CN105517569A

CN105517569A - 狂犬病疫苗

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Publication number: CN105517569A
Application number: CN201480045804.1A
Authority: CN
Inventors: 玛吉特·施内; 托马斯·克兰普斯; 洛塔尔·施蒂茨; 本亚明·佩奇
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Curevac SE
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2016-04-20
Also published as: US20200268908A1; CA2915712A1; US12083190B2; RU2712743C2; WO2015024665A1; RU2016109940A; US20160166711A1; US10682426B2; US11369694B2; AU2014310931B2; CN110195072A; US20220288239A1; AU2014310931A1; BR112016001192A2

Abstract

本发明涉及包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区的mRNA序列。另外，本发明涉及包含多个mRNA序列的组合物，所述mRNA序列包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区。此外，本发明还公开所述mRNA序列或包含多个mRNA序列的组合物在制备药物组合物、尤其是疫苗中的应用，例如，所述药物组合物、尤其是疫苗用于预防或治疗狂犬病病毒感染。本发明还描述了使用所述mRNA序列治疗或预防狂犬病的方法。

Description

狂犬病疫苗

本发明涉及包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区的mRNA序列。另外，本发明涉及包含多个mRNA序列的组合物，所述mRNA序列包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区。

此外，本发明还公开所述mRNA序列或包含多个mRNA序列的组合物在制备药物组合物、尤其是疫苗中的应用，例如，所述药物组合物、尤其是疫苗用于预防、暴露后预防或治疗狂犬病病毒感染。本发明还描述了使用所述mRNA序列治疗、暴露后预防或预防狂犬病的方法。

狂犬病是病毒性人畜共通传染病，在多于100个国家和地区中流行(WHO流行病学记录2007a.No.49/50(82)：425-436.Rabiesvaccines：WHOpositionpaper(狂犬病疫苗：WHO意见书))，并且对30亿人产生威胁(KnobelDL等人.Re-evaluatingtheburdenofrabiesinAfricaandAsia(重新评价非洲和亚洲的狂犬病负担).BulletinoftheWorldHealthOrganisation2005；83：360-368)。在不存在暴露后预防的条件下发生的临床症状发作之后，该疾病总是致死性的(WHO流行病学记录2010.No.32(85)：309-320.Rabiesvaccine：WHOpositionpaper(狂犬病疫苗：WHO意见书))。WHO认为每年有55000例狂犬病相关的死亡和多于1000万人的暴露后治疗(PET)(WHO每周流行病学记录，No.49/50，2007b，82：425-436)。

目前可用的狂犬病疫苗包括最广泛应用的但是具有高危险倾向的神经组织疫苗，或者较安全但是成本更高的细胞培养物和含胚卵疫苗(CCEEVs)。与神经组织疫苗相关的危险包括由于其固有的髓磷脂含量而诱导自身免疫性中枢神经系统疾病；需要多次注射，和不可靠的功效(PlotkinSA.Rabies(狂犬病).ClinInfectDis2000；30：4-12)。WHO不推荐使用神经组织疫苗，并且强烈鼓励向贫穷群体增加供应先锋的且高质量的疫苗(WHO流行病学记录2007a.No.49/50(82)：425-436.Rabiesvaccines：WHOpositionpaper(狂犬病疫苗：WHO意见书))。禽类胚胎疫苗和细胞培养物疫苗包含灭活的纯化病毒，不含神经蛋白。尽管比神经组织疫苗更安全且更有免疫原性，但是细胞培养制备方法费时且是资源密集型的，并且，尽管有WHO目前的推荐，但是，相关的成本负担在很大程度上将所述应用局限在发达国家中(WarrellMJ和WarrellDA.Intradermalpostexposurerabiesvaccineregimens(真皮内暴露后狂犬病疫苗方案).ClinInfectDis2000；31：844-845)。

使用细胞培养物疫苗的暴露前预防(PrEP)是安全的，并且推荐用于处于增加的危险中的个体(例如，实验室工作人员，兽医，动物训练者，野生生物工作者和到狂犬病流行地区的旅行者)，但是出于成本原因，其主要局限在发达国家。此外，向到非洲和亚洲国家旅行的人推荐抗-狂犬病疫苗，在那里狂犬病是地方性流行病(STIKO2011)。

在德国，例如，仅供应两种抗-狂犬病疫苗，即和“Tollwut-Impfstoff(人二倍体细胞[HDC])inaktiviert”。这些疫苗包含灭活的狂犬病病毒。两种疫苗被推荐用于暴露前和暴露后应用。在与患狂犬病的或怀疑患狂犬病的动物接触后，推荐PET(暴露后治疗)，在暴露后第0，3，7，14和28天接种。与接种组合，应该进行正确的伤口管理并同时施用狂犬病免疫球蛋白(Ig)来有效地预防该疾病。

当前问题是这些疫苗的短缺，在某些时候，这些疫苗仅可用于暴露后预防，并且不用于预防接种。然而，预防接种对于参观发展中国家的旅行者是重要的，在发展中国家，用于暴露后预防的狂犬病病毒Ig可能是不可获得的。

因此，对可以在任何时候递送的安全且有效的狂犬病疫苗存在需求。此外，急需不依赖于冷却(冷链)的温度稳定的狂犬病疫苗。

此外，对于改善狂犬病疫苗递送效率和对于开发比目前可用的细胞培养物疫苗更负担得起和更快速制备的安全有效的狂犬病疫苗存在未满足的医学需求。

因此，本发明潜在的目的是提供编码狂犬病病毒的抗原肽或蛋白的mRNA序列，其用作用于狂犬病的预防或治疗、特别是暴露前预防或暴露后预防的疫苗。此外，本发明的一个目的是提供有效的狂犬病疫苗，所述疫苗可以无需冷链进行保存，并且能够允许快速且规模化的疫苗制备。

这些目的通过后附权利要求的主题解决。特别地，按照第一方面，本发明潜在的目的通过本发明包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区的mRNA序列得以解决。

为了清楚和可读性，提供下述科学背景信息和定义。由此公开的任何技术特征可以是本发明每一个实施方案的一部分。另外的定义和解释可以提供在该公开内容的上下文中。

免疫系统：免疫系统可以保护生物体免受感染。如果病原体突破生物体的物理屏障并且进入该生物体，则先天性免疫系统提供即时的但非特异性的应答。如果病原体避开该先天性应答，脊椎动物具有第二层保护，即适应性免疫系统。此处，免疫系统在感染过程中改变其应答以改善其对病原体的识别。然后，该改善的应答在病原体被消除后以免疫记忆的形式保留，并且允许适应性免疫系统在每次遇到该病原体时建立更快且更强的攻击。根据此，免疫系统包括先天性和适应性免疫系统。这两部分的每一个包含所谓的体液和细胞成分。

免疫应答：免疫应答典型地可以是适应性免疫系统针对特定抗原的特异性反应(所谓的特异性或适应性免疫应答)或是先天性免疫系统的非特异性反应(所谓的非特异性或先天性免疫应答)。本质上，本发明涉及适应性免疫系统的特异性反应(适应性免疫应答)。具体地，其涉及针对病毒感染(如例如狂犬病)的适应性免疫应答。然而，这种特异性反应可以得到另外的非特异性反应(先天性免疫应答)的支持。因此，本发明还涉及用于同时刺激先天性和适应性免疫系统以激发有效的适应性免疫应答的化合物。

适应性免疫系统：适应性免疫系统由消除或防止病原性生长的高度专门化的、系统性的细胞和过程构成。所述适应性免疫应答提供具有识别并记忆特定病原体(以产生免疫性)并且在每次遇到所述病原体时建立更强的攻击的能力的脊椎动物免疫系统。由于体细胞高度突变(增加频率的体细胞突变过程)和V(D)J重组(抗原受体基因片段的不可逆的遗传重组)，该系统是高度适应性的。这种机制允许少量的基因产生巨大数量的不同的抗原受体，然后其在每种个体淋巴细胞上独特地表达。由于基因重排导致每种细胞的DNA中的不可逆的改变，则该细胞的所有后代(子代)都将遗传编码相同受体特异性的基因，包括记忆B细胞和记忆T细胞，它们是长久的特异性免疫性的关键细胞。免疫网络理论是关于适应性免疫系统如何工作的理论，其是基于T细胞、B细胞受体的可变区与由T细胞和B细胞产生具有可变区域的分子的可变区之间的相互作用。

适应性免疫应答：适应性免疫应答典型地理解为是抗原特异性的。抗原特异性允许产生针对特定抗原、病原体或病原体感染的细胞定制的反应。在体内由“记忆细胞”保留建立这些定制的反应的能力。如果病原体感染机体超过一次，则这些特异性记忆细胞通常迅速将其消灭。在这一情形中，适应性免疫应答的第一步是抗原呈递细胞对幼稚抗原特异性T细胞或能够诱导抗原特异性免疫应答的不同的免疫细胞的激活。这发生在幼稚T细胞通常从中流过的淋巴组织和器官中。可以作为抗原呈递细胞的细胞类型特别是树突细胞、巨噬细胞和B细胞。这些细胞中的每一种在激发免疫应答中具有不同的功能。树突细胞通过吞噬作用和大胞饮吸收抗原并且通过与例如外源抗原接触而被刺激以迁移到局部淋巴组织，它们在该处分化成成熟的树突细胞。巨噬细胞摄取颗粒抗原，诸如细菌，并且被传染物或其他适当的刺激诱导来表达MHC分子。B细胞特有的通过其受体结合可溶性蛋白抗原并使其内在化的能力对于诱导T细胞也是重要的。在MHC分子上呈递抗原导致T细胞的激活，这诱导其增殖并且分化成武装效应T细胞。效应T细胞最重要的功能是通过CD8+细胞毒性T细胞杀死感染的细胞以及通过Th1细胞激活巨噬细胞，二者共同组成细胞介导的免疫性，以及通过Th2和Th1细胞激活B细胞，从而产生不同种类的抗体，由此驱动体液免疫应答。T细胞通过其T细胞受体识别抗原，所述T细胞受体不直接识别和结合抗原，相反而是识别与在其他细胞表面上的MHC分子结合的例如病原体来源的蛋白抗原的短肽片段。

细胞免疫性/细胞免疫应答：细胞免疫性典型地涉及巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的激活以及响应抗原的各种细胞因子的释放。在更一般的方式中，细胞免疫性不涉及抗体而是涉及免疫系统细胞的激活。例如，细胞免疫应答的特征在于，激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，其能够在其表面上展示抗原表位的机体细胞(如病毒感染的细胞、具有细胞内细菌的细胞)和展示肿瘤抗原的癌细胞中诱导凋亡；激活巨噬细胞和天然杀伤细胞，允许它们破坏病原体；并且刺激细胞分泌影响适应性免疫应答和先天性免疫应答所涉及的其他细胞的功能的多种细胞因子。

体液免疫性/体液免疫应答：体液免疫性典型地是指抗体产生和可能伴随其的辅助过程。例如，体液免疫应答可以典型地特征在于，Th2激活和细胞因子产生，生发中心形成和同种异型转换，亲和力成熟和记忆细胞产生。体液免疫性还典型地可以指抗体的效应子功能，其包括病原体和毒素中和作用，经典补体激活和吞噬作用及病原体消除的调理促进。

先天性免疫系统：典型地，先天性免疫系统(也称为非特异性免疫系统)包括以非特异性方式保护宿主防御其他生物体的感染的细胞和机制。这意指先天性系统的细胞以一般方式识别病原体并且针对其反应，但是与适应性免疫系统不同，其不赋予宿主长久的或保护性的免疫性。例如，先天性免疫系统可以被病原体-相关的分子模式(PAMP)受体(例如，Toll-样受体(TLRs))的配体或其他辅助性物质激活，所述其他辅助性物质如脂多糖，TNF-α，CD40配体或细胞因子，单核因子，淋巴因子，白介素或趋化因子，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21，IL-22，IL-23，IL-24，IL-25，IL-26，IL-27，IL-28，IL-29，IL-30，IL-31，IL-32，IL-33，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，LT-β，TNF-α，生长因子和hGH，人Toll-样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的配体，鼠Toll-样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的配体，NOD-样受体的配体，RIG-I样受体的配体，免疫刺激性核酸，免疫刺激性RNA(isRNA)，CpG-DNA，抗菌剂或抗病毒剂。典型地，先天性免疫系统的反应包括通过产生化学因子招募免疫细胞至感染部位，所述化学因子包括专门的化学调节剂，称为细胞因子；激活补体级联；通过专门的白血细胞识别并且去除器官、组织、血液和淋巴中存在的外源物质；通过已知为抗原呈递的过程激活适应性免疫系统；和/或作用为针对传染物的物理和化学屏障。

佐剂/佐剂成分：佐剂或佐剂成分在最广泛意义上典型地是可以改变(例如增强)其他药剂(如药物或疫苗)的功效的试剂或组合物(例如，药学或免疫学试剂或组合物)。常规地，该术语在本发明的情形中是指作为免疫原和/或其他药物活性化合物的载体或辅助物质的化合物或组合物。其应该在广义上解释，并且是指能够增加与所讨论的佐剂一起结合或共同施用的抗原的免疫原性的广谱物质。在本发明的情形中，佐剂优选增强本发明的活性药剂的特异性免疫原性作用。典型地，“佐剂”或“佐剂成分”具有相同的意思，并且可以互换使用。例如，佐剂可以分成免疫增强剂、抗原递送系统或甚至是它们的组合。

术语“佐剂”典型地理解为不包括本身赋予免疫性的试剂。佐剂辅助免疫系统以非特异性地增强抗原-特异性的免疫应答，例如，通过促使抗原向免疫系统的呈递或诱导非特异性的先天性免疫应答而增强。此外，例如，佐剂可以优选地调节抗原特异性免疫应答，例如，通过将主要的基于Th2的抗原特异性应答转换为更多基于Th1的抗原特异性应答或反之亦然进行调节。因此，佐剂可以有利地调节细胞因子表达/分泌、抗原呈递、免疫应答的类型等。

免疫刺激性RNA：在本发明的情形中，免疫刺激性RNA(isRNA)可以典型地是本身能够诱导天性免疫应答的RNA。其通常不具有开放阅读框，并且由此不提供肽-抗原或免疫原而是激发先天性免疫应答，例如，通过与特定种类的Toll-样受体(TLR)或其他适当的受体结合而激发。然而，具有开放阅读框并且编码肽/蛋白(例如，抗原功能)的mRNAs当然也可以诱导先天性免疫应答。

抗原：根据本发明，术语“抗原”典型地是指可以由免疫系统识别并能够例如通过形成作为适应性免疫应答的一部分的抗体或抗原特异性T-细胞来触发抗原特异性免疫反应的物质。抗原可以是蛋白或肽。在这一情形中，适应性免疫应答的第一步是通过抗原呈递细胞激活幼稚抗原特异性T细胞。这发生在幼稚T细胞通常从中流过的淋巴组织和器官中。可以起抗原呈递细胞作用的三种细胞类型是树突细胞、巨噬细胞和B细胞。这些细胞中的每种在引发免疫应答中具有不同的功能。组织树突细胞通过吞噬作用和大胞饮吸收抗原并受感染刺激移动到局部淋巴组织，它们在该处分化为成熟树突细胞。巨噬细胞摄取颗粒抗原(诸如细菌)并受传染物诱导表达MHCII类分子。B细胞经由其受体结合并内在化可溶性蛋白抗原的独特能力对于诱导T细胞可能是重要的。通过在MHC分子上呈递抗原，导致T细胞的活化，这诱导其增殖和分化为武装效应T细胞。效应T细胞的最重要功能是通过CD8⁺细胞毒性T细胞杀死被感染的细胞和通过TH1细胞激活巨噬细胞，它们共同组成细胞介导的免疫性，和通过TH2和TH1细胞二者激活B细胞以产生不同种类的抗体，由此驱动体液免疫应答。T细胞通过其T细胞受体识别抗原，所述T细胞受体不直接识别和结合抗原，相反而是识别与在其他细胞表面上的MHC分子结合的短肽片段，例如病原体蛋白抗原的短肽片段。

T细胞属于两种具有不同效应子功能的主要类型。这两类通过细胞表面蛋白CD4和CD8的表达来区分。这两种T细胞类型的不同之处在于它们识别的MHC分子类型。存在两种MHC分子类型-MHCI类和MHCII类分子-其区别在于它们的结构和在身体组织上的表达模式。CD4⁺T细胞结合MHCII类分子，CD8⁺T细胞结合MHCI类分子。MHCI类和MHCII类分子在细胞之间具有不同的分布，这反映识别它们的T细胞的不同效应子功能。MHCI类分子将细胞溶质和核来源的肽(例如，来自病原体，常见地，来自病毒的肽)呈递到CD8⁺T细胞，其分化为细胞毒性T细胞，所述细胞毒性T细胞特化为杀死它们特异性识别的任何细胞。尽管组成型表达的水平从一种细胞类型到下一种而变化，但是几乎所有细胞都表达MHCI类分子。但是不仅来自病毒的病原体肽由MHCI类分子呈递，而且自身-抗原(如肿瘤抗原)也由它们呈递。MHCI类分子结合来自在细胞溶胶中降解和在内质网中运输的蛋白的肽。识别在感染的细胞表面上的MHCI类：肽复合物的CD8⁺T细胞被特化为杀死展示外源肽的任何细胞，并因此除去受病毒和其他胞质病原体感染的细胞体。识别MHCII类分子的CD4⁺T细胞(CD4⁺辅助T细胞)的主要功能是激活免疫系统的其他效应细胞。因此MHCII类分子通常存在于参与免疫应答的B淋巴细胞、树突细胞和巨噬细胞上，而不在其他组织细胞上。例如，激活巨噬细胞，从而杀死它们包埋的小泡内病原体，并且激活B细胞分泌针对外源分子的免疫球蛋白。防止MHCII类分子与内质网中的肽结合，并且由此MHCII类分子结合来自在内体中降解的蛋白的肽。它们可以捕获来自已经进入巨噬细胞小泡系统的病原体的肽，或来自通过未成熟树突细胞或B细胞免疫球蛋白受体内在化的抗原的肽。在巨噬细胞和树突细胞小泡内部大量积聚的病原体倾向于刺激TH1细胞的分化，而胞外抗原倾向于刺激TH2细胞生成。TH1细胞激活巨噬细胞的杀微生物性质并诱导B细胞产生IgG抗体，所述IgG抗体非常有效地调理胞外病原体，从而被吞噬细胞摄取，而TH2细胞通过激活幼稚B细胞分泌IgM而起始体液应答，并诱导弱调理抗体诸如IgG1与IgG3(小鼠)和IgG2与IgG4(人)以及IgA与IgE(小鼠和人)的生成。

表位：(还称为“抗原决定簇”)：在本发明的情形中，蛋白的T细胞表位或部分可以包括优选具有约6至约20个或甚至更多个氨基酸的长度的片段，例如，由MHCI类分子加工和呈递的片段，优选具有约8-约10个氨基酸的长度，例如，8，9，或10个氨基酸(或甚至11或12个氨基酸)，或通过MHCII类分子加工和呈递的片段，优选具有约13个以上氨基酸的长度，例如，13，14，15，16，17，18，19，20个或甚至更多个氨基酸，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任意部分。这些片段典型地以由所述肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别。

B细胞表位典型地是位于本文定义的(天然)蛋白或肽抗原外表面上的片段，优选地具有5至15个氨基酸，更优选地具有5至12个氨基酸，甚至更优选地具有6至9个氨基酸，其可以被抗体识别，即，以其天然形式被抗体识别。

蛋白或肽的此类表位还可以选自本文提及的所述蛋白或肽的变体中的任一种。在这一情形中，抗原决定簇可以是构象或不连续的表位，其由本文定义的蛋白或肽的片段构成，所述片段在本文定义的蛋白或肽的氨基酸序列上是不连续的，但是在三维结构上聚在一起；或者是由单一多肽链构成的连续或线性的表位。

疫苗：疫苗典型地理解为提供至少一种抗原或抗原功能的预防性或治疗性物质。所述抗原或抗原功能可以刺激机体的适应性免疫系统，从而提供适应性免疫应答。

提供抗原的mRNA：在本发明的情形中，提供抗原的mRNA典型地可以是具有至少一个可以由提供有所述mRNA的细胞或生物体翻译的开放阅读框的mRNA。该翻译的产物是可以作用为抗原、优选作用为免疫原的肽或蛋白。该产物也可以是由多于一种免疫原构成的融合蛋白，例如，由来源于相同或不同病毒蛋白的两种以上的表位、肽或蛋白组成的融合蛋白，其中所述表位、肽或蛋白可以通过接头序列连接。

双/多顺反子mRNA：mRNA典型地可以具有两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)开放阅读框(ORF)。在这种情形中，一个开放阅读框是可以翻译成肽或蛋白的数个核苷酸三联体(密码子)的序列。所述mRNA的翻译产生两种(双顺反子)或更多种(多顺反子)不同的翻译产物(假定ORFs是不相同的)。对于在真核生物中的表达，例如，所述mRNAs可以包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。

5’-帽结构：5′-帽典型地是添加在mRNA分子的5’末端的修饰的核苷酸，特别是鸟嘌呤核苷酸。优选地，5’-帽使用5′-5′-三磷酸酯键添加(还称为m7GpppN)。5′-帽结构的其他实例包括甘油基，反向脱氧非碱性残基(结构部分)，4’，5’亚甲基核苷酸，1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸，4’-硫代核苷酸，碳环核苷酸，1，5-无水己糖醇核苷酸，L-核苷酸，α-核苷酸，修饰的碱基核苷酸，苏-戊呋喃糖基核苷酸，无环3’，4’-仲核苷酸，无环3，4-二羟基丁基核苷酸，无环3，5二羟基戊基核苷酸，3’-3’-反向核苷酸结构部分，3’-3’-反向非碱性结构部分，3’-2’-反向核苷酸结构部分，3’-2’-反向非碱性结构部分，1，4-丁二醇磷酸酯，3’-氨基磷酸酯，己基磷酸酯，氨基己基磷酸酯，3’-磷酸酯，3’硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，或桥连或非桥连甲基磷酸酯结构部分。在本发明的情形中，这些修饰的5′-帽结构可以用于修饰本发明的mRNA序列。可以用在本发明的情形中的其他修饰的5′-帽结构是CAP1(m7GpppN的邻近核苷酸的核糖的甲基化)，CAP2(m7GpppN下游第2个核苷酸的核糖的甲基化)，CAP3(m7GpppN下游第3个核苷酸的核糖的甲基化)，CAP4(m7GpppN下游第4个核苷酸的核糖的甲基化)，ARCA(反向颠倒帽类似物(anti-reverseCAPanalogue))，修饰的ARCA(例如，硫代磷酸酯修饰的ARCA)，肌苷，N1-甲基-鸟苷，2’-氟-鸟苷，7-去氮杂-鸟苷，8-氧-鸟苷，2-氨基-鸟苷，LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。

蛋白的片段：在本发明的情形中，蛋白或肽的“片段”可以典型地包括本文所定义的蛋白或肽的序列，关于其氨基酸序列(或其编码核酸分子)，与原始(天然)蛋白(或其编码核酸分子)相比，其在N端和/或C端被截短。因此，所述截短可以发生在氨基酸水平上或者相应地发生在核酸水平上。故而，关于本文定义的所述片段的序列同一性可以优选地指本文定义的完整的蛋白或肽或指所述蛋白或肽的完整的(编码)核酸分子。

此外，在本发明的情形中，蛋白或肽的片段可以包含本文定义的蛋白或肽的序列，其具有例如至少5个氨基酸的长度，优选至少6个氨基酸的长度，优选至少7个氨基酸，更优选至少8个氨基酸，甚至更优选至少9个氨基酸；甚至更优选至少10个氨基酸；甚至更优选至少11个氨基酸；甚至更优选至少12个氨基酸；甚至更优选至少13个氨基酸；甚至更优选至少14个氨基酸；甚至更优选至少15个氨基酸；甚至更优选至少16个氨基酸；甚至更优选至少17个氨基酸；甚至更优选至少18个氨基酸；甚至更优选至少19个氨基酸；甚至更优选至少20个氨基酸；甚至更优选至少25个氨基酸；甚至更优选至少30个氨基酸；甚至更优选至少35个氨基酸；甚至更优选至少50个氨基酸；或甚至更优选至少100个氨基酸。例如，所述片段可以具有约6-约20个或甚至更多个氨基酸的长度，例如，通过MHCI类分子加工和呈递的片段，优选具有约8-约10个氨基酸的长度，例如，8，9，或10个氨基酸(或甚至6，7，11，或12个氨基酸)，或通过MHCII类分子加工和呈递的片段，优选具有约13个以上氨基酸的长度，例如，13，14，15，16，17，18，19，20个或甚至更多个氨基酸，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任意部分。这些片段典型地以由所述肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别，即，所述片段典型地不以其天然形式被识别。蛋白或肽的片段可以包含那些蛋白或肽的至少一个表位。此外，蛋白的结构域，如胞外结构域、胞内结构域或跨膜结构域以及蛋白的缩短或截短版本，也可以理解为包含蛋白的片段。

蛋白的变体：可以产生本发明的情形中所定义的蛋白或肽的“变体”，其具有与原始序列在一个或多个突变处不同的氨基酸序列，所述突变诸如一个或多个置换的、插入的和/或缺失的氨基酸。优选地，与全长天然蛋白相比，这些片段和/或变体具有相同的生物功能或特定的活性，例如，其特异性的抗原特性。例如，本发明的情形中所定义的蛋白或肽的“变体”与其天然序列(即，未突变的生理序列)相比可以包含保守氨基酸置换。这些氨基酸序列及其编码核苷酸序列特别都在本文定义的术语变体的涵盖下。其中来源于同一类的氨基酸彼此交换的置换称为保守置换。具体地，这些是具有脂族侧链、带正电荷或负电荷的侧链、在侧链中有芳香基团的氨基酸或是这样的氨基酸，即所述氨基酸的侧链可以参与氢键，例如，具有羟基官能的侧链。这意味着，例如，具有极性侧链的氨基酸被具有相似极性侧链的另一种氨基酸替代，或者例如，以疏水侧链为特征的氨基酸被另一种具有类似的疏水侧链的氨基酸置换(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)置换，或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。特别地，插入和置换可能在不引起三维结构改变或不影响结合区的那些序列位置。例如，使用CD光谱(圆二色谱)可以容易地确定插入或缺失对三维结构的改变(Urry，1985，Absorption，CircularDichroismandORDofPolypeptides(多肽的吸光度、圆二色性和ORD)，在：ModernPhysicalMethodsinBiochemistry(生物化学中的现代物理方法)，Neuberger等人，(编)，Elsevier，Amsterdam中)。

蛋白或肽的“变体”与所述蛋白或肽的10、20、30、50、75或100个氨基酸的片段相比可以具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性。

此外，本文定义的可以由核酸分子编码的蛋白或肽的变体还可以包含那样的序列，其中编码核酸序列的核苷酸按照遗传密码的简并性交换，而不引起所述蛋白或肽的相应氨基酸序列的改变，即，在上述意义内的一个或多个突变处，氨基酸序列或其至少部分可能没有与原始序列不同。

序列同一性：为了确定两个序列相同的百分数，所述序列例如，本文定义的核酸序列或氨基酸序列，优选由本文定义的聚合载体的核酸序列编码的氨基酸序列或氨基酸序列本身，可以比对所述序列，以随后彼此比较。因此，例如，第一序列的位置可以与第二序列的相应位置进行比较。如果第一序列中的位置被与第二序列中某位置相同的成分(残基)占据，则这两个序列在该位置是相同的。如果这不是这样的情形，则所述序列在该位置是不同的。如果与第一序列相比，在第二序列中存在插入，则可以在第一序列中插入缺口以允许进一步的比对。如果与第一序列相比，在第二序列中存在缺失，则可以在第二序列中插入缺口以允许进一步的比对。然后，两个序列相同的百分数是相同位置的数目除以位置总数(包括仅在一个序列中占据的那些位置)的函数。两个序列相同的百分数可以使用数学算法确定。可以使用的一种优选的但非限制性的数学算法的实例是Karlin等人，(1993)，PNASUSA，90：5873-5877或Altschul等人，(1997)，NucleicAcidsRes.(核酸研究)，25：3389-3402的算法。这样的算法整合在BLAST程序中。通过该程序能够鉴定与本发明的序列在某种程度上相同的序列。

蛋白或肽的衍生物：蛋白或肽的衍生物典型地理解为来源于另一种分子(如所述肽或蛋白)的分子。肽或蛋白的“衍生物”还包括包含用在本发明中的肽或蛋白的融合体。例如，融合体包含标记，诸如例如，表位，例如，FLAG表位或V5表位。例如，所述表位是FLAG表位。例如，所述标签有效用于纯化融合蛋白。

单顺反子mRNA：单顺反子mRNA可以典型地是只编码一个开放阅读框的mRNA。在这种情形中，一个开放阅读框是可以翻译成肽或蛋白的数个核苷酸三联体(triplet)(密码子)的序列。

核酸：术语核酸典型地意指任意的DNA-或RNA-分子，并且与多核苷酸同义使用。当本文中提及编码特定蛋白和/或肽的核酸或核酸序列时，所述核酸或核酸序列分别优选地还包含调节序列，所述调节序列允许其在适当的宿主(例如，人)中的表达，即，编码所述特定蛋白或肽的核酸序列的转录和/或翻译。

肽：肽是氨基酸单体的聚合物。通常，所述单体通过肽键连接。术语“肽”不限制氨基酸聚合物链的长度。在本发明的一些实施方案中，例如，肽可以包含少于50个单体单位。较长的肽也称为多肽，典型地具有50-600个单体单位，更具体地是50-300个单体单位。

药物有效量：在本发明的情形中，药物有效量典型地理解为足以诱导免疫应答的量。

蛋白：蛋白典型地由折叠成3维形式的一种或多种肽和/或多肽组成，其促进生物功能。

聚胞苷酸序列：聚胞苷酸序列典型地是一段长的胞嘧啶核苷酸的序列，典型地约10至约200个胞嘧啶核苷酸，优选约10至约100个胞嘧啶核苷酸，更优选地约10至约70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选地约20至约50个或甚至约20至约30个胞嘧啶核苷酸。聚胞苷酸序列可以优选地位于核酸所包含的编码区的3’。

聚腺苷酸尾：聚腺苷酸尾也称为“3′-聚腺苷酸尾”，典型地是添加在RNA的3’端的一段多至约400个腺苷核苷酸的长的腺苷核苷酸序列，例如，约25至约400个，优选约50至约400个，更优选约50至约300个，甚至更优选约50至约250个，最优选约60至约250个腺苷核苷酸。

稳定的核酸：稳定的核酸典型地表现出增加的抵抗体内降解(例如，被外切或内切核酸酶降解)和/或离体降解(例如，通过疫苗施用之前的制备过程，例如，在制备要施用的疫苗溶液的过程中)的修饰。例如，mRNA的稳定可以通过提供5’-帽结构、聚腺苷酸尾、或任意其他的UTR修饰而实现。其还可以通过核酸的主链修饰或G/C含量的修饰而实现。多种其他方法在本领域中是已知的，并且可以在本发明的情形中想到。

载体/聚合载体：在本发明的情形中的载体典型地可以是促进另一种化合物的转运和/或复合的化合物。所述载体可以与所述另一种化合物形成复合物。聚合载体是由聚合物形成的载体。

阳离子组分：术语“阳离子组分”典型地是指带电荷的分子，在典型地约1-9的pH值，优选等于或低于9(例如5-9)，等于或低于8(例如5-8)、等于或低于7(例如5-7)的pH值，最优选在生理pH值，例如，约7.3-7.4，所述分子带正电荷(阳离子)。因此，本发明所述的阳离子肽、蛋白或聚合物在生理条件下、特别是在体内细胞的生理盐条件下带正电荷。阳离子肽或蛋白包含比其他氨基酸残基更多数量的阳离子氨基酸，例如，更多数量的Arg、His、Lys或Orn(特别地，比如Asp或Glu的阴离子氨基酸残基更多的阳离子氨基酸)，或包含主要由阳离子氨基酸残基形成的单位(blocks)。定义“阳离子”还可以是指“聚阳离子”组分。

赋形剂：试剂，例如，载体，其典型地可以用在药物组合物或疫苗内用于促进所述药物或疫苗的组分对个体的施用。

3’-不翻译区(3’UTR)：3’UTR典型地是mRNA的一部分，其位于mRNA的蛋白编码区(即开放阅读框)和聚腺苷酸序列之间。mRNA的3’UTR不翻译成氨基酸序列。3’UTR序列通常由在基因表达过程中转录成各个mRNA的基因编码。基因组序列首先转录成不成熟的mRNA，其包含可选的内含子。然后，所述不成熟的mRNA在成熟过程中进一步加工成成熟的mRNA。该成熟过程包括下述步骤：5’-加帽，剪接不成熟的mRNA剪接以切除可选的内含子，和3’-末端修饰，如不成熟的mRNA3’-末端的多聚腺苷化，和可选的内切或外切核酸酶切割等。在本发明的情形中，3’UTR对应于成熟mRNA的这样的序列，所述序列位于蛋白编码区终止密码子的3’，优选紧接着蛋白编码区的终止密码子的3’，并且延伸至聚腺苷酸序列的5’-端，优选至紧接着聚腺苷酸序列的5’核苷酸。术语“对应于”意指所述3’UTR序列可以是用于限定3’UTR的RNA序列(如在mRNA序列中)或是对应于所述RNA序列的DNA序列。在本发明的情形中，术语“基因的3’UTR”，诸如“白蛋白基因的3’UTR”是对应于来源于该基因的成熟mRNA的3’UTR的序列，即，通过该基因的转录和不成熟mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3’UTR”包括3’UTR的DNA序列和RNA序列。

5’-不翻译区(5’UTR)：5’-UTR典型地理解为信使RNA(mRNA)的特定部分。其位于mRNA开放阅读框的5’。典型地，5’UTR起始与转录起点并且终止于开放阅读框起始密码子前的一个核苷酸。5’-UTR可以包含控制基因表达的元件，其也称为调节元件。例如，所述调节元件可以是核糖体结合位点或5’-末端寡聚嘧啶片段。5’UTR可以在转录后被修饰，例如，通过添加5’-帽而被修饰。在本发明的情形中，5’UTR对应于成熟mRNA位于5’-帽与起始密码子之间的序列。优选地，5’UTR对应于这样的序列，所述序列从位于5’-帽的3’的核苷酸，优选从紧挨着位于5’-帽的3’的核苷酸延伸至位于蛋白编码区起始密码子的5’的核苷酸，优选延伸至紧挨着位于蛋白编码区起始密码子的5’的核苷酸。紧挨着位于成熟mRNA的5’-帽的3’的核苷酸典型地对应于转录起点。术语“对应于”意指所述5’UTR序列可以是用于限定5’UTR的RNA序列(如在mRNA序列中)或是对应于所述RNA序列的DNA序列。在本发明的情形中，术语“基因的5’UTR”，诸如“TOP基因的5’UTR”是对应于来源于该基因的成熟mRNA的5’UTR的序列，即，通过该基因的转录和不成熟mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的5’UTR”包括5’UTR的DNA序列和RNA序列。

5’末端寡聚嘧啶片段(TOP)：5’末端寡聚嘧啶片段(TOP)典型地是位于核酸分子5’末端的嘧啶核苷酸片段，诸如特定mRNA分子的5’末端区或特定基因的功能实体(例如，转录的区域)的5’末端区。所述序列以胞苷起始，其通常对应于转录起点，接着是通常约3-30个嘧啶核苷酸的片段。例如，TOP可以包含3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30个或甚至更多个核苷酸。所述嘧啶片段以及由此的5’TOP终止于位于TOP下游的第一个嘌呤核苷酸的5’的一个核苷酸。包含5′末端寡聚嘧啶片段的信使RNA通常称为TOPmRNA。因此，提供所述信使RNAs的基因称为TOP基因。例如，TOP序列已经发现存在于编码肽延伸因子和核糖体蛋白的基因和mRNAs中。

TOP基序：在本发明的情形中，TOP基序是对应于上文定义的5’TOP的核酸序列。因此，在本发明的情形中，TOP基序优选是具有3-30个核苷酸的长度的嘧啶核苷酸片段。优选地，TOP-基序由至少3个嘧啶核苷酸组成，优选由至少4个嘧啶核苷酸、优选至少5个嘧啶核苷酸、更优选至少6个嘧啶核苷酸、更优选至少7个嘧啶核苷酸、更优选至少8个嘧啶核苷酸组成，其中所述嘧啶核苷酸片段优选地在其5’末端以胞嘧啶核苷酸起始。在TOP基因和TOPmRNAs中，TOP-继续优选地在其5’末端以转录起点起始，并且终止于所述基因或mRNA中第一个嘌呤残基的5’的一个核苷酸。在本发明的意义中，TOP继续优选地位于表示5’UTR的序列的5’末端或位于编码5’UTR的序列的5’末端。因此，优选地，在本发明的意义中，如果该片段位于各自序列(如本发明的mRNA，本发明的mRNA的5’UTR元件，或来源于本文定义的TOP基因的5’UTR的核酸序列)的5’末端，则3个以上嘧啶核苷酸的片段称为“TOP基序”。换言之，不是位于5’UTR或5’UTR元件的5’末端而是位于5’UTR或5’UTR元件内的任意位置的3个以上嘧啶核苷酸的片段优选地不称为“TOP基序”。

TOP基因：TOP基因典型地特征在于存在5’末端寡聚嘧啶片段。此外，大部分TOP基因特征在于生长相关的翻译调节。然而，还已知具有组织特异性翻译调节的TOP基因。如上文定义，TOP基因的5’UTR对应于来源于TOP基因的成熟mRNA的5’UTR，其优选地从位于5’-帽3’的核苷酸延伸至位于起始密码子5’的核苷酸。TOP基因的5’UTR典型地不包含任何起始密码子，优选地没有上游AUGs(uAUGs)或上游开放阅读框(uORFs)。此处，上游AUGs和上游开放阅读框典型地理解为存在于应该被翻译的开放阅读框的起始密码子(AUG)5’的AUGs和开放阅读框。TOP基因的5’UTRs通常相当短。TOP基因的5’UTRs的长度可以在20核苷酸至多至500核苷酸之间变化，并且典型地少于约200个核苷酸，优选地少于约150个核苷酸，更优选地少于约100个核苷酸。在本发明的意义中，示例性的TOP基因的5’UTRs是这样的核酸序列，其从专利申请WO2013/143700中SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的序列或其同源物或变体中位置5的核苷酸延伸至紧挨着位于起始密码子(例如ATG)的5’的核苷酸，所述专利申请的公开内容通过引用结合在本文中。在该情形中，TOP基因的5’UTR的特别优选的片段是缺少5’TOP基序的TOP基因的5’UTR。术语‘TOP基因的5’UTR’优选地是指天然存在的TOP基因的5’UTR。

核酸序列、特别是mRNA的片段：核酸序列的片段由连续的一段核苷酸组成，其对应于全长核酸序列中连续的一段核苷酸(其是片段的核苷酸序列的基础)，其表示所述全长核酸序列的至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少90％。在本发明的意义中，所述片段优选是所述全长核酸序列的功能片段。

核酸序列、特别是mRNA的变体：核酸序列的变体是指核酸序列的变异，其形成核酸序列的基础。例如，与变体所来源的核酸序列相比，所述变体核酸序列可以展现出一个或多个核苷酸缺失、插入、添加和/或置换。优选地，核酸序列的变体与所述变体所来源的核酸序列至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％相同。优选地，所述变体是功能性变体。与所述核酸序列的10、20、30、50、75或100个核苷酸的片段相比，核酸序列的“变体”可能具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的核苷酸同一性。

核酸序列的同源物：术语核酸序列的“同源物”是指不同于特定序列的物种的序列。特别优选的是，核酸序列是人源的，因此，优选地，同源物是人核酸序列的同源物。

喷射注射：术语“喷射注射”用在本文中是指无针注射方法，其中通过孔推动包含至少一种本发明的mRNA序列和任选地其他适当的赋形剂的流体，由此产生能够渗透哺乳动物皮的高压超细流，并且取决于注射设备，皮下组织或肌肉组织。原则上，液体流在皮肤中形成孔洞，液体流通过该孔洞压入到靶组织中。优选地，喷射注射用于皮内注射、皮下或肌内注射本发明所述的mRNA序列。在优选的实施方案中，喷射注射用于肌内注射本发明所述的mRNA序列。在另一个优选的实施方案中，喷射注射用于皮内注射本发明所述的mRNA序列。

