CN104854128A - 牛流感病毒组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了已从牛物种中分离的C型流感病毒。C型流感病毒多核苷酸和多肽也已得到鉴定。本发明还描述了免疫原性组合物，以及诊断试剂盒和检测方法。

Description

牛流感病毒组合物

技术领域

本发明涉及微生物学和免疫学领域，特别涉及病毒和包含其的免疫原性组合物。具体地，它涉及从牛中分离的C型流感病毒。本文还公开了C型流感病毒多核苷酸和多肽。最后，本发明公开了诊断试剂盒和检测方法。

背景技术

牛呼吸道疾病(BRD)复合物是肉牛工业最显著的健康问题。在1991年，由于治疗成本、生产损失和死亡，发生估计$624,000,000的损失。BRD复合物是多因素感染，具有许多促成病原体，为病毒和细菌两种。

含有负义基因组的有包膜单链RNA的病毒科分类为具有不分段基因组的组(副粘液病毒科、弹状病毒科)或具有分段基因组的组(正粘病毒科、布尼亚病毒科和沙粒病毒科)。正粘病毒科仅含有流感病毒，为A、B和C型。

流感病毒颗粒由含有分段单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋核衣壳)和内部由基质蛋白(M)衬里的外部脂蛋白包膜组成。A型流感的分段基因组由线性、负极性、单链RNA的八个分子(C型流感为七个)组成，所述单链RNA编码十种多肽，包括：RNA指导的RNA聚合酶蛋白质(PB2、PB1和PA)和形成核衣壳的核蛋白(NP)；基质蛋白(M1、M2)；从脂蛋白包膜伸出的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)(这是C型流感病毒缺乏的)；以及其功能未知的非结构蛋白质(NS1和NS2)。基因组的转录和复制在核中发生，并且装配经由在质膜上出芽而发生。病毒可在混合感染期间重配基因。

C型流感病毒在该属中仅具有被称为“C型流感病毒”的一个物种。C型流感病毒已从人和猪中分离出。A和B型流感病毒为通常被称为“流行性感冒”的感染的成因剂，所述流行性感冒可产生寒战、发热、咽喉痛、肌肉痛、头痛、咳嗽、虚弱/疲乏和全身不适的临床症状。然而，与A或B型相比较，C型流感病毒是罕见的，并且在人中引起轻度上呼吸道感染或感染是不明显的。

发明内容

本申请人已惊讶地鉴定并且在本文中公开了从牛中分离的C型流感病毒。本文公开且提供了所述牛C型流感病毒的多核苷酸和多肽，以及含有所述多核苷酸和或所述多肽的免疫原性组合物。本发明还提供了检测牛C型流感病毒的诊断试剂盒和方法。

在一个实施例中，本公开提供了分离的牛C型流感病毒。

在另一个方面，本发明提供了包含分离的C型流感病毒的组合物，其中所述病毒包含下述基因区段中的至少一种：编码与SEQ ID NO：4具有大于52％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：6具有大于72％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：8具有大于50％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：10具有大于54％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：12具有大于40％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQID NO：14具有大于36％同一性的蛋白质的核酸；和编码与SEQ ID NO：16具有大于33％同一性的蛋白质的核酸。

在另一个方面，本发明提供了包含分离的核酸的组合物，其中所述分离的核酸包含下述核酸中的一种或多种：编码与SEQ ID NO：4具有大于52％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：6具有大于72％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：8具有大于50％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：10具有大于54％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：12具有大于40％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：14具有大于36％同一性的蛋白质的核酸；和编码与SEQ ID NO：16具有大于33％同一性的蛋白质的核酸，其中SEQ ID NO：4编码C型流感“PB2”蛋白质；SEQ ID NO：6编码C型流感“PB1”蛋白质；SEQ ID NO：8编码流感“PA”蛋白质；SEQ ID NO：10编码C型流感“HE”蛋白质；SEQ ID NO：12编码C型流感“N”蛋白质；SEQ ID NO：14编码C型流感“M”蛋白质；而SEQ ID NO：16编码C型流感“NS1”蛋白质。

在另外的方面，本发明提供了包含牛C型流感病毒的免疫原性组合物、表达载体和宿主细胞，和/或根据本发明的先前提及方面的氨基酸和/或核酸。

在另外一个方面，本发明提供了治疗由C型流感病毒引起的疾病或使动物免于由C型流感病毒引起的疾病的方法，该方法包括给动物施用包含该病毒的免疫原性组合物，或根据上文公开的本发明方面的一种或多种核酸序列或者一种或多种氨基酸序列。

在其他方面，本发明提供了诊断试剂盒和方法，以及可用于此类方法和试剂盒的抗体和/或核苷酸引物。更具体而言，在一些方面，本发明提供了检测动物对C型流感病毒的暴露的方法，所述方法包括测定来自动物的样品中SEQ ID NO：3；5；7；9；11；13；和15中任何一种或多种的存在。

在另一个方面，本发明提供了检测动物对C型流感病毒的暴露的方法，所述方法包括测定来自动物的样品中SEQ ID NO：4；6；8；10；12；14；和16中任何一种或多种的存在。

在另外一个方面，本发明提供了与分离的牛C型流感病毒特异性结合的抗体。

在另一个方面，本发明还提供了与来自多肽的表位特异性结合的抗体，所述多肽选自SEQ ID NO：4；6；8；10；12；14；和16-20的多肽。

附图说明

图1是分离的牛C型流感病毒的电子显微照片。

具体实施方式

本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献均以引用方式全文并入。

下述定义可应用于实施例的说明中采用的术语。下述定义替代以引用方式并入本文的每个个别参考文献中含有的任何矛盾定义。

除非本文另有定义，否则与本实施例结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。

如本文使用的，当与可测量的数字变量结合使用时，术语“约”或“大约”意指所示的变量值，以及在所示值的实验误差内的所有变量值(例如在平均值的95％置信区间内)，或在所示值的10％内，无论哪个值更大。

如本文使用的，术语“佐剂”意指修改其他试剂例如药物或免疫原性组合物的效应的药理学或免疫学试剂。佐剂通常包括在免疫原性组合物中，以增强接受者对所供应抗原的免疫应答。关于佐剂的更多描述参见下文。如本文使用的，术语“氨基酸”指天然存在和合成氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及以后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)，非天然氨基酸例如α和α二取代氨基酸、N-烷基氨基酸及其他非常规氨基酸，也可为本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸及其他类似氨基酸和亚氨基酸。

氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，所述基本化学结构即与氢结合的碳、羧基、氨基和R基。示例性氨基酸类似物包括例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的必需化学结构。氨基酸模拟物指如下化学化合物，其具有的结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。

氨基酸在本文中可通过其由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的通常已知的三字母符号或其单字母符号提及。

如本文使用的，术语“保守氨基酸置换”指关于给定氨基酸残基的任何氨基酸置换，其中置换残基在化学上如此类似于给定残基，使得不产生多肽功能的实质降低(例如酶促活性)。保守氨基酸置换是本领域通常已知的，并且其例子例如在美国专利号6,790,639、6,774,107、6,194,167或5,350,576中描述。在优选实施例中，保守氨基酸置换将是在下述六组之一中发生的任何一种置换：

·小的脂肪族、基本上非极性残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；

·大的脂肪族、非极性残基：Ile、Leu、Val和Met；

·极性、带负电的残基：Asp和Glu；

·极性、带负电的残基的酰胺：Asn和Gln；

·极性、带正电的残基：Arg、Lys和His；以及

·大的芳香族残基：Trp、Tyr和Phe。

在优选实施例中，保守氨基酸置换将是作为天然残基(保守置换)对列出的下述中的任何一种：Ala(Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gln；His)；Asp(Glu)；Gln(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gln；Glu)；Met(Leu；Ile)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)；和Val(Ile；Leu)。

如本文使用的，术语“动物”意指对被牛C型流感病毒感染敏感的驯养和野生的任何动物，包括哺乳动物。优选地，如本文使用的，“动物”指牛。

如本文使用的，术语“抗体”意指借助于表位的识别能够与抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由“轻”和“重”多肽链组成的血清蛋白质，其具有“恒定区”和“可变区”，并且基于恒定区的组成分类(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。对于给定抗原“特异性”的抗体指示抗体的可变区专一地识别且结合特定抗原。抗体可为多克隆混合物，或为单克隆的。它们可为源自天然或重组来源的完整免疫球蛋白，或可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体可以多种形式存在，包括Fv、Fab’、F(ab’)2、Fc，以及单链。抗体可转换为抗原结合蛋白质，所述抗原结合蛋白质包括但不限于抗体片段。如本文使用的，可互换使用的术语“抗原结合蛋白质”、“抗体”等等指包含抗原结合位点的一种或多种多肽或其片段。术语“抗原结合蛋白质”或“抗体”优选指单克隆抗体及其片段，以及其可与特定蛋白质及其片段结合的免疫学结合等价物。如本文使用的，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，还涵盖其片段。为了本发明的目的，“抗体”和“抗原结合蛋白质”还包括抗体片段，除非另有说明。示例性抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb、双抗体、其抗原识别片段、小分子免疫药物(SMIP)纳米抗体、IgNAR(免疫球蛋白新抗原受体)分子等等，均由本领域技术人员识别为抗原结合蛋白质或抗体片段，以及上述片段及其化学或遗传处理的配对物中任一种，以及其他抗体片段及其突变体，包含抗体部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构造。抗体和抗原结合蛋白质可例如经由下述进行制备：常规杂交瘤技术(Kohler等人，Nature 256：495-499(1975))、重组DNA方法(美国专利号4,816,567)或使用抗体文库的噬菌体展示技术(Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991))。对于多种其他抗体生产技术，参见Antibodies：ALaboratory Manual，Harlow等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，1988以及本领域技术人员众所周知的其他技术。

在抗体结合背景下的术语“特异性结合”、“特异性地结合”或“与……特异性结合”指抗体与特异性抗原即多肽或表位的高亲合力和/或高亲和力结合。特异性结合抗原的抗体强于相同抗体与其他抗原的结合。与多肽特异性结合的抗体可能能够以弱的仍可检测的水平(例如与目的多肽显示结合的10％或更少)结合其他多肽。例如通过使用适当对照，此类弱结合或背景结合可容易地与主题多肽的特异性抗体结合区分。一般而言，特异性抗体以K_d为10^-7M或更少，例如10^-8M或更少，例如10^-9M或更少、10^-10或更少、10^-11或更少、10^-12或更少或10^-13或更少等的结合亲和力与抗原结合。

如本文使用的，“抗原”意指含有一个或多个表位(线性、构象或两者)的分子，在暴露于受试者后，所述分子将诱导对于该抗原特异性的免疫应答。表位是与T细胞受体或特异性B细胞抗体结合的特定抗原位点，并且通常包含约3至约20个氨基酸残基。术语“抗原”还可指亚单位抗原(与抗原在自然界中与之结合的完整生物体分开且不连续的抗原)以及被杀死、减毒或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其他微生物。术语“抗原”还指抗体，例如抗独特型抗体或其片段，以及可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟表位(mimotope)。术语“抗原”还指例如在DNA免疫接种应用中，在体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸。如本文使用的，“抗原”是能够由抗体或抗原结合蛋白质特异性结合的分子或分子的一部分。特别地，抗体或抗原结合蛋白质将与抗原的表位结合。如本文使用的，表位指由抗体或抗原结合蛋白质的可变区的高变区或互补决定区(CDR)识别的抗原决定簇。除非另有说明，否则如本文使用的术语“表位”指牛C型流感病毒的区域，所述区域将与本发明的抗体特异性结合。

如本文使用的，术语“牛”意指体型中等至大型的有蹄类的多样化群体，一般具有偶蹄并且性别中的至少一种具有真正的角。牛包括但不限于驯养牛、野牛、非洲水牛、水牛、牦牛和四只角或螺旋角羚羊。

如本文使用的，术语“诊断”意指某一事物例如疾病的性质和/或原因的鉴定，或可用于作出此类鉴定的试剂盒。

如本文使用的，术语“基因区段”意指其为病毒基因组的一部分的核酸小片。在流感病毒的情况下，它们含有七个或八个基因区段，其中一些含有超过一种基因。由基因区段组成的病毒基因组全是DNA或全是RNA。

如本文使用的，术语“异源的”意指并非天然存在的元件的组合。例如，异源DNA指并非天然位于细胞中或细胞中的染色体位点处的DNA。异源DNA还可包括对细胞外源的基因。“异源表达调节元件”或“异源启动子”是与其在自然界中与之结合的基因不同的基因可操作地结合的元件。如本文使用的，“异源核苷酸序列”指如下核苷酸序列，其通过重组方法加入本发明的核苷酸序列中，以形成并非在自然界中天然形成的核酸。此类核酸可编码嵌合和/或融合蛋白/多肽。因此，异源核苷酸序列可编码含有调节和/或结构特性的肽/蛋白质。

如本文使用的，术语“宿主细胞”意指具有质粒、载体或病毒的原核或真核细胞。此类细胞可包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞和哺乳动物细胞(例如鼠、大鼠、猿猴或人)。术语“宿主细胞”可意指能够支持病毒复制的任何个别细胞或细胞培养物。就质粒和载体而言，“宿主细胞”是任何个别细胞或细胞培养物，其可为或已为载体的接受者或用于掺入外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质的接受者。它还预期包括单一细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可不一定在形态中或者在基因组或总DNA互补体中与原始亲本细胞完全相同。“宿主细胞”意欲包括任何个别细胞或细胞培养物，其可为或已为载体的接受者或用于掺入外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质的接受者。它还预期包括单一细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态中或者在基因组或总DNA互补体中)。如本文使用的，术语“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。

如本文使用的，术语“同一性”意指两个核苷酸或蛋白质序列不变的程度。如本文使用的，术语“相似性”或“同源性”意指核苷酸或蛋白质序列与之相关的程度。两个序列之间的相似性程度可基于序列同一性和/或保守性百分比。除指示为保守氨基酸外的氨基酸可在蛋白质或酶中不同，使得在具有相似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可改变，并且如根据比对方案测定的，可为例如至少70％、75％、80％、85％、90％和95％。

如本文使用的，术语“免疫原性组合物”意指当单独或与药学可接受的载体一起施用于动物时，生成免疫应答(即，具有免疫原性活性)的组合物。免疫应答可为主要由细胞毒性T细胞介导的细胞免疫应答，或主要由辅助T细胞介导的体液免疫应答，所述辅助T细胞依次又活化B细胞，从而导致抗体生产。此外，可生成特异性T淋巴细胞或抗体，以允许免疫接种的宿主的未来保护。

如本文使用的，术语“C型流感病毒”或“流感病毒C型”意指在正粘病毒科内的属，其包括可引起通常被称为“流行性感冒”的流感的那些病毒。

如本文使用的，术语“分离的”意指从它通常在其中发现的环境取出的提及的材料。因此，分离的生物材料可不含细胞组分，即材料在其中发现或产生的细胞的组分。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括例如PCR产物、分离的mRNA、cDNA或限制片段。在另一个实施例中，分离的核酸优选从它可在其中发现的染色体中切除，并且更优选不再与非调节、非编码区连接，或者当在染色体中发现时，不再与位于核酸分子的上游或下游的其他基因连接。在另外一个实施例中，分离的核酸缺乏一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入质粒、粘粒、人工染色体等等的序列。因此，在特定实施例中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白质可与它在细胞中与之结合的其他蛋白质或核酸或两者结合，或如果它是膜结合蛋白质，则与细胞膜结合。分离的细胞器、细胞或组织从它在生物体中在其中发现的解剖部位中取出。分离的材料可以但无需是纯化的。“分离的”或“纯化的”多肽或多核苷酸，例如“分离的多肽”或“分离的多核苷酸”纯化至超过它在自然界中存在的状态。例如，“分离的”或“纯化的”多肽或多核苷酸可基本上不含来自蛋白质或多核苷酸源自其的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白质，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。具有小于约50％非抗原结合蛋白质(在本文中也被称为“污染蛋白质”)或化学前体的抗原结合蛋白质制剂视为“基本上不含的”。40％、30％、20％、10％且更优选5％(按干重计)的非抗原结合蛋白质或化学前体视为基本上不含的。

如本文使用的，术语“可操作地连接”意指核酸分子例如DNA或RNA以及一种或多种调节表达元件(例如启动子或其一部分连同或不连同增强子，内部核糖体进入位点(IRES)或其他表达调节元件以这样的方式连接，以便当适当分子与调节序列结合时，允许由核酸分子转录RNA，或允许核酸分子的产物(即多肽)表达。调节表达元件可构建为生成以正或负方向的一种或多种双链或单链核酸。

如本文使用的，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”意指由在链中键合的两个或更多个氨基酸组成的有机聚合物分子。术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为线性或分支的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可由非氨基酸间断。该术语还包含已天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述修饰例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或者任何其他操作或修饰，例如与标记组分缀合。在该定义内还包括了例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文使用的，术语“质粒”意指无需成为其宿主细胞的染色体的一部分而稳定遗传的遗传元件。质粒可包含DNA或RNA，并且可为线性或环状的。质粒编码确保其在细胞复制期间的复制和稳定遗传的分子，并且可编码具有医学、农业和环境重要性的产物。质粒可作为载体广泛用于分子生物学中，以克隆和表达重组基因。

如本文使用的，术语“多核苷酸”或“多核苷酸分子”意指由在链中共价键合的核苷酸单体组成的有机聚合物分子。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有不同生物功能的多核苷酸的例子。术语“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”等等在本文中可互换使用，并且指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)。核酸可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。术语“核酸”包括例如单链和双链分子。核酸可为例如基因或基因片段、外显子、内含子、DNA分子(例如cDNA)、RNA分子(例如mRNA)、重组核酸、质粒及其他质粒、引物和探针。包括5′至3′(有义)和3′至5′(反义)多核苷酸两者。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物内的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可在聚合物装配前或后赋予。核苷酸序列可由非核苷酸组分间断。多核苷酸还在聚合后例如通过与标记组分缀合进行修饰。其他类型的修饰包括例如“加帽”(天然存在的核苷酸中的一种或多种由类似物置换)，核苷酸间修饰例如具有不带电连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺(phosphoamidate)、氨基甲酸酯(cabamate)等)和具有带电荷连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修饰，含有悬垂部分例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的那些修饰，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些修饰，含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些修饰，含有烷基化剂的那些修饰，具有经修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些修饰，以及这些多核苷酸的未经修饰的形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基均可被替换为例如膦酸基、磷酸基，被标准保护基保护，或被活化以制备与另外核苷酸的另外连接、或者可缀合至固相载体上。5’和3’端OH可被磷酸化或者替代为胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分。其他羟基也可被衍生化为标准的保护基。多核苷酸也可含有本领域一般已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如，2′-0-甲基、2′-0-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖、碳环糖类似物、异头糖、差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及脱碱基核苷类似物例如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可替换为可替代连接基团。这些可替代连接基团包括但不限于，其中磷酸酯替换为P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、″(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)的实施例，其中每一R或R′均独立地是H或是取代的或未取代的烷基(1-20C)，任选含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。并非多核苷酸中的所有连接均必须是相同的。前面的描述适用于在本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

如本文使用的，术语“预防”或“防止”等等意指抑制微生物的复制，抑制微生物的传播，或抑制微生物在其宿主中建立自身。这些术语等等还可意指抑制或阻断一种或多种感染体征或症状。

如本文使用的，术语“重组蛋白质”或“重组体”意指源自细胞的蛋白质、肽或多肽以及用于产生其的技术，所述细胞被编码所需蛋白质、肽或多肽的外源DNA构建体转化。

术语“治疗有效量”(或“有效量”)指当施用于受试者或患者时，足以实现有益或所需结果的活性成分例如根据本发明的试剂的量。有效量可在一次或多次施用、施加或剂量中施用。根据本发明的组合物的治疗有效量可由本领域普通技术人员容易地决定。

如本文使用的，术语“治疗”或“处理”涵盖疾病或障碍的完全治疗谱。例如，本发明的“治疗”剂可以预防或防止的方式起作用，或处理可导致预防或防止的效应，包括掺入设计为靶向可鉴定为处于危险中的动物的操作的那些处理(药物遗传学)；或以在性质中是改善或治愈的方式起作用；或可作用于减慢被治疗疾病或障碍的至少一种症状的进展速率或程度。

如本文使用的，术语“载体”指能够携带且转移它已与之连接的另一多核苷酸片段或序列从一个位置(例如宿主或系统)到另一个位置的多核苷酸分子。该术语包括用于体内或体外表达系统的载体。例如，本发明的载体可采取“质粒”的形式，所述质粒指通常附加型地维持、但也可整合到宿主基因组内的环状双链DNA环。本发明的载体还可采取线性形式。此外，本发明预期包括发挥等价功能并且从今以后变得本领域已知的其他载体形式。

如本文使用的，术语“兽医学可接受的载体”指这样的物质，所述物质在合理医学判断范围内，适用于与动物组织接触，而无过度毒性、刺激、变应性应答等等，与合理的利益风险比相称，并且对于其预期用途有效。

提供下述说明书以帮助本领域技术人员实践本发明。即使如此，本说明书也不应解释为不适当地限制本发明，因为在本文讨论的实施例中的修饰和变化可通过本领域普通技术人员作出，而不背离本发明发现的精神或范围。

病毒；免疫原性组合物

在本发明的某些实施例中，C型流感病毒已从牛中鉴定且分离以及表征。C型流感病毒的分离物保藏于ATCC，并且已指定登录号PTA-13105。

在一个方面，本发明的C型流感病毒表征为含有下述核酸序列中的至少一种：编码PB2蛋白质、PB1蛋白质、PA蛋白质、HE蛋白质、N蛋白质、M蛋白质和NS1蛋白质的核酸序列。这七种的任何组合也由本发明涵盖。

本发明的HE蛋白质包含SEQ ID NO：20或者与SEQ ID NO：20至少93.2％相同、或至少95.5％相同、或至少98％相同的氨基酸序列。

在一些实施例中，本发明的HE蛋白质包含SEQ ID NO：18或至少78％相同且84％相似的序列。在一些实施例中，与SEQ ID NO：18的同一性为至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％，并且与SEQID NO：18的相似性为至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％，任选地，条件是SEQ ID NO：18的氨基酸36-79与SEQ ID NO：20至少93.2％相同、或至少95.5％相同、或至少98％或100％相同。

在另外其他实施例中，本发明的HE蛋白质包含SEQ ID NO：19或至少63％相同且85％相似的序列。在一些实施例中，与SEQ ID NO：19的同一性为至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％，并且与SEQ ID NO：19的相似性为至少90％、或至少95％、或至少99％。

在其他实施例中，本发明的HE蛋白质包含与SEQ ID NO：10至少54％相同的氨基酸序列，优选地，条件是SEQ ID NO：10的氨基酸58-136包含SEQ ID NO：18，或至少78％相同且84％相似的序列。在一些实施例中，与SEQ ID NO：18的同一性为至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％，并且与SEQ ID NO：18的相似性为至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％，任选地，条件是SEQ ID NO：18的氨基酸36-79与SEQ ID NO：20至少93.2％相同、或至少95.5％相同、或至少98％或100％相同。

HE蛋白质还可通过如下另外或可替代条件表征：它的氨基酸539-598包含SEQ ID NO：19或至少63％相同且85％相似的序列。在一些实施例中，与SEQ ID NO：19的同一性百分比为至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％，并且与SEQ ID NO：19的相似性为至少90％、或至少95％、或至少99％。

优选地，编码HE蛋白质的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：10至少60％相同或与SEQ ID NO：10至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或100％相同的序列。

在另一个方面，M蛋白质表征为包含SEQ ID NO：17，或至少67％相同且92％相似的序列。在一些实施例中，与SEQ ID NO：17的同一性为至少70％、或至少75％、至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％，并且与SEQ ID NO：17的相似性为至少95％、或至少99％。此外，C型流感病毒的M蛋白质可表征为包含与SEQ ID NO：14至少36％相同的氨基酸序列。在不同实施例中，同一性可为与SEQ ID NO：14至少40％或至少45％、或至少50％或至少55％、至少60％或至少65％、至少70％或至少75％、至少80％或至少85％、至少90％或至少95％、至少99％或100％的同一性。

编码PB2蛋白质的氨基酸表征为与SEQ ID NO 4具有至少52％同一性。在某些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO：4至少55％或至少60％或至少65％、或至少70％或至少75％、或至少80％或至少85％、或至少90％或至少95％、或至少99％或100％的同一性。

编码PB1蛋白质的氨基酸表征为与SEQ ID NO 6具有至少72％同一性。在某些实施例中，同一性百分比为与SEQ ID NO：6至少75％、或至少80％或至少85％、或至少90％或至少95％、或至少99％或100％的同一性。

编码PA蛋白质的氨基酸表征为与SEQ ID NO 8具有至少50％同一性。在某些实施例中，同一性为与SEQ ID NO：8至少55％或至少60％或至少65％、或至少70％或至少75％、或至少80％或至少85％、或至少90％或至少95％、或至少99％或100％的同一性。

编码N蛋白质的氨基酸表征为与SEQ ID NO 12具有至少40％同一性。在某些实施例中，同一性为与SEQ ID NO：12至少45％、或至少50％或至少55％或至少60％或至少65％、或至少70％或至少75％、或至少80％或至少85％、或至少90％或至少95％、或至少99％或100％的同一性。

编码NS1蛋白质的氨基酸表征为与SEQ ID NO 16具有至少33％同一性。在某些实施例中，同一性为与SEQ ID NO：16至少40％或至少45％、或至少50％或至少55％、至少60％或至少65％、至少70％或至少75％、至少80％或至少85％、至少90％或至少95％、至少99％或100％的同一性。

本发明的C型流感病毒可在细胞、细胞系和宿主细胞中繁殖。所述细胞、细胞系或宿主细胞可为例如但不限于哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞，包括昆虫和植物细胞。本发明的C型流感病毒可在其中繁殖的细胞、细胞系和宿主细胞是本领域普通技术人员容易已知且获得的。

C型流感病毒可在免疫原性组合物中使用前减毒或灭活。减毒和灭活方法是本领域技术人员众所周知的。用于减毒的方法包括但不限于在细胞培养中的连续传代、紫外线辐射和化学诱变。用于灭活的方法包括但不限于用福尔马林、β丙内酯(betapropriolactone)(BPL)或二乙烯亚胺(BEI)处理或者本领域技术人员已知的其他方法。通过福尔马林灭活可通过使病毒悬浮液与37％甲醛混合至0.05％的甲醛终浓度来进行。将病毒-甲醛混合物在室温下持续搅拌大约24小时。然后通过测定在合适的细胞系上的生长就残留活病毒测试灭活病毒混合物。通过BEI灭活可通过使病毒悬浮液与0.1M BEI(在0.175N NaOH中的2-溴乙胺)混合至1mM的BEI终浓度来进行。将病毒-BEI混合物在室温下持续搅拌大约48小时，随后为添加1.0M硫代硫酸钠至0.1mM的终浓度。混合继续进行另外两小时。通过测定在合适的细胞系上的生长就残留活病毒测试灭活病毒混合物。

本发明的免疫原性组合物可包括一种或多种兽医学可接受的载体，例如任何和所有溶剂、分散介质、涂层、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等等。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等渗剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖，以及本领域技术人员已知的其他等渗剂。稳定剂包括白蛋白以及技术人员已知的其他稳定剂。防腐剂包括硫柳汞以及技术人员已知的其他防腐剂。

本发明的免疫原性组合物可包括一种或多种佐剂。佐剂包括但不限于RIBI佐剂体系(Ribi Inc.；Hamilton，MT)、明帆、氢氧化铝凝胶、水包油乳剂、油包水乳剂例如弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(CytRx；Atlanta，GA)、SAF-M(Chiron；Emeryville，CA)、佐剂、皂苷、QuilA、QS-21(Cambridge Biotech Inc.；Cambridge，MA)、GP1-0100(GalenicaPharmaceuticals，Inc.；Birmingham，AL)或其他皂苷级分、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的不耐热性肠毒素(重组体或其他形式)、霍乱毒素或胞壁酰二肽，以及本领域技术人员已知的很多其他佐剂。

可用于本发明上下文中的佐剂和添加剂的量和浓度可由本领域技术人员容易地确定。在一个实施例中，本发明考虑包含约50μg至约2000μg佐剂的免疫原性组合物。在另一个实施例中，佐剂以约100μg至约1500μg、或约250μg至约1000μg、或约350μg至约750μg的量包括。在另一个实施例中，以约500μg/2ml剂量的免疫原性组合物的量包括佐剂。

许多细胞因子或淋巴因子已显示具有免疫调节活性，并且可用作佐剂，包括但不限于白细胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见例如美国专利号5,723,127)、13、14、15、16、17和18(及其突变体形式)，干扰素-α、β和γ，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(参见例如美国专利号5,078,996和ATCC登录号39900)，巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，GSF以及肿瘤坏死因子α和β。可用于本发明的另外其他佐剂包括趋化因子，包括但不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。粘附分子例如选择素例如L-选择素、P-选择素和E-选择素也可用作佐剂。另外其他有用的佐剂包括但不限于粘蛋白样分子，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整联蛋白家族成员例如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族成员例如PECAM、ICAM例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3，共刺激分子例如CD40和CD40L，生长因子包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子，受体分子包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。另外一种佐剂分子包括半胱天冬酶(ICE)。还参见以引用方式并入本文的国际专利公开号WO98/17799和WO99/43839。

用于增强免疫应答的合适佐剂包括但不限于MPL^TM(3-O-脱乙酰单磷酰脂质A；Corixa，Hamilton，MT)，其在以引用方式在此并入的美国专利号4,912,094中描述。还适合用作佐剂的是合成脂质A类似物或氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)或其衍生物或类似物，这些可得自Corixa(Hamilton，MT)，并且在以引用方式在此并入的美国专利号6,113,918中描述。一种此类AGP为2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称为529(以前称为RC529)。该529佐剂配制为水性形式或稳定乳剂。

另外其他佐剂包括矿物油和水乳剂、铝盐(明矾)例如氢氧化铝、磷酸铝等，爱菲金(Amphigen)，阿夫立定，L121/角鲨烯，D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷，复合多元醇，胞壁酰二肽，被杀死的博德特氏菌(Bordetella)，皂苷例如以引用方式在此并入的美国专利号5,057,540中所述的Stimulon^TM QS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，以及由其生成的颗粒例如ISCOMS(免疫刺激复合物)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，细菌脂多糖，合成多核苷酸例如含有CpG基序的寡核苷酸(以引用方式在此并入的美国专利号6,207,646)，百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热毒素(LT)，特别是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；参见例如以引用方式并入本文的国际专利公开号WO93/13302和WO 92/19265。

还可用作佐剂的是霍乱毒素及其突变体，包括在公开的国际专利申请号WO 00/18434中所述的那些(其中在氨基酸位置29处的谷氨酸替换为除天冬氨酸外的另一种氨基酸，优选组氨酸)。类似的CT毒素或突变体在公开的国际专利申请号WO 02/098368中描述(其中在氨基酸位置16处的异亮氨酸替换为另一种氨基酸，单独或与在氨基酸位置68处的丝氨酸替换为另一种氨基酸组合；和/或其中在氨基酸位置72处的缬氨酸替换为另一种氨基酸)。其他CT毒素在公开的国际专利申请号WO 02/098369中描述(其中在氨基酸位置25处的精氨酸替换为另一种氨基酸；和/或氨基酸在氨基酸位置49处插入；和/或两个氨基酸在氨基酸位置35和36处插入)。

本发明的免疫原性组合物还可包括表面活性物质。合适的表面活性物质包括但不限于醌类似物，十六胺，十八胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂，二甲基双十八烷基溴化铵、甲氧基十六烷基甘油和复合多元醇；聚胺例如吡喃，硫酸葡聚糖，聚IC，卡波普；肽例如胞壁酰肽和二肽，二甲基甘氨酸，促吞噬肽；油乳剂；和矿物凝胶，例如磷酸铝等等，以及免疫刺激复合物(ISCOMS)。

本发明的免疫原性组合物还可包括抗生素。此类抗生素包括但不限于来自下述类别的抗生素：氨基糖苷类、碳青霉烯类、头孢霉素类、糖肽类、大环内酯类、青霉素类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。在一个实施例中，本发明考虑了包含约1μg/ml至约60μg/ml抗生素的免疫原性组合物。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含约5μg/ml至约55μg/ml抗生素、或约10μ，g/ml至约50μg/ml抗生素、或约15μg/ml至约45μg/ml抗生素、或约20μg/ml至约40μg/ml抗生素、或约25μg/ml至约35μg/ml抗生素。在另外一个实施例中，免疫原性组合物包含小于约30μg/ml抗生素。

其他添加剂也可包括在本发明的免疫原性组合物中，包括防腐剂、稳定成分等等。合适的示例性防腐剂包括三氯叔丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。可使用的合适的稳定成分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、二磷酸单钾、乳糖、乳清蛋白水解物和奶粉。免疫原性组合物还可掺入脂质体内用作免疫原性组合物，并且还可含有适合于组合物的所选施用模式的其他添加剂。该组合物可包括其他药学可接受的赋形剂用于开发粉末、液体或悬浮液剂型。参见例如其教导以引用方式在此并入的Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第2卷，第19版(1995)，例如第95章Aerosols；和国际专利公开号WO99/45966。

本发明的免疫原性组合物可包括其他抗原。抗原可采取灭活的完整或部分微生物制剂的形式，或者通过重组技术或化学合成获得的抗原分子的形式。适合于依照本发明使用的其他抗原包括但不限于源自致病菌的抗原，所述致病菌例如睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、支气管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumonie)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannhemia haemolytica)、牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、梭菌属物种(Clostridial spp.)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusopathiae)、衣原体属物种(Chlamydia spp.)、布鲁氏菌属物种(Brucella spp.)、弧菌属物种(Vibriospp.)、肠炎沙门氏菌血清变型(Salmonella enterica serovars)和钩端螺旋体属物种(Leptospira spp.)。抗原还可源自致病性真菌例如假丝酵母属(Candida)，原生动物例如小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、犬新孢子虫(Neosporacanium)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、艾美球虫属物种(Eimeria spp.)、巴贝斯虫属物种(Babesia spp.)、贾第虫属物种(Giardia spp.)，或蠕虫例如奥斯特线虫属(Ostertagia)、古柏线虫属(Cooperia)、血矛线虫属(Haemonchus)和片吸虫属(Fasciola)。另外的抗原可包括致病性病毒例如牛冠状病毒、牛疱疹病毒、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛白血病病毒、牛瘟病毒、口蹄疫病毒和狂犬病病毒。

在其他实施例中，免疫原性组合物可包含如上所述的本发明的纯化的氨基酸序列，包括但不限于SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16-20。

施用形式、剂量、途径

本发明的免疫原性组合物可施用于动物，以诱导针对C型流感病毒的有效免疫应答。因此，本发明提供了通过给动物施用治疗有效量的本文描述的本发明免疫原性组合物，刺激针对C型流感病毒的有效免疫应答的方法。

取决于施用途径，本发明的免疫原性组合物可以多种形式制备。例如，免疫原性组合物可以适合于可注射用途的无菌水性溶液或分散体的形式制备，或使用冷冻干燥技术以冻干形式制备。冻干的免疫原性组合物通常维持在约4℃下，并且可在含或不含佐剂的稳定溶液例如盐水或HEPES中重构。免疫原性组合物还可以悬浮液或乳剂的形式制备。

这些免疫原性组合物可含有适合于经由任何方便的施用途径施用的添加剂。本发明的免疫原性组合物可制备用于施用于受试者，其形式为例如液体、粉末、气溶胶、片剂、胶囊、肠溶衣片或胶囊、或栓剂。因此，免疫原性组合物还可包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和可植入的持续释放或生物可降解的制剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施例中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供用于在重构组合物的肠胃外施用前由合适媒介物(例如无菌无热原水)重构。其他可用的可肠胃外施用的制剂包括包含以微晶形式、在脂质体制剂中或作为生物可降解聚合物系统的组分的活性成分的制剂。用于持续释放或植入的组合物可包含药学可接受的聚合物或疏水性材料，例如乳剂、离子交换树脂、难溶性聚合物或难溶性盐。

本发明的免疫原性组合物包括治疗有效量的C型流感病毒。纯化的病毒可直接用于免疫原性组合物中，或还可进行减毒或灭活。通常，免疫原性组合物含有约1×10²至约1×10¹²病毒颗粒，或约1×10³至约1×10¹¹病毒颗粒，或约1×10⁴至约1×10¹⁰病毒颗粒，或约1×10⁵至约1×10⁹病毒颗粒，或约1×10⁶至约1×10⁸病毒颗粒。在免疫原性组合物中有效提供保护效应的病毒精确量可由技术人员确定。

免疫原性组合物一般包含体积为约0.5ml至约5ml的兽医学可接受的载体。在另一个实施例中，载体的体积为约1ml至约4ml，或约2ml至约3ml。在另一个实施例中，载体的体积为约1ml，或约2ml，或约5ml。适用于免疫原性组合物中的兽医学可接受的载体可为本文描述的这些载体中的任一种。

此类载体包括但不限于水、盐、缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液。其他常规采用的稀释剂、佐剂和赋形剂可依照常规技术加入。此类载体可包括乙醇、多元醇及其合适混合物、植物油和可注射有机酯。还可采用缓冲剂和pH调节剂。缓冲剂包括但不限于由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括但不限于有机酸盐，例如柠檬酸的盐，例如柠檬酸盐、抗坏血酸、葡糖酸、组氨酸-Hel、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、邻苯二甲酸、Tris、盐酸三甲胺或磷酸盐缓冲液。肠胃外载体可包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖、海藻糖、蔗糖、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体可包括流体和营养补充剂、电解质补充剂例如基于林格氏右旋糖的电解质补充剂等等。防腐剂及其他添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂(例如EDTA)、惰性气体等等也可在药物载体中提供。本发明不受限于载体的选择。由上述组分制备具有适当pH、等渗性、稳定性及其他常规特征的这些药学可接受的组合物在本领域技术内。参见例如，课本例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott Williams&Wilkins，2000年出版；和The Handbook of Pharmaceutical Excipients，4.sup.th edit.，R.C.Rowe等人编辑，APhA Publications，2003。

本领域技术人员可容易地确定病毒在施用前是否需要减毒或灭活。在本发明的另一个实施例中，C型流感病毒可直接施用于动物而无需另外减毒。治疗有效的病毒量可取决于使用的特定病毒、动物状况和/或感染程度而改变，并且可由技术人员确定。

依照本发明的方法，单一剂量可施用于动物，或可替代地，可发生两次或更多次接种，间隔为约二至约十周。可能需要加强方案，并且可调整剂量方案，以提供最佳免疫接种。本领域技术人员可容易地确定最佳施用方案。

免疫原性组合物可直接施用到血流、肌内或内脏内。合适的肠胃外施用方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内和皮下。合适的肠胃外施用装置包括针(包括显微操作针)注射器、无针注射器和输注技术。

肠胃外制剂通常为水性溶液，所述水性溶液可含有赋形剂例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选至pH约3至约9、或约4至约8、或约5至约7.5、或约6至约7.5、或约7至约7.5)，但对于一些应用，它们可更适当地配制为无菌非水性溶液，或与合适的媒介物例如无菌无热原水结合使用的干燥形式。在无菌条件下例如通过冻干制备肠胃外制剂可使用本领域技术人员众所周知的标准制药技术容易地完成。

用于制备肠胃外溶液的化合物的可溶性可通过使用技术人员已知的适当配制技术得到增加，例如掺入可溶性增强试剂包括缓冲剂、盐、表面活性剂、脂质体、环糊精等等。

肠胃外施用的制剂可配制为立即和/或改进释放。改进释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控释放。因此，本发明的化合物可配制为固体、半固体或触变性液体用于作为植入储库施用，从而提供活性化合物的改进释放。此类制剂的例子包括药物涂覆的支架和聚dl-乳酸共乙醇酸(PLGA)微球体。

本发明的免疫原性组合物还可局部施用于皮肤或粘膜，即真皮或经皮施用。用于该目的的典型制剂包括凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏、软膏、撒粉、敷料、泡沫、膜、皮肤贴剂、晶片、埋植剂、海绵、纤维、绷带和微乳剂；还可使用脂质体。典型载体包括醇、水、矿物油、液体矿脂、白凡士林、甘油、聚乙二醇和丙二醇。可掺入渗透增强剂；参见例如Finnin和Morgan，J.Pharm Sci，88(10)：955-958(1999)。其他局部施用方法包括通过电穿孔、离子透入疗法、超声透入疗法、超声促渗和显微操作针或无针(例如Powderject^TM，Bioject^TM等)递送。局部施用的制剂可设计为立即和/或改进释放。改进释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控释放。

免疫原性组合物还可鼻内或通过吸入施用，通常采取来自干粉吸入器的干粉的形式(单独或作为混合物，例如在具有乳糖的干共混物中，或作为混合组分颗粒，例如与磷脂例如磷脂酰胆碱混合)，或作为来自增压容器、泵、喷雾器、雾化器(优选使用电流体动力学产生细雾的雾化器)的气溶胶喷雾。它还可经由喷洒器施用，伴随或不伴随合适推进剂例如1，1，1，2-四氟乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷的使用。对于鼻内使用，粉末可包含生物粘附剂，例如壳聚糖或环糊精。增压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器含有本发明的一种或多种化合物的溶液或悬浮液，包含例如乙醇，水性乙醇或用于分散、增溶或延长活性剂释放的合适替代试剂，作为溶剂的一种或多种推进剂和任选的表面活性剂例如三油酸脱水山梨醇酯、油酸或寡聚乳酸。

在干粉或悬浮液制剂中使用之前，药物产品一般微粒化至适合于通过吸入递送的大小(通常小于约5微米)。这可通过任何适当的粉碎方法来实现，例如螺旋喷流粉碎、流化床喷流粉碎、超临界流体处理(以形成纳米颗粒)、高压匀浆化或喷雾干燥。

用于吸入器或吹入器的胶囊(例如由明胶或羟丙基甲基纤维素制备)、泡罩和药液筒可配制为含有本发明的化合物的粉末混合物。合适的粉基可为乳糖或淀粉，并且性能改进剂可为l-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁。乳糖可为无水的，或采取一水合物的形式。其他合适的赋形剂包括右旋糖酐、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。

使用电流体动力学产生细雾，用于雾化器的合适溶液制剂可含有约1μg至约20mg本发明的化合物/驱动，并且驱动体积可从约1μl到约100μl不等。在另一个实施例中，化合物的量/驱动的范围可为约100μg至约15mg、或约500μg至约10mg、或约1mg至约10mg、或约2.5μg至约5mg。在另一个实施例中，驱动体积的范围可为约5μl至约75μl、或约10μl至约50μl、或约15μl至约25μl。典型制剂可包含本发明的化合物、丙二醇、无菌水、乙醇和氯化钠。可代替丙二醇使用的可替代溶剂包括甘油和聚乙二醇。

吸入/鼻内施用的制剂可使用例如PLGA配制为立即和/或改进释放。改进释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控释放。

在干粉吸入器和气溶胶的情况下，剂量单位一般借助于递送计量的量的阀来确定。依照本发明的单位通常安排为施用含有约10ng至约100μg本发明化合物的计量的剂量或“喷烟(puff)”。在另一个实施例中，在计量的剂量中施用的化合物量为约50ng至约75μg、或约100ng至约50μg、或约500ng至约25μg、或约750ng至约10μg、或约1μg至约5μg。总体日剂量通常在约1μg至约100mg的范围内，其可在单一剂量中施用，或更通常地，作为全天的分份剂量施用。在另一个实施例中，总体日剂量的范围可为约50μg至约75mg、或约100μg至约50mg、或约500μg至约25mg、或约750μg至约10mg、或约1mg至约5mg。

本发明的免疫原性组合物还可经口或口服施用，即通过口或经由口进入受试者的体内，并且涉及吞咽或通过口腔粘膜(例如舌下或经颊吸收或两者)转运。合适的调味料例如薄荷脑和左薄荷脑，或甜味剂例如糖精或糖精钠，可加入预期用于经口或口服施用的那些本发明制剂中。

本发明的免疫原性组合物可经直肠或阴道施用，例如采取栓剂、子宫托或灌肠剂的形式。可可脂是常规栓剂基质，但适当时可使用多种替代物。直肠/阴道施用的制剂可配制为立即和/或改进释放。改进释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控释放。

本发明的免疫原性组合物还可直接施用于眼或耳，通常采取微粒化悬浮液的滴或在等渗pH调整的无菌盐水中的溶液的形式。其他适合于眼和耳施用的制剂包括软膏、生物可降解的(例如可吸收的凝胶海绵、胶原)和生物不可降解的(例如硅酮)埋植剂、晶片、透镜和微粒或囊状系统，例如类脂质体(niosome)或脂质体。聚合物例如交联聚丙烯酸，聚乙烯醇，透明质酸，纤维素聚合物例如羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素，或杂多糖聚合物例如琼脂糖胶(gelan gum)，可连同防腐剂例如苯扎氯铵一起掺入。此类制剂还可通过离子透入疗法递送。眼/耳施用的制剂可配制为立即和/或改进释放。改进释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控释放。

本发明的免疫原性组合物不受限于可用于上述类型的药物制剂的常规、生理学可接受的载体、佐剂或其他成分的选择。由上述组分制备具有适当pH、等渗性、稳定性及其他常规特征的这些药学可接受的组合物在本领域技术内。

一般而言，关于本发明的免疫原性组合物组分的适当“有效量”或剂量的选择还将基于在一种或多种免疫原性组合物中采用的抗原的身份，以及受试者的健康状况，最尤其包括免疫接种的受试者的一般健康、年龄和重量。施用方法和途径，以及免疫原性组合物中的另外组分的存在，也可影响组合物的剂量和量。此类选择以及有效剂量的上调或下调在本领域技术内。在受试者中诱导免疫应答优选保护性应答，或产生外源效应而无显著不利副作用所需的组合物量，取决于这些因素而改变。合适的剂量由本领域技术人员容易地确定。

类似地，免疫原性组合物施用次序和个别施用之间的时间段可由本领域技术人员基于宿主的体格特征和对施加方法的确切应答而选择。此类最佳化预期完全在本领域技术内。

本发明的免疫原性组合物还可用于制备用于治疗和/或预防动物中的C型流感病毒感染的药剂。

重组技术

在本发明的另外其他实施例中，免疫原性组合物可包含重组疫苗。此类重组疫苗一般包含载体和包含抗原的异源插入片段。在一些实施例中，异源插入片段包含如上所述的编码本发明的氨基酸序列的一种或多种核酸序列，例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16-20。插入片段可任选包含异源启动子，例如本领域已知的合成启动子。作为另外一种选择，宿主载体的启动子可对插入片段的表达施加转录控制。启动子的合适非限制性例子(其可为天然或异源的，取决于载体的选择)为H6牛痘启动子、13L牛痘启动子、42K痘病毒启动子、7.5K牛痘启动子和Pi牛痘启动子。

合适的载体已在本专利申请中的其他地方描述。在一些实施例中，载体可为病毒载体，包括但不限于牛痘和痘病毒载体，例如副痘、浣熊痘、猪痘和不同禽痘载体(例如金丝雀痘和鸡痘毒株)。目前考虑的病毒毒株包括D1701、ALVAC、TROVAC、NYVAC毒株。一般地，病毒宿主非必需的序列是用于本发明的插入片段的合适插入位点。上述毒株在本领域中得到充分表征，并且这些载体中的一些插入位点是众所周知的。参见例如美国专利号5,174,993；美国专利号5,505,941，美国专利号5,766,599，美国专利号5,756,103，美国专利号7,638,134，美国专利号6,365,393。

存在可用于克隆和表达本发明的核苷酸序列的几种已知方法或技术。例如，序列可作为限制片段分离且克隆到克隆和/或表达载体内。序列还可PCR扩增且克隆到克隆和/或表达载体内，或它们可通过这两种方法的组合进行克隆。一般可遵循如下述中所述的本领域已知且未具体描述的标准分子生物学技术：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1989)；Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等人，Recombinant DNA，Scientific American Books，New York；Birren等人(编辑)Genome Analysis：ALaboratory Manual Series，第1-4卷ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；以及美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法。聚合酶链反应(PCR)一般如PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中所述进行。

本发明涵盖原核和真核表达系统包括载体和宿主细胞的使用，所述表达载体可用于表达由本发明的核苷酸序列表达的截短和全长形式的重组多肽两者。多种宿主-表达载体系统可用于表达本发明的多肽。此类宿主-表达系统还代表通过其可克隆且随后纯化目的编码序列的媒介物。本发明还提供了宿主细胞，当用适当载体或核苷酸序列转化或转染时，所述宿主细胞可表达所编码的本发明的多肽基因产物。此类宿主细胞包括但不限于微生物，例如用含有编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有基因产物编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或容纳含有启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)，所述启动子源自哺乳动物细胞的基因组(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。

一般地，本发明的载体可源自但不限于细菌质粒、细菌噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(例如如上所述)、哺乳动物染色体和其组合，例如源自质粒和细菌噬菌体遗传元件包括但不限于粘粒和噬菌粒的那些。

本发明的载体可用于多肽的表达。一般地，本发明的载体包括与多核苷酸可操作地连接的顺式作用调节区，所述多核苷酸编码待表达的多肽。调节区可为组成型或诱导型的。适当的反式作用因子通过体外翻译系统由宿主、互补载体或在引入宿主内之后由载体本身提供。

本发明的载体可包括通常包括在表达或展示载体中的任何元件，包括但不限于复制起点序列、一种或多种启动子、抗生素抗性基因、前导区或信号肽序列、多种标签序列、可编码其多肽赋予抗生素抗性的基因的填充序列、限制位点、核糖体结合位点、翻译增强子(能够形成茎环结构用于mRNA转录后稳定性的序列)、编码缺乏终止密码子的氨基酸的序列和编码细菌外壳蛋白质的序列。

检测、诊断方法

本发明提供了诊断在动物中通过牛C型流感病毒的感染的方法。该诊断可经由多种诊断方法中的任一种完成，包括但不限于ELISA、蛋白质印迹、PCR、基于核酸的测定包括DNA或RNA印迹分析以及测序。作为另外一种选择，可采用基于蛋白质的测定。在基于蛋白质的测定中，可从动物中分离怀疑受感染的细胞或组织。可由此类细胞或组织制备细胞提取物，并且可经受例如使用可区别地检测病毒存在的适当抗体的蛋白质印迹。

在动物中诱导的免疫应答的程度和性质可通过使用多种技术进行评价。例如，可从接种的动物收集血清，并且例如在常规病毒中和测定中测试对于病毒特异性的抗体的存在或不存在。在淋巴样组织中的响应细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测可通过测定例如T细胞增殖实现，所述T细胞增殖指示细胞免疫应答的诱导。有关技术在本领域中得到充分描述，例如Coligan等人Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons Inc.(1994)。

试剂盒

因为可能期望个别或与另外化合物组合施用免疫原性组合物，例如用于治疗特定疾病或状况的目的，所以在本发明的范围内免疫原性组合物可方便地包括或组合在试剂盒的形式中，所述试剂盒适合于组合物的施用或共施用。本发明的试剂盒可包含一种或多种分开的药物组合物，其中至少一种为依照本发明的免疫原性组合物，以及用于分开保存所述组合物的工具，例如容器、分份瓶或分份箔包。此类试剂盒的例子是注射器和针等等。本发明的试剂盒特别适合于施用不同剂型，例如经口或肠胃外，用于以不同剂量间隔施用分开的组合物，或用于针对彼此滴定分开的组合物。为了帮助施用本发明的组合物，试剂盒通常包含施用说明书。

本发明的另一种试剂盒可包含可用于检测C型流感病毒的一种或多种试剂。试剂盒可包括用于就完整C型流感病毒、或C型流感病毒多肽、表位或多核苷酸序列的存在分析样品的试剂。在某些实施例中，试剂盒可包括指示试剂盒可用于检测由C型流感病毒感染的动物的一组印刷说明书或标签。

抗体

抗体可为单克隆、多克隆或重组的。抗体可针对免疫原或其一部分进行制备。例如，基于免疫原的氨基酸序列或通过克隆技术重组制备的合成肽，或天然基因产物和/或其一部分可被分离且用作免疫原。免疫原可通过本领域技术人员众所周知的标准抗体产生技术用于产生抗体，所述技术例如Harlow和Lane，“Antibodies：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)，以及Borrebaeck，“Antibody Engineering-APractical Guide”，W.H.Freeman and Co.(1992)中一般描述的。抗体片段还可通过本领域技术人员已知的方法由抗体制备，并且包括Fab、F(ab′)₂和Fv。

免疫原的合适非限制性例子包括牛C型流感病毒的蛋白质或蛋白质片段，例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16-20。

在本发明的一个实施例中，本发明的抗体还提供了通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点，能够与靶特异性结合的完整免疫球蛋白，所述靶例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。完整抗体具有两条轻链和两条重链。因此，单一分离的完整抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体或异源嵌合抗体。

在抗体产生中，所需抗体的筛选可通过本领域中已知的免疫学标准方法来实现。未具体描述的技术一般遵循如Stites等人(编辑)，“Basic and ClinicalImmunology”(第8版)，Appleton and Lange，Norwalk，CT(1994)，以及Mishell和Shiigi(编辑)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freemanand Co.，New York(1980)中。一般而言，ELISA和蛋白质印迹是优选免疫测定类型；两种测定均为本领域技术人员众所周知的。多克隆和单克隆抗体两者均可用于测定中。抗体可与固体载体基底结合，或与可检测部分缀合，或如本领域众所周知的结合且缀合。(关于荧光或酶促部分的缀合的一般讨论，参见Johnstone和Thorpe，“Immunochemistry in Practice”，Blackwell ScientificPublications，Oxford(1982).)。抗体与固体载体基底的结合也是本领域众所周知的。(关于一般讨论，参见Harlow和Lane(1988)和Borrebaeck(1992).)考虑用于本发明的可检测部分可包括但不限于荧光、金属、酶促和放射性标记例如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酶、b-半乳糖苷酶、过氧化物酶、尿素酶、荧光素、罗丹明、氚、¹⁴C和碘化。

本发明还通过下述实例举例说明，但决不受限于下述实例。

实例

实例1：病毒分离

来自牛呼吸系统疾病病例的鼻拭子库用于病毒分离。病毒的初步分离在HRT-18G细胞上完成。在HRT-18G细胞上的后续传代导致用于以后研究的高滴度病毒(～1x10⁸TCID₅₀/mL)的更大制剂。在受感染的HRT-18G细胞上未观察到致细胞病变效应(CPE)；然而，偶然存在巨细胞，指示病毒诱导的细胞融合。病毒的存在通过间接免疫荧光抗体(IFA)染色加以证实，其中使用合并的恢复期牛血清作为第一抗体来源，随后为抗牛FITC缀合的第二抗体。病毒最初鉴定为分离物#14。在培养液中未鉴定牛起源的外来病毒病原体。

实例2：多种细胞类型的敏感性

多种细胞系就其对分离的病毒的敏感性进行评估。还对从多种生产性细胞感染收获的培养液进行病毒滴定。一般未观察到CPE，除了在NLST(猪睾丸)细胞上之外。

表1.测试病毒生长和得率的细胞系。

细胞类型	处理	Log10TCID50/mL
			HRT-18G	胰蛋白酶	8.2
HRT-18G	无	8.3
			BK-6	胰蛋白酶	7.5
BK-6	无	8.0
			NLST	胰蛋白酶	7.5
NLST	无	7.7
			MDBK	胰蛋白酶	7.2
MDBK	无	7.3
			BT/CS	胰蛋白酶	7.5
BT/CS	无	7.0
			CRFK	胰蛋白酶	5.8
CRFK	无	7.3
			MA104	胰蛋白酶	6.5
MA104	无	6.5
			MDCK	胰蛋白酶	6.5
MDCK	无	6.2
			NLED5	胰蛋白酶	5.8
NLED5	无	6.7
			Vero	胰蛋白酶	5.7
Vero	无	5.2
			NLFK	胰蛋白酶	5.0
NLFK	无	5.7
			NLDK	胰蛋白酶	5.0
NLDK	无	5.2

胰蛋白酶处理看起来不是病毒繁殖必需的。此外，在进一步研究后，得出结论尽管该病毒的确感染一些细胞系，但它不是生产性感染(有时被称为“流产感染”)。HRT-18G、NLST、MA-104和BK-6细胞是生产性感染的，其中HRT-18G和BK-6细胞获得最高滴度。

实例3：血凝测定

使用来自公鸡以及豚鼠的红血细胞进行标准血凝(HA)测试。结果(未示出)指示牛病毒为HA阳性，并且在HA测试中获得高滴度。

实例4：电子显微镜检查

使含有该病毒的细胞培养液澄清，并且使该病毒浓缩。使形成团块的病毒经受磷钨酸钠染色。在该处理后，在电子显微镜下观察该制剂。病毒的负染色图像显示有包膜、有刺突、直径～100nm的多态病毒颗粒(图1)。

实例5：通过RT-PCR扩增聚合酶基因

使用Viral RNA Mini Kit(Qiagen；Valencia，CA)，从由病毒感染的培养液中分离总RNA。合成设计用于扩增副粘液病毒的通用引物对：Par F1(GAAGGI TAT TGT CAI AAR NTN TGG AC)和Par R(GCT GAA GTT ACI GGITCI CCD ATR TTN C)。具有Taq的III One-StepRT-PCR System(Life Technologies；Grand Island，NY)用于建立RT-PCR反应，唯一变化是使用更低的退火温度(44℃)。生成448nt片段的PCR产物，在E-凝胶(Life Technologies)上分离，并且从琼脂糖中提取用于测序。Par F1和Par R引物用作测序引物。将获得的DNA序列翻译，并且用作查询序列以在GenBank中搜索有关序列。具有最高蛋白质同一性(57％)的命中为来自人C型流感病毒的聚合酶碱性蛋白质(PB2)。

实例6：病毒序列测定

将细胞培养液收获且澄清，并且通过超速离心浓缩病毒。使用Viral RNAMini Kit(Qiagen)提取病毒RNA。使用NanoDrop光谱仪(Thermo Scientific；Wilmington，DE)，对两个RNA样品(RNA-1；RNA-2)进行质量评价。采用来自Illumina(San Diego，CA)的测序技术。RNA样品(10.5μl)用于文库制备。使RNA片段化，并且使用TruSeq mRNA Sample Prep Kit(Illumina)，由RNA构建cDNA文库。使用标准Illumina衔接子使文库标有条形码。将所得的最终文库纯化，并且使用Agencort AMpure XP珠(Beckman Coulter：Beverly，MA)和琼脂糖凝胶电泳进行大小选择。来自复制样品的文库测定为具有280bp的平均片段大小。使用KAPA Library Quantification Kit(Kapa Biosystems；Woburn，MA)定量文库。

进行广泛qPCR评估以便准确地测量输入DNA的量，以便促进在cBOT平台(Illumina)上的热扩增的进行性循环期间的最佳簇生成。为了在cBOT上生成DNA簇，将文库合并，且以范围为4至8pmol的不同浓度连同来自cBOTPaired-End Cluster Generation Kit(Illumina)的试剂一起装载。将测序模板固定在有专利权的流动池表面上，并且将样品装载到Illumina Genome Analyzer上，以生成150个碱基的配对终末读数(2x150bp运行)。成功运行对于每个样品生成一千万单一分子簇级别的密度。使用Bowtie 2(Langmead和Salzberg；Nature Methods，9：357-359，2012)，鉴定且取出对人基因组作图的读数。13％的RNA-1读数和11％的RNA-2读数对人基因组作图。在过滤后，对于RNA-1保留460万读数，并且对于RNA-2保留190万读数。对于15-20kb的预期基因组大小，这对于RNA-1给出21,000X-28,000X的覆盖率，并且对于RNA-2给出9,000X-11,000X的覆盖率。

使用ABySS(Simpson等人；Genome Res.，19：1117-1123，2009)，将读数装配到重叠群内。对于RNA-1，生成总体大小13.8kb的10个重叠群。对于RNA-2，生成总体大小14.7kb的16个重叠群。使用BlastX(Altschul等人，J Mol Biol.，215(3)：403-410，1990)，针对GenBank非冗余蛋白质数据库搜索，注释这些重叠群。更大的重叠群具有与来自人C型流感病毒的蛋白质的强同源性。人C型流感病毒为负义、分段RNA病毒。它的基因组含有七个RNA区段，其编码下述蛋白质(以MW递减的次序列出)：病毒聚合酶PB2，PB1和PA；血凝素神经氨酸酶(HE)，核衣壳(N)，基质(M)和非结构蛋白NS1。

表2.重叠群及其与人C型流感病毒的同一性比较。

实例7：牛C型流感基因组的保守片段的测定。

因为一般而言，保守序列具有功能意义，所以进行另外的Blast搜索，以测定在牛和人C型流感病毒之间保守的牛C型流感基因组的更短片段的唯一性。M蛋白质和HA蛋白质用作代表性例子。

表3.BLAST设置。

使用表5中所述的BLAST设置，申请人已惊讶地发现牛C型流感病毒的M蛋白质(SEQ ID NO：17)的氨基酸145-181与人C型流感病毒Saitama毒株(C/Saitama/2/2000)67％相同且92％相似(33/36阳性)。与所有其他核酸序列的同一性和阳性匹配值相同或甚至更低。牛C型流感病毒的其他非重叠区甚至比数据库中的任何序列更少阳性匹配。

当申请人分析HE蛋白质(SEQ ID NO：10)时，他们已发现两个氨基酸区域，氨基酸58-136(SEQ ID NO：18)和氨基酸539-598(SEQ ID NO：19)与人C型流感病毒Ann Arbor毒株(C/Ann Arbor/1/50)高度阳性匹配。当这些序列各自分开进行分析时，惊讶地发现它们各自是独特的：SEQ ID NO：18与人C型流感病毒毒株Milan(C/Milan/1101/2009)78％相同且84％阳性匹配(阳性66/79(84％))。SEQ ID NO：19与人C型流感病毒Alberta毒株(C/Alberta/3502/2011)63％相同且85％阳性匹配。甚至更令人惊讶地，SEQ IDNO：20(SEQ ID NO：18的氨基酸36-79)与人C型流感病毒毒株Milan(C/Milan/1101/2009)93.1％(41/44)相同。

实例8：动物研究

小牛研究#1。用10mL澄清的病毒培养液鼻内接种单只破腹产3日龄小牛。在攻击后，每天收集鼻和粪便拭子，并且记录临床观察结果。随后使用HRT-18G细胞，对鼻和粪便拭子进行病毒分离。还对多种肺组织样品进行病毒分离。从研究第1天直到第7天，从鼻拭子中并且还从肺样品中分离到牛C型流感病毒(表4)。然而，未从粪便拭子中分离到病毒。

表4.来自小牛研究#1的牛C型流感病毒分离结果。

研究日	样品类型	以Log10TCID50/mL的滴度
			1	鼻拭子	≤1.5
2	鼻拭子	3.0
			3	鼻拭子	5.5
4	鼻拭子	5.3
			5	鼻拭子	5.5
6	鼻拭子	4.8
			7	鼻拭子	2.8
1	粪便拭子	≤1.5

7	粪便拭子	≤1.5
			7	右肺前叶	5.0
7	左肺前叶	5.8
			7	右肺尾叶	4.0
7	左肺尾叶	4.5
			7	右肺中叶	6.3
7	左肺中叶	6.3
			7	附属组织	4.3
7	气管	5.3
				接种物	8.3

在用澄清的培养液接种小牛后，未观察到临床症状。在尸检时，未鉴定出显著的肉眼病理学变化。组织病理学评估指示肺显示出轻度间质性肺炎，与病毒感染一致。然而，这些轻度病变未预期为肉眼可见。

小牛研究#2。通过用从研究#1的小牛中收集的10mL澄清的合并样品(鼻拭子和肺匀浆物)的鼻内施用，接种单只破腹产3日龄小牛。在攻击后，每天收集鼻和粪便拭子，并且记录临床观察结果。使用HRT-18G细胞，随后对鼻和粪便拭子进行病毒分离。还对多种肺组织样品进行病毒分离。从研究第1天直到第6天，从鼻拭子中以及从肺样品中分离到牛C型流感病毒(表5)。再一次，未从粪便拭子中分离到病毒。

表5.来自小牛研究#2的牛C型流感病毒分离结果。

研究日	样品类型	IFA	病毒滴度
				0	鼻拭子	阴性	≤1.5
1	鼻拭子	阳性	1.7
				2	鼻拭子	阳性	5.2
3	鼻拭子	阳性	2.2
				4	鼻拭子	阳性	3.8
5	鼻拭子	阳性	3.5
				6	鼻拭子	阳性	2.6
7	鼻拭子	阴性	≤1.5
				8	鼻拭子	阴性	≤1.6

0	粪便拭子	阴性	≤1.5
				1	粪便拭子	阴性	≤1.5
8	粪便拭子	阴性	≤1.5
				8	右颅肺	阳性	ND
8	左颅肺	阴性	ND
				8	右尾肺	阳性	ND
8	左尾肺	阳性	ND
				8	右中肺	阳性	ND
8	左中肺	阳性	ND
				8	附属组织	阳性	ND
8	气管	阴性	2.5
				8	气管/支气管.	阴性	ND
8	肺灌洗液	阳性	2.5

ND＝未测定

在用来自先前研究的合并样品接种小牛后，未观察到临床症状。在尸检时，未鉴定出显著的肉眼病理变化。肺样品具有轻度至中度多病灶支气管-间质组织细胞肺炎，具有内部损伤胞浆内嗜酸性包涵体和少数合体细胞。

实例9：血清流行病学调查

使用直接荧光抗体测定(FA)，就针对牛C型流感病毒的抗体的存在评估来自多个兽群/场所的血清样品。将HRT-18G细胞用该病毒感染，并且在接种后，在80％丙酮中固定。将血清样品在PBS中稀释，以1∶40起始，随后为4倍系列稀释。将稀释的血清样品加入固定细胞的孔中，并且温育40-60分钟。在多次洗涤后，加入山羊抗牛FITC缀合的抗体，并且温育30分钟。将板洗涤且在UV光源下阅读。滴度报告为FA阳性的最高稀释度的倒数。来自取样的多个兽群的结果在下文列出：

兽群C-1。测试182个血清样品(在2011年夏季收集)；85个具有大于或等于40的滴度。抗牛C型流感病毒抗体的普遍率为47.8％。二十个阳性样品具有2560的滴度，从而指示活动性感染。

兽群C-2。从相同兽群(C-1)中收集339个血清样品，但早2-3个月。160个样品中的二十四个(15％)通过FA为阳性。在这些阳性样品中，2个具有2560的滴度，从而指示活动性感染。

兽群D。收集173个牛血清样品；4个(2.3％)具有针对牛C型流感病毒80-320的抗体滴度，从而提示该抗体已母源获得，并且这些断奶年龄小牛可能仍未暴露于该病毒。

兽群X。从研究农场的小牛中收集72个血清样品；11个(15.2％)具有大于640的FA滴度，除了一个(FA滴度160)以外。

Claims (23)

1.一种组合物，所述组合物包含分离的牛C型流感病毒。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述病毒是活的、灭活的或减毒的。

3.一种包含分离的C型流感病毒的组合物，其中所述病毒包含下述基因区段中的至少一种：编码与SEQ ID NO：4具有大于52％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：6具有大于72％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：8具有大于50％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQID NO：10具有大于54％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：12具有大于40％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：14具有大于36％同一性的蛋白质的核酸；和编码与SEQ ID NO：16具有大于33％同一性的蛋白质的核酸。

4.一种包含分离的核酸的组合物，其中所述分离的核酸包含下述核酸中的一种或多种：编码与SEQ ID NO：4具有大于52％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：6具有大于72％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：8具有大于50％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：10具有大于54％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：12具有大于40％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：14具有大于36％同一性的蛋白质的核酸；和编码与SEQ ID NO：16具有大于33％同一性的蛋白质的核酸，其中SEQ ID NO：4编码C型流感“PB2”蛋白质；SEQ ID NO：6编码C型流感“PB1”蛋白质；SEQ ID NO：8编码流感“PA”蛋白质；SEQ IDNO：10编码C型流感“HE”蛋白质；SEQ ID NO：12编码C型流感“N”蛋白质；SEQ ID NO：14编码C型流感“M”蛋白质；而SEQ ID NO：16编码C型流感“NS1”蛋白质。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的组合物，所述组合物包含下述基因区段中的一种或多种：编码SEQ ID NO：4的C型流感PB2蛋白质的核酸；编码SEQ ID NO：8的PB 1蛋白质的核酸；编码SEQ ID NO：10的HE蛋白质的核酸；编码SEQ ID NO：12的N蛋白质的核酸；编码SEQ IDNO：14的M蛋白质的核酸；和编码SEQ ID NO：16的NS1蛋白质的核酸。

6.一种组合物，所述组合物包含选自下述的一种或多种分离的多肽：SEQ ID NO：4的C型流感PB2蛋白质；SEQ ID NO：8的PB 1蛋白质；SEQID NO：10的HE蛋白质；SEQ ID NO：12的N蛋白质；SEQ ID NO：14的M蛋白质；和SEQ ID NO：16的NS1蛋白质。

7.一种组合物，所述组合物包含选自SEQ ID NO：4；6；8；10；12；14；和16的分离的多肽中的一种或多种。

8.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物选自根据权利要求1-7中任一项所述的组合物。

9.根据权利要求8所述的组合物，所述组合物还包含佐剂。

10.一种表达载体，所述表达载体包含选自下述的一种或多种多核苷酸：编码与SEQ ID NO：4具有大于52％同一性的蛋白质的核酸；与SEQ IDNO：6具有大于72％同一性的核酸；编码与SEQ ID NO：8具有大于50％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：10具有大于54％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：12具有大于36％同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQ ID NO：14具有大于36％同一性的蛋白质的核酸；和编码与SEQ ID NO：16具有大于33％同一性的蛋白质的核酸。

11.根据权利要求10所述的表达载体，所述表达载体包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13和15中的一种或多种。

12.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求10或11所述的载体。

13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含牛C型流感病毒。

14.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含根据权利要求1或2所述的分离的牛C型流感病毒。

15.根据权利要求14所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含佐剂和或药学可接受的赋形剂或载体。

16.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是灭活的、活的或活减毒的。

17.一种治疗由C型流感病毒引起的疾病或使动物免于由C型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括给所述动物施用根据权利要求1-10和14-16中任一项所述的免疫原性组合物。

18.一种检测动物对C型流感病毒的暴露的方法，所述方法包括测定来自所述动物的样品中SEQ ID NO：4-16中任何一种或多种的存在。

19.一种抗体，所述抗体与根据权利要求1或2所述的分离的病毒特异性结合。

20.一种抗体，所述抗体与来自多肽的表位特异性结合，所述多肽选自SEQ ID NO：4；6；8；10；12；14；和16-20的多肽。

21.一种用于检测牛C型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含与对于牛C型流感病毒特异性的表位特异性结合的抗体和用于检测所述抗体的工具。

22.一种用于检测流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含与选自SEQ IDNO：4、6、8、10、12、14、16-20的多肽的多肽特异性结合的抗体和用于检测所述抗体的工具。

23.一种用于检测流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13和15中的一种或多种核酸杂交的核酸。