JP2022520925A - 弱毒化ボルデテラ・ブロンキセプチカ株、当該弱毒化株を含む経口ワクチン並びに前記の製造及び使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株を提供し、前記はB.ブロンキセプチカに対する免疫応答を動物において誘発するために有効である。さらにまた提供されるものは免疫原性組成物及びワクチンであり、前記は弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株を含む。さらにまた提供されるものは、そのような組成物及びワクチンに関して使用されるキットである。さらにまた提供されるものは、弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株、組成物及びワクチンを動物に経口的に投与する方法である。

Description

（関連出願の相互引用）本出願は、米国仮特許出願2/788,764（2019年1月4日出願、その完全な内容は本明細書における参照によって本明細書に包含される）に対し優先権を主張する。
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（技術分野）
本発明は、概してボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）細菌株、組成物及びワクチン、並びに前記の製造及び使用方法に関する。

獣医医学では、B.ブロンキセプチカはある範囲の宿主規定病理変化をもたらし、イヌ、ブタ及びウサギで重篤な疾患を引き起こす。ブタでは、B.ブロンキセプチカ及びP.ムルトシダ（P. multocida）は一緒になって萎縮性鼻炎を引き起こす。イヌでは、B.ブロンキセプチカは警笛様“ケンネル”コフによって代表される急性気管気管支炎を引き起こす。そのような咳はまた、イヌアデノウイルス-2（cAV2）及び/又はイヌパラインフルエンザウイルス（cPI2）によって引き起こされ得る。ネコでは、B.ブロンキセプチカ感染は、気管気管支炎、結膜炎及び鼻炎（“上気道感染”又は“URI”と呼ばれる）、下顎リンパ節腫脹、及び肺炎と密接に関係する。しかしながら、ネコのURIはまた、ヘルペスウイルス、カリシウイルス、マイコプラズマ属の複数種、及び/又はクラミジア・シッタシ（Chlamydia psittaci）によって引き起こされ得る。
B.ブロンキセプチカは、高頻度の相変異及び抗原性変化（antigenic modulation）について良く知られている（Monack, D. M., et al., “Phase Variants of Bordetella bronchiseptica Arise by Spontaneous Deletions in the Vir Locus.” Molecular Microbiology, vol. 3, no. 12, 1989, pp. 1719-1728）。したがって、ある株と別の株間で、さらに培養条件に応じて、抗原決定基の発現レベルは変動し、不活化ワクチン調製物の免疫原性に影響を与え得る。古典的には、37℃で増殖させたB.ブロンキセプチカ株（例えばRB50）は、病毒性に関与し重要な抗原決定基であることが判明しているタンパク質（アデニル酸シクラーゼ-ヘモリシン（Ac-Hly）、タイプIII分泌系エフェクター（BteA）、繊維状赤血球凝集素（FHA）、ペルタクチン（PRN）及び線毛（FIM、vagと称される病毒性活性化遺伝子によってコードされる）を含む）を産生する。しかしながら、当該細菌は、25℃で又はMgSO₄若しくはニコチン酸の存在下で37℃で増殖させるときこれらの病毒性因子の産生を抑制する。さらにまた、vrgと称される病毒性抑制遺伝子（例えば鞭毛をコードするもの）の発現はこれらの条件下で活性化される。

鼻内ワクチン接種は、B.ブロンキセプチカに対して動物をワクチン免疫するために当業界で唯一の許容可能な方法と概ねみなされてきた。生B.ブロンキセプチカワクチンの全身的投与は弱毒化されたときでも重篤な膿瘍形成を生じ得ることが判明して以来、生B.ブロンキセプチカワクチンの全身的投与は安全な選択肢とはみなされなかった（例えば以下を参照されたい：Toshach et al., J Am Anim Hosp Assoc 33:126-128, 1997）。同様に、複数の研究が、鼻内ワクチン接種は経口ワクチン接種よりもはるかに優れていることを示した（Ellis J.A., et al. “Comparative efficacy of intranasal and oral vaccines against Bordetella bronchiseptica in dogs.” The Veterinary Journal, vol. 212, 2016, pp. 71-77）。
生弱毒化/非病毒性ボルデテラ・ブロンキセプチカ株は、ワクチン処方物としてイヌに鼻内投与されるとき、イヌのケンネルコフに対して強力な防御を提供することが示された（Bey, R. F., et al., “Intranasal Vaccination of Dogs with Liver Avirulent Bordetella bronchiseptica: Correlation of Serum Agglutination Titer and the Formation of Secretory IgA with Protection Against Experimentally Induced Infectious Tracheobronchitis.” American Journal of Veterinary Research, vol. 42, no. 7, 1981, pp. 1130-1132）。実験的に誘発した伝染性気管支炎に対する防御に関して、血清凝集力価と分泌IgA形成の相関性が鼻内投与後に示された。この防御は、ワクチン接種後48時間で早くも認められた。生弱毒化B.ブロンキセプチカによる鼻内ワクチン接種はまた、2日齢の仔ブタの萎縮性鼻炎を防御することが示された（De Jong, M. F. “Prevention of Atrophic Rhinitis in Piglets by Means of Intranasal Administration of a Live Non-AR-PathogenicBordetella Bronchisepticavaccine.” Veterinary Quarterly, vol. 9, no. 2, 1987, pp. 123-133）。生AR非病原性ボルデテラ・ブロンキセプチカワクチンの鼻内投与手段による仔ブタの萎縮性鼻炎の予防は、ボルデテラワクチンが新生動物において生弱毒化形で活性を有し得ることを示している。

B.ブロンキセプチカのaroA欠失株もまた構築され、もっぱら鼻内ワクチンとして用いられてきた（Stevenson and Roberts, Vaccine 20, 2325-2335, 2002）。しかしながら、aroA遺伝子の不活化はB.ブロンキセプチカを高度に弱毒化させ、気道におけるその定着能力及び生存能力を甚だしく障害する。このことは、aroA欠失B.ペルツシス（B. pertussis）は高度に弱毒化されるが、鼻内ワクチン接種動物の気道に定着するその能力もまた失われてしまい、高用量の反復投与後にのみ防御性免疫を誘発するという類似研究と一致する（Roberts, et al. “Construction and Characterization in Vivo of Bordetella Pertussis AroA Mutants.”Infection and Immunity, American Society for Microbiology Journals, 1 Mar. 1990, iai.asm.org/content/58/3/732.short.）。
鼻内ワクチンは、特に何らかの物質の鼻孔への投与にしばしば抵抗する動物（例えばイヌ科の動物又はネコ科の動物）への投与には不都合である。鼻内へのワクチン投与はまた、投与中に動物がくしゃみをすると、動物によって取り込まれるワクチンの量が防御を示す用量よりも顕著に少ないというリスクを生じる。
既存のB.ブロンキセプチカワクチン及び方法における上記制限に加えて、既存のB.ブロンキセプチカ株を他の細菌及びウイルス株と一緒に用いる多価ワクチンを提供する努力も限定的な成果しか上げていない。例えば、Skibinskiらは、組合せワクチンの開発に関連する数多の課題（複数の抗原の1つに対する応答の低下を含む）を記載した（Skibinski, David AG, et al., “Combination Vaccines.”Journal of Global Infectious Diseases, vol. 3, no. 1, 2011, p. 63., doi:10.4103/0974-777x.77298）。
既存のB.ブロンキセプチカワクチンは、また例えば既存のワクチン処方物に必須であるワクチン賦形剤に基づく望ましくない副作用のような他の制限にも煩わされる。ワクチン有効性を押上げるために用いられるアジュバントは、局所反応（例えば注射部位の発赤、腫脹及び痛み）及び全身反応（例えば発熱、寒気及び身体の痛み）を増加させる（“Vaccine Safety.”Centers for Disease Control and Prevention, Centers for Disease Control and Prevention, 22 Oct. 2018, www.cdc.gov/vaccinesafety/concerns/adjuvants.html.）。既存のワクチンで用いられる血清はタンパク質に富み、アレルギー反応のリスクを増加させる。例えば、ウシ胎児血清（FCS）は、アレルギー反応を生じ得る典型的な動物起源の物質（SAO）である（Ohmori, Keitaro, et al. “IgE Reactivity to Vaccine Components in Dogs That Developed Immediate-Type Allergic Reactions after Vaccination.”Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 104, no. 3-4, 2005, pp. 249-256., doi:10.1016/j.vetimm.2004.12.003）。
したがって、希求されるものは、非鼻内デリバリーのために安全で有効でありかつ適切である、改善されたB.ブロンキセプチカワクチンである。

本明細書で提供されるものは、動物に経口的に投与したとき、動物においてB.ブロンキセプチカ感染に対する防御性免疫を誘発することができる弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株である。複数の実施態様において、当該弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株は部分欠失aroA遺伝子を有する。複数の実施態様において、当該弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株はそのaroA遺伝子の完全な欠失を有する。複数の実施態様において、当該弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株は、配列番号:3と少なくとも85％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。複数の実施態様において、当該弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株はCNCM 受託番号I-5391のもとに寄託されている。
本明細書で提供されるものはまた動物に経口的に投与したとき免疫応答を誘発することができる弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株を含む免疫原性組成物である。複数の実施態様において、当該免疫原性組成物はさらに、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル及び/又は賦形剤を含む。複数の実施態様において、当該免疫原性組成物はアジュバントを含まない。複数の実施態様において、当該免疫原性組成物は経口投与のための一用量処方物である。複数の実施態様において、当該一用量処方物は、1ｘ10³ CFUから1ｘ10¹⁰ CFUの弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株を有する。複数の実施態様において、当該一用量処方物は、1ｘ10⁸ CFUから1ｘ10¹⁰ CFUの弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株を有する。複数の実施態様において、当該免疫原性組成物はさらにイヌパラインフルエンザウイルス抗原を含む。複数の実施態様において、当該免疫原性組成物はさらにイヌアデノウイルス抗原を含む。複数の実施態様において、当該免疫原性組成物は動物起源の物質を含まない。複数の実施態様において、当該免疫原性組成物はワクチンである。
本明細書で提供されるものはまた有効量のaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌株を含む経口ワクチンを動物に投与する工程を含む、動物においてB.ブロンキセプチカに対する防御性免疫応答を誘発する方法である。複数の実施態様において、当該動物はイヌ科の動物又はネコ科の動物である。複数の実施態様において、当該防御性免疫応答は、病毒性B.ブロンキセプチカ感染、病毒性B.ブロンキセプチカ感染に関連する臨床的疾患、及び/又は病毒性B.ブロンキセプチカ感染に関連する臨床的症候に対する防御を動物に提供するために有効である。複数の実施態様において、当該方法はプライム-ブースト投与レジメンを採用する。複数の実施態様において、当該動物は0から6ヶ月齢である。

DNAプラスミドpBP1070のマップを示す。 B.ブロンキセプチカ株05の染色体へのpPB1070自殺プラスミドの組込みを図式化した流れ図である。 変異B.ブロンキセプチカ株を生成するための第二の工程を図式化した流れ図である。ここでは、自殺プラスミドpPB1070はB.ブロンキセプチカ株05の染色体からaroAを切り出し、株05の変異体ΔaroAバージョンを生成する。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、pPB1070自殺プラスミドの大腸菌（E. coli）での機能的特徴付けの結果を示す。図4AはLB/カナマイシンプレートでの増殖を示す；sacBを有する自殺プラスミド並びにクローン4及び5。結果が示すように、sacBはポーリンプロモータの制御下に置かれている。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、pPB1070自殺プラスミドの大腸菌（E. coli）での機能的特徴付けの結果を示す。図4BはLB/シュクロース（2.5％）プレートでの増殖を示す；sacBを有する自殺プラスミド並びにクローン4及び5結果が示すように、sacBはポーリンプロモータの制御下に置かれている。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、pPB1070自殺プラスミドの大腸菌（E. coli）での機能的特徴付けの結果を示す。図4CはLB/カナマイシンプレートでの増殖を示す；クローン1から3。結果が示すように、sacBはポーリンプロモータの制御下に置かれている。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、pPB1070自殺プラスミドの大腸菌（E. coli）での機能的特徴付けの結果を示す。図4DはLB/シュクロース（2.5％）プレートでの増殖を示す；クローン1から3。結果が示すように、sacBはポーリンプロモータの制御下に置かれている。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、組み込まれたpPB1070自殺プラスミドの機能的特徴付けを示す。BGプレートでの各クローン培養の連続希釈及びドット：カナマイシン（図5A）、シュクロース5％（図5B）、及びシュクロース10％（図5C）。図5AはBGプレート＋カナマイシンでの細菌の増殖を示す。対抗選択sacB/シュクロースはBbで機能性であるように見える。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、組み込まれたpPB1070自殺プラスミドの機能的特徴付けを示す。BGプレートでの各クローン培養物の連続希釈及びドット：カナマイシン（図5A）、シュクロース5％（図5B）、及びシュクロース10％（図5C）。図5Bは5％シュクロースでの細菌の増殖を示す。対抗選択sacB/シュクロースはBbで機能性であるように見える。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、組み込まれたpPB1070自殺プラスミドの機能的特徴付けを示す。BGプレートでの各クローン培養の連続希釈及びドット：カナマイシン（図5A）、シュクロース5％（図5B）、及びシュクロース10％（図5C）。図5Cは10％シュクロースでの細菌の増殖を示す。対抗選択sacB/シュクロースはBbで機能性であるように見える。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、組み込まれたpPB1070自殺プラスミドの追加の機能的特徴付けを示す。BGプレートでの各クローン培養の連続希釈及びドット：カナマイシン（図6A）、シュクロース5％（図6B）、及びシュクロース10％（図6C）。図6AはBG＋カナマイシンでの細菌の増殖を示す。対抗選択sacB/シュクロースは48HのBbで機能性であるように見える。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、組み込まれたpPB1070自殺プラスミドの追加の機能的特徴付けを示す。BGプレートでの各クローン培養の連続希釈及びドット：カナマイシン（図6A）、シュクロース5％（図6B）、及びシュクロース10％（図6C）。図6BはBG＋5％シュクロースでの細菌の増殖を示す。対抗選択sacB/シュクロースは48HのBbで機能性であるように見える。 B.ブロンキセプチカにおけるaroA欠失について、組み込まれたpPB1070自殺プラスミドの追加の機能的特徴付けを示す。BGプレートでの各クローン培養の連続希釈及びドット：カナマイシン（図6A）、シュクロース5％（図6B）、及びシュクロース10％（図6C）。図6CはBG＋10％シュクロースでの細菌の増殖を示す。対抗選択sacB/シュクロースは48HのBbで機能性であるように見える。 sacB/シュクロース対抗選択系を用いた、ΔaroA欠失変異体スクリーニングの結果を示す。図7Aのプレートは5％シュクロースを有する。 sacB/シュクロース対抗選択系を用いた、ΔaroA欠失変異体スクリーニングの結果を示す。図7Bは、図7Aに示したシュクロースプレートのレプリカプレート（カナマイシンを含む）である。 13の新規なH+（溶血性クローン）aroA遺伝子欠失B.ブロンキセプチカ変異体の種々の寒天プレートを用いた同定を示す。図8AのプレートはBG＋5％血液を有する（最上段）。 13の新規なH+（溶血性クローン）aroA遺伝子欠失B.ブロンキセプチカ変異体の種々の寒天プレートを用いた同定を示す。図8BのプレートはBG＋5％血液＋1ｘアロミクスを有する（中段）。 13の新規なH+（溶血性クローン）aroA遺伝子欠失B.ブロンキセプチカ変異体の種々の寒天プレートを用いた同定を示す。図8CのプレートはBG＋5％血液＋1ｘアロミクス＋1ｘカナマイシンを有する。 ボルデテラ・ブロンキセプチカのH+（溶血性クローン）aroA遺伝子欠失変異体の同定を示すゲルである。 13のΔaroA B.ブロンキセプチカクローンの変異状況を提示するPCRの結果を示す。 表示処置の実施に続いて病毒性B.ブロンキセプチカによる病毒性チャレンジを受けた後のイヌの臨床徴候を示すグラフである。 グループA及びCについてB.ブロンキセプチカの包括的臨床徴候を示すグラフである。 種々の培地で培養したB.ブロンキセプチカΔaroAの臨床スコアに関する結果を示す。 配列表を詳述する表を示す。

本開示は、aroA遺伝子によってコードされる芳香族アミノ酸の生成に肝要なタンパク質が、発現された場合に非機能性であるか、又は全く生成されないような変異又は欠失aroA遺伝子を有する、変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を提供する。変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、高度に病毒性の親株（例えば野生型株）から開始し、当該親株のaroA遺伝子を操作して1つ以上のヌクレオチドを変異又は欠失させることによって作製できる。驚くべきことに、本開示の変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は弱毒化されるが高度な免疫原性をなお維持し、したがって生免疫原性組成物、生弱毒化ワクチン、及びこれらを使用する方法における使用に適切である。
本開示の変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌、免疫原性組成物及びワクチンは、当業界に存在するものを超える多くの利益を提供することができる。
有利には、変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌株は動物内で複製できず、したがって当該動物から排出され得ない。したがって、変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌でワクチン免疫された動物は細菌を排出しない。

変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌はまた、経口ルートで動物にデリバリーされるとき、高度に防御性である免疫応答を安全にかつ効果的に誘発することができる。実際、変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ株の単一用量経口投与は、アジュバントの非存在下ですら防御性免疫を付与するために十分であり得る。これらの結果は以下の理由で驚くべきである：（i）当業者は、B.ブロンキセプチカの定着/増幅は細菌が防御性免疫応答を誘発するために必要であり、aroA変異/欠失はB.ブロンキセプチカのin vivo増幅能力を阻止すると信じていた；（ii）当業者は、B.ブロンキセプチカワクチンの経口投与は、鼻内ルートよりも顕著にかつ法外に効果が低いと予想していた（例えば、経口投与は存続可能/実行可能な選択肢ではなかった）；及び（iii）当業者は、従来技術のB.ブロンキセプチカワクチンは有効であるためにはアジュバントが必要であることを知っていた。
本開示の変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌の別の利点は、この細菌が非動物性トリプシン大豆ブロス（TSB-NA）で効果的に培養できるということである。最終的には免疫原性組成物及びワクチンとなる変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を培養するためにTSB-NAを使用することは、動物起源の物質（例えば動物血清）とは対照的に、偶発的因子による夾雑のリスクを軽減し、ワクチン成分のコストを削減し（動物由来材料は非動物性よりも高価である）、動物製品の品質における固有の変動性によるプロセス変動性を減少させることができる。

本開示及び特に特許請求の範囲及び/又はパラグラフで、用語、例えば“comprises”、“comprised”、“comprising”（“含む”）などは、米国特許法でそれらに帰するとされる意味を有することができ、例えば、それらは、“includes”、“included”、“including”（“含む”）などを意味することができ、さらに用語、例えば“consisting essentially of”及び“consists essentially of”（“本質的に～から成る”）は、米国特許法でそれらに帰するとされる意味を有することができ、例えば、それらは、明確に列挙されていない要素を許容するが、従来技術で見出されるか又は本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響を及ぼす要素を排除することが特記される。
特段の説明が無いかぎり、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する業界の業者の1人が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。単数形用語“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうでないことを示していないかぎり複数の指示対象を含む。同様に、単語“or（又は）”は、文脈が明瞭にそうでないことを示していないかぎり“and（及び）”を含むことが意図される。

本明細書で用いられるように、“動物”には哺乳動物が含まれる。動物は以下から選択できる：ウマ科の動物（例えばウマ）、イヌ科の動物（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ科の動物（例えばライオン、トラ、イエネコ、ヤマネコ、他の大型のネコ、及び他のネコ科の動物（チーター及びオオヤマネコを含む））、ヒツジ類（例えばヒツジ）、ウシ類（例えば畜牛）、ブタ類（例えばブタ）、鳥類（例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュー及びヒクイドリ）、霊長類（例えば原猿類、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿）。“動物”という用語はまた、全ての発育段階（新生期、胚性期及び胎児期を含む）における個々の動物を含む。
本明細書で用いられるように、“抗原”又は“免疫原”は、宿主動物で特異的な免疫応答を誘発する物質を意味する。抗原は、例えば生物体全体（殺滅、弱毒化又は生）、1つの生物のサブユニット又は部分、宿主動物への提示に際して免疫応答を誘発できるDNA片又はフラグメントなどを含むことができる。
“エピトープ”という用語は、特異的なB細胞及び/又はT細胞が応答する、抗原又はハプテン上の部位を指す。当該用語はまた、“抗原決定基”又は“抗原決定部位”と互換的に用いられる。同じエピトープを認識する複数の抗体は単純な免疫アッセイで同定することができ、前記免疫アッセイは、別の抗体と標的抗原との結合を阻止する1つの抗体の能力を示す。

本明細書で用いられるように、“aroA変異”細菌はaroA遺伝子において遺伝子変化を有する細菌であり、前記遺伝子変化は細菌のコリスミ酸生合成経路の障害をもたらす。aroA変異細菌は、コリスミ酸を合成できないか又は対応する野生型細菌よりも顕著に少ないコリスミ酸を合成し、結果として非補充培地、環境又は境遇で当該細菌の増殖の顕著な阻害及び/又は阻止を生じる。
本明細書で用いられるように、特段の指示がなければ“イヌ科の動物”という用語には、全ての飼い犬、キャニス・ルプス・ファミリアリス（Canis lupus familiaris）及びキャニス・ファミリアリス（Canis familiaris）が含まれる。
本明細書で用いられるように、ネコ科の動物という用語は、ネコ科の任意のメンバーを指す。この科のメンバーには野生、動物園、及び飼いならされたメンバー、例えばネコ亜科の任意のメンバー、例えばネコ、ライオン、トラ、ピューマ、ジャガー、ヒョウ、ユキヒョウ、パンサー、北米ピューマ（North American mountain lion）、チーター、オオヤマネコ、ボブキャット、カラカル又は前記の任意の雑種が含まれる。ネコはまたイエネコ、純血種及び/又は雑種コンパニオンネコを含み、ネコ、実験室ネコ、クローンネコ及び野生又は野生化ネコを示す。

本明細書で用いられるように、“遺伝子”という用語は広く用いられ、生物学的機能に関係するポリヌクレオチドの任意のセグメントを指す。
“単離された”生物学的成分（例えば核酸又はタンパク質又は細胞小器官）は、当該成分が天然に存在する生物の細胞内の他の生物学的成分（例えば他の染色体及び染色体外DNA及びRNA、タンパク質並びに細胞小器官）から実質的に分離され又は精製された成分を指す。“単離”た核酸及びタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。当該用語はまた、化学合成と同様に組換え技術によって調製される核酸及びタンパク質を包含する。
本明細書で用いられるように、遺伝子の“遺伝子変化”又は“変異”は、当該遺伝子における核酸の置換、欠失、及び/又は挿入を指す。

本明細書で用いられるように、“同一性”又は“配列同一性”は、2つ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち参照配列及び参照配列と比較される与えられた配列との間の関係を指す。配列同一性は、複数の配列を最適にアラインメントし、そのような配列鎖間の合致によって決定される最高度の配列類似性を達成した後で、当該与えられた配列を当該参照配列と比較することによって決定される。そのようなアラインメントでは、配列同一性は位置の一つずつについて確認され、例えば、ある特定の位置でヌクレオチドが同一であるならば当該配列は当該特定の位置で“同一”である。続いて、そのような位置同一総数を当該参照配列のヌクレオチド総数で割って％配列同一性が得られる。配列同一性は公知の方法によって容易に計算できる。前記方法には以下に記載されているものが含まれる（ただしそれらに限定されない）：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991；及びCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988。配列同一性を決定する好ましい方法は、被検配列間で最大の合致を生じるよう設計される。配列同一性を決定する方法はまた、与えられた配列間の配列同一性を決定する公開コンピュータプログラムで体系化されている。また別に本明細書で言及されるものの他に、以下のプログラムが挙げられる：BLAST、ギャップ付加BLAST、BLASTN、BLASTP、及びPSI-BLAST（生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）で提供される）。これらのプログラムは、本目的のために当業界で広く用いられ、2つのアミノ酸配列の相同領域をアラインメントすることができる。

本明細書で用いられるように、“免疫原性組成物”という用語は、免疫原性組成物を投与される宿主で免疫学的応答を誘発する少なくとも1つの抗原を含む組成物を指す。
本明細書で用いられるように、組成物又はワクチンに対する“免疫学的応答”は、問題の組成物又はワクチンに対する細胞性及び/又は抗体媒介性免疫応答の宿主における発達である。通常、“免疫学的応答”には以下の作用の1つ以上が含まれる（ただしそれらに限定されない）：問題の組成物若しくはワクチンに含まれる1つの抗原又は複数の抗原に対する特異的な、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、及び/又は細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は、新規感染に対する抵抗性が強化される、及び/又は疾患の臨床的重篤性が軽減されるような治療的又は防御的免疫学的応答を提示するであろう。そのような防御は、感染宿主が通常なら提示する症候及び/又は臨床的疾患の徴候の軽減又は欠如、感染宿主におけるより急速な回復期間及び/又は低下する病原体力価によって示され得る。
本明細書で用いられるように、“多価ワクチン”は、2つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。多価ワクチンは、典型的には2つ以上の異なる病原体に対して受容動物の免疫系を刺激することができる。

本明細書で用いられるように、“核酸”及び“ポリヌクレオチド”という用語は、直鎖状若しくは分枝状、一本鎖若しくは二本鎖、又は前記のハイブリッドであるRNA又はDNAを指す。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子若しくは遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナローグ、ウラシル、他の糖類及び連結基、例えばフルオロリボース及びチオレート、並びにヌクレオチド分枝を含むことができる。
本明細書で用いられるように、“医薬的に許容できる”及び“獣医的に許容できる”という用語は形容詞的に用いられ、修飾される名詞が医薬製品又は獣医用製品での使用に適切であることを意味する。前記が、例えば医薬品又は獣医用ワクチンの賦形剤を記述するために用いられるとき、当該賦形剤は、組成物の他の成分と適合し、意図される受容動物に有害ではないと特徴付けられる。
本明細書で用いられるように、“担体”という用語は、化合物がそれと一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。医薬的に許容できる担体は、無菌的液体、例えば水及び/又は油（石油、動物、植物又は合成起源のものを含む）、例えば落花生油、大豆油、鉱物油、ごま油などであり得る。水又は水溶液、食塩水溶液及びデキストロース水並びにグリセロール溶液を担体として用いることができる。
本明細書で用いられるように、“アジュバント”は、一連の免疫学的事象を促進又は増幅することができ、最終的にはより良好な免疫学的応答、すなわち抗原に対する統合的身体応答をもたらすことができる物質である。アジュバントは、一般的には免疫学的応答の発生に要求されないが、本応答を促進又は増幅する。

本明細書で用いられるように、“防御する”、“～に防御を提供する”、及び“防御を助ける”という用語は、いずれの感染適応症に対しても完全な防御を要求しない。例えば、“防御を助ける”とは、当該防御が十分であり、したがってチャレンジ後に根本的な感染の症候が少なくとも軽減されるか、及び/又は症候を引き起こす根本的な細胞的、生理学的又は生化学的原因若しくはメカニズムの1つ以上が軽減及び/又は除去されることを意味することができる。この文脈で用いられる軽減とは、単に感染の生理学的状態ではなく、感染の状態（感染の分子的状態を含む）との対比を意味する。
本明細書で用いられるように、“タンパク質”及び“ポリペプチド”という用語は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に用いられる。ポリマーは直鎖状でも分枝状でもよく、前記は、改変アミノ酸又はアミノ酸アナローグを含むことができ、さらにアミノ酸以外の化学的部分で中断されることがある。当該用語はまた、天然に若しくは介入によって（例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化によって）、又は任意の他の操作若しくは改変（例えば標識又は生物活性成分との結合）によって改変されてあるアミノ酸ポリマーを包含する。

本明細書で用いられるように、ポリヌクレオチドとの関連で“組換え体”という用語は、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味し、前記ポリヌクレオチドは天然に存在しないか、又は天然には見出されない配置で別のポリヌクレオチドと連結される。
“異種”は、比較されている実体と当該実体の残りのものとは遺伝的に別個の実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によってあるポリヌクレオチドが異なる供給源に由来するプラスミド又はベクターに配置されると、前記ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。その天然のコード配列から取り出されて当該天然の配列以外のコード配列と作動的に連結されたプロモータは異種プロモータである。
本明細書で用いられるように、“ワクチン”は、動物への投与のために適切な免疫原性組成物であり、前記は、動物に投与されるとき、野生型の病原性微生物の感染により生じる臨床的疾患の防御を最小限助けるために十分に強力である（例えば、臨床的疾患及び/又は臨床的疾患と関連する臨床徴候の治癒、緩和、防御、及び/又は予防を助けるために十分に強力である）免疫応答を誘発する。

組成物
本開示はaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を提供する。aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌はaroA遺伝子に遺伝子変化を有し、当該遺伝子変化は親株のaroA遺伝子（例えば正常なaroA遺伝子機能を示す病毒性野生型親株のaroA遺伝子）と比較した変化である。当該遺伝子変化は、aroA遺伝子によってコードされるポリペプチド又はタンパク質、好ましくは病毒性に関係するタンパク質及びポリペプチド（例えば3-ホスホシキミ酸1-カルボキシビニルトランスフェラーゼ）の発現及び/又は生物学的活性を低下又は停止させるために有効であり得る。当該遺伝子変化は、当該細菌の病毒性を弱毒化させるために（例えば当該細菌の病原性を低下又は停止させるために）有効であり得る。複数の実施態様において、遺伝子変化は、宿主に投与されたとき、たとえ細菌が弱毒化されていたとしても当該細菌の強力かつ長期間続く免疫応答刺激能力（例えば、B.ブロンキセプチカによるその後のチャレンジに対して防御を提供するために有効である免疫応答）に実質的な影響を生じない。
本開示の遺伝子変化はコード配列内で発生させてaroA遺伝子機能を破壊することができる。しかしながら、当該遺伝子変化は、aroA遺伝子機能の破壊のためにコード配列内に配置される必要はない。当該遺伝子変化はまた、aroA遺伝子発現の制御に必要とされるヌクレオチド配列において、例えば転写開始、翻訳及び転写終了を制御する領域で発生させることができる。したがって、以下もまた前記領域に含まれる：プロモータ及びリボソーム結合領域（一般的にはこれらの制御エレメントはコード配列の開始コドンの約60から250ヌクレオチド上流に存在する：Doree S M et al., J. Bacteriol. 2001, 183(6): 1983-9；Pandher K et al., Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613-9；Chung J Y et al., FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296）、転写終了因子（一般的には当該終了因子はコード配列又は遺伝子の終止コドンの下流の約50ヌクレオチド以内に配置される：Ward C K et al., Infect. Imm. 1998, 66(7): 3326-36）。オペロンの場合には、そのような制御領域はコード配列の上流に遠く離れて配置される。

複数の実施態様において、遺伝子変化は、親株aroA遺伝子の1つ以上のヌクレオチドの欠失、親株aroA遺伝子に現存するヌクレオチドと異なる1つ以上のヌクレオチドによる置換、及び/又は親株aroA遺伝子への1つ以上のヌクレオチドの挿入を含む。複数の実施態様において、遺伝子変化は親株aroA遺伝子の部分的欠失である（例えば変異ゲノムは部分的なaroA遺伝子を有する）。複数の実施態様において、遺伝子変化は、親株aroA遺伝子の完全な欠失である（例えば変異ゲノムはaroA遺伝子をもたない）。
好ましくは、親株は正常な構造及び機能を示すaroA遺伝子を有する（例えば、構造及び機能は野生型病毒性B.ブロンキセプチカ株と一致する）。本開示での使用に適切な親株には、例えば、下記の例に記載される株05の特徴の大半、好ましくは全てを示すB.ブロンキセプチカ株が含まれる。
複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、親株と対比してaroA遺伝子コードポリペプチドの発現低下を示すか、又はそれらはaroA遺伝子コードポリペプチドを全く発現できない。複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は親株と対比して遺伝子変化後に5％未満の残存aroA発現を有し、これは、変異細菌が親株と対比して5％未満のaroA遺伝子コードポリペプチドを発現することを意味する。複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は検出不能なレベルのaroAポリペプチドを発現する。

複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、親株のaroA遺伝子コードポリペプチドと対比して低下する生物活性を示す変異aroA遺伝子コードポリペプチドを発現するか、又は、それらは、生物学的活性を示すことができない（例えば完全に非機能性）変異aroA遺伝子コードポリペプチドを発現する。
複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、親株のaroA遺伝子コードポリペプチドと対比して遺伝子変化後に5％未満の残存生物学的活性を有する変異aroA遺伝子コードポリペプチドを発現し、これは、変異aroA遺伝子コードポリペプチドが親株由来の参照aroA遺伝子コードポリペプチドの生物学的活性の5％未満を有することを意味する。複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、検出不能レベルの生物学的活性を有するaroA遺伝子コードポリペプチドを発現する。
複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、配列番号:3に示す配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、若しくは99.9％同一性を有するポリヌクレオチド、又は配列番号:3に示す配列と100％同一性を有するポリヌクレオチドを含む。複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、配列番号:3に示す配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、若しくは99.9％同一性を有するポリヌクレオチド、又は配列番号:3に示す配列と100％同一性を有するポリヌクレオチドを含むaroA遺伝子座を有する。複数の実施態様において、配列番号:3と一定の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、好ましくは弱毒化表現型を有し、経口的に動物に投与されたときにはその動物において防御性免疫応答を安全に誘発することができるか、及び/又は配列番号:3によってコードされる機能性と同じ機能性をコードする。比較し得る機能の例には、同じ酵素反応の触媒能力/無能力及び同じ構造性役割の提供能力/無能力が含まれる。

複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は溶血活性を示す。複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は弱毒化されている。
複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は、受託番号I-5391の下に2018年12月20に国立細胞培養集積所（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM））に寄託された株である。
複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は非動物系培地で培養され、したがって動物起源の物質を含まない。複数の実施態様において、非動物系培地はトリプシン大豆ブロス非動物性（TSB-NA）培地である。複数の実施態様において、非動物系培地（例えばTSB-NA）でのaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌の培養は、動物起源の物質を含む培地中の変異細菌の培養と対比して偶発的因子による夾雑のリスクを減少させる。複数の実施態様において、非動物系培地中のaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌の培養は、動物に経口投与したときに防御性免疫応答を誘発する細菌の能力に負の影響を与えない。
本開示はまた、本開示の任意のaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を含む免疫原性組成物及びワクチンを提供する。複数の実施態様において、本免疫原性組成物及びワクチンは、動物に投与されるとき、その動物（例えばイヌ科の動物又はネコ科の動物）に免疫応答を誘発し、誘導し、及び/又は刺激するために有効である。複数の実施態様において、本免疫原性組成物及びワクチンは、弱毒化されたaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を含む。

複数の実施態様において、本免疫原性組成物及びワクチンは一価であり、唯一の抗原としてaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を含む。
複数の実施態様において、本免疫原性組成物及びワクチンは多価であり2つ以上の抗原を有するが、抗原の少なくとも1つは本開示のaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌であることを条件とする。複数の実施態様において、多価免疫原性組成物及びワクチンは、第二の抗原として非ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を含む。複数の実施態様において、多価免疫原性組成物及びワクチンは、第二の抗原として非ボルデテラ・ブロンキセプチカイヌ抗原を含む。
複数の実施態様において、多価免疫原性組成物及びワクチンは、第二の抗原としてイヌパラインフルエンザウイルス（CPIV又はPIV5）抗原を含む。複数の実施態様において、イヌパラインフルエンザウイルス抗原は不活化及び/又は弱毒化ウイルス全体である。本開示の抗原として使用される適切なCPIVウイルスの例には下記の表1に挙げられるものが含まれる。この表はRimaらの論文に由来し、当該論文はイヌPIV5の多数の配列を提供する（Rima, B. K., et al. “Stability of the Parainfluenza Virus 5 Genome Revealed by Deep Sequencing of Strains Isolated from Different Hosts and Following Passage in Cell Culture.”Journal of Virology, vol. 88, no. 7, 2014, pp. 3826-3836, doi:10.1128/jvi.03351-13）。表1のGenBankアクセッション番号の各々は、Rimaらの論文と同様に参照によってその全体が本明細書に包含される。CPIV配列はまたWO 2000/77043 A2（Fischer, et al）に開示されている（前記は参照によってその全体が本明細書に包含される）。Rimaらの論文（Rima et al., Journal of Virology, vol. 88, no. 7, 2014）に記載されているように、イヌパラインフルエンザウイルスは高度に保存され、したがって下記のいずれも本発明で用いることができる。

表1：CPIV配列（CPIVは時にPIV5と称されるが、同じウイルスである）

複数の実施態様において、多価免疫原性組成物及びワクチンは、第二の抗原としてイヌアデノウイルス（CAV）抗原を含む。複数の実施態様において、イヌアデノウイルス抗原は不活化及び/又は弱毒化ウイルス全体である。本開示で抗原として用いられる適切なCAVウイルスの例には、イヌアデノウイルス1型（CAV-1）及びイヌアデノウイルス2型（CAV-2）が含まれる。本発明のワクチン組成物で用いられるこれらの病原体の抗原は、改変生ウイルス調製物又は不活化ウイルス調製物の形態であり得る。これらのウイルスの病毒株を弱毒化する方法及び不活化ウイルス調製物を作製する方法は当業界で公知であり、例えば米国特許4,567,042号及び4,567,043号に記載されている。また別には、CAV2の免疫原若しくは抗原又はCAV2免疫原のエピトープ（例えばキャプシド、マトリックス又はヘキソンタンパク質）を用いてもよい。

複数の実施態様において、本開示のワクチンは、動物に投与したとき安全かつ有効にB.ブロンキセプチカに対して防御性免疫応答を誘発し、したがってその後に続くB.ブロンキセプチカ感染及び疾患に関連する臨床的症候を軽減及び/又は予防することができるように処方される。複数の実施態様において、本開示のワクチンは、後にB.ブロンキセプチカに暴露されたときにB.ブロンキセプチカの臨床徴候及び病変の重篤性を低下させ、B.ブロンキセプチカの増殖速度を低下させ、及び/又は死亡を予防するために有効である防御性免疫応答を誘発することができる。
複数の実施態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル、及び/又は賦形剤を含む。医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル、及び/又は賦形剤は、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌の効果的な投与を促進する任意の化合物又は化合物の組合せであり得る。

医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル、及び/又は賦形剤は当業者には周知である。例えば、医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤は、0.9％NaCl（例えば生理食塩水）溶液又はリン酸緩衝液であり得る。用いることができる他の医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル、及び/又は賦形剤にはポリ-(L-グルタミン酸)又はポリビニルピロリドンが含まれるが、ただし前記に限定されない。適切なアジュバントには以下が含まれ得る：（1）アクリル酸又はメタクリル、無水マレイン酸のポリマー、及びアルケニル誘導体ポリマー、（2）免疫刺激配列（ISS）、例えば1つ以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（“CpG Motifs Present in Bacterial DNA Rapidly Induce Lymphocytes to Secrete Interleukin 6, Interleukin 12 and Interferon γ.” Molecular Medicine Today, vol. 2, no. 6, 1996, p. 233; WO98/16247）、（3）水中油エマルジョン、例えば以下の文献（“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995）の147ページに記載のSPTエマルジョン及び同文献の183ページに記載のエマルジョンMF59、（4）第四アンモニウム塩を含む陽イオン脂質、例えばDDA、（5）サイトカイン、（6）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、（7）サポニン、又は（8）これらの任意の組合せ又は混合物。

複数の実施態様において、免疫原性組成物及びワクチンは粘膜基底層を貫通する吸収の改善を促進する粘膜アジュバントを含む。粘膜アジュバントのいくつかの例には、キトサン、MPL、LKT63、毒素、PLGマイクロ粒子、及びいくつかの他のものが含まれる（Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627；Lubben, Inez M Van Der, et al. “Chitosan and Its Derivatives in Mucosal Drug and Vaccine Delivery.” European Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 14, no. 3, 2001, pp. 201-207；Patel et al. “Chitosan: A Unique Pharmaceutical Excipient.” Drug Delivery Technol., 2005; Majithiya et al. “Enhancement of Mucoadhesion by Blending Anionic, Cationic and Nonionic Polymers.” Drug Delivery Technol., 2008；又はMajithiya, J., et al. “Efficacy of Isavuconazole, Voriconazole and Fluconazole in Temporarily Neutropenic Murine Models of Disseminated Candida Tropicalis and Candida Krusei.” Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 63, no. 1, 2008, pp. 161-166；US Patent Serial No. 5,980.912）。
複数の実施態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、アジュバントフリーであり（すなわちアジュバントを含まず）、動物に投与したとき有効かつ安全である。複数の実施態様において、免疫原性組成物及びワクチンは動物起源物質フリーである（すなわち動物起源物質を含まない）。

複数の実施態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、ワンショット投与（例えば一剤型の1回限り投与）用に処方される。複数の実施態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、マルチショット投与（例えば1つの単一剤形の複数投与、複数剤形の複数投与）用に処方される。
複数の実施態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、動物（例えばイヌ科の動物又はネコ科の動物）への経口投与のために処方される。複数の実施態様において、免疫原性組成物及びワクチンは経口投与のための液体用量として処方される。複数の実施態様において、当該液体剤形は瓶又はピペット中の液体であり得る。複数の実施態様において、液体用量剤形は、一般に0.1から10.0mL、0.2から5.0mL、0.1から1.0mL、又は0.5mLから1.0mLの用量体積を有し得る。一用量の体積は、動物一体に一度に投与される免疫原性組成物及びワクチンの総体積を指す。
複数の実施態様において、液体用量剤形は、1用量当たり1ｘ10³ CFUから1ｘ10¹⁰ CFU、1用量当たり1ｘ10⁴ CFUから1ｘ10⁶ CFU、1用量当たり1ｘ10⁶ CFUから1ｘ10⁸ CFU、1用量当たり1ｘ10⁸ CFUから1ｘ10¹⁰ CFU、1用量当たり1ｘ10⁴ CFUから1ｘ10⁵ CFU、1用量当たり1ｘ10⁵ CFUから1ｘ10⁶ CFU、1用量当たり1ｘ10⁶ CFUから1ｘ10⁷ CFU、1用量当たり1ｘ10⁷ CFUから1ｘ10⁸ CFU、1用量当たり1ｘ10⁸ CFUから1ｘ10⁹ CFU、又は1用量当たり1ｘ10⁹ CFUから1ｘ10¹⁰ CFUの量のaroA変異ブロンキセプチカ細菌を含むことができる。

複数の実施態様において、液体剤形は、イヌパラインフルエンザウイルス抗原（例えば生又は弱毒化全イヌパラインフルエンザウイルス）を、1用量当たり約6log10 DICC50から約8log10 DICC50、好ましくは1用量当たり6.7log10 DICC50から約7log10 DICC50の範囲の量で含むことができる。
複数の実施態様において、液体剤形は、イヌアデノウイルス抗原（例えば生又は弱毒化イヌアデノウイルス全体）をある量で含むことができ、弱毒化CAV-2は、少なくとも1用量当たり約6log10 DICC50から約8log10 DICC50、好ましくは1用量当たり6.5log10から約6.7log10 DICC50の範囲の量であるべきである。
本開示はまたaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を含むキットを提供する。複数の実施態様において、当該キットは、本明細書に記載の任意のaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌、免疫原性組成物、又はワクチンを収納するバイアルを含む。複数の実施態様において、当該キットは、プライム-ブースト投与レジメンを用いる使用が意図され、プライム投与工程で使用される本開示の第一のワクチン又は免疫原性組成物を収納する第一のバイアル、及びブースト投与工程で使用される本開示の第二のワクチン又は免疫原性組成物を収納する第二のバイアルを含む（第一及び第二のワクチン又は免疫原性組成物は同じであっても異なっていてもよい）。

使用方法
本開示はまた、本開示のaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌、免疫原性組成物、及び/又はワクチンを用いて動物において免疫応答を誘発する方法を提供する。複数の実施態様において、動物は成熟動物である。複数の実施態様において、動物は幼若動物である。複数の実施態様において、動物は0から6ヶ月齢、1から4ヶ月齢、又は2から4ヶ月齢である。
複数の実施態様において、提供されるものは、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を含む免疫原性組成物を動物に投与する工程を含む、動物においてB.ブロンキセプチカに対して免疫応答を誘発する方法である。複数の実施態様において、免疫原性組成物はさらに、医薬的に又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル、及び/又は賦形剤を含む。複数の実施態様において、動物はイヌ科の動物又はネコ科の動物である。複数の実施態様において、免疫原性組成物は経口的に投与される。複数の実施態様において、免疫原性組成物はアジュバントを含まない。複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は弱毒化されている。

複数の実施態様において、提供されるものは、有効量のaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を含むワクチンを動物に投与する工程を含む、動物においてB.ブロンキセプチカに対する防御性免疫応答を誘発する方法である。複数の実施態様において、ワクチンはさらに、医薬的に又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル、及び/又は賦形剤を含む。複数の実施態様において、動物はイヌ科の動物又はネコ科の動物である。複数の実施態様において、ワクチンは経口的に投与される。複数の実施態様において、ワクチンはアジュバントを含まない。複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌は弱毒化されている。複数の実施態様において、動物はボルデテラ・ブロンキセプチカに対してワクチン接種/免疫される。複数の実施態様において、防御性免疫応答は、その後に続く病毒性B.ブロンキセプチカ感染、並びに感染に関連する臨床的疾患及び症候に対する防御を動物に提供するために有効である。
複数の実施態様において、免疫応答を誘発する方法及び防御性免疫応答を誘発する方法は、プライム-ブーストレジメンを用いることができる。プライム-ブーストレジメンは最初のプライミング投与及びブースター投与を含む。典型的には、最初の投与で用いられる免疫原性組成物又はワクチンは、ブースター投与で用いられるものと本来相違する。しかしながら、同じ組成物/ワクチンをプライミング投与及びブースター投与で用いてもよい。複数の実施態様において、プライム-ブーストレジメンは、好ましくは1から6週間離して、2から5週間離して、2から3週間離して、又は3から4週間離して実施される投与を利用する。

製造方法
本開示はまたaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を作製する方法を提供する。複数の実施態様において、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を作製する方法は以下の工程の1つ以上を含む：（i）ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌のコリスミ酸生合成経路の障害を生じる遺伝子変化をボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌親株のaroA遺伝子に導入する工程、及び/又は（ii）ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌親株からaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を単離する工程。複数の実施態様において、遺伝子変化は、親株のaroA遺伝子から1つ以上のヌクレオチドの欠失、親株のaroA遺伝子に存在するヌクレオチドと異なる1つ以上のヌクレオチドによる置換、及び/又は親株のaroA遺伝子への1つ以上のヌクレオチドの挿入を含む。複数の実施態様において、遺伝子変化は、親株のaroA遺伝子の部分的欠失である（例えば変異ゲノムは部分的aroA遺伝子を有する）。複数の実施態様において、遺伝子変化は、親株のaroA遺伝子の完全な欠失である（例えば変異ゲノムはaroA遺伝子をもたない）。好ましくは、親株は、正常な構造及び機能（例えば野生型病毒性B.ブロンキセプチカ株と一致する構造及び機能）を示すaroA遺伝子を有する。本開示で使用される適切な親株には、下記実施例に記載する株05の特徴の大半、好ましくは全てを示すB.ブロンキセプチカ株が含まれる。
本開示はまた、aroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を増殖させる方法を提供する。複数の実施態様において、当該方法は、非動物系培地中でaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ細菌を培養する工程を含む。複数の実施態様において、当該非動物系培地はトリプシン大豆ブロス非動物性（TSB-NA）である。
本発明はこれから下記の非限定的な例によってさらに記載されるであろう。

B.ブロンキセプチカ株の特徴付け
多様な単離株を総括して、どの単離株が新規なイヌ注射可能（不活化、弱毒化又はその両方）ボルデテラ・ブロンキセプチカワクチンの開発に有用であるかを決定した。内部収集物の16の単離株の特徴付けを実施した。前記特徴付けには、増殖評価、溶血活性、病毒性/免疫原性因子産生の制御及び分子型判定が含まれる。株の各々についてワクチン処方物の安全かつ有効な成分としての潜在能力を評価した。
ブタ、イヌ及びヒト起源の16のメリアル（Merial）B.ブロンキセプチカ単離株（表2に掲載）を特徴付けのために選択した。比較のために、2つのコントロール株を全ての実験に加えた。

表2：16のB.ブロンキセプチカ単離株及びそれらの起源

表3：検査の説明

16株のうち10株が37℃で溶血を示した。16単離株のうち6株が非溶血性であった（02、03、11、12、15及び16）。これらのデータは、アデニル酸シクラーゼ活性の測定及びAC-HLYタンパク質の免疫検出と相関する。株02、03、11、12はcya遺伝子を欠くが、一方、15及び16はおそらく非病毒相IVで固定されている。
当該結果は、全ての被検単離株は富裕化培地で増殖し、この培地ではそれらの間で世代時間に有意な相違は存在しないことを示した。BteA及びFHAは、古典的なvag発現条件下で15及び16を除き全ての単離株によって産生された。PRNは、06、10、15及び16を除き全ての単離株によって産生された。濃厚BG又は合成SS培地での病毒性因子の産生は、両培地について検査した全ての株について同様であった。病毒性因子発現の制御は16株のうち12株について“古典的”であり、25℃で及びMgSO₄又はニコチン酸存在下で抑制された。2つの株（09及び05）はそれぞれ病毒性因子の部分的な構成的発現を示した。2つの株（15及び16）は病毒性因子産生の完全な抑制を示した。それらは非病毒相IVに切り替わったと考えられ（Monack et al., 1989, Mol. Microbiol. 3: 1719）、それらはvag抑制相に固定され、検査条件が何であれ病毒性決定基を全く発現しないことを意味する。TSBでの増殖は、SS培地での増殖よりもこれらの培地で検査した単離株で2から3ｘ速かった。BteA及びPRNの産生はSSと比較して全体的に低いように思われる。Fim2は16単離株の8単離株によって産生される。いずれの単離株もFim3を産生しなかった。

当該結果は、10単離株は“古典的”な運動性の制御を提示し、25℃で運動性であるが37℃ではそうでないことを示した。株05は混合運動表現型を示し、運動性はある種の条件下でのみ（それぞれMgSO₄又は25℃）抑制解除され、vag遺伝子の半構成的発現と相関する（vrg遺伝子の系統的抑制解除はない）。06及び10の両方がfla遺伝子の変異のために同様に非運動性であった。15及び16は構成的に運動性で、それらはvrg発現（非病毒相IV）で固定されるという上記の観察と一致する。
16単離株は、7つの異なるPGFEグループ（AからG）及び4つの異なる配列型又はSTにクラスター化される。株15及び16はウサギ起源の参照RB50と一緒のグループに分けられた。株02、03、11、12はST27に属する。この系統の1つの特殊性は、記載されたようにcya遺伝子座のptpによる置換である（Buboltz et al. 2008. J. Bacteriol. 190:5502）。したがって、これらの4株は溶血活性を示さず、むしろ他の病毒性因子の産生の関係で“古典的行動態様”を示した。これらの株についてcya遺伝子座のptpオペロンによる置換はPCRによって確認された。
分子型判定試験及び配列分析は下記の実施例2でさらに記載される。
マウスでのLD50の結果は下記の表4に示される。

表4：マウスに対するLD50

全ての被検株は、それらの構成的制御又は鞭毛及びペルタクチンの有無に応じて類似の病毒性を示した。
結論：株05及び09は、それらは共に、重要な抗原性決定基でもある病毒性因子の発現について部分的又は完全に構成的であるために強力なワクチン株候補と考えられた。株02、03、11及び12はcya遺伝子座を欠き（ST27株の典型的な特徴）、したがって溶血活性を全く示さない。さらにまた、06及び10は共に非運動性でありペルタクチンを発現しないが、それにもかかわらず病毒性のままである。重要な事に、全ての分析が06及び10は同一の行動態様をとることを示し、複数の継代を通して当該株の背景には大きな変化が無いことを明示している。
株15及び16は構成的に運動性であり、被検条件が何であれ病毒性因子を全く発現しなかった。それらは非病毒相IVに切り替わったと考えられ、それらはvag抑制相で固定されて被検条件が何であれ他の病毒性因子のいずれも発現しないことを意味する。これらの株は構成的に病毒性抑制遺伝子を発現し、したがって全ての被検条件で運動性を示す。したがって、これらの株はマウスで非病毒性であるための良好な候補株であった。

親B.ブロンキセプチカ株（株05）のaroA遺伝子の欠失
B.ブロンキセプチカのaroA遺伝子欠失は当該変異体で栄養要求性を生じる。この型の欠失変異体は、細菌増殖のために3つの不可欠の芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）が補充されないときにはin vivoで又はin vitroの増殖培地で増殖できない。
要旨：本実施例では、ボルデテラ・ブロンキセプチカaroA欠失変異体を作製した。遺伝子改変（完全aroA遺伝子欠失）を実施するために用いた方法論は、操作した自殺プラスミドpPB1070に基づく（図1参照）。このプラスミドは大腸菌で複製するが、B.ブロンキセプチカでは複製しなかった。このプラスミドは、ColE1複製起点、カナマイシン遺伝子耐性、B.ブロンキセプチカのポーリンプロモータ下に配置されたsacB遺伝子（対抗選択系として）及び欠失カセットを含んでいた。欠失カセットは5’（下流遺伝子）及び3’（上流遺伝子）でaroA遺伝子にフランキングする2つの遺伝子のみを含んでいた。aroA遺伝子は6Xポリストップで取り替えられた。
pPB1070プラスミドはエレクトロポレーションによってB.ブロンキセプチカ株05に導入され、aroA遺伝子座の5’末端又は3’末端における第一の組換え事象に続いて染色体に組み込まれた（図2参照）。このプラスミドの組込みはまた“ポップイン（pop in）”と称される。当該形質転換クローン（組込みクローン）は部分二倍体と称され、前記はカナマイシン耐性（Km^R）かつシュクロース感受性（Suc^S）となった。第二の組換え事象は細菌の増殖中に無作為に発生し、野生型株（aroA ⁺ ）又はaroA欠失変異体（ΔaroA）（カナマイシン感受性（Km^S）かつシュクロース耐性（Suc^R））のどちらかの可能な単離をもたらす。前記は、この第二の組換え事象に続く染色体からのpB1070プラスミドの脱落の低下によると予想される（図3参照）。遺伝子特異的PCRは所望のB.ブロンキセプチカaroA欠失変異体の同定を可能にした。これは完全なaroA遺伝子座の配列決定（aroA遺伝子の欠如及びpB1070プラスミドの欠如）によって確認される。

B.ブロンキセプチカでのaroA欠失についてpB1070自殺プラスミドの大腸菌での機能的特徴付け：大腸菌複製性プラスミド＝SacB/シュクロース毒性の多コピー作用（＝対抗選択系）。図4Aから4Dに示すように、自殺プラスミドpB1070はB.ブロンキセプチカ（Bb）に首尾よく組み込まれた。したがって、このプラスミドを用いて、他のBb株（H+親株を含む）からaroA遺伝子を迅速に欠失させることができる。
B.ブロンキセプチカでのaroA欠失について組み込まれたpB1070自殺プラスミドのB.ブロンキセプチカでの機能的特徴付け（sacBはポーリンプロモータの制御下に配置）：B.ブロンキセプチカ染色体に組み込まれたプラスミド＝SacB/シュクロース毒性の一コピー作用（＝対抗選択系）。図5A－5C及び図6A－6Cに示す結果によって提示されるように、シュクロースに対する高い感受性は、5logを超える部分二倍体の生存率低下を示す対抗選択系の上首尾の機能性とつり合う。それら部分二倍体のBGプレート＋5％及び10％シュクロースで増殖する能力について、部分二倍体クローン培養の希釈及びドット体積を試験し、PCRによって確認した。
SacB/シュクロース対抗選択系を用いるΔaroA欠失変異体のスクリーニング：図7A－7Bに示すように、高い感受性を有するB.ブロンキセプチカは、10μLの部分二倍体をBTS＋アロミクス（1X）中で増殖させ5％シュクロースプレートに広げたとき、シュクロース耐性である約100 CFUを生じることが示された。カナマイシン含有及び非含有BGプレートでのレプリカプレートアッセイ（図7B）によれば、非感受性クローンは当該CFUの96％を占めた。最後に、SucR及びKmS遺伝子特異的PCRによって、当該96 CFUは、“ポップアウト（pop out）”クローンであり、100％溶血性である組換え体を生じることが確認された。
最適なaroA変異体単離条件の同定：図8に示すように、クローン#2は、aroA欠失、溶血性H+の変異体であった。本実施例のB.ブロンキセプチカゲノムからaroAが欠失したとき、aroA遺伝子座全体は野生型aroA遺伝子座（3.6kb）と比較して2.3kb小さかった。B.ブロンキセプチカについて1つのaroA遺伝子欠失変異体H+を入手する頻度は1/10⁶足らずであり、したがって、例えば本実施例の100％機能的対抗選択系のような技術を用いて1つのaroA変異体さえも入手することは到底あり得なかった。
結論：13の新規なaroA遺伝子欠失、H+のB.ブロンキセプチカ変異体を操作し、さらに特徴付けた。PCR及び/又は配列決定によって確認されたように、クローン1、2、3、4、5、6、7、8、10、14、16、17及び19は、ΔaroA欠失変異体B.ブロンキセプチカであった（図9参照）。これらのクローンは全てH+であり、H+ CFUを単離するために1X及び2Xアロミクス補充BG＋血液上でストリークし、その後で液体培養を開始し続いて-70℃で保存した（図10参照）。一般に液体培養は単離クローンで実施し、培養は、1）BTS、2）BTS＋1Xアロミクス、及びBTS＋2Xアロミクス中で37℃にて180rpmで増殖させ、1.0－1.3辺りのOD₆₉₄で採集した。最後に、H+活性アッセイは、10^-6希釈の150のアリコットをBG＋血液＋1Xアロミクス上に広げることによって、各培養条件から生じたもので実施した。

BbΔaroA経口ワクチンの有効性
目的及び試験の概要：Bb陰性のイヌに20日離して2回免疫した後のボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bb）（L1aroA）ワクチン候補の有効性を評価するために、低用量（5ｘ10⁴ CFU/用量）を皮下にデリバリーし、高用量（3－5ｘ10⁹ CFU/用量）を経口的にデリバリーした。最後のワクチン接種から7日後の試験によって有効性を評価した。非ワクチン接種グループと比較して臨床徴候を評価した。全てのイヌは、ワクチン接種前（D-2）に陰性及びチャレンジ前（T-1）に陰性と決定された。表5は実験設計を示す。
増殖条件及び細菌力価：aroA遺伝子欠失、H+変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ（L1aroA）を1Xアロミクス補充液体培地TBS（トリプシン大豆ブロス）でlog期のほぼ終わりまで200rpmの攪拌下に37℃で培養した。この時点で、培養物は694nmで約1.2のOD（OD₆₉₄＝1.2）を有し、これは5ｘ10⁹ CFU/mLに近い細菌力価に相当する。これらの結果は培養として約12－13時間に相当する。次に、フローサイトメトリーを用い並行して培養物を滴定し、続いて目標力価に希釈した。ワクチン細菌数計測及び溶血反応をBG（ボルデージャング）寒天＋5％ヒツジ血液＋1Xアロミクスで実施した。同様に、ワクチン接種と並行してワクチンの純度を試験した。
表5：実験設計

*ワクチン接種前又はチャレンジ前；Bb懸濁物の実際の力価：グループA Vacc1：1.4ｘ10⁵ CFU/mL；グループA Vacc2：0.86ｘ10⁵ CFU/mL；グループB Vacc1：3.5ｘ10⁹ CFU/mL；グループB Vacc2：2.61ｘ10⁹ CFU/mL

チャレンジ株：チャレンジBb株を1/50接種物から37℃の液体培地（TBS）で200rpmで振盪しながら増殖させてG4世代を調製した。G4増幅を約7.30時間後に停止させて、FACSにより直ちに培養物を滴定し目標力価に希釈した。並行して、5％ヒツジ血液（Biomerieux）補充BG寒天に培養物を広げて37℃で48時間インキュベートし、コロニーの均質性及び外観（滑らかで小さな灰色のコロニー）及びそれらの溶血性特徴もまた見極めた。約100％のコロニーが溶血性表現型を発現した。並行して、寒天上での滴定を実施して、FACS決定力価を確認した。
動物：ビーグル犬、鼻スワブのqPCRによりBb陰性及び血清抗Bb抗体陰性、0日目に9から12週齢。前記動物をD0前に任意抽出し、それらの出生日及びqPCR Bb力価にしたがって6匹のイヌの2グループ及び5匹のイヌの1グループに分けた。
ワクチン接種前（D0）に、グループAの全てのイヌの肩甲骨間一帯の毛を剃った。試験直前にワクチン株を調製した。ワクチン接種日に、約10⁵ CFU/mL及び3－5ｘ10⁹ CFU/mLのワクチン株の10mLを調製し氷上に静置した。接種物のアリコットを滴定した（FACS及びボックス計測）。良好な全身状態及び非高体温のイヌにのみワクチン接種した（興奮に関連する高体温を除く：ただしT℃＞39.5℃は警戒及び対応を要する）。グループA：D0及びD20に、グループAの全てのイヌの皮下に0.5mLのワクチンBb aroA（約10⁵ CFU/mL）を接種した。グループB：D0及びD20に、グループBの全てのイヌに経口的に1mLのBb aroA（約3－5ｘ10⁹ CFU/mL）をワクチン接種した。グループC：動物にはワクチン接種を実施しなかった。

表6：高体温の結果

全てのコントロールが高体温（RT＞39.5℃）をチャレンジ後少なくとも3日間示した。グループAでは、6匹のうち4匹のイヌが1、2又は4日間正確に高体温を示した。グループBでは、2匹のイヌが一度正確に高体温を示した。

表7：全てのコントロールはUSDA（“累積して2日以上の日数にわたって突発性（spontaneous）咳”）及び欧州薬局方評価項目の両方にしたがってチャレンジの有効性を立証した。

表8：チャレンジ後の臨床徴候（T0－T14のデータ）。USDA基準：コントロールのイヌの少なくとも75％が連続して2日以上にわたって突発性咳を生じる。

図11は、表示の処置、続いて病毒性B.ブロンキセプチカによる病毒性チャレンジを実施した後のイヌの臨床徴候を示す。

経口B.ブロンキセプチカΔaroAの有効性
目的：高用量（10⁹ CFU/mL用量）の候補ワクチン（aroA欠失ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bb ΔaroA））の経口ルートによるワンショットワクチン免疫の有効性を評価する。
表9：実験設計－1回限り経口ワクチン免疫

^*ワクチン接種又はチャレンジ前
チャレンジ株：上述したように調製した。
動物：ビーグル犬、鼻スワブのqPCRによりBb陰性及び血清抗Bb抗体陰性、0日目に9から12週齢。前記動物をD0前に任意抽出し、それらの出生日及びqPCR Bb力価にしたがって5匹のイヌの2グループ及び5匹のイヌの1グループに分けた
臨床徴候の結果：イヌが連続して2日以上にわたって突発性咳を生じる場合（AM及び/又はPM）、イヌはBb感染による疾患を有すると分類される（USDA 評価項目定義による）。
表10：臨床徴候の結果

チャレンジに対する臨床的防御は全身臨床スコアによって両ワクチングループで確認した（図12）。
要旨：本開示の弱毒化B.ブロンキセプチカ株の有効量を含む経口デリバリーワクチンは防御を生じさせることができた。

ボルデテラ・ブロンキセプチカ：2つのΔaroA二価ワクチンの2つの製造プロセスの比較
目的：経口ルートによる1ショットのワクチン接種後に2つの異なるΔaroAワクチン（異なる製造プロセス）の有効性を評価する。
第一のワクチンはコーヘン・ホイーラー（Cohen Wheeler）（CW）培地で調製した（Cohen SM, Wheeler MW. Pertussis Vaccine Prepared with Phase-I Cultures Grown in Fluid Medium. Am J Public Health Nations Health. 1946 Apr.; 36(4):371-376）。第二の培地は非動物トリプシン大豆ブロスで調製した（下記実施例6参照）。合計18匹のSPFのイヌ（9－12週齢）を齢及び性別により6匹の3グループに任意抽出した。両ワクチンはまた下記に記載するように生、弱毒化CPIV（PIV5）抗原を含んでいた。

表11：実験設計－2つのΔaroAワクチンの比較

最終チャレンジ用量/チャンバー

イヌパラインフルエンザウイルスワクチン（PIC）の調製：PIC（CPIV）ワクチン株を含むバイアルの最初の懸濁物（力価8.7 log10 DICC50/mL）をチューブを転がすことによって均質化させた。凍結氷中で全てのカップを再構築した。力価は、Karberの方法によって細胞培養50％の感染用量として計算する（Karber G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Archiv f experiment Pathol u Pharmakol. 1931; 162:480-483（連続薬理学試験の共通処置（Archive for Pathol and Pharmac experiment）に寄稿）。
ワクチン懸濁物PIC（目標力価6.4 log10 DICC50/mL、最初の懸濁物の1/200希釈）は以下の二工程を含む。工程1（1/10に希釈）：最初の懸濁物の1mLを9mLのSRLで溶解させる（PIC0懸濁物）、工程2（1/20に希釈）：工程1で得られた懸濁物の4mLを76mLのSRLで溶解させる（PIC1懸濁物）。
最終懸濁物として80mLのPIC懸濁物（6.4 log10）が得られ、31mLのPIC 6.4 log10を瓶に残す（溶液B1）。1mLのPIC（6.4 log10）を取り出す（-70℃で維持）。別の瓶に体積を残す（溶液A1）。
最終ワクチン懸濁物の調製：対応するワクチン懸濁物の調製直後に各グループのイヌにワクチン接種した。各工程で、チューブを転がすことによって懸濁物を均質化させた。
全ての工程を凍結氷及びPSM中で再構築した。
ワクチン懸濁物A2（グループA）：各々0.4mLのA1溶液を有する64バイアルのワクチンBb CWを64ボトル一緒にプールし、得られた懸濁物を均質化した：ワクチン懸濁物A2（前記は約25mLのBb（8.5 log10/mL）及びPIC（6.4 log10/mL）を含む。懸濁物A2の1mLを取り出した（-70℃で維持）。3.3mL/A2懸濁物/イヌでグループAのイヌをワクチン免疫した。
ワクチン懸濁物B2（グループB）：各々1mLのSRLを有する2バイアルのワクチンBb BTSをプールして均質化した。最初の懸濁物の1/2希釈：先の工程で得られた1mLを1mLのSRLと一緒にする（B0懸濁物）。1/32希釈：1mLのB0懸濁物を31mLの溶液B1に入れる：ワクチン懸濁物B2は32mLのBb（8.5 log10/mL）及びPIC（6.4 log10/mL）を含む。懸濁物B2の1mLを取り出した（-70℃で維持）。3.3mL/B2懸濁物/イヌでグループBのイヌをワクチン免疫した。
イヌを任意抽出して異なる噴霧化チャンバー及びセッションに置き、したがって各チャンバーは各処置グループでほぼ等しい割合の動物を収容した。

表12.チャレンジ前のイヌの状態

TSB-NA及びCW培地の二価ワクチンの臨床スコアに関する結果：図13は、種々の培地で培養したB.ブロンキセプチカΔaroAの臨床スコアに関する結果を示す。チャレンジはコントロールで検証された。Bb TSBワクチンはコントロールと比較して臨床徴候の強い軽減を誘発した。Bb CWはコントロールと比較して臨床徴候を軽減しなかった。

表13：種々の培地で培養したB.ブロンキセプチカΔaroAのイヌにおける結果

本試験は、aroA変異Bbは二価設定（すなわちイヌパラインフルエンザウイルスとの組合せ）で投与したとき経口ルートによりイヌを防御することを示す。さらに重要なことに、本試験でグループBワクチンは、動物起源の一切の物質を含まないTSB-NA培地で培養されたBb aroAを含む。したがって、このワクチンは、より広い防御及び偶発因子による夾雑のより低いリスクを提供する。
CW培地で製造されたグループAは防御性ではなく、選択した製造培地がB.ブロンキセプチカチャレンジに対して防御するワクチンの能力を温存するか否かは予想できないことを示した。チャレンジに対する臨床的防御は、全身臨床スコアによってワクチングループBで確認された(表13)。
要旨：イヌパラインフルエンザウイルスと組合わされ、さらにTSB-NA培地で製造された、本開示の弱毒化B.ブロンキセプチカ株の有効量を含む経口投与二価ワクチンは、広い防御を誘発することができる。非動物製品の使用は偶発的因子による夾雑のリスクを減少させる。

非動物起源のトリプシン大豆ブロス（TSB-NA）でのボルデテラ・ブロンキセプチカΔaroAの培養
目的：非動物起源のトリプシン大豆ブロスで強溶血性B.ブロンキセプチカΔaroAを培養する。
ボルデテラ・ブロンキセプチカΔaroAの培養物をろ過トリプシン大豆ブロス培地非動物起源（TSB-NA、Acumedia.comから購入できる）中で増殖させ、続いて安定剤と70/30（v/v）％で混合した。
培地の調製：非動物起源のTSB（TSB-NA）を製造業者の指示にしたがって調製した。
種フラスコ：TSB-NAを製造業者の指示にしたがって調製し、0.2μmの孔サイズのフィルターでろ過滅菌した。滅菌TSB-NAの1000mLを無菌的な3Lの通気キャップ付き使い捨てエーレンマイヤーフラスコに注いだ。当該培地を37℃で少なくとも12時間維持して、無菌的であることを検証した。接種直前に、無菌的ピペットを用いて10mLのろ過滅菌100ｘC AroMixを種フラスコに無菌的に添加した。融解したX+3バイアルから1mLをフラスコに接種した。当該フラスコを200RPMのシェーカー上で37℃にて12から18時間インキュベートした。種培養物のOD₆₀₀が2.5±1.0になったとき、発酵装置に接種した。播種密度は種培養物OD₆₀₀＝1で2.75％v/vに正規化した。接種体積は以下の等式を用いて計算した：110/OD₆₀₀種フラスコ＝接種体積（mL）。適切な体積の種培養物を無菌的な瓶にディップチューブアッセンブリーを用いて移し、蠕動ポンプを用いて発酵装置に接種した。
生産発酵：7Lの発酵装置を用意し、オートクレーブで最少限30分滅菌する。調製し滅菌した4.0LのTSB-NAを無菌的発酵装置に加えた。培地を含む発酵装置を少なくとも12時間37℃、0.5vvmの通気（2SLPM）及び200RPMの攪拌でインキュベートした。温度設定点に達し安定したとき、pHを外部pHメーターでチェックしてプロセス設定点に調整した。エレクトロニックゼロ（アンプラグケーブル）を用いDOプローブでゼロ較正を実施し、続いて2SLPMでの曝気及び200RPMでの攪拌で100％に設定した。接種直前に、40mLの無菌的100xC Aromixを無菌的に添加した。セクション3.2.1.2に記載した種培養物を容器に接種した。37℃で約24h EFTで培養した。30％酵母抽出物フィードの700±50mLがデリバリーされたとき、培養物を採集した。

培養条件及び発酵は生産発酵装置を制御する：作業体積：4L。温度：37℃±0.2。pH：7.2±0.1（パイレックス瓶/チューブ装置中の400mLの5N乳酸を用いて維持）。攪拌：200RPM－600RPM（自動的に調整されDO設定点が維持される）。曝気：最初0、続いて培養がDO＝30％の時に0.5vvm（2SLPM）で一定。圧：n/a。溶解酸素（DO）：一定の曝気、調節可能攪拌及び純粋O₂の補充により40％に維持。BioXpertプログラム：aroA_Feed_4L（Applikon Biotechnology）。フィード：レシピにしたがって開始され、50mL/hの速度で30％Bacto酵母抽出物の供給が9h EFTで始まる。
発酵終了：発酵終了は、700±50mLの酵母抽出物フィードがデリバリーされる約24時間の発酵時間で到達した。バキュテーナー（商標）を用いて発酵装置からサンプルを採取した。OD₆₀₀を調べた。約800mLの細胞培養ブロスを無菌的な1L瓶に採集した。600mLの最終ワクチン体積のために、420mLの細胞培養ブロスを安定化剤と70/30（v/v）％で混合した。混合培養物は、凍結乾燥前に穏やかに攪拌しながら最大で3日間4℃で保存された。凍結乾燥前に、確保後に混合培養物についてCFU試験を実施した。凍結乾燥後サンプルは純度、CFU、及び溶血活性について試験した。
プロセスモニタリング：ログオンラインデータにBioXpertソフトウェアを提供した。BioXpertレシピ：Bordetella_aroA。以下を含むタイムコースデータを記録した：サンプル時間、pH、温度、溶解酸素、発酵中のインペラ速度（バッチ記録を用いる）。
凍結乾燥：採集時に、TSB-NAの細胞培養ブロス420mLを以前に規定したペプトンシュクロース安定化剤（表14）とともに調合し、4℃で混合しながら最大で3日間保存した。目標最大時間（filling time）は調合後24時間であった。調合は表14に示すように実施した。

表14：凍結乾燥調合

混合培養物を攪拌しながら、ワクチンをバイアルあたり1.1mLで充填した。約500個の3cc混合バイアルを充填しGEA凍結乾燥装置にローディングした。ローディング時にトレーから10バイアルを取出すことによって凍結乾燥前試験を実施し、凍結乾燥前のCFU（5バイアルをプール）、pH、密度、浸透圧及びTgを試験した。表15に示すように経口用B.ブロンキセプチカAFQ2株のために開発されたサイクルを用いてワクチンを凍結乾燥させた。

表15：凍結乾燥サイクル工程、温度及び圧

凍結乾燥後、バイアルにラベルを付け、蓋をして、表16に概略するように試験した。

サンプリング：表16は、B.ブロンキセプチカΔaroA発酵バッチのサンプリングプロセスを示す。発酵装置のサンプル採取はインキュベーション前、発酵過程の特定時期、及び発酵終了時（HV）に実施した。HVサンプルでCFUを実施した。周期的に顕微鏡検査及びストリークｗ培養を実施して、無菌性をチェックし微生物の形態を観察した。採集後に、CFUについて凍結乾燥前及び凍結乾燥後サンプルを試験した。

表16：B.ブロンキセプチカΔaroA発酵バッチのサンプリングプロセス

評価基準/データ分析/統計：結果の解釈はデータ分析を基準にした。TBS-NA培養物について10¹⁰ CFU/mLより高いCFU収量が得られた。凍結乾燥による損失を計算し、損失は凍結乾燥前から凍結乾燥後で0.5 log₁₀未満であった。
*******
本発明の好ましい実施態様を詳細にこれまで記載してきたが、本発明の趣旨又は範囲を外れることなく多くの明白な改変が可能であるので、上記に明示した発明は上記に示される具体的詳細に限定されるべきではないことは理解されるべきである。

Claims (20)

1. 動物に経口的に投与したとき、当該動物においてB.ブロンキセプチカ（B. bronchiseptica）感染に対する防御性免疫を誘発することができる弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株。
2. 部分欠失aroA遺伝子を有する、請求項1に記載の弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株。
3. aroA遺伝子の完全な欠失を有する、請求項1に記載の弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株。
4. 配列番号:3と少なくとも85％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株。
5. CNCM 受託番号 I-5391のもとに寄託されている、請求項1に記載の弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株。
6. 動物に経口的に投与したとき免疫応答を誘発することができる弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株を含む、免疫原性組成物。
7. さらに、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル及び/又は賦形剤を含む、請求項6に記載の免疫原性組成物。
8. アジュバントを含まない、請求項6に記載の免疫原性組成物。
9. 経口投与のための一用量処方物である、請求項6に記載の免疫原性組成物。
10. 一用量処方物が、1ｘ10³ CFUから1ｘ10¹⁰ CFUの弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株を有する、請求項9に記載の免疫原性組成物。
11. 一用量処方物が、1ｘ10⁸ CFUから1ｘ10¹⁰ CFUの弱毒化aroA変異B.ブロンキセプチカ株を有する、請求項9に記載の免疫原性組成物。
12. さらにイヌパラインフルエンザウイルス抗原を含む、請求項6に記載の免疫原性組成物。
13. さらにイヌアデノウイルス抗原を含む、請求項6に記載の免疫原性組成物。
14. 動物起源の物質を含まない、請求項6に記載の免疫原性組成物。
15. ワクチンである、請求項6に記載の免疫原性組成物。
16. B.ブロンキセプチカに対する防御性免疫応答を誘発する方法であって、有効量のaroA変異ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）細菌株を含む経口ワクチンを動物に投与する工程を含む、前記方法。
17. 動物がイヌ科の動物又はネコ科の動物である、請求項6に記載の方法。
18. 防御性免疫応答が、病毒性B.ブロンキセプチカ感染、病毒性B.ブロンキセプチカ感染に関連する臨床的疾患、及び/又は病毒性B.ブロンキセプチカ感染に関連する臨床的症候に対する防御を動物に提供するために有効である、請求項16に記載の方法。
19. プライム-ブースト投与レジメンを採用する、請求項16に記載の方法。
20. 動物が0から6ヶ月齢である、請求項19に記載の方法。

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