本发明是基于本发明人令人惊讶的发现，即，包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白的编码区的mRNA序列诱导抗原特异性免疫应答，所述免疫应答中和狂犬病病毒颗粒，并且由此预防狂犬病病毒感染。对于本发明人来说，本发明的mRNA序列诱导至少与许可的由完整的灭活狂犬病病毒组成的狂犬病疫苗相同的免疫应答，是非常令人惊讶的。甚至更令人惊讶地，本发明编码狂犬病病毒的抗原蛋白的mRNA序列诱导的抗原特异性CD4+-T细胞高于许可的狂犬病疫苗。

此外，本发明人惊讶地发现本发明所述的基于mRNA的狂犬病疫苗在40℃保存6个月后，并且甚至在60℃保存1个月后都是有生物学活性的。因此，由于较之必须保存在+2至+8℃的许可疫苗，本发明所述的基于mRNA的狂犬病疫苗可以保存在环境温度，其将是发展中国家中用于暴露后预防的有吸引力的选择。

总之，本发明包含编码狂犬病病毒的至少一种抗原肽或蛋白的编码区的mRNA序列可以有助于提供负担得起的、易于获得的、温度稳定性的狂犬病疫苗，特别是用于发达国家和发展中国家的暴露前和暴露后狂犬病预防。

因此，本发明所述的mRNA序列能够允许快速的且合理的疫苗设计，具有可能超过当前基于病毒的技术的那些的制备灵活性、速度和规模性。

在该情形中，特别优选的是，本发明的mRNA序列包含编码来源于狂犬病病毒的下述至少一种抗原肽或蛋白的编码区：糖蛋白G(RAV-G)，核蛋白(RAV-N)，磷蛋白(RAV-P)，基质蛋白(RAV-M)，或RNA聚合酶(RAV-L)，或其片段、变体或衍生物。

按照本发明第一方面所述的本发明的mRNA序列的编码区可以作为单顺反子、双顺反子或甚至是多顺反子mRNA存在，即，携带一种、两种或更多种蛋白或肽的编码序列的mRNA序列。在双顺反子或甚至是多顺反子mRNAs中的所述多个编码序列可以由至少一个内部核糖体进入位点(IRES)序列隔开，例如，如本文所述，或由信号肽隔开，所述信号肽诱导所得到的包含数个蛋白或肽的多肽的切割。

按照本发明第一方面，本发明的mRNA序列包含编码区，所述编码区编码至少一个来源于狂犬病病毒的下述蛋白的抗原肽或蛋白：糖蛋白G(RAV-G)，核蛋白(RAV-N)，磷蛋白(RAV-P)，基质蛋白(RAV-M)或RNA聚合酶(RAV-L)，或其片段、变体或衍生物。

在本发明第一方面的特别优选的实施方案中，本发明的mRNA序列包含编码区，所述编码区编码来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)或其片段、变体或衍生物的至少一个抗原肽或蛋白。

在该情形中，所述至少一个抗原肽或蛋白的氨基酸序列可以选自来源于下述的任何肽或蛋白：任意狂犬病病毒分离株的糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白N(RAV-N)、磷蛋白P(RAV-P)、基质蛋白M(RAV-M)、RNA聚合酶L(RAV-L)，或其片段、变体或衍生物，或者选自任意合成改造的狂犬病肽或蛋白。

在一个特别优选的实施方案中，包含在本发明的mRNA中的编码区编码糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白N(RAV-N)、磷蛋白P(RAV-P)、基质蛋白M(RAV-M)或RNA聚合酶L(RAV-L)的全长蛋白。

在另一个特别优选的实施方案中，包含在本发明的mRNA中的编码区编码包含糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白N(RAV-N)、磷蛋白P(RAV-P)、基质蛋白M(RAV-M)或RNA聚合酶L(RAV-L)的至少一个表位的片段。

特别优选的是狂犬病疫苗株的氨基酸序列，优选NCBI登记号M13215所述的Pasteur疫苗株：

Pasteur疫苗株的糖蛋白G(RAV-G)：

SEQIDNo.1所述的氨基酸序列：

MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYISAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPGGNCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPGQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLVSSVIPLMHPLADPSTVFKNGDEAEDFVEVHLPDVHERISGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCWRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESYKSGGETGL

Pasteur疫苗株的核蛋白N(RAV-N)：

SEQIDNo.2所述的氨基酸序列：

MDADKIVFKVNNQVVSLKPEIIVDQYEYKYPAIKDLKKPCITLGKAPDLNKAYKSVLSCMSAAKLDPDDVCSYLAAAMQFFEGTCPEDWTSYGIVIARKGDKITPGSLVEIKRTDVEGNWALTGGMELTRDPTVPEHASLVGLLLSLYRLSKISGQSTGNYKTNIADRIEQIFETAPFVKIVEHHTLMTTHKMCANWSTIPNFRFLAGTYDMFFSRIEHLYSAIRVGTVVTAYEDCSGLVSFTGFIKQINLTAREAILYFFHKNFEEEIRRMFEPGQETAVPHSYFIHFRSLGLSGKSPYSSNAVGHVFNLIHFVGCYMGQVRSLNATVIAACAPHEMSVLGGYLGEEFFGKGTFERRFFRDEKELQEYEAAELTKTDVALADDGTVNSDDEDYFSGETRSPEAVYTRIIMNGGRLKRSHIRRYVSVSSNHQARPNSFAEFLNKTYSSDS

Pasteur疫苗株的磷蛋白P(还称为M1)(RAV-P)：

SEQIDNo.3所述的氨基酸序列：

MSKIFVNPSAIRAGLADLEMAEETVDLINRNIEDNQAHLQGEPIEVDNLPEDMGRLHLDDGKSPNPGEMAKVGEGKYREDFQMDEGEDPSLLFQSYLDNVGVQIVRQIRSGERFLKIWSQTVEEIISYVAVNFPNPPGKSSEDKSTQTTGRELKKETTPTPSQRESQSSKARMAAQTASGPPALEWSATNEEDDLSVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGILLYNFEQLKMNLDDIVKEAKNVPGVTRLARDGSKLPLRCVLGWVALANSKKFQLLVESNKLSKIMQDDLNRYTSC

Pasteur疫苗株的基质蛋白M(还称为M2)(RAV-M)：

SEQIDNo.4所述的氨基酸序列：

MNFLRKIVKNCRDEDTQKPSPVSAPLDDDDLWLPPPEYVPLKELTSKKNRRNFCINGGVKVCSPNGYSFGILRHILRSFDEIYSGNHRMVGLVKVVIGLALSGAPVPEGMNWVYKLRRTLIFQWADSRGPLEGEELEYSQEITWDDNTEFVGLQIRVSAKQCHIRGRIWCINMNSRAGQLWSDMSLQTQRSEEDKDSSLLLE

Pasteur疫苗株的RNA聚合酶L(RAV-L)：

SEQIDNo.5所述的氨基酸序列：

MLDPGEVYDDPIDPIELEAEPRGTPTVPNILRNSDYNLNSPLIEDPARLMLEWLKTGNRPYRMTLTDNCSRSFRVLKDYFKKVDLGSLKVGGMAAQSMISLWLYGAHSESNRSRRCITDLAHFYSKSSPIEKLLNLTLGNRGLRIPPEGVLSCLERVDYDNAFGRYLANTYSSYLFFHVITLYMNALDWDEEKTILALWKDLTSVDIGKDLVKFKDQIWGLLIVTKDFVYSQSSNCLFDRNYTLMLKDLFLSRFNSLMVLLSPPEPRYSDDLISQLCQLYIAGDQVLSMCGNSGYEVIKILEPYVVNSLVQRAEKFRPLIHSLGDFPVFIKDKVSQLEETFGSCARRFFRALDQFDNIHDLVFVYGCYRHWGHPYIDYRKGLSKLYDQVHIKKVIDKSYQECLASDLARRILRWGFDKYSKWYLDSRFLARDHPLTPYIKTQTWPPKHIVDLVGDTWHKLPITQIFEIPESMDPSEILDDKSHSFTRTRLASWLSENRGGPVPSEKVIITALSKPPVNPREFLKSIDLGGLPDEDLIIGLKPKERELKIEGRFFALMSWNLRLYFVITEKLLANYILPLFDALTMTDNLNKVFKKLIDRVTGQGLLDYSRVTYAFHLDYEKWNNHQRLESTEDVFSVLDQVFGLKRVFSRTHEFFQKSWIYYSDRSDLIGLREDQIYCLDASNGPTCWNGQDGGLEGLRQKGWSLVSLLMIDRESQIRNTRTKVLAQGDNQVLCPTYMLSPGLSQEGLLYELESISRNAFSIYRAVEEGASKLGLIIKKEETMCSYDFLIYGKTPLFRGNILVPESKRWARVSCVSNDQIVNLANIMSTVSTNALTVAQHSQSLIKPMRDFLLMSVQAVFHYLLFSPILKGRVYKILSAEGESFLLAMSRIIYLDPSLGGVSGMSLGRFHIRQFSDPVSEGLSFWREIWLSSHESWIHALCQEAGNPDLGERTLESFTRLLEDPTTLNIRGGASPTILLKDAIRKALYDEVDKVENSEFREAILLSKTHRDNFILFLTSVEPLFPRFLSELFSSSFLGIPESIIGLIQNSRTIRRQFRKSLSKTLEESFYNSEIHGISRMTQTPQRVGGVWPCSSERADLLREISWGRKVVGTTVPHPSEMLGLLPKSSISCTCGATGGGNPRVSVSVLPSFDQSFFCTGPLKGYLGSSTSMSTQLFHAWEKVTNVHVVKRALSLKESINWFITRDSNLAQTLIRNIVSLTGPDFPLEEAPVFKRTGSALHRFKSARYSEGGYSSVCPNLLSHISVSTDTMSDLTQDGKNYDFMFQPLMLYAQTWTSELVQRDTRLRDSTFHWHLQCNRCVRPIDDVTLETSQIFEFPDVSKRISRMVSGAVPHFQRLPDIRLRPGDFESLSGREKSHHIGSAQGLLYSILVAIHDSGYNDGTIFPVNIYGKVSPRDYLRGLARGVLIGSSICFLTRMTNININRPLELISGVISYILLRLDNHPSLYIMLREPSFREEIFSIPQKIPAAYPTTMKEGNRSILCYLQHVLRYEREVITASPENDWLWIFSDFRSAKMTYLTLITYQSHLLLQRVERNLSKSMRDNLRQLSSLMRQVLGGHGEDTLESDDNIQRLLKDSLRRTRWVDQEVRHAARTMTGDYSPNKKVSRKVGCSEWVCSAQQVAVSTSANPAPVSELDIRALSKRFQNPLISGLRVVQWATGAHYKLKPILDDLNVFPSLCLVVGDGSGGISRAVLNMFPDAKLVFNSLLEVNDLMASGTHPLPPSAIMRGGNDIVSRVIDFDSIWEKPSDLRNLATWKYFQSVQKQVNMSYDLIICDAEVTDIASINRITLLMSDFALSIDGPLYLVFKTYGTMLVNPNYKAIQHLSRAFPSVTGFITQVTSSFSSELYLRFSKRGKFFRDAEYLTSSTLREMSLVLFNCSSPKSEMQRARSLNYQDLVRGFPEEIISNPYNEMIITLIDSDVESFLVHKMVDDLELQRGTLSKVAIIIAIMIVFSNRVFNVSKPLTDPLFYPPSDPKILRHFNICCSTMMYLSTALGDVPSFARLHDLYNRPITYYFRKQVILGNVYLSWSWSNDTSVFKRVACNSSLSLSSHWIRLIYKIVKTTRLVGSIKDLSGEVERHLHRYNRWITLENIRSRSSLLDYSCLCIGYSWKPAHAKTLV

另外特别优选的是NCBI登记号GU565703所述的Flury-LEP疫苗株(用于)的氨基酸序列：

Flury-LEP疫苗株的糖蛋白G(RAV-G)：

SEQIDNo.6所述的氨基酸序列：

MVPQVLLFVPLLGFSLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSEFSYMELKVGYISAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVTDLDPYDKSLHSRVFPGGNCSGITVSSTYCSTNHDYTIWMPENLRLGTSCDIFTNSRGKRASKGGKTCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSDETKWCPPGQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGSDGHVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLMHPLADPSTVFKDGDEVEDFVEVHLPDVHEQVSGVELGLPNWGKYVLMIAGALIALMLIIFLMTCCRRVNRPESTQSSLGETGRNVSVTSQSGKVISSWESYKSGGETRL

Flury-LEP疫苗株的核蛋白N(RavN)：

SEQIDNo.7所述的氨基酸序列：

MDADKIVFKVNNQVVSLKPEIIVDQYEYKYPAIKDLKKPCITLGKAPDLNKAYKSVLSGMNAAKLDPDDVCSYLAAAMQFFEGTCPEDWTSYGILIARKGDKITPDSLVEIKRTDVEGNWALTGGMELTRDPTVSEHASLVGLLLSLYRLSKISGQNTGNYKTNIADRIEQIFETAPFVKIVEHHTLMTTHKMCANWSTIPNFRFLAGTYDMFFSRIEHLYSAIRVGTVVTAYEDCSGLVSFTGFIKQINLTAREAILYFFHKNFEEEIRRMFEPGQETAVPHSYFIHFRSLGLSGKSPYSSNAVGHVFNLIHFVGCYMGQVRSLNATVIAACAPHEMSVLGGYLGEEFFGKGTFERRFFRDEKELQEYEAAELTKTDVALADDGTVNSDDEDYFSGETRSPEAVYTRIMMNGGRLKRSHIRRYVSVSSNHQARPNSFAEFLNKTYSSDS

Flury-LEP疫苗株的磷蛋白P(RavP)：

SEQIDNo.8所述的氨基酸序列：

MSKIFVNPSAIRAGLADLEMAEETVDLINRNIEDNQAHLQGEPIEVDNLPEDMRQFHLGDEKLSNLGEMVRVGEGKYREDFQMDEGEDPNLLFQSYLDNVGVQIVRQMRSGERFLKIWSQTVEEIISYVTVNFPNPPGRSSEDKSTQTTGRFLKKETTSTLSQRESQPSKAGMVAQVASGPPSLEWSATNEEDDLSVEAEIAHQIAESFSKKYKFPSRSSGIFLYNFEQLEMNLDDIVKEAKNVPGVTRLAHDGSKIPLRCVLGWVALANSKKFQLIVEADKLSKIMQDDLDRYTSC

Flury-LEP疫苗株的基质蛋白M(RavM)：

SEQIDNo.9所述的氨基酸序列：

MNFLCKIVKNCRDEDTQKPSPVSAPPDGDDLWLPPPEYVPLKELTSKKNMRNFCINGEVKVCSPNGYSFRILRHILRSFDEIYSGNHRMIGLVKVVIGLALSGAPVPEGMNWVYKLRRTLIFQWADSRGPLEGEELEHSQEITWDDDTEFVGLQMRVSARQCHIQGRIWCINMNSRACQLWSDMSLQTQRSEEDKDSSLLLE

Flury-LEP疫苗株的RNA聚合酶L(RavL)：

SEQIDNo.10所述的氨基酸序列：

MLDPGEVYDDPIDPIESEAEPRGTPTVPNILRNSDYNLNSPLIEDSAKLMLEWLKTGNRPYRMTLTDNCSRSYKVLKDYFKKVDLGSLKVGGTAAQSMISLWLYGAHSESNRSRRCITDLAHFYSKSSPIEKLLNCTLGNRGLRIPPEGVLSCLERVDYDKAFGRYLANTYSSYLFFHVITLYMNALDWEEEKTILALWKDLTSVDTGKDLVKFKDQIWGLLVVTKDFVYSQSSNCLFDRNYTLMLKDLFLSRFNSLMILLSPPEPRYSDDLISQLCQLYIAGDQVLSLCGNSGYEVIKILEPYVVNSLVQRAEKFRPLIHSLGDFPMFIKDKVNQLEGTFGPSAKRFFRVLDQFDNIHDLVFVYGCYRHWGHPYIDYRKGLSKLYDQVHIKKVIDKSYQECLASDLARRILRWGFDKYSKWYLDSRFLALDHPLAPYIKTQTWPPKHIVDLVGDTWHKLPITQIFEIPESMDPSEILDDKSHSFTRTRLASWLSENRGGPVPSEKVIITALSKPPVNPREFLKSIDLGGLPDDDLIIGLRPKERELKIEGRFFALMSWNLRLYFVITEKLLANYILPLFDALTMTDNLNKVFKKLIDRVTGQGLLDYSRVTYAFHLDYEKWNNHQRLESTEDVFSVLDQVFGLKRVFSRTHEFFQKSWIYYSDRSDLIGLREDQIYCLDMSNGPTCWNGQDGGLEGLRQKGWSLVSLLMIDRESQTRNTRTKILAQGDNQVLCPTYMLSPGLSQEGLLYELESISRNALSIYRAIEEGASKLGLIIKKEETMCSYDFLIYGKTPLFRGNILVPESKRWARVSCISNDQIVNLANIMSTVSTNALTVAQHSQSLIKPMRDFLLMSVQAVFHYLLFSPILKGRVYKILSAEGESFLLAMSRIIYLDPSLGGVSGMSLGRFHIRQFSDPVSEGLSFWREIWLSSHESWIHALCQEAGNPDLGERTLESFTRLLEDPTTLNIKGGASPTILLKDAIRKALYDEVDKVENSEFREAILLSKTHRDNFILFLKSVEPLFPRFLSELFSSSFLGIPESIIGLIQNSRTIRRQFRKSLSRTLEESFYNSEIHGINRMTQTPQRVGRVWPCSSERADLLREISWGRKVVGTTVPHPSEMLGLLPKSSISCTCGATGGGNPRVSVSVLPSFDQSFFSRGPLKGYLGSSTSMSTQLFHAWEKVTNVHVVKRAISLKESINWFINRNSNLAQTLIRNIMSLTGPDFPLEEAPVFKRTGSALHRFKSARYSEGGYSSVCPNLLSHISVSTDTMSDLTQDGKNYDFMFQPLMLYAQTWTSELVQRDTRLRDSTFHWHLRCNRCVRPIEDITLETSQIFEFPDVSKRISRMVSGAVPHFQKLPDIRLRPGDFESLSGREKSRHIGSAQGLLYSILVAIHDSGYNDGTIFPVNIYGKVSPRDYLRGLARGILIGSSICFLTRMTNINIKRPLELISGVISYILLRLDNHPSLYIMLREPSLRGEIFSIPQKIPAAYPTTMKEGNRSILCYLQHVLRYEREVITASPENDWLWIFSDFRSAKMTYLTLITYQSHLLLQRVERNLSKSMRATLRQMGSLMRQVLGGHGEDTLESDDDIQRLLKDSLRRTRWVDQEVRHAARTMSGDYSPNKRVSRKAGCSEWVCSAQQVAVSTSANPAPVSELDIRALSKRFQNPLISGLRVVQWATGAHYKLKPILDDLNVFPSLCLVVGDGSGGISRAVLNMFPDSKLVFNSLLEVNDLMASGTHPLPPSAIMSGGDDIISRVIDFDSIWEKPSDLRNLATWRYFQSVQKQVNMSYDLIVCDAEVTDIASINRITLLMSDFALSIDGPLYLVFKTYGTMLVNPDYKAIQHLSRAFPSVTGFITQVTSSFSSELYLRFSKRGKFFRDAEYLTSSTLREMSLVLFNCSSPKSEMQRARSLNYQDLVRGFPEEIISNPYNEMIITLIDSDVESFLVHKMVDDLELQRGTLSKVAIIISIMIVFSNRVFNISKPLTDPLFYPPSDPKILRHFNICCSTMMYLSTALGDVPSFARLHDLYNRPITYYFRKQVIRGNIYLSWSWSDDTPVFKRVACNSSLSLSSHWIRLIYKIVKTTRLVGSIEDLSGEVERHLHGYNRWITLEDIRSRSSLLDYSCL

在本发明的情形中，除了本文公开的SEQIDNos.1-10所述的氨基酸序列之外，不同狂犬病病毒分离株的氨基酸序列也可以按照本发明进行使用并结合在本文中。这些不同的狂犬病病毒分离株优选表现出与SEQIDNos.1-10所述的氨基酸序列至少70％、更优选至少80％且最优选至少90％的同一性。

所述不同的狂犬病病毒分离株的实例为：

下述NCBI登记号所述的狂犬病病毒株：JQ730682，AF499686，AB569299，AB839170，AB781935，FJ959397，AB362483，EF206720，EF206718，EF206717，EF206715，EF206714，EF206713，EF206712，EF206711，EF206710，EF206709，EF206708，EF206707，EU182346，HM535790，GQ918139，EU877071，EU877070，EU877069，EU182347，M31046，EU877068，EU877067，EF542830，AB839169，JQ647510，KC169986，JX088694，JQ730682，JN609295，JN234411，HQ317918，EF206719，EF564174，EU643590，JQ946087，FJ913470HQ891318，AB645847，AB569299，AY705373，GU565704，GU565703，FJ577895，JX276550，FJ866836，FJ866835，DQ875051，DQ875050，AB128149，AB009663，AB044824，JQ944709，EU345004，EU345003，EU345002，AB608731，EF564173，JQ423952，AB618037，AB618036，AB618035，AB618034，AB618033，AB618032，AB085828，M13215，M21634，AB247437，AB247436，AB247435，AB247434，AB247433，AB247432，D42112，AB247430，AB247431

此外，在该情形中，编码来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白N(RAV-N)、磷蛋白P(RAV-P)、基质蛋白M(RAV-M)或RNA聚合酶L(RAV-L)或其片段、变体或衍生物的至少一个抗原肽或蛋白的编码区可以选白包含来源于任意狂犬病病毒分离株的编码区的任意核酸序列或其片段或变体。

特别优选的是狂犬病病毒疫苗株编码区的野生型mRNA序列，优选是NCBI登记号M13215所述的Pasteur疫苗株的编码区的野生型mRNA序列。

Pasteur疫苗株的糖蛋白G(RavG)：

SEQIDNo.11所述的编码区的野生型mRNA序列：

augguuccucaggcucuccuguuuguaccccuucugguuuuuccauuguguuuugggaaauuc

ccuauuuacacgauaccagacaagcuuggucccuggagcccgauugacauacaucaccucagcugc

ccaaacaauuugguaguggaggacgaaggaugcaccaaccugucaggguucuccuacauggaacuu

aaaguuggauacaucucagccauaaaaaugaacggguucacuugcacaggcguugugacggaggcu

gaaaccuacacuaacuucguugguuaugucacaaccacguucaaaagaaagcauuuccgcccaaca

ccagaugcauguagagccgcguacaacuggaagauggccggugaccccagauaugaagagucucua

cacaauccguacccugacuaccacuggcuucgaacuguaaaaaccaccaaggagucucucguuauc

auaucuccaaguguggcagauuuggacccauaugacagaucccuucacucgagggucuucccuggc

gggaauugcucaggaguagcggugucuucuaccuacugcuccacuaaccacgauuacaccauuugg

augcccgagaauccgagacuagggaugucuugugacauuuuuaccaauaguagagggaagagagca

uccaaagggagugagacuugcggcuuuguagaugaaagaggccuauauaagucuuuaaaaggagca

ugcaaacucaaguuauguggaguucuaggacuuagacuuauggauggaacaugggucgcgaugcaa

acaucaaaugaaaccaaauggugcccucccggucaguuggugaauuugcacgacuuucgcucagac

gaaauugagcaccuuguuguagaggaguuggucaagaagagagaggagugucuggaugcacuagag

uccaucaugaccaccaagucagugaguuucagacgucucagucauuuaagaaaacuugucccuggg

uuuggaaaagcauauaccauauucaacaagaccuugauggaagccgaugcucacuacaagucaguc

agaacuuggaaugagaucaucccuucaaaaggguguuuaagaguuggggggaggugucauccucau

guaaacgggguauuuuucaaugguauaauauuaggaccugacggcaaugucuuaaucccagag

augcaaucaucccuccuccagcaacauauggaguuguