CN115737793A - 细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents
细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115737793A CN115737793A CN202111034464.0A CN202111034464A CN115737793A CN 115737793 A CN115737793 A CN 115737793A CN 202111034464 A CN202111034464 A CN 202111034464A CN 115737793 A CN115737793 A CN 115737793A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- echinococcus
- deg95
- dec95
- protein
- canadensis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了一种细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法；该二联亚单位疫苗包含免疫原dEG95/dEC95抗原蛋白和药学上可以接受的载体；其中，dEG95蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；dEC95蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。目前尚无同时抗细粒棘球蚴感染和加拿大棘球蚴感染的疫苗，本发明采用dEG95‑dEC95异源二聚体蛋白作为抗原，制备的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗生产成本低，生产工艺简单；可以同时预防细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴的感染，具有安全、高效、成本低、抗原纯度高等诸多优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种抗棘球蚴感染的亚单位疫苗及其制备方法，尤其涉及一种细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术
棘球蚴病(Echinococcosis)是由棘球蚴属绦虫的幼虫—棘球蚴(hydatid cyst)寄生于人和动物的肺、肝等组织器官而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。棘球蚴病流行广，呈世界性分布，世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health；法语：Office international desépizooties，OIE)将棘球蚴病归为全球通报的传染病，归属为多种动物共患病；世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将棘球蚴病列为全球早期预警系统优先预测和应急处置的疾病之一。棘球蚴病也是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。
根据病灶的形态及感染病原的差异，棘球蚴病主要分为细粒棘球蚴病(cysticechinococcosis,CE)和多房棘球蚴病两种，其中细粒棘球蚴病分布最广，患者人数最多。CE的致病原目前由几个棘球绦虫复合种构成：狭义细粒棘球绦虫(EchinococcusgranuLosus)、加拿大棘球绦虫(Echinococcus.canadensis)、马棘球绦虫、奥氏棘球绦虫，其中由狭义细粒棘球绦虫G1型引起的CE超过90％，而由加拿大棘球蚴绦虫G6型引起的CE超过7％。
目前研究表明控制棘球蚴病的流行主要是通过切断棘球绦虫发育环节，控制人、畜等中间宿主对棘球蚴的感染，预防或驱虫治疗犬类等终宿主，阻断虫卵的大范围播散。其中对于中间宿主接种疫苗可以有效控制细粒棘球蚴病的流行。Lightowlers等发现EG95是存在于Eg中的天然六钩蚴抗原之一，并且是筛选的众多蛋白中最有效的保护性抗原，已有成功研制抗羊细粒棘球蚴病的疫苗。然而现有重组EG95蛋白疫苗是由大肠杆菌包涵体复性制备，纯度低且难以维持蛋白的空间结构，而且与加拿大棘球蚴绦虫G6型无明显交叉保护性，因此有一定的局限性，现在亟待研究针对细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴的多价疫苗，用于包虫病的防治。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法用，可以同时预防细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴的感染，具有安全、高效、成本低、抗原纯度高等诸多优点。其中所述抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中包含免疫原dEG95/dEC95抗原蛋白和药学上可以接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述dEG95蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；dEC95蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述dEG95蛋白可以是单体，也可以是用多肽串联起来的单链多聚体。举例为二聚体2dEG95，三聚体3dEG95，四聚体4dEG95，五聚体5dEG95。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述dEC95蛋白可以是单体，也可以是用多肽串联起来的单链多聚体。举例为二聚体2dEC95，三聚体3dEC95，四聚体4dEC95，五聚体5dEC95。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述二联可以是在不同载体中分别表达dEG95蛋白和dEC95蛋白，形成的dEG95蛋白和dEC95蛋白的混合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述二联可以是在同一个载体中共表达dEG95蛋白和dEC95蛋白，形成的dEG95蛋白和dEC95蛋白的混合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述二联可以是在同一个载体表达用多肽串联起来的dEG95蛋白和dEC95蛋白，形成的单链二聚体蛋白dEG95-dEC95。
本发明的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗二免疫后第4周即能达到不低于1:1024的抗体效价，且能维持长时期高滴度抗体效价。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中dEG95/dEC95抗原蛋白含量为40-100μg/ml。
抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述的dEG95/dEC95抗原蛋白含量可选自40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml。
即使当抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中dEG95/dEC95蛋白抗原含量仅为40μg/ml，二次免疫后第4周即能达到不低于1:256的抗体效价，且能维持长时期的高滴度的抗体效价。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中dEG95/dEC95蛋白抗原含量为60μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂等等中的一种或几种。优选MontanideISA 50V。
所述佐剂含量为5％-60％V/V。优选为20％-60％V/V，更优选50％V/V。
作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体选自药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。
为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明还涉及一种制备所述抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将细粒棘球蚴中的dEG95抗原蛋白的基因及加拿大棘球蚴中dEC95抗原蛋白的基因修饰后进行串联，基因合成得到dEG95-dEC95基因(如SEQ ID NO.8所示)，克隆到表达载体，得到含有dEG95-dEC95抗原蛋白基因的重组表达载体；
步骤(2)将所述步骤(1)得到的含有dEG95-dEC95抗原蛋白基因的重组表达载体转化或转导宿主，得到含有所述重组表达载体的重组子；
步骤(3)培养所述步骤(2)得到的重组子，表达dEG95-dEC95抗原蛋白；
以及步骤(4)纯化所述步骤(3)得到的所述dEG95-dEC95抗原蛋白，加入佐剂，得到所述抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(1)中的所述dEG95蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1序列所示，dEC95蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2序列所示。所述步骤(2)中的宿主为E.coli。所述步骤(3)中所述表达的dEG95-dEC95抗原蛋白为细胞内可溶性蛋白。
本发明还涉及所述的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗在制备预防和/或治疗棘球蚴感染的药物中的应用。
本发明所述的制备预防和/或治疗棘球蚴感染的药物的施用对象包括羊、牛、骆驼。
本发明中，大肠杆菌24a-dEG95-dEC95(Escherichia coli 24a-dEG95-dEC95)，已经于2021年6月23日递交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2021750。
大肠杆菌24a--2dEC95(Escherichia coli 24a-2dEC95)，已经于2021年6月23日递交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2021749。
大肠杆菌24a--2dEG95(Escherichia coli 24a-2dEG95)，已经于2021年6月23日递交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2021748。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)目前尚无同时抗细粒棘球蚴感染和加拿大棘球蚴感染的疫苗，本发明采用dEG95-dEC95异源二聚体蛋白作为抗原，制备的抗细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗生产成本低，生产工艺简单；
2)本发明的二联亚单位疫苗可以同时预防细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴的感染，具有安全、高效、成本低、抗原纯度高等诸多优点。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为蛋白纯化结果；其中，泳道M：蛋白标准分子量；泳道1：蛋白样品P-24a-2dEG95；泳道2：蛋白样品P-24a-2dEC95；泳道3：蛋白样品P-24a-dEG95-dEC95；泳道4：蛋白样品P-MAL-dEG95-dEC95；
图2：竞争ELISA检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：重组载体的构建
1.1基因序列的合成。
以E.coli为宿主菌，本发明对编码重组蛋白2dEG95、2dEC95、dEG95-dEC95、aEG95-aEC95的碱基序列进行了密码子的优化，优化后的碱基序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其中，将dEG95氨基酸通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链同源二聚体2dEG95；将dEC95氨基酸通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链同源二聚体2dEC95；dEG95氨基酸序列和dEC95氨基酸序列通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链异源二聚体dEG95-dEC95；aEG95氨基酸序列(如SEQ ID No.9所示)和aEC95氨基酸序列(如SEQ ID No.10所示)通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链异源二聚体aEG95-aEC95。2dEG95的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；2dEC95的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；dEG95-dEC95的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；aEG95-aEC95的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
1.2重组表达载体pET24a-dEG95-dEC95的构建。
(1)以dEG95-dEC95为模板，设计上游引物dEG95-Nde I-F和下游引物dEC95-XhoI-R，PCR扩增得到基因片段dEG95-dEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如下表1和表2所示。
表1：PCR引物名称及序列
表2：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段dEG95-dEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-dEG95-dEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
1.3重组载体pET24a-2dEG95、pET24a-2dEC95、pMAL-dEG95-dEC95参考1.2的实验步骤，分别(1)将基因序列2dEG95连接到载体pET24a，酶切位点为Nde I/Xho I，得到重组载体pET24a-2dEG95，所用克隆模板为2dEG95基因，所用引物dEG95-Nde I-F序列如SEQ IDNO.3所示，和引物dEG95-Xho I-R序列如SEQ ID No.12所示；(2)将基因序列2dEC95连接到载体pET24a，酶切位点为Nde I/Xho I，得到重组载体pET24a-2dEC95，所用克隆模板为2dEC95基因，所用引物dEG95-Nde I-F序列如SEQ ID No.3所示，和引物dEC95-Xho I-R序列如SEQ ID No.4所示；(3)将基因序列dEG95-dEC95连接到载体pMAL，酶切位点为NdeI/EcoRI，得到重组载体pMAL-dEG95-dEC95，所用克隆模板为dEG95-dEC95基因，所用引物dEG95-Nde I-F序列如SEQ ID No.3所示，和引物dEC95-EcoRI-R序列如SEQ ID No.13所示；(4)将基因序列aEG95-aEC95连接到载体pET24a，酶切位点为Nde I/Xho I，得到重组载体pET24a-aEG95-aEC95，所用克隆模板为aEG95-aEC95基因，所用引物aEG95-Nde I-F序列如SEQ ID No.14所示，和引物aEC95-Xho I-R序列如SEQ ID No.15所示。以上所得重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
实施例2：重组菌的构建
2.1原始种子的构建。将上述的pET24a-dEG95-dEC95、pET24a-2dEG95、pET24a-2dEC95、pMAL-dEG95-dEC95、pET24a-aEG95-aEC95分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的LB培养基平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的3ml液体培养基，37℃培养，从中取1ml菌液加入终浓度为8％的甘油，-80℃冷冻保存，分别得到重组工程菌24a-dEG95-dEC95、24a-2dEG95、24a-2dEC95、MAL-dEG95-dEC95、24a-aEG95-aEC95，作为原始种子库。
2.2原始种子的鉴定。
(1)形态和生化特性：本工程菌为革兰氏阴性短杆菌。能发酵分解葡萄糖，产酸产气；吲哚试验、甲基红试验均呈阳性；Voges-Proskauer二氏试验(V.P试验)、枸橼酸盐试验均呈阴性。
(2)培养特性：在LB固体培养基上生长形成圆形、边缘整齐、隆起、乳白色有光泽的光滑菌落。
(3)纯粹检验：按《中华人民共和国兽药典》附录中纯粹检验法进行检验，结果纯粹。
实施例3：重组菌的发酵
将菌株接种到500mL含相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至OD600值为1.2～1.5时，按照10％的接种量，将种子液接种至5L发酵罐中进行发酵培养，当菌体OD600值达到20～25时，降低培养温度至28℃，同时添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12～14h。离心收集菌体湿重约500g。
按照每克湿菌体加10毫升重悬缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl)重悬菌体。
实施例4：重组抗原的纯化
4.1利用均质机对重悬菌液进行破碎，压力700bar，破碎4次。
4.2裂解液28000g离心40分钟，取上清。
4.3采用亲和层析的方式进行纯化，蛋白层析设备为AKTA pure 150m蛋白纯化仪。
(1)关于重组蛋白P-24a-dEG95-dEC95、P-24a-2dEG95、P-24a-2dEC95、P-24a-aEG95-aEC95，采用的层析填料为Ni Sepharose 6FF，平衡液为20mM Tris-HCl pH7.5，500mM NaCl，洗杂液为30mM咪唑，洗脱液为500mM咪唑；
(2)关于重组蛋白P-MAL-dEG95-dEC95，采用的层析填料为Dextrin SepharoseHigh Performance，平衡液为20mM Tris-HCl,200mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,pH7.4，洗脱液为20mM Tris-HCl,200mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,10mM maltose,pH7.4。
4.4无菌过滤。在超净工作台中，将样品用0.22μm的无菌过滤器进行除菌过滤，并分装在无菌样品瓶中。
4.5SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化情况，如图1所示，结果表明目的蛋白完全与层析柱结合，并被洗脱液洗脱。一步纯化得到的目的蛋白纯度大于85％。
实施例5：重组抗原的理化分析
5.1无菌试验。按《中华人民共和国兽药典》附录中无菌检验法进行检验，结果为无菌。
5.2抗原蛋白浓度检测和纯度检测。采用灰度分析法，取样进行SDS-PAGE电泳，用凝胶成像仪对样品的各条带浓度和纯度进行分析。结果如下表3。
表3：蛋白样品纯度及浓度结果
| 样品 | 纯度(％) | 浓度(mg/ml) |
| P-24a-dEG95-dEC95 | 91.10 | 0.85 |
| P-24a-2dEG95 | 88.50 | 0.79 |
| P-24a-2dEC95 | 85.30 | 0.74 |
| P-MAL-dEG95-dEC95 | 90.40 | 1.52 |
5.3 2017版《兽药质量标准》中收入的《羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗》质量标准中要求抗原百分含量≥15％，本发明测得的P-24a-dEG95-dEC95、P-24a-2dEG95、P-24a-2dEC95抗原百分含量分别是标准的6.07倍、5.90倍、5.69倍。
实施例6：不同佐剂样品的制备
(1)水溶性复合物佐剂GEL疫苗样品制备。
将P-24a-dEG95-dEC95抗原用PBS稀释至100μg/ml，与20％(体积百分比)GEL佐剂按照体积比1:1进行混合，4℃静置12h，得疫苗样品V-24a-dEG95-dEC95-GEL。
(2)水佐剂QuilA疫苗样品制备。
将P-24a-dEG95-dEC95抗原用PBS稀释至100μg/ml，与1mg/ml QuilA佐剂按照体积比1:1进行混合，4℃静置12h，得疫苗样品V-24a-dEG95-dEC95-QuilA。
(3)油佐剂Montanide ISA 50V疫苗样品制备。
将P-24a-dEG95-dEC95抗原用PBS稀释至100μg/ml，与Montanide ISA 50V佐剂按照体积比1:1进行乳化，4℃静置12h，得疫苗样品V-24a-dEG95-dEC95-50V。
实施例7：不同佐剂疫苗样品羔羊免疫实验
(1)筛选32只阴性羔羊，羊只要求如下表4。
表4：动物筛选要求
(2)免疫操作过程如下表5所示。
表5：免疫操作程序
(3)抗体水平检测。对采集的血清进行ELISA抗体检测。结果表明疫苗组二免后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，抗体持续期至少二免后48周，油佐剂Montanide ISA50V疫苗组明显优于其他两个疫苗组，具体如下表6、表7、表8和表9所示。
表6：V-24a-dEG95-dEC95-GEL抗体效价检测结果
表7：V-24a-dEG95-dEC95-QuilA抗体效价检测结果
表8：V-24a-dEG95-dEC95-50V抗体效价检测结果
表9：PBS抗体效价检测结果
实施例8：乳化条件的优化
根据以下优化实验，最终选择剪切转速14000rpm、剪切时间10min、油水比1:1作为最优乳化条件。
(1)优化乳化过程中使用的剪切力。分别使用12000rpm、14000rpm和16000rpm，根据乳化样品的均一性和稳定性判定，结果14000rpm优于16000rpm优于12000rpm。
(2)优化乳化时间。在适当剪切速度下，分别剪切8min、10min和12min，根据乳化样品的均一性和稳定性判定，结果10min优于12min优于8min。
(3)优化油水的比例。分别选取油水比为0.8:1、1:1和1.2:1，根据乳化样品的均一性和稳定性判定，结果1:1优于1.2:1优于0.8:1。
实施例9：不同抗原含量重组疫苗的制备
9.1取适量佐剂Montanide ISA50V，121高压灭菌30min，备用。
9.2取实施例4中纯化得到的蛋白样品P-24a-dEG95-dEC95，根据测得的浓度，用无菌PBS分别稀释至80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml。
9.3按照油:水＝1:1(v:v)的比例，准备适量的佐剂，至于烧杯中，将剪切头浸至佐剂中。
9.4预乳化。开始剪切，向正在剪切的佐剂中缓慢加入水相，确保混合均匀。
9.5乳化。14000rpm剪切速度下，剪切10分钟，延搅拌头移动烧杯确保乳化均匀。
9.6分析。乳液制备完毕，室温下放置一晚上，再进行检查。取1ml乳液，3000rpm离心30min，结果底部没有水相析出，说明乳化良好。
9.7制备得到抗原含量分别为40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的疫苗样品V-24a-dEG95-dEC95(40μg)、V-24a-dEG95-dEC95(60μg)、V-24a-dEG95-dEC95(80μg)。
实施例10：重组疫苗稳定性分析
10.1将疫苗置于玻璃瓶中，分别储存在4℃，20℃和37℃条件下，进行稳定性研究。
10.2乳化液稳定性的判定标准为：(1)样品析出层高度不大于5％；(2)保持无菌状态；(3)破乳后，与原液相比，抗原含量不低于80％。
10.3经检测疫苗样品在4℃条件下存放18个月，20℃条件下存放3个月，37℃条件下存放1个月，疫苗样品稳定。
实施例11：不同抗原含量疫苗样品羔羊免疫实验
(1)筛选32只阴性羔羊，羊只要求如下表10。
表10：动物筛选要求
(2)免疫操作过程如下表11所示。
表11：免疫操作程序
(3)抗体水平检测。对采集的血清进行ELISA抗体检测。结果表明疫苗组二免后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，抗体持续期至少二免后48周，60μg抗原含量疫苗组明显优于其他两个疫苗组，具体如下表12、表13、表14和表15所示。
表12：V-24a-dEG95-dEC95(40μg)抗体效价检测结果
表13：V-24a-dEG95-dEC95(60μg)抗体效价检测结果
表14：V-24a-dEG95-dEC95(80μg)抗体效价检测结果
表15：PBS抗体效价检测结果
实施例12：不同抗原重组疫苗的制备
12.1取适量佐剂Montanide ISA 50V，121高压灭菌30min，备用。
12.2取实施例4中纯化得到的蛋白样品P-24a-dEG95-dEC95和P-24a-aEG95-aEC95，根据测得的浓度，用无菌PBS分别稀释至120μg/ml。
12.3按照油:水＝1:1(v:v)的比例，准备适量的佐剂，至于烧杯中，将剪切头浸至佐剂中。
12.4预乳化。开始剪切，向正在剪切的佐剂中缓慢加入水相，确保混合均匀。
12.5乳化。14000rpm剪切速度下，剪切10分钟，延搅拌头移动烧杯确保乳化均匀。
12.6分析。乳液制备完毕，室温下放置一晚上，再进行检查。取1ml乳液，3000rpm离心30min，结果底部没有水相析出，说明乳化良好。
12.7制备得到的疫苗样品分别为V-24a-dEG95-dEC95和V-24a-aEG95-aEC95。
实施例13：不同抗原疫苗样品羔羊免疫实验
(1)筛选24只阴性羔羊，羊只要求如下表16。
表16：动物筛选要求
(2)免疫操作过程如下表17所示。
表17：免疫操作程序
(3)抗体水平检测。对采集的血清进行ELISA抗体检测。结果表明：同样使用60ug抗原，疫苗组二免后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，抗体持续期至少二免后48周，其中V-24a-dEG95-dEC95疫苗组二免后48周的抗体滴度全部不低于1：512，而V-24a-aEG95-aEC95疫苗组二免后48周的抗体滴度全部不高于1：256，具体如下表18、表19和表20所示。
表18：V-24a-dEG95-dEC95抗体效价检测结果
表19：V-24a-aEG95-aEC95抗体效价检测结果
表20：PBS抗体效价检测结果
实施例14：抗血清的交叉保护效果评价。
据报道细粒棘球绦虫G1型和加拿大棘球蚴绦虫G6型不存在交叉保护效果，本发明设计了竞争ELISA的实验，将抗原P-MAL-dEG95-dEC95做为包被抗原，抗V-24a-dEG95-dEC95血清分别与以下抗原孵育P-24a-dEG95-dEC95、P-24a-2dEG95、P-24a-2dEC95、P-MAL-dEG95-dEC95、P-MAL-2dEC95、PBS，抗V-24a-dEG95-dEC95血清的稀释倍数100倍。竞争ELISA检测结果如图2所示。结果表明单组分抗原EC95或者EG95均不能够阻断抗P-24a-dEG95-dEC95血清与P-MAL-dEG95-dEC95抗原的结合，进一步佐证了研发二价疫苗的必要性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 申联生物医药（上海）股份有限公司
<120> 细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法
<130> DD15187
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val
115
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val
115
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtccatatg catcaccatc atcaccacct g 31
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagt tagacggtag attctttttt accagc 36
<210> 5
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala
115 120 125
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
130 135 140
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
145 150 155 160
Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile
165 170 175
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln
180 185 190
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
195 200 205
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
210 215 220
Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys
225 230 235 240
Glu Ser Thr Val
<210> 6
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala
115 120 125
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
130 135 140
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
145 150 155 160
Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile
165 170 175
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln
180 185 190
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
195 200 205
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
210 215 220
Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys
225 230 235 240
Glu Ser Thr Val
<210> 7
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala
115 120 125
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
130 135 140
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
145 150 155 160
Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile
165 170 175
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln
180 185 190
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
195 200 205
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
210 215 220
Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys
225 230 235 240
Glu Ser Thr Val
<210> 8
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgcatcacc atcatcacca cctggcgcaa gaatacaaag gtatgggcgt ggaaactcgc 60
actaccgaaa cccctctgcg taaacacttc aatctgactc cggttggttc ccaaggtatc 120
cgtctgtctt gggaagttca gcacctgagc gatctgaaag gtaccgacat cagcctgaaa 180
gctgtgaacc cgagcgatcc gctggtatat aaacgtcaga ctgcgaaatt ctctgacggt 240
cagctgacca tcggtgaact gaaaccgtct accctgtaca aaatgactgt tgaagcggtc 300
aaagctaaaa aaaccatcct gggtttcacc gttgacatcg aaacgccgcg tgcaggcaaa 360
aaagaatcta ctgtcggcgg cggtagcggc ggcggtagcc tggcacagga atacaaaggt 420
atgggtattg aaacccgtac caccgaaact ccgctgcgta aacacttcaa cctgaccctg 480
gtcggcagcc agggtatccg tctgtcttgg gatgttcagc atctgtctga tctgaaaggc 540
accaacatct ccctgaaagc agtgaacccg tctgacccgc tggtctacaa acgtcaaacg 600
gctaaattct ccgatggtca gctgaccatt ggtgaactga aaccgagcac tctgtacaag 660
atgactgtag aagccgttaa agccaaaaaa actatcctgg aattcactgt cgacattgaa 720
actccgccgg ctggtaaaaa agaatctacc gtctaa 756
<210> 9
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val
1 5 10 15
Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr
20 25 30
Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu
35 40 45
Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser
50 55 60
Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val
85 90 95
Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile
100 105 110
Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly
115 120 125
Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val
130 135 140
Val Val Leu Thr
145
<210> 10
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile
1 5 10 15
Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr
20 25 30
Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu
35 40 45
Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser
50 55 60
Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val
85 90 95
Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile
100 105 110
Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly
115 120 125
Ser Ala Leu Thr Ser Thr Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val
130 135 140
Val Val Leu Thr
145
<210> 11
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val
1 5 10 15
Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr
20 25 30
Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu
35 40 45
Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser
50 55 60
Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val
85 90 95
Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile
100 105 110
Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly
115 120 125
Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val
130 135 140
Val Val Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Phe Ala Thr
145 150 155 160
Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr
165 170 175
Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser
180 185 190
Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys
195 200 205
Gly Thr Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val
210 215 220
Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly
225 230 235 240
Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys
245 250 255
Ala Lys Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro
260 265 270
Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Thr Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val Val Val Leu Thr
290 295 300
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgctcgagt tagacagtag attctttttt gc 32
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccggaattct tagacggtag attctttttt accagc 36
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtccatatg catcaccatc atcaccacct gtt 33
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccgctcgagt taagtcagaa ctacaacgat gc 32
Claims (10)
1.一种细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗，其特征在于，包含免疫原dEG95/dEC95抗原蛋白和药学上可以接受的载体；其中，dEG95蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；dEC95蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗，其特征在于，所述dEG95蛋白为单体，或为用多肽串联起来的单链多聚体；所述dEC95蛋白为单体，或为用多肽串联起来的单链多聚体。
3.根据权利要求1所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗，其特征在于，所述二联为在不同载体中分别表达dEG95蛋白和dEC95蛋白，形成的dEG95蛋白和dEC95蛋白的混合物；或为在同一个载体中共表达dEG95蛋白和dEC95蛋白，形成的dEG95蛋白和dEC95蛋白的混合物。
4.根据权利要求3所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗，其特征在于，所述二联为在同一个载体表达用多肽串联起来的dEG95蛋白和dEC95蛋白，形成的单链二聚体蛋白dEG95-dEC95。
5.根据权利要求1所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗，其特征在于，所述二联亚单位疫苗中dEG95/dEC95抗原蛋白含量为40-100μg/ml。
6.根据权利要求1所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗，其特征在于，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗，其特征在于，所述二联亚单位疫苗中佐剂含量为5％-60％V/V。
8.根据权利要求1所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗，其特征在于，所述药学上可以接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂中的一种或几种；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、巨噬细胞集落刺激因子M-CSF和白介素2IL2中的一种或几种。
9.一种根据权利要求1所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将细粒棘球蚴中的dEG95抗原蛋白的基因及加拿大棘球蚴中dEC95抗原蛋白的基因修饰后进行串联，基因合成得到dEG95-dEC95基因，克隆到表达载体，得到含有dEG95-dEC95抗原蛋白基因的重组表达载体；
S2、将所述步骤S1得到的含有dEG95-dEC95抗原蛋白基因的重组表达载体转化或转导宿主，得到含有所述重组表达载体的重组子；
S3、培养所述步骤S2得到的重组子，表达dEG95-dEC95抗原蛋白；
S4、纯化所述步骤S3得到的dEG95-dEC95抗原蛋白，加入药学上可以接受的载体，得到所述二联亚单位疫苗。
10.根据权利要求9所述的细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述dEG95-dEC95抗原蛋白为细胞内可溶性蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111034464.0A CN115737793A (zh) | 2021-09-03 | 2021-09-03 | 细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111034464.0A CN115737793A (zh) | 2021-09-03 | 2021-09-03 | 细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115737793A true CN115737793A (zh) | 2023-03-07 |
Family
ID=85331962
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111034464.0A Pending CN115737793A (zh) | 2021-09-03 | 2021-09-03 | 细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115737793A (zh) |
-
2021
- 2021-09-03 CN CN202111034464.0A patent/CN115737793A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20040247617A1 (en) | Fusion antigen used as vaccine | |
| JP5097544B2 (ja) | 炭疽菌からの防御抗原の調製 | |
| CN108586618B (zh) | 一种猪流行性腹泻亚单位疫苗的制备及应用 | |
| CN113058032B (zh) | 一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN113845576B (zh) | 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用 | |
| CN107812183B (zh) | 一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| CN102276730A (zh) | 金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白制备方法及其应用 | |
| CN106279431B (zh) | 一种猪圆环病毒亚单位灭活疫苗 | |
| CN109395072B (zh) | 一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法 | |
| CN109021115B (zh) | 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗 | |
| CN111925426B (zh) | 一种产气荚膜梭菌α毒素突变体、表达系统、制备方法及应用 | |
| WO2017113050A1 (zh) | 猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物 | |
| CN109207502A (zh) | 猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型重组蛋白及制备二联疫苗 | |
| CN111973738A (zh) | 一种基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗、制备方法及应用 | |
| US20030165526A1 (en) | Vaccines and agents for inducing immunity against rickettsial diseases, and associated preventative therapy | |
| CN115737793A (zh) | 细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴二联亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN110041437B (zh) | 一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白 | |
| CN117003885A (zh) | H5n8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用 | |
| CN1864746B (zh) | 幽门螺杆菌AhpC-NapA融合基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN104854128A (zh) | 牛流感病毒组合物 | |
| CN115737792A (zh) | 一种加拿大棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN110157655B (zh) | 一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用 | |
| CN111978380A (zh) | 野生型气肿疽梭菌细胞毒素a及其制备方法、应用和疫苗 | |
| CN107827986B (zh) | 猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗 | |
| CN111944028A (zh) | 产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |