da cepa 05 de B. bronchiseptica.

[0020] A FIG. 3 é um diagrama de fluxo esquematizando a segunda etapa para a produção de uma cepa de B. bronchiseptica mutante. Aqui, o plasmídeo suicida pPB1070 excisa aroA do cromossomo de B. bronchiseptica cepa 05, produzindo uma versão mutante ∆aroA da cepa 05.

[0021] As FIGS. 4A-4D mostram os resultados da caracterização funcional em E. coli do plasmídeo suicida pPB1070 para a deleção de aroA em B. bronchiseptica. A FIG. 4A mostra o crescimento em placas de LB / canamicina; plasmídeo suicida com sacB e clones 4 e 5. A FIG. 4B mostra o crescimento em placas de LB / sacarose (2,5%); plasmídeo suicida com sacB e clones 4 e 5. A FIG. 4C mostra o crescimento em placas de LB / canamicina; clones 1 a 3. A FIG. 4D mostra o crescimento em placas de LB / sacarose (2,5%); clones 1 a 3. Como indicado pelos resultados, sacB foi colocado sob o controle do promotor porino.

[0022] FIGS. 5A-5C mostram a caracterização funcional do plasmídeo suicida pPB1070 integrado para deleção de aroA em B. bronchiseptica. Diluição em série e pontos de cada cultura de clone em placas BG: canamicina (FIG. 5A), Sacarose 5% (FIG. 5B) e Sacarose 10% (FIG. 5C). A FIG. 5A mostra o crescimento bacteriano em placas BG + canamicina. A FIG. 5B mostra o crescimento bacteriano em sacarose a 5%. A FIG. 5C mostra o crescimento bacteriano em sacarose a 10%. A contra-seleção sacB / sacarose parece funcional em Bb.

[0023] As FIGS. 6A-6C mostram caracterização funcional adicional do plasmídeo suicida pPB1070 integrado para deleção de aroA em B. bronchiseptica. Diluição em série e pontos de cada cultura de clone em placas BG: canamicina (FIG. 6A), Sacarose 5% (FIG. 6B) e Sacarose 10% (FIG. 6C). A FIG. 6A mostra o crescimento bacteriano em BG + canamicina. A FIG. 6B mostra o crescimento bacteriano em BG + 5% de sacarose. A FIG. 6C mostra o crescimento bacteriano em BG + sacarose a 10%. A contra-seleção sacB / sacarose parece funcional em Bb em 48H.

[0024] As FIGS. 7A-7B mostram os resultados da triagem de mutante de deleção ∆aroA usando o sistema de contra-seleção sacB / sacarose. A placa da FIG. 7A tem 5% de sacarose. FIGO. 7B é uma réplica da placa de sacarose mostrada na FIG. 7A, contendo canamicina.

[0025] As FIGs. 8A-C mostram a identificação de treze novos mutantes de B. bronchiseptica com deleção do gene H + (clone hemolítico) aroA usando várias placas de ágar. A placa da FIG. 8A tem (BG + 5% de sangue, topo; a placa na FIG. 8B tem BG + 5% de sangue + 1X aromix, meio; a placa na FIG. 8C tem BG + 5% de sangue + 1X aromix + 1X canamicina).

[0026] A FIG. 9 é um gel que mostra a identificação de um mutante eliminado do gene aroA H + (clone hemolítico) em Bordetella bronchiseptica.

[0027] A FIG. 10 mostra os resultados de PCR que demonstram o estado mutante dos treze clones delta aroA B. bronchiseptica.

[0028] A FIG. 11 é um gráfico que mostra os sinais clínicos em caninos após a administração dos tratamentos indicados, seguido por desafio virulento com B. bronchiseptica virulenta.

[0029] A FIG. 12 é um gráfico que mostra os sinais Clínicos Globais de B. bronchiseptica para os grupos A e C.

[0030] A FIG. 13 mostra resultados em pontuações clínicas para B. bronchiseptica ΔaroA cultivada em diferentes meios.

[0031] A FIG. 14 mostra uma tabela detalhando a lista de sequência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0032] A presente divulgação fornece bactérias Bordetella bronchiseptica mutantes com um gene aroA mutado ou deletado, de modo que uma proteína crucial para a produção de aminoácidos aromáticos codificados pelo gene aroA é não funcional quando expressa ou não é produzida. A bactéria Bordetella bronchiseptica mutante pode ser feita, começando com uma cepa parental altamente virulenta (por exemplo, uma cepa de tipo selvagem), por engenharia do gene aroA da cepa parental para ter uma mutação ou deleção de um ou mais nucleotídeos. Surpreendentemente, as bactérias Bordetella bronchiseptica mutantes da presente divulgação são atenuadas, mas ainda retêm um alto grau de imunogenicidade e são, portanto, adequadas para uso em composições imunogênicas atenuadas vivas, vacinas atenuadas vivas e métodos de uso das mesmas.

[0033] A bactéria Bordetella bronchiseptica mutante, composições imunogênicas e vacinas da presente divulgação podem fornecer uma série de benefícios sobre aqueles existentes no estado da técnica.

[0034] Vantajosamente, as cepas mutantes da bactéria Bordetella bronchiseptica podem não se replicar em um animal e, portanto, não podem se desprender do animal. Assim, um animal vacinado com a bactéria mutante Bordetella bronchiseptica não pode liberar bactérias.

[0035] A bactéria Bordetella bronchiseptica mutante também é capaz de induzir com segurança e eficiência uma resposta imune altamente protetora quando administrada por via oral a um animal. Na verdade, uma administração oral de dose única das cepas mutantes de Bordetella bronchiseptica pode ser suficiente para conferir imunidade protetora, mesmo na ausência de um adjuvante. Estes resultados são surpreendentes porque os técnicos versados no assunto: (i) acreditavam que a colonização / amplificação de B. bronchiseptica era necessária para a bactéria desencadear uma resposta imune protetora e uma mutação / deleção de aroA bloqueia a capacidade da bactéria B. bronchiseptica de amplificar in vivo, (ii) esperava que a administração oral de uma vacina de B. bronchiseptica seria significativamente e proibitivamente menos eficiente do que a via intranasal

(por exemplo, a administração oral não era uma opção viável / viável), e (iii) sabia que as as vacinas contra B. bronchiseptica exigiam adjuvantes para serem eficazes.

[0036] Outra vantagem da bactéria Bordetella bronchiseptica mutante da presente divulgação é que elas podem ser efetivamente cultivadas em caldo de soja tríptico não animal (TSB-NA). O uso de TSB-NA, em oposição a substâncias de origem animal como soros de animais, para cultivar bactérias Bordetella bronchiseptica mutantes que acabam em composições imunogênicas e vacinas pode reduzir o risco de contaminação por agentes adventícios, reduzir o custo dos componentes da vacina (os materiais de origem animal são mais caros do que os não animais) e reduzem a variabilidade do processo devido à variabilidade intrínseca na qualidade dos produtos de origem animal.

[0037] Note-se que neste relatório descritivo e particularmente nas reivindicações e / ou parágrafos, termos como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantes podem ter o significado atribuído a eles na lei de patentes dos EUA; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído", "incluindo" e semelhantes; e que termos como "consistindo essencialmente em" e "consistindo essencialmente em" têm o significado atribuído a eles na lei de patentes dos EUA, por exemplo, eles permitem elementos não explicitamente recitados, mas excluem elementos que são encontrados no estado da técnica ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

[0038] A menos que explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório descritivo têm o mesmo significado como comumente entendido por algum técnico versado no assunto à qual esta divulgação pertence. Os termos singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" se destina a incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0039] Conforme usado neste relatório descritivo, "animal" inclui mamíferos. O animal pode ser selecionado de equino (por exemplo, cavalo), canino (por exemplo, cães, lobos, raposas, coiotes, chacais), felino (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros grandes felinos e outros felinos, incluindo chitas e linces), ovinos (por exemplo, ovelhas), bovinos (por exemplo, gado), suínos (por exemplo, porco), aves (por exemplo, galinha, pato, ganso, peru, codorna, faisão, papagaio, tentilhões, falcão, corvo, avestruz, emu e casuar), primata (por exemplo, prosimian, tarsier, macaco, gibão, macaco). O termo “animal” também inclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo recém-nascido, embrionário e fetal.

[0040] Conforme usado neste relatório descritivo, "antígeno" ou "imunógeno" significa uma substância que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender, por exemplo, um organismo inteiro, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um pedaço ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune após a apresentação a um animal hospedeiro; e similar.

[0041] O termo "epítopo" se refere ao local em um antígeno ou hapteno ao qual células B e / ou células T específicas respondem. O termo também é usado indistintamente com "determinante antigênico" ou "local determinante antigênico". Os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples que mostra a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo.

[0042] Conforme usado neste relatório descritivo, uma bactéria "mutante aroA" é uma bactéria com uma alteração genética no gene aroA que resulta em comprometimento da via biossintética do corismato da bactéria. Uma bactéria mutante aroA não pode sintetizar corismato, ou sintetiza significativamente menos corismato do que uma bactéria de tipo selvagem correspondente, o que consequentemente leva a uma inibição significativa e / ou bloqueio do crescimento da bactéria em um meio, ambiente ou meio não suplementado.

[0043] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "canino" inclui todos os cães domésticos, Canis lupus familiaris e Canis familiaris, a menos que indicado de outra forma.

[0044] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "felino" se refere a qualquer membro da família Felidae. Os membros desta família incluem membros selvagens, zoológicos e domésticos, como qualquer membro das subfamílias Felinae, por exemplo, gatos, leões, tigres, pumas, onças, leopardos, leopardos das neves, panteras, leões da montanha norte-americanos, chitas, lince, linces, caracais ou quaisquer raças cruzadas dos mesmos. Os gatos também incluem gatos domésticos, gatos de raça pura e / ou mestiços, gatos de exibição, gatos de laboratório, gatos clonados e gatos selvagens ou selvagens.

[0045] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "gene" é usado amplamente para se referir a qualquer segmento de um polinucleotídeo associado a uma função biológica.

[0046] Um componente biológico "isolado" (como um ácido nucleico ou proteína ou organela) se refere a um componente que foi substancialmente separado ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outro DNA e RNA cromossômico e extra-cromossômico, proteínas e organelas. Ácidos nucleicos e proteínas que foram "isolados" incluem ácidos nucleicos e proteínas purificadas por métodos de purificação padrão. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparados por tecnologia recombinante, bem como síntese química.

[0047] Tal como aqui utilizado, uma "alteração genética" ou "mutação" de um gene se refere a uma substituição, deleção e / ou inserção de ácido nucleico no gene.

[0048] Tal como aqui utilizado, os termos “identidade” e “identidade de sequência” referem-se a uma relação entre duas ou mais sequências polinucleotídicas, nomeadamente uma sequência de referência e uma determinada sequência a ser comparada com a sequência de referência. A identidade da sequência é determinada comparando a sequência dada com a sequência de referência após as sequências terem sido alinhadas de forma otimizada para produzir o mais alto grau de similaridade de sequência, conforme determinado pela correspondência entre as cadeias de tais sequências.

Após tal alinhamento, a identidade da sequência é verificada posição por posição, por exemplo, as sequências são "idênticas" em uma posição particular se nessa posição, os nucleotídeos são idênticos.

O número total de tais identidades de posição é então dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência para dar% de identidade de sequência.

A identidade de sequência pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, AN, ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW , ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.

M., e Griffin, H.

G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M.

Stockton Press, New York (1991); e Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J.

Applied Math., 48: 1073 (1988). Os métodos preferidos para determinar a identidade da sequência são concebidos para dar a maior correspondência entre as sequências testadas.

Os métodos para determinar a identidade de sequência também são codificados em programas de computador disponíveis publicamente que determinam a identidade de sequência entre determinadas sequências.

Além daqueles aqui mencionados de outra forma, é feita menção aos programas BLAST, gapped BLAST, BLASTN, BLASTP e PSI-BLAST,

fornecidos pelo National Center for Biotechnology Information. Estes programas são amplamente utilizados na arte para este fim e podem alinhar regiões homólogas de duas sequências de aminoácidos.

[0049] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "composição imunogênica" se refere a uma composição que compreende pelo menos um antígeno que induz uma resposta imunológica em um hospedeiro ao qual a composição imunogênica é administrada.

[0050] Tal como aqui utilizado, uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imunitária celular e / ou mediada por anticorpos a uma composição ou vacina de interesse. Normalmente, uma "resposta imunológica" inclui, mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares e / ou células T citotóxicas, dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. De preferência, o hospedeiro exibirá uma resposta imunológica terapêutica ou protetora de modo que a resistência a uma nova infecção seja aumentada e / ou a gravidade clínica da doença reduzida. Tal proteção pode ser demonstrada por uma redução ou falta de sintomas e / ou sinais clínicos de doença normalmente exibidos por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e / ou um título de patógeno reduzido no hospedeiro infectado.

[0051] Conforme usado neste relatório descritivo, uma "vacina multivalente" é uma vacina que compreende dois ou mais antígenos diferentes. Uma vacina multivalente normalmente pode estimular o sistema imunológico do receptor contra dois ou mais patógenos diferentes.

[0052] Conforme usado neste relatório descritivo, os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" referem-se a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita simples ou dupla, ou um híbrido dos mesmos. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene, exons, íntrons, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos, uracil, outros açúcares e grupos de ligação, tais como fluororibose e tiolato, e ramificações de nucleotídeos.

[0053] Conforme usado neste documento, os termos "farmaceuticamente aceitável" e "veterinariamente aceitável" são usados adjetivamente para significar que o substantivo modificado é apropriado para uso em um produto farmacêutico ou veterinário. Quando é usado, por exemplo, para descrever um excipiente em uma vacina farmacêutica ou veterinária, caracteriza o excipiente como sendo compatível com os outros ingredientes da composição e não prejudicial para o destinatário pretendido.

[0054] Tal como aqui utilizado, o termo "transportador" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, como água e / ou óleos, incluindo os de petróleo, origem animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. Água ou soluções salinas de solução aquosa e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem ser empregues como veículos.

[0055] Conforme usado neste documento, um "adjuvante" é uma substância que é capaz de favorecer ou amplificar a cascata de eventos imunológicos, em última análise, levando a uma melhor resposta imunológica, ou seja, a resposta corporal integrada a um antígeno. Em geral, não é necessário um adjuvante para que ocorra a resposta imunológica, mas favorece ou amplifica essa resposta.

[0056] Conforme usado neste documento, os termos "protegendo", "fornecendo proteção para" e "auxilia na proteção" não requerem proteção completa contra qualquer indicação de infecção. Por exemplo, "ajuda na proteção" pode significar que a proteção é suficiente para que, após o desafio, os sintomas da infecção subjacente sejam pelo menos reduzidos e / ou que uma ou mais das causas celulares, fisiológicas ou bioquímicas subjacentes ou os mecanismos que causam os sintomas são reduzidos e / ou eliminados. Entende- se que reduzido, conforme usado neste contexto, significa relativo ao estado da infecção, incluindo o estado molecular da infecção, não apenas o estado fisiológico da infecção.

[0057] Conforme usado neste documento, os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados indistintamente neste documento para se referir a polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos e pode ser interrompido por porções químicas diferentes de aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como a conjugação com um marcador ou componente bioativo.

[0058] Tal como aqui utilizado, o termo "recombinante" no contexto de um polinucleotídeo significa um polinucleotídeo com origem semissintética ou sintética que não ocorre na natureza ou está ligado a outro polinucleotídeo em um arranjo não encontrado na natureza.

[0059] “Heterólogo” significa derivado de uma entidade geneticamente distinta do resto da entidade com a qual está sendo comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser colocado por técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vetor derivado de uma fonte diferente e é um polinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido da sua sequência de codificação nativa e operacionalmente ligado a uma sequência de codificação diferente da sequência nativa é um promotor heterólogo.

[0060] Tal como aqui utilizado, uma "vacina" é uma composição imunogênica que é adequada para administração a um animal que, após administração ao animal, induz uma resposta imune forte o suficiente para auxiliar minimamente na proteção de uma doença clínica decorrente de uma infecção com um microrganismo patogênico de tipo selvagem (por exemplo, forte o suficiente para auxiliar na cura, melhoria, proteção contra e / ou prevenção de uma doença clínica e / ou sinais clínicos associados a ela). Composições de matéria.

[0061] A presente divulgação fornece bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA. A bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA tem uma alteração genética em seu gene aroA, sendo a alteração genética relativa ao gene aroA da cepa parental (por exemplo, um gene aroA da cepa parental de tipo selvagem virulento que exibe a função do gene aroA normal). A alteração genética pode ser eficaz para reduzir ou abolir a expressão e / ou atividade biológica do (s) polipeptídeo (s) ou proteína (s) codificada (s) pelo gene aroA, de preferência polipeptídeo (s) e proteína (s) associada (s) à virulência, como 3- fosfosiquimato 1-carboxiviniltransferase. A alteração genética pode ser eficaz para atenuar a virulência da bactéria (por exemplo, reduzir ou eliminar a patogenicidade da bactéria). Nas concretizações, a alteração genética não afeta materialmente a capacidade da bactéria de estimular uma resposta imune forte e de longa duração quando administrada a um hospedeiro, mesmo que a bactéria seja atenuada (por exemplo, uma resposta imune eficaz para fornecer proteção contra o desafio subsequente com B. bronchiseptica).

[0062] As alterações genéticas da presente divulgação podem ser feitas dentro de uma sequência de codificação para interromper a função do gene aroA; no entanto, as alterações genéticas não precisam ser localizadas dentro de uma sequência de codificação para interromper a função do gene aroA. As alterações genéticas também podem ser feitas em sequências de nucleotídeos envolvidas na regulação da expressão do gene aroA, por exemplo, em regiões que regulam o início da transcrição, tradução e término da transcrição. Assim, também estão incluídos os promotores e as regiões de ligação ao ribossomo (em geral, esses elementos reguladores encontram-se aproximadamente entre 60 e 250 nucleotídeos a montante do códon de início da sequência de codificação; Doree SM et al., J. Bacteriol. 2001, 183 (6): 1983 -9; Pandher K et al., Infect. Imm. 1998, 66 (12): 5613-9; Chung JY et al., FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296), terminadores de transcrição (em geral, o terminador é localizado dentro de aproximadamente 50 nucleotídeos a jusante do códon de parada da sequência ou gene de codificação; Ward CK et al., Infect. Imm. 1998, 66 (7): 3326-36). No caso de um operon, tais regiões regulatórias podem estar localizadas a uma distância maior a montante da sequência de codificação.

[0063] Em concretizações, a alteração genética inclui a deleção de um ou mais nucleotídeos de um gene aroA da cepa parental, a substituição de um ou mais nucleotídeos diferentes do que aqueles existentes no gene aroA da cepa parental e / ou a inserção de um ou mais nucleotídeos em o gene aroA da cepa parental. Em concretizações, a alteração genética é uma deleção parcial do gene aroA da cepa parental (por exemplo, o genoma mutante tem um gene aroA parcial). Em concretizações, a alteração genética é uma deleção completa do gene aroA da cepa parental (por exemplo, o genoma mutante não tem um gene aroA).

[0064] De preferência, a cepa parental tem um gene aroA exibindo estrutura e função normais (por exemplo, uma estrutura e função consistente com cepas de B. bronchiseptica virulenta de tipo selvagem). As cepas parentais adequadas para uso na presente divulgação incluem, por exemplo, cepas de B. bronchiseptica exibindo a maioria, e, de preferência, todas as características da cepa 05 descritas nos exemplos abaixo.

[0065] Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA pode exibir expressão reduzida de polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA em relação a uma cepa parental, ou podem não expressar polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA. Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica AroA mutante tem menos de 5% de expressão de aroA residual após a alteração genética em relação à cepa parental, o que significa que a bactéria mutante expressa menos de 5% do (s) polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA em relação a uma cepa parental . Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica AroA mutante expressa nível (s) de polipeptídeo (s) aroA que são indetectáveis.

[0066] Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica AroA mutante expressa polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA mutante com atividade biológica reduzida em relação ao (s) polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA da cepa parental, ou expressam polipeptídeo (s) codificado pelo gene aroA mutante podem não ter biológicos atividade (por exemplo,

completamente não funcional).

[0067] Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica AroA mutante expressa polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA mutante com menos de 5% de atividade biológica residual após a alteração genética em relação ao (s) polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA da cepa parental, o que significa que o gene aroA mutante codificado o (s) polipeptídeo (s) têm menos de 5% da atividade biológica do (s) polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA de referência da cepa parental. Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA expressa polipeptídeo (s) codificado (s) pelo gene aroA que têm níveis indetectáveis de atividade biológica.

[0068] Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA compreende um polinucleotídeo com pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% de identidade com a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, ou um polinucleotídeo tendo 100% de identidade com a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3. Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica AroA mutante tem um locus aroA compreendendo um polinucleotídeo com pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2 %, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% de identidade com a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, ou um polinucleotídeo tendo 100% de identidade com a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3. Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica AroA mutante compreendendo um polinucleotídeo com uma certa identidade de sequência para SEQ ID NO: 3 preferencialmente tem um fenótipo atenuado, são capazes de induzir com segurança uma resposta imune protetora em um animal quando administrado oralmente e / ou codificar para a mesma funcionalidade que aquela codificada pela SEQ ID NO: 3. Exemplos de funções comparáveis incluem a capacidade / incapacidade de catalisar as mesmas reações enzimáticas e a capacidade / incapacidade de servir ao mesmo papel estrutural.

[0069] Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA exibe atividade hemolítica. Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica AroA mutante é atenuada.

[0070] Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica AroA mutante é a cepa depositada na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sob o número de depósito I-5391 em 20 de dezembro de 2018.

[0071] Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA é cultivada em um meio de cultura não animal e, portanto, livre de substâncias de origem animal. Em concretizações, o meio de cultura não baseado em animal é meio não animal Tryptic Soy Broth (TSB-NA). Em concretizações, a cultura da bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA em meio de cultura não animal, como TSB-NA, diminui o risco de contaminação por agentes adventícios em relação à cultura da bactéria mutante em meio contendo substâncias de origem animal. Em concretizações, o cultivo da bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA em meio de cultura não baseado em animal não afeta negativamente a capacidade da bactéria mutante de induzir uma resposta imune protetora em um animal quando administrada por via oral.

[0072] A presente divulgação também fornece composições imunogênicas e vacinas compreendendo qualquer bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA, de acordo com a presente divulgação. Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são eficazes para induzir, induzir e / ou estimular uma resposta imune em um animal, como um canino ou felino, quando administradas ao animal. Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas compreendem uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA atenuada.

[0073] Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são monovalentes, tendo uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA como o antígeno único.

[0074] Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são multivalentes, tendo dois ou mais antígenos, desde que pelo menos um dos antígenos seja uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA de acordo com a presente divulgação. Em concretizações, as composições imunogênicas multivalentes e vacinas compreendem, como um segundo antígeno, um antígeno não- Bordetella bronchiseptica. Em concretizações, as composições imunogênicas multivalentes e vacinas compreendem, como um segundo antígeno, um antígeno canino não Bordetella bronchiseptica.

[0075] Em concretizações, as composições imunogênicas multivalentes e vacinas compreendem, como um segundo antígeno, um antígeno do vírus da parainfluenza canino (CPIV ou PIV5). Nas concretizações, o antígeno do vírus da parainfluenza canino é um vírus inteiro inativado e / ou atenuado. Exemplos de vírus CPIV adequados para uso como antígenos na presente divulgação incluem aqueles listados na Tabela 1 abaixo, que é derivado de Rima et al., que fornece múltiplas sequências de PIV5 canino (Rima, BK, et al. “Estabilidade de o genoma do vírus da Parainfluenza 5 revelado por sequenciamento profundo de cepas isoladas de diferentes hospedeiros e após passagem em cultura celular. ”Journal of Virology, vol. 88, no. 7, 2014, pp. 3826–3836, doi: 10.1128 / jvi.03351 -13). Cada um dos Números de Acesso do GenBank da Tabela 1, bem como Rima et al., São incorporados neste relatório descritivo por referência em sua totalidade. As sequências de CPIV são também divulgadas em WO 2000/77043 A2, Fischer, et al., Aqui incorporado por referência na sua totalidade. Conforme descrito em Rima et al., Journal of Virology, vol. 88, no. 7, 2014, os vírus da parainfluenza canina são altamente conservados, portanto, qualquer um dos abaixo pode ser usado na presente invenção. Tabela 1. Sequências de CPIV (o CPIV às vezes é referido como PIV5, mas é o mesmo vírus). Cepa PIV5 Fonte País de Década de No. de hospedeira origem Isolamento acesso ao GenBank

CPI+ Cão Alemanha 1980s JQ743321.1 CPI- Cão Alemanha 1980s JQ743320.1 1168-1 Cão Coreia 2000s KC237064.1 do Sul 78524 Cão Reino 1980s JQ743319.1 Unido H221 Cão Reino 1980s JQ743323.1 Unido 08-1990 Cão Coreia 2000s KC237063.1 do Sul D277 Dog Coreia 2000s KC237065.1 do Sul

[0076] Em concretizações, as composições imunogênicas multivalentes e vacinas compreendem, como um segundo antígeno, um antígeno de adenovírus canino (CAV). Em concretizações, o antígeno de adenovírus canino é um vírus inteiro inativado e / ou atenuado. Exemplos de vírus CAV adequados para uso como antígenos na presente divulgação incluem adenovírus canino tipo 1 (CAV-1) e adenovírus canino tipo 2 (CAV-2). Os antígenos desses patógenos para uso nas composições de vacina da presente invenção podem estar na forma de uma preparação viral viva modificada ou uma preparação viral inativada. Os métodos de atenuação de cepas virulentas desses vírus e os métodos de preparação de uma preparação viral inativada são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes US 4.567.042 e

4.567.043. Alternativamente, imunógenos ou antígenos de CAV2, ou epítopos de imunógenos de CAV2, tais como proteínas de capsídeo, matriz ou éxon podem ser usados.

[0077] Em concretizações, as vacinas da presente divulgação são formuladas de modo que sejam seguras e eficazes para induzir imunidade protetora contra B. bronchiseptica quando administrada a um animal e, assim, reduzir e / ou prevenir sintomas clínicos associados à infecção e doença por B. bronchiseptica subsequente. Em concretizações, as vacinas da presente divulgação são capazes de desencadear respostas imunes protetoras que são eficazes para diminuir a gravidade dos sinais clínicos e lesões de B. bronchiseptica, diminuir a taxa de crescimento de B. bronchiseptica e / ou prevenir a morte quando posteriormente exposto a B. bronchiseptica.

[0078] Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas compreendem um carreador, adjuvante, veículo e / ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Os transportadores, adjuvantes, veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis podem ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitam a administração eficaz da bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA.

[0079] Os transportadores, adjuvantes, veículos e / ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, um transportador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma solução de NaCl a 0,9% (por exemplo, solução salina) ou um tampão de fosfato. Outros transportadores, adjuvantes, veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, poli (L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. Os adjuvantes adequados podem incluir: (1) polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maleico e polímeros derivados de alquenil, (2) sequências imunoestimulantes (ISS), tais como sequências de oligodesoxirribonucleotídeo tendo uma ou mais unidades CpG não metiladas ("Motivos CpG presentes em Bacterial DNA Rapidly Induce Lymphocytes to Secrete Interleukin 6, Interleukin 12 and Interferon γ. ”Molecular Medicine Today, vol. 2, no. 6, 1996, p. 233; WO98 / 16247), (3) uma emulsão de óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo trabalho, (4) lípidos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, por exemplo, citocinas DDA (5), (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina ou (8) quaisquer combinações ou misturas dos mesmos.

[0080] Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas compreendem um adjuvante da mucosa que promove a absorção aprimorada através dos revestimentos da mucosa. Alguns exemplos de adjuvantes da mucosa incluem quitosana, MPL, LTK63, toxinas, micropartículas PLG e vários outros (Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627; Lubben, Inez M Van Der, et al. “Chitosan and its Derivatives in Mucosal Drug and Vaccine Delivery. ”European Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 14, no. 3, 2001, pp. 201–207; Patel et al.“ Chitosan: A Unique Pharmaceutical Excipient. ”Drug Delivery Technol. , 2005; Majithiya et al. "Enhancement of Mucoadhesion by Blending Anionic, Cationic and Nonionic Polymers." Drug Delivery Technol., 2008 ou Majithiya, J., et al. Disseminated Candida Tropicalis and Candida Krusei. ”Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 63, no. 1, 2008, pp. 161-166; Patente US No. 5.980.912).

[0081] Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são livres de adjuvante (ou seja, não contêm adjuvante) e são eficazes e seguras quando administradas a animais. Nas concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são isentas de substâncias de origem animal (ou seja, não contêm substâncias de origem animal).

[0082] Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são formuladas para administração de um tiro (por exemplo, uma administração única de uma forma de dosagem). Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são formuladas para administração multi-shot (por exemplo, múltiplas administrações de uma única forma de dosagem, múltiplas administrações de formas de dosagem multiplaca).

[0083] Em concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são formuladas para administração oral a um animal, como um canino ou felino. Nas concretizações, as composições imunogênicas e vacinas são formuladas como doses líquidas para administração oral. Em concretizações, as formas de dosagem líquidas podem ser um líquido em uma garrafa ou pipeta. Em concretizações, as formas de dosagem líquidas podem ter um volume de dose geralmente entre 0,1 a 10,0 mL, entre 0,2 a 5,0 mL, entre 0,1 a 1,0 mL ou entre 0,5 mL a 1,0 mL. O volume de uma dose se refere ao volume total da composição imunogênica ou vacina administrada de uma vez a um animal.

[0084] Nas concretizações, as formas de dosagem líquidas podem compreender bactérias bronchiseptica mutante aroA em uma quantidade entre 1 x 103 CFU a 1 x 1010 CFU por dose, entre 1 x 104 CFU a 1 x 106 CFU por dose, entre 1 x 106 CFU a 1 x 108 CFU por dose, entre 1 x 108 CFU a 1 x 1010 CFU por dose, entre 1 x 104 CFU a 1 x 105 CFU por dose, entre 1 x 105 CFU a 1 x 106 CFU por dose, entre 1 x 106 CFU a 1 x 107 CFU por dose, entre 1 x 107 CFU a 1 x 108 CFU por dose, entre 1 x 108 CFU a 1 x 109 CFU por dose, ou entre 1 x 109 CFU a 1 x 1010 CFU por dose,

[0085] Nas concretizações, as formas de dosagem líquidas podem compreender um antígeno do vírus da parainfluenza canino, tal como um vírus da parainfluenza canino inteiro vivo ou atenuado, em uma quantidade entre cerca de 6log10 DICC50 a cerca de 8log10 DICC50 por dose, e de preferência na faixa de 6,7 log10 a cerca de 7log10 DICC50 por dose.

[0086] Em concretizações, as formas de dosagem líquidas podem compreender um antígeno de adenovírus canino, como um adenovírus canino inteiro vivo ou atenuado, em uma quantidade entre. O CAV-2 atenuado deve estar em uma quantidade de pelo menos cerca de 6log10 DICC50 a cerca de 8log10 DICC50 por dose, e preferencialmente na faixa de 6,5 log10 a cerca de 6,7log10 DICC50 por dose.

[0087] A presente divulgação também fornece kits que compreendem a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA. Em concretizações, o kit compreende um frasco contendo qualquer bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA,

composição imunogênica ou vacina como aqui descrito. Em concretizações, o kit se destina a uso com um regime de administração de primeira-reforço e compreende um primeiro frasco contendo uma primeira vacina ou composição imunogênica da divulgação para uso em uma etapa de administração primária e um segundo frasco contendo uma segunda vacina ou composição imunogênica de a divulgação para uso em uma etapa de administração de reforço (a primeira e a segunda vacina ou composição imunogênica podem ser iguais ou podem ser diferentes). Métodos de uso

[0088] A presente divulgação também fornece métodos para induzir uma resposta imune em um animal usando a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA, composições imunogênicas e / ou vacinas da presente divulgação. Nas concretizações, o animal é um adulto. Nas concretizações, o animal é um juvenil. Nas concretizações, o animal tem entre 0 e 6 meses de idade, entre 1 e 4 meses de idade ou entre 2 e 4 meses de idade.

[0089] Em concretizações, é fornecido um método para induzir uma resposta imune contra B. bronchiseptica em um animal, compreendendo a administração ao animal de uma composição imunogênica compreendendo uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA. Em concretizações, a composição imunogênica compreende ainda um transportador, adjuvante, veículo e / ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Nas concretizações, o animal é canino ou felino. Nas concretizações, a composição imunogênica é administrada por via oral. Em concretizações,

a composição imunogênica é livre de adjuvante. Nas concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA é atenuada.

[0090] Em concretizações, é fornecido um método para desencadear uma resposta imune protetora contra B. bronchiseptica em um animal, compreendendo a administração ao animal de uma vacina compreendendo uma quantidade eficaz de uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA. Em concretizações, a vacina compreende ainda um transportador, adjuvante, veículo e / ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Nas concretizações, o animal é canino ou felino. Nas concretizações, a vacina é administrada por via oral. Em concretizações, a vacina é livre de adjuvantes. Em concretizações, a bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA é atenuada. Nas concretizações, o animal é vacinado / imunizado contra Bordetella bronchiseptica. Em concretizações, a resposta imune protetora é eficaz para fornecer ao animal proteção contra subsequente infecção por B. bronchiseptica virulenta e doença clínica e sintomas associados a ela.

[0091] Em concretizações, os métodos para induzir uma resposta imune e os métodos para induzir uma resposta imune protetora podem empregar um regime de iniciação- reforço. Um regime de iniciação-reforço compreende uma administração primária e uma administração de reforço. Normalmente, a composição imunológica ou vacina usada na administração primária é de natureza diferente daquela usada na administração de reforço. No entanto, a mesma composição / vacina pode ser usada na administração primária e na administração de reforço. Em concretizações, um regime de iniciação-reforço utiliza administrações que são preferencialmente realizadas com 1 a 6 semanas de intervalo, 2 a 5 semanas de intervalo, 2 a 3 semanas de intervalo ou 3 a 4 semanas de intervalo. Métodos de fabricação

[0092] A presente divulgação também fornece métodos de produção de uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA. Nas concretizações, o método de produção de uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA compreende uma ou mais das seguintes etapas: (i) introdução de uma alteração genética no gene aroA de uma cepa parental da bactéria Bordetella bronchiseptica que resulta no comprometimento da via biossintética do corismato de a bactéria; e / ou (ii) isolar uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA da cepa mãe da bactéria Bordetella bronchiseptica. Em concretizações, a alteração genética inclui a deleção de um ou mais nucleotídeos de um gene aroA da cepa parental, a substituição de um ou mais nucleotídeos diferentes do que aqueles existentes no gene aroA da cepa parental e / ou a inserção de um ou mais nucleotídeos em o gene aroA de uma cepa parental. Em concretizações, a alteração genética é uma deleção parcial do gene aroA da cepa parental (por exemplo, o genoma mutante tem um gene aroA parcial). Em concretizações, a alteração genética é uma deleção completa do gene aroA da cepa parental (por exemplo, o genoma mutante não tem um gene aroA). De preferência, a cepa parental tem um gene aroA exibindo estrutura e função normais (por exemplo, uma estrutura e função consistente com cepas de B. bronchiseptica virulenta de tipo selvagem). As cepas parentais adequadas para uso na presente divulgação incluem, por exemplo, cepas de B. bronchiseptica exibindo a maioria, e de preferência todas, as características da cepa 05 descritas nos exemplos abaixo.

[0093] A presente divulgação também fornece métodos de propagação de uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA. Nas concretizações, os métodos incluem a cultura de uma bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA em um meio não baseado em animal. Em concretizações, o meio de cultura de base não animal é Tryptic Soy Broth não animal (TSB-NA).

[0094] A invenção será agora descrita mais detalhadamente por meio dos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Caracterização de cepas de B. bronchiseptica

[0095] Várias cepas isoladas foram revisadas para determinar quais seriam úteis no desenvolvimento de uma nova vacina canina injetável (inativada, atenuada ou ambas) contra Bordetella bronchiseptica. A caracterização de dezesseis (16) isolados de uma coleta interna foi realizada, incluindo uma avaliação do crescimento, atividade hemolítica, regulação da produção de fatores de virulência / imunogênicos e tipagem molecular. O potencial de cada uma das cepas para ser um componente seguro e eficaz de uma formulação de vacina foi avaliado.

[0096] Dezesseis isolados de Merial B. bronchiseptica de origem suína, canina e humana (listados na

Tabela 2), foram selecionados para a caracterização.

Para comparação, duas cepas de controle foram incluídas em todos os experimentos.

Tabela 2. Dezesseis isolados de B. bronchiseptica e suas origens.

No de referência da cepa Origem 01 Humana 02 Canina 03 Canina 04 Suína 05 Suína 06 Suína 07 Suína 08 Canina 09 Canina 10 Cepa US (372CN) 11 Canina 12 Canina 13 Suína 14 Desconhecida 15 Desconhecida 16 Canina Controle 1 canina (286, coleção CNR) Controle 2 Coelho (RB50, US, genoma sequenciado) Tabela 3. Descrição dos testes Teste Princípio Cepas testadas Hemólise Detecção de um halo após o Todas crescimento em BG rico em sólidos

Atividade de Determinação da transformação de Todas Adenilato ATP em AMPc devido à ação do AC- ciclase Hly dependente de calmodulina sobre o crescimento em BG rico em sólidos Detecção de - Western blotting usando Todas produção de soros policlonais de camundongos fatores criados contra B. bronchiseptica antigênicos/ BteA purificado e B. pertussis virulentos purificado FHA, PRN e AC-Hly - Após o crescimento dos Todas isolados em 01, 02, i) meio Bordet Gengou rico em 03, 04, sólido a 37 ° C ou 25 ° C 05, 06, ii) meio Stainer (SS) 07, 08, Scholte líquido enriquecido a 37 ° C com 09, e 10 ou sem a adição de MgSO4 iii) Meio líquido Tryptic Soy 06, 09, e Broth (TSB) a 37 ° C 10 Tipagem Glutinação de uma suspensão Todas Fimbria bacteriana após incubação com anticorpos policlonais anti Fim2 ou Fim3 de camundongos produzidos contra fímbrias purificadas Determinação Cultivo em meio SS enriquecido 01, 02, do tempo de 03, 04, geração 05, 06, 07, 08, 09, e 10 Ensaios de Seleção de colônias de bactérias Todas Mobilidade isoladas em meio de Ciclodextrina

(CSM) semissintético e semissólido, a 25 ° C ou 36 ° C com ou sem a adição de MgSO4 ou ácido nicotínico Tipagem Eletroforese em Gel de Campo Todas Pulsado (PFGE) e Tipagem de Sequenciamento MultiLocus (MLST). Substituição PCR no locus cya codificando 02, 03, do locus cya adenilati ciclase 11, and 12 LD50 em Desafio de grupos de 10 04, 05, camundongos camundongos com 3 x 10 , 3 x 10 e 06, 8 7 07, 6 09, e 10

3.10 cfu/ml de B. bronchiseptica e observação da mortalidade durante 15 dias

[0097] Dez das dezesseis cepas mostraram hemólise a 37° C. Seis dos dezesseis isolados eram não hemolíticos (02, 03, 11, 12, 15 e 16). Esses dados se correlacionam com a medição da atividade da adenilato ciclase e imunodetecção da proteína AC-HLY. As cepas 02, 03, 11, 12 carecem de um gene cya, enquanto 15 e 16 podem estar bloqueadas em uma fase IV não virulenta.

[0098] Os resultados mostraram que todos os isolados testados cresceram em meio enriquecido e não houve diferença significativa de tempo de geração entre eles neste meio. BteA e FHA foram produzidos por todos os isolados, exceto 15 e 16, em condições clássicas de expressão de vag. O PRN foi produzido por todos os isolados, exceto 06, 10, 15 e 16. A produção de fatores de virulência em meio BG rico ou SS sintético foi semelhante para todos os isolados para os quais ambos os meios foram testados. A regulação da expressão dos fatores de virulência é “clássica” para doze das dezesseis cepas, com repressão a 25 ° C e na presença de MgSO4 ou ácido nicotínico. Duas cepas 09 e 05 apresentaram expressão constitutiva parcial de fatores de virulência, respectivamente. Duas cepas 15 e 16 mostraram repressão completa da produção de fatores de virulência. Eles são considerados como tendo mudado para uma fase avirulenta IV (Monack et al., 1989, Mol. Microbiol. 3: 1719), o que significa que eles estão bloqueados em uma fase de repressão vaga, não expressando quaisquer determinantes de virulência sejam quais forem as condições testadas. O crescimento em TSB foi 2 a 3x mais rápido do que em meio SS para os isolados testados nesses meios. A produção de BteA e PRN parece geral mais baixa em TSB em comparação com SS. Fim 2 é produzido por oito isolados dos dezesseis isolados. Nenhum dos isolados produziu Fim 3.

[0099] Os resultados mostraram que dez isolados exibiram uma regulação “clássica” da motilidade, sendo móveis a 25° C, mas não a 37° C. A cepa 05 mostrou um fenótipo de motilidade mista: a motilidade é reprimida apenas em certas condições (MgSO4 ou 25° C respectivamente), o que se correlaciona com a expressão semi-constitutiva de genes vag (sem desrepressão sistemática de genes vrg). Ambos 06 e 10 eram imóveis provavelmente devido a uma mutação nos genes fla. 15 e 16 são constitutivamente móveis, em coerência com a observação acima de que eles estão bloqueados em uma expressão de vrg, fase avirulenta IV.

[00100] Os dezesseis isolados agrupados em 7 grupos

PGFE diferentes (A a G) e quatro tipos de sequência diferentes ou ST. As estirpes 15 e 16 agrupadas com a referência RB50 de origem de coelho. As cepas 02, 03, 11, 12 pertencem a ST27. Uma particularidade desta linhagem é a substituição do locus cya por ptp conforme descrito (Buboltz et al. 2008. J. Bacteriol. 190: 5502). Consequentemente, essas 4 cepas não exibiram atividade hemolítica, mas sim um "comportamento clássico" em termos de produção de outros fatores de virulência. A substituição do locus cya pelo operon ptp foi confirmada por PCR para essas cepas.

[00101] O estudo de tipagem molecular e a análise de sequência são ainda descritos no Exemplo 2 abaixo.

[00102] Os resultados de LD50 em camundongos são mostrados na Tabela 4 abaixo. Tabela 4. LD50 em camundongos CFU/ml CFU/camundongo Controle 1 7 x 105 3,5 x 104 04 1,7 x 107 8 x 105 05 9 x 106 4,5 x 105 09 4,5 x 106 2,25 x 105

[00103] Todas as cepas testadas apresentaram perfis de virulência semelhantes, independentemente de sua regulação constitutiva, ou ausência de flagelos e pertactina.

[00104] Conclusão. As cepas 05 e 09 foram consideradas fortes candidatas à vacina porque são parciais ou totalmente constitutivas para a expressão de fatores de virulência que também são determinantes antigênicos importantes. As cepas 02, 03, 11 e 12 não têm o locus cya, uma característica típica das cepas ST27 e, portanto, não apresentam qualquer atividade hemolítica. Além disso, ambos 06 e 10 são imóveis e não expressam pertactina, mas ainda assim permanecem virulentos. É importante ressaltar que todas as análises mostram que as cepas vacinais 06 e 10 se comportam de forma idêntica, indicando que não há grande mudança no background da cepa nas passagens.

[00105] As cepas 15 e 16 eram constitutivamente móveis e não expressavam nenhum fator de virulência em quaisquer condições testadas. Eles foram considerados como tendo mudado para uma fase avirulenta IV, o que significa que eles estavam presos em uma fase de repressão vaga, não expressando nenhum dos outros fatores de virulência em quaisquer condições testadas. Essas cepas expressam constitutivamente genes reprimidos de virulência, apresentando, portanto, motilidade em todas as condições testadas. Como tal, essas cepas eram boas candidatas a serem avirulentas em camundongos. Exemplo 2 - Deleção do gene aroA na cepa parental de B. bronchiseptica (cepa 05)

[00106] Uma deleção do gene aroA em B. bronchiseptica cria auxotrofia no mutante. Este tipo de deleção mutante não é capaz de crescer in vivo ou em meio de crescimento in vitro quando não suplementado com os 3 aminoácidos aromáticos essenciais para o crescimento bacteriano (fenilalanina, triptofano e tirosina).

[00107] Resumo. Neste exemplo, foi gerado um mutante com deleção de Bordetella bronchiseptica aroA. A metodologia usada para realizar a modificação genética (deleção completa do gene aroA) foi baseada em um plasmídeo suicida projetado pPB1070 (ver FIG. 1). Este plasmídeo era replicativo em E. coli, mas não em B. bronchiseptica. Este plasmídeo continha a origem de replicação ColE1, a resistência do gene da canamicina, o gene sacB (como sistema de contra-seleção) colocado sob o promotor porino de B. bronchiseptica e a cassete de deleção. O cassete de deleção continha apenas os dois genes que flanqueiam o gene aroA em 5 '(gene a jusante) e 3' (gene a montante). O gene aroA foi substituído por um polystop 6X.

[00108] O plasmídeo pPB1070 foi introduzido na cepa de B. bronchiseptica 05 por eletroporação e foi integrado no cromossomo após um primeiro evento de recombinação no locus do gene aroA na extremidade 5 'ou na extremidade 3' (ver FIG. 2). Esta integração de plasmídeo também é chamada de “pop in”. Os clones transformantes (clones integrantes) são denominados Merodiplóides que se tornaram resistentes à canamicina (KmR) e sensíveis à sacarose (SucS). Um segundo evento de recombinação ocorre aleatoriamente durante o crescimento bacteriano levando ao possível isolamento de uma cepa de tipo selvagem (aroA +) ou um mutante de deleção aroA (∆aroA) que é sensível à canamicina (KmS) e resistente à sacarose SucR, conforme esperado devido a perda de expulsão do plasmídeo pB1070 do cromossomo após este segundo evento de recombinação (ver FIG. 3). A PCR específica para o gene permitiu a identificação do mutante com deleção de aroA de B. bronchiseptica. Isto é confirmado por sequenciação do locus aroA completo: ausência do gene aroA e ausência do plasmídeo pPB1070.

Caracterização funcional em E. coli do plasmídeo suicida pPB1070 para deleção de aroA em B. bronchiseptica.

[00109] Plasmídeo replicativo em E. coli = efeito de pluricopia da toxicidade SacB / Sacarose (= sistema de contra-seleção). Conforme mostrado nas FIGs. 4A a 4D, o plasmídeo suicida pPB1070 foi integrado com sucesso em B. bronchiseptica (Bb). Como tal, este plasmídeo pode ser usado para deletar rapidamente o gene aroA de outras cepas de Bb, incluindo a cepa parental H +. Caracterização funcional em B. bronchiseptica do plasmídeo suicida pPB1070 integrado para a deleção de aroA em B. bronchiseptica (sacB colocado sob o controle do promotor porino).

[00110] Plasmídeo integrado no cromossomo B. bronchiseptica = efeito de monocopia da toxicidade SacB / Sacarose (= sistema de contra-seleção). Conforme demonstrado pelos resultados mostrados nas FIGs. 5A-5C e FIGs. 6A-6C, uma alta sensibilidade à sacarose é igual à funcionalidade bem-sucedida do sistema de contra-seleção com redução de sobrevivência superior a 5 log de Merodiplóides. A diluição e o volume de pontos da cultura dos clones merodiplóides foram testados e confirmados por PCR quanto à sua capacidade de crescer na placa BG + 5% ou 10% de sacarose. Triagem de mutante de deleção ∆aroA usando o sistema de contra-seleção sacB / sacarose.

[00111] Como mostrado nas FIGs. 7A-7B, B. bronchiseptica com uma alta sensibilidade à sacarose foi demonstrada quando 10 uL de uma cultura Merodiploide crescida (1X) em BTS + aromix e espalhada em placas de sacarose a 5%

deu origem a cerca de 100 CFUs que são resistentes à sacarose. De acordo com o ensaio da placa de réplica na placa BG com e sem canamicina (FIG. 7B), os clones não sensíveis representaram 96% das CFUs. Finalmente, a PCR específica para o gene SucR e KmS confirmou que as 96 UFCs eram clones "pop out", dando origem a recombinantes hemolíticos 100%. Identificação das condições ideais de isolamento do mutante aroA.

[00112] Como mostrado na FIG. 8, o Clone # 2 era um mutante H + hemolítico com deleção de aroA. Quando aroA foi deletado do genoma de B. bronchiseptica deste exemplo, o locus do gene aroA total é 2,3 kb menor em comparação com o locus do gene aroA de tipo selvagem, que é 3,6 kb. A frequência para a obtenção de um mutante H + com deleção do gene aroA para B. bronchiseptica é escassa de 1/106 e, como tal, a obtenção de até mesmo um mutante aroA era altamente improvável ausente usando uma técnica como o sistema de contra-seleção 100% funcional do presente exemplo.

[00113] Conclusão. Treze (13) novos mutantes do gene aroA deletados, H +, B. bronchiseptica foram projetados e caracterizados. Como confirmado por PCR e / ou sequenciamento, os clones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 e 19 são B. bronchiseptica mutante deletado com ∆aroA (ver FIG. 9). Todos estes clones são H + e foram semeados em sangue BG + suplementado com 1X e 2X de aromix para isolamento de H + CFUs antes de iniciar uma cultura líquida para armazenamento subsequente a -70 ° C (ver FIG. 10). Em geral, as culturas líquidas foram realizadas a partir dos clones isolados e as culturas foram cultivadas a 180 rpm a

37 ° C em 1) BTS, 2) BTS + 1X aromix e BTS + 2X aromix, e colhidas em OD694 em torno de 1,0-1,3. Finalmente, os ensaios de atividade de H + foram conduzidos a partir de cada condição de cultura resultante, espalhando em sangue BG + + 1X aromix, uma alíquota 150 de diluição 10-6. Exemplo 3 - Eficácia da vacina oral Bb ∆aroA Objetivos e visão geral do estudo.

[00114] Para avaliar a eficácia de uma vacina candidata contra Bordetella bronchiseptica (Bb) (L1aroA) após 2 imunizações com 20 dias de intervalo em cães negativos para Bb. A dose baixa (5 x 104 CFU / dose) foi administrada por via subcutânea, e a dose alta foi administrada por via oral (3-5 x 109 CFU / dose). A eficácia foi avaliada por um teste 7 dias após a última vacinação. Os sinais clínicos foram avaliados em comparação com um grupo não vacinado. Todos os cães foram considerados negativos antes da vacinação (D-2) e negativos antes do desafio (T-1). A Tabela 5 apresenta o desenho experimental. Condições de crescimento e título bacteriano.

[00115] O gene aroA deletado, H + mutante Bordetella bronchiseptica (L1aroA), foi cultivado em meio líquido TSB (caldo de soja tríptico) suplementado com 1X aromix a 37° C sob agitação de 200 rpm até cerca do final da fase log. Neste ponto, a cultura tinha uma OD em 694 nm de cerca de 1,2 (OD694 = 1,2), o que corresponde a um título bacteriano próximo a 5 x 109 CFU / mL. Esses resultados correspondem a cerca de 12-13 horas em cultura. Em seguida, a cultura foi titulada em paralelo usando citometria de fluxo e, em seguida, diluída para os títulos alvo. As contagens bacterianas vacinais e a hemólise foram realizadas em ágar BG (Bordet Gengou) + 5% de sangue de ovelha + 1X aromix. Da mesma forma, a pureza da vacina foi testada em paralelo com a vacinação. Tabela 5. Projeto experimental Gp Vacinação Desafio Monitoração Amostragem Eutanásia T14 D0 & D20 D27 = T0 clínica A Alvo Bb Pesagem: A (n=6) ∆aroA Intranasal: cada 2 For qPCR: Amostras Post- 0,5 ml / semanas D-2, D19, mortem título: narina + T-1 e T2, (pulmões e 105 intra- T3, T6, locais de UFC/ml traqueal: 1 Monitoramento T8, T10, injeção)

0.5 ml; ml; clínico: T14 SQ Título - Manhã: D0 * Para B Alvo Bb alvo: 3.109 a D4; D20 a Sorologia: histopatologia (n=6) ∆aroA UFC/ml D24; T0 * a D-2, D5, T14 D12, D19 título: - Tarde: T-1, T14 3x109 entre T0 e UFC/ml T13 todos os 1 ml; VO dias, exceto C NA fim de semana (n=5) * antes da vacinação ou desafio; Títulos reais das suspensões de Bb: Gp A Vacc1: 1,4 x 105 CFU / ml; Gp A Vacc2: 0,86 x 105 CFU / ml; Gp B Vacc1: 3,5 x 109 CFU / ml; Gp B Vacc2: 2,61 x 109 CFU / ml. Cepa de Desafio.

[00116] A cepa de desafio Bb foi amplificada para preparar uma geração G4 em meio líquido (TSB) a 37° C a partir de uma inoculação de 1/50 com agitação de 200 rpm. A amplificação de G4 foi interrompida após cerca de 7,30 horas, e a cultura foi imediatamente titulada via FACS e diluída para o título alvo. Em paralelo, a cultura foi espalhada em ágar BG suplementado com 5% de sangue de ovelha (Biomerieux) e incubada 48h a 37 ° C para avaliar a homogeneidade e a aparência das colônias (por exemplo, colônias pequenas e lisas cinza), e, também seu caráter hemolítico. Cerca de 100% das colônias expressaram o fenótipo hemolítico. Em paralelo, a titulação em ágar foi conduzida para confirmar o título determinado por FACS. Animais.

[00117] Cães Beagle, negativos para Bb por qpcr de esfregaços nasais e negativos para anticorpos anti-Bb séricos, com idade entre 9 e 12 semanas no dia 0. Os animais foram randomizados e divididos em 2 grupos de 6 cães e um grupo de 5 cães de acordo com suas datas de nascimento e os títulos qPCR Bb, antes de D0.

[00118] Antes da vacinação (D0), todos os cães do Grupo A foram rapados na zona interescapular. A cepa da vacina foi preparada pouco antes do teste. No dia da vacinação, 10 ml de cepa de vacina a cerca de 105 CFU / ml e 3 - 5 x 109 CFU / ml foram preparados e colocados em gelo. Uma alíquota do inóculo foi titulada (FACS e contagem de caixas). Apenas cães em bom estado geral e sem hipertermia (exceto hipertermia relacionada à excitação: T ° C> 39,5° C mas alerta e reativo) foram vacinados. Grupo A: Em D0 e D20, todos os cães do grupo A foram vacinados por via subcutânea com 0,5 ml da vacina Bb aroA tinha cerca de 105 UFC / ml.

Grupo B: Em D0 e D20, todos os cães do Grupo B foram vacinados por via oral com 1 ml de Bb aroA a cerca de 3 - 5 x 109 CFU / ml. Os animais do grupo C não foram vacinados. Tabela 6. Resultados de hipertermia Grupos Cães *Antes do desafio

[00119] Todos os controles com hipertermia (RT > 39,5° C) após desafio por pelo menos 3 dias. No gp A: 4 cães / 6 com hipertermia por 1, 2 ou 4 dias. No gp B: 2 cães com hipertermia pontual uma vez.

[00120] Tabela 7. Todos os controles validaram o desafio de acordo com o USDA (“tosse espontânea por 2 ou mais dias cumulativos”) e o Ph. Eur. Endpoints Gp GCS

A 156 (∆aroA 10^5 CFU/ml SC)

B 45 (∆aroA 3.10^9 CFU/ml VO) C (Controls) 393

[00121] Tabela 8. Sinais clínicos após o desafio (dados de T0-T14). Critérios do USDA: pelo menos 75% dos cães de controle desenvolvem tosse espontânea por dois ou mais dias consecutivos Grupo Tratamento No. de % de No. de cães No. cães com cães com com tosse médio de doença doença espontânea dias com tosse A aroA 10^5 4 80 4 2,7 CFU/ml SC (n=6) B aroA 3x10^9 0 0 4 0,7 CFU/ml VO (n=6) C Controles 5 100 5 7.4 (n=5)

[00122] A FIG. 11 mostra os sinais clínicos em caninos após a administração dos tratamentos indicados, seguido de desafio virulento com B. bronchiseptica virulenta. Exemplo 4 - Eficácia de B. bronchiseptica ∆aroA Oral Objetivos.

[00123] Para avaliar a eficácia da vacinação de uma injeção por via oral de uma vacina candidata (Bordetella bronchiseptica com deleção de aroA (Bb ∆aroA) em dose alta (109 UFC / ml dose).

[00124] Tabela 9. Desenho experimental - vacinação oral única Gp Vacinação Desafio Monitoramento Amostragem Eutanásia T14 D0 & D20 D21 = T0 clínico Pesagem: D-1, Para qPCR A Alvo Bb Intranasal: D14, D20, T14 swabs Amostras Post- (n=5) ∆aroA 0.5 nasal: mortem título: ml/nostril D-2, D7, (pulmões e 109 + intra- Monitoramento D14, D20, locais de UFC/ml tracheal: clínico: T2, T3, injeção); para

1.0 ml; 1ml; - Manhã: T0 a T6, T8, histopatologia Oral Target T14 T10, T14 titer: -Tarde: entre 9 C NA 1x10 T0 e T13 todo Sorologia: (n=5) UFC/ml dia, exceto D-1, D7, fim de semama D14, D20, T14 * antes da vacinação ou desafio Cepa de Desafio.

[00125] Preparado conforme descrito acima. Animais.

[00126] Cães Beagle, negativos para Bb por qpcr de esfregaços nasais e negativos para anticorpos anti-Bb séricos, com idade entre 9 e 12 semanas no Dia 0. Os animais foram randomizados e divididos em 2 grupos de 5 cães e um grupo de 5 cães de acordo com suas datas de nascimento e os títulos qPCR Bb, antes de D0. Resultados de sinais clínicos.

[00127] Um cão é classificado como portador da doença devido à infecção por Bb se desenvolver tosse espontânea (manhã e / ou tarde) por dois ou mais dias consecutivos (de acordo com a definição de desfecho do USDA).

[00128] Tabela 10. Resultados de sinais clínicos Grupo No de cães % de cães No de cães com Número médio com doença com doença tosse espontânea de dias com tosse A 0 0 2 0,4 C 4 80 5 6,4

[00129] A proteção clínica contra o desafio foi confirmada para ambos os grupos de vacina por escores clínicos globais (FIG. 12). Resumo.

[00130] A vacina administrada por via oral contendo uma quantidade eficaz da cepa de B. bronchiseptica atenuada divulgada foi capaz de induzir proteção. Exemplo 5 - Bordetella bronchiseptica: comparação de dois processos de produção de duas vacinas bivalentes ΔaroA Objetivos

[00131] Para avaliar a eficácia de 2 vacinas ΔaroA diferentes (processos de produção diferentes) após a vacinação de uma injeção por via oral.

[00132] A primeira vacina foi preparada em meio Cohen Wheeler (CW) (Cohen SM, Wheeler MW. Vacina contra coqueluche preparada com culturas de fase I cultivadas em meio fluido. Am J Public Health Nations Health. 1946 abril; 36 (4): 371– 376). A segunda vacina foi preparada em Caldo de Soja Tríptico não animal (ver Exemplo 6 abaixo). Um total de 18 cães SPF entre 9-12 semanas de idade foram randomizados em 3 grupos de 6 por idade e sexo. Ambas as vacinas também incluíram antígenos vivos atenuados de CPIV (PIV5), conforme descrito abaixo.

[00133] Tabela 11. Projeto experimental - comparação de 2 vacinas ΔaroA Grupo Vacinação no Dia Desafio no Endpoints Amostras Eutanásia 0 T0 clínico T14 Rota Oral – 3.3ml (=D20) Cepa Cepa

Bb ΔaroA PIC A Processo Título Nebulização, Pesagem: 2 swabs Amostras (n=6) CW alvo: título alvo D-1, D13, nasais post mortem título 6.9log10 ~9log10 T-1, T14 (qPCR): de pulmões e alvo DICC50/ CFU/câmara check up D-1, D1, traqueia 9log10, dose Volume alvo Pós D2, D7, T- para CFU/dose a ser vacinação 1, T1, T3, análises B Processo nebulizado clínica: T6, T8, histológicas (n=6) TSB ~20mL D0 a D4 T10, T14 título check up 2 alvo Pós esfregaços 9log10, desafio traqueais: CFU/dose clínico: D-1, D7, C NA -AM: D0 T-1 e T8 (n=6) a D14 Sangue -PM: (frascos entre T0 secos de 4 e T13, mL): D-1, todo dia D7, D13, exceto T-1 T14 fim de semana. *Dose de desafio final / câmara Preparação da vacina do vírus da parainfluenza canina (PIC).

[00134] A suspensão inicial (Titer 8,7 log10 DICC50 / ml) do frasco contendo a cepa de vacina PIC (CPIV) foi homogeneizada por rollover dos tubos. Todas as xícaras foram reconstruídas em gelo congelado. O título é calculado em doses infecciosas para cultura de células 50% (DICC50) pelo método Kàrber. Kärber G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Archiv f experiment Pathol u Pharmakol. 1931; 162: 480–483 (Contribuição para o tratamento coletivo de ensaios farmacológicos em série. Arquivo para o experimento Pathol e Pharmac).

[00135] Suspensão de vacina PIC, título alvo 6,4 log10 DICC50 / ml, diluição 1/200 da suspensão inicial compreendeu duas etapas. Etapa 1 (diluição para 1/10): derreter 1 ml da suspensão inicial com 9 ml de SRL (suspensão PIC0). Etapa 2 (diluição para 1/20): derreter 4 mL da suspensão obtida na etapa 1 com 76 mL de SRL (suspensão PIC1).

[00136] Na suspensão final, obteve-se 80 ml de suspensão PIC a 6,4 log10; deixando 31 ml de PIC 6. 4 log10 em uma garrafa: solução B1. Removido 1 ml de PIC a 6,4 log10 (manter a -70 ° C). Deixou o volume em outro frasco: solução A1. Preparação das suspensões finais da vacina.

[00137] Os cães em cada grupo foram vacinados imediatamente após a preparação da suspensão de vacina correspondente. Em cada etapa, as suspensões foram homogeneizadas por rollover dos tubos. Todas as etapas foram reconstruídas no gelo congelado e no PSM.

[00138] Suspensão vacinal A2 (grupo A): 64 frascos de vacina Bb CW com 0,4 ml de solução A1 cada foram agrupados com os 64 frascos e homogeneizando a suspensão obtida: suspensão vacinal A2. contendo ≈ 25 ml de Bb a 8,5 log10 / ml e PIC a 6,4 log10 / ml. Removido 1 ml de suspensão A2: (manter a -70 ° C). Cães vacinados do Grupo A com 3,3 ml / suspensão A2 / cão.

[00139] Suspensão de vacina B2 (Grupo B): 2 frascos de vacina Bb BTS com 1 ml de SRL cada foram reunidos e homogeneizados. Diluído ½ da suspensão inicial: colocar 1 ml obtido na etapa anterior com 1 ml da suspensão SRL: B0. Diluído 1/32: colocar 1 ml de suspensão B0 em 31 ml de solução B1: A suspensão de vacina B2 contém 32 ml de Bb a 8,5 log10 / ml e PIC a 6,4 log10 / ml. Removido 1 ml de suspensão B2: (manter a -70 ° C). Cães vacinados do Grupo B com 3,3 ml / suspensão B2 / cão.

[00140] Os cães foram distribuídos aleatoriamente em diferentes câmaras e sessões de nebulização de modo que cada câmara contivesse proporção aproximadamente igual de animal de cada grupo de tratamento.

[00141] Tabela 12. Status dos cães antes do desafio Resultados nas pontuações clínicas da vacina bivalente em meio TSB-NA e CW.

[00142] A FIG. 13 mostra resultados em pontuações clínicas para B. bronchiseptica ΔaroA cultivada em diferentes meios. O desafio foi validado nos controles. A vacina Bb TSB induziu uma grande redução dos sinais clínicos quando comparada aos controles. Bb CW não reduziu os sinais clínicos em comparação com os controles.

[00143] Tabela 13. Resultados em cães para B. bronchiseptica ΔaroA cultivados em diferentes meios Nb o of dogs mean Número N o de % de cães N de cães Nb of dogs % of dogs comwith médioofde tosse number Gp cães com com with disease with disease spontaneous dias espontânea days com with doença doença cough tosse cough

A 6 100 6 5.7 Bb CW

B 2 33 3 1.4 Bb STB

C 6 100 6 7.3 control

[00144] Este estudo mostra que o aroA mutado com Bb está protegendo cães por via oral quando administrado em um ambiente bivalente (ou seja, em combinação com o vírus da parainfluenza canino). Além disso, neste estudo a vacina do grupo B contém Bb aroA cultivado em meio TSB-NA que é isento de qualquer substância de origem animal. Dessa forma, essa vacina oferece proteção mais ampla e menor risco de contaminação por agentes adventícios.

[00145] O grupo A produzido em um meio CW não foi protetor, mostrando que é imprevisível se um meio de produção selecionado preservará a capacidade da vacina de proteger contra um desafio de B. bronchiseptica. A proteção clínica contra o desafio foi confirmada para a vacina do Grupo B pelos escores clínicos globais (Tabela 13).

Resumo.

[00146] A vacina bivalente administrada por via oral contendo uma quantidade eficaz da cepa de B. bronchiseptica atenuada divulgada em combinação com o vírus da parainfluenza canino e produzida em meio TSB-NA foi capaz de induzir ampla proteção. O uso de um produto não animal diminui o risco de contaminação por agentes adventícios. Exemplo 6 - Cultura de Bordetella bronchiseptica ΔaroA em caldo de soja tríptico de origem não animal (TSB-NA) Objetivos

[00147] Cultura de B. bronchiseptica ΔaroA fortemente hemolítica em caldo de soja tríptico de origem não animal.

[00148] A cultura de Bordetella bronchiseptica ΔaroA foi cultivada em meio de Caldo de Soja Tríptico filtrado de origem não animal (TSB-NA, pode ser adquirido em Acumedia.com) e depois misturado 70/30% (v / v) com estabilizador. Preparação do meio.

[00149] TSB de origem não animal preparado (TSB-NA) de acordo com as instruções do fabricante. Frasco semeados.

[00150] TSB-NA preparado de acordo com as instruções do fabricante e esterilizado por filtro através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 µm. Dispensou 1000 mL de TSB-NA estéril em um frasco Erlenmeyer descartável de 3 L estéril com tampa ventilada. Manteve o meio por no mínimo 12 horas a 37 ˚C para verificar a esterilidade. Imediatamente antes da inoculação, adicionou assepticamente 10 mL de AroMix 100xC esterilizado por filtro ao frasco semeado usando uma pipeta estéril. Inoculou o frasco com 1 mL de um frasco X + 3 descongelado. Incubar o frasco a 37 ˚C em um agitador a 200 RPM por 12 a 18 h. Quando a OD600 da cultura de sementes estava em 2,5 ± 1,0, inoculei o fermentador. A densidade de semeadura foi normalizada para 2,75% v / v na cultura de sementes OD600 = 1. O volume do inóculo foi calculado usando a seguinte equação: 110 / OD600 Frasco de Semente = volume de inóculo (mL). Transferiu o volume apropriado de cultura de semente para uma garrafa estéril com conjunto de tubo de imersão e fermentador inoculado usando uma bomba peristáltica. Fermentação de produção.

[00151] Preparou um fermentador de 7 L e esterilizou por no mínimo 30 min em autoclave. Preparado e esterilizado por filtração 4,0 L de meio TSB-NA para o fermentador estéril. Incubou o fermentador contendo o meio a 37 ˚C, fluxo de ar de 0,5 vvm (2 SLPM) e agitação a 200 RPM por pelo menos 12 h. Quando o ponto de ajuste da temperatura foi alcançado e estável, o pH foi verificado usando um medidor de pH externo e ajustado para o ponto de ajuste do processo. Realizou uma calibração de zero na sonda DO usando zero eletrônico (desconecte o cabo) e, em seguida, foi medido a 100% com aeração a 2 SLPM e agitação a 200 RPM. Imediatamente antes da inoculação, adicionou-se assepticamente 40 mL de Aromix 100xC estéril. Recipiente inoculado com cultura de sementes, conforme descrito na seção 3.2.1.2. Cultivado a 37 ˚C por aproximadamente 24 h EFT. Cultura colhida quando 700 ± 50 mL de 30% de extrato de levedura alimentar foi entregue

[00152] As condições de cultura e fermentação controlam o fermentador da produção. Volume de trabalho: 4 L. Temperatura: 37 ˚C +/- 0,2. pH: 7,2 +/- 0,1 (mantido usando 400 mL de ácido lático 5 N em uma garrafa / aparelho de tubulação Pyrex). Agitação: 200 RPM - 600 RPM ajustado automaticamente para manter o ponto de ajuste DO. Aeração: Zero inicial então a 0,5 vvm (2 SLPM) constante quando cultura DO = 30%. Pressão: n / a. Oxigênio dissolvido (OD): 40% mantido com aeração constante, agitação ajustável e suplementação de O2 puro. Programa BioXpert: aroA_Feed_4L (Applikon Biotechnology). Alimentação: A alimentação com 30% de extrato de levedura Bacto começou às 9 h EFT a uma taxa de 50 mL / h iniciada pela receita. Final da fermentação.

[00153] O final da fermentação foi alcançado em aproximadamente 24 h do tempo de fermentação, quando 700 ± 50 mL de extrato de levedura foi entregue. Amostrou o fermentador usando um vacutainer. Testado para OD600. Colhido ~ 800 mL de caldo de cultura de células em um frasco estéril de 1 L. 420 mL de caldo de cultura de células misturados 70/30% (v / v) com estabilizador para um volume final de vacina de 600 mL. As culturas combinadas foram armazenadas a 4 ° C, com mistura suave, por até 3 dias após a colheita antes da liofilização. Teste de CFU realizado em culturas combinadas após a espera, antes da liofilização. As amostras pós-liofilização foram testadas quanto à pureza, CFU e atividade hemolítica.

[00154] Monitoramento de processos.

[00155] Implementado o software BioXpert para registro de dados online. Receita BioXpert: Bordetella_aroA.

Dados de processo de curso de tempo registrados, incluindo tempo de amostra, pH, temperatura, oxigênio dissolvido, velocidade do impulsor durante a fermentação usando o registro do lote. Liofilização.

[00156] Na colheita, 420 mL de caldo de cultura de células da cultura TSB-NA foi formulado com o estabilizador de sacarose peptona definido anteriormente (Tabela 14) e armazenado por até 3 dias enquanto se mistura a 4 ˚C. O tempo de enchimento alvo foi de 24 horas após a formulação. A formulação foi feita como mostrado na Tabela 14.

[00157] Tabela 14. Formulação de liofilização Ingrediente Concentração (p/p) Alvo /dose 70% v/v Cultura de B. n/a ingrediente bronchiseptica ΔaroA ativo Sacarose 30 % 15 % v/v

13.3 % de peptona de Componente soja estabilizador 15 % v/v

13.3 % de Dextrana 70 Dextrano-Peptona 3,33 % de MSG

[00158] As vacinas foram preenchidas com 1,1 mL por frasco enquanto se misturava a cultura combinada. Aproximadamente 500 frascos de 3 cc de mistura foram enchidos e carregados no liofilizador GEA. O teste de pré-liofilização foi feito removendo 10 frascos das bandejas durante o carregamento para testar as UFCs de pré-liofilização (5 frascos agrupados), pH, densidade, osmolaridade e Tg. As vacinas foram liofilizadas usando o ciclo desenvolvido para a cepa AFQ2 de B. bronchiseptica oral, conforme mostrado na

Tabela 15. Tabela 15. Etapas dos ciclos de liofilização, temperatura e pressão Etapa Time Temperatu Pressão (min) ra Carregamento NA 4 ˚C ambiente Congelamento 80 -45 ˚C ambiente Congelando 90 -45 ˚C ambiente Secagem Primária 105 -10 ˚C 80 mTorr Secagem Primária 1080 -10 ˚C 80 mTorr Secagem Secundária 131 28 ˚C 80 mTorr Secagem Secundária 540 28 ˚C 80 mTorr Temperatura de 1 28˚C 80 mTorr parada Aterro de 2.9 psia (150 n/a 28 ˚C nitrogênio Torr) Descarregando n/a 4 ˚C ambiente

[00159] Após a liofilização, os frascos foram rotulados, tampados e testados conforme descrito na Tabela

16. Amostragem.

[00160] A Tabela 16 mostra o processo de amostragem para as bateladas de fermentação ΔaroA de B. bronchiseptica. O fermentador foi amostrado antes da inoculação, durante tempos específicos do processo de fermentação e no final da fermentação (HV). CFUs realizadas na amostra HV. Realizou verificações microscópicas e estratificação periodicamente para verificar a esterilidade e observar a morfologia do microorganismo. Após a colheita, as amostras de pré- liofilização e pós-liofilização foram testadas para UFC.

[00161] Tabela 16. Processo de amostragem para bateladas de B. bronchiseptica ΔaroA Ponto de tempo H+ Fase OD600 Pureza CFU DMO pH Dens Osmo Tg da amostra %

BP BP BP Teste Lab BPD BPD BPD BPD BPD BPD

D D D 1 0.1 1 1 Quantidade 1 mL TSA 1 mL 3 mL 1 mL mL mL mL mL Frasco At inoculação ✓ Frasco Final ✓ ✓ ✓ semeado Pré-Inoculação ✓ Cultura de ✓ Recipiente crescimento HV ✓ ✓ ✓ ✓ Suspensão PBS ✓ Pré-lyo ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ Pós-lyo Lyo. (ingrediente ✓ ✓ ✓ ativo) 37 4 4 Estocar n/a 37˚C 37˚C n/a 4 ˚C 4 ˚C ˚C ˚C ˚C

[00162] Critérios de avaliação / análise de dados / estatísticas. A interpretação dos resultados baseou-se na análise dos dados. Rendimentos de UFC superiores a 1010 UFC / mL para a cultura TSB-NA foram colhidos. A perda de liofilização foi calculada e foi inferior a 0,5 log10 desde a pré-liofilização até a pós-liofilização.

[00163] Tendo assim descrito em detalhes concretizações preferidas da presente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não deve ser limitada a detalhes particulares estabelecidos na descrição acima, visto que muitas variações aparentes das mesmas são possíveis sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada caracterizada pelo fato de que é capaz de induzir imunidade protetora contra infecção por B. bronchiseptica em um animal quando administrada por via oral ao animal.

2. Cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada tem um gene aroA parcialmente deletado.

3. Cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada tem uma deleção completa de seu gene aroA.

4. Cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada compreende um polinucleotídeo com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3.

5. Cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada é depositada sob o Depósito CNCM No. I-5391.

6. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada capaz de induzir uma resposta imune quando administrada por via oral a um animal.

7. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica compreende ainda um transportador, adjuvante,

veículo e / ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

8. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica é livre de adjuvante.

9. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica é uma formulação de dose única para administração oral.

10. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a formulação de dose única tem entre 1 x 103 CFU a 1 x 1010 CFU da cepa B. bronchiseptica mutante aroA atenuada.

11. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a formulação de dose única tem entre 1 x 108 CFU a 1 x 1010 CFU da cepa de B. bronchiseptica mutante de aroA atenuada.

12. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno do vírus parainfluenza canino.

13. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno de adenovírus canino.

14. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica é livre de substâncias de origem animal.

15. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica é uma vacina.

16. Método para induzir uma resposta imune protetora contra B. bronchiseptica em um animal caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao animal uma vacina oral compreendendo uma quantidade eficaz de uma cepa de bactéria Bordetella bronchiseptica mutante aroA.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o animal é um canino ou felino.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a resposta imune protetora é eficaz para fornecer ao animal proteção contra infecção por B. bronchiseptica virulenta, doença clínica associada à infecção por B. bronchiseptica virulenta e / ou sintomas clínicos associados à infecção por B. bronchiseptica virulenta.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que um regime de administração inicial-reforço é empregado.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o animal tem entre 0 a 6 meses de idade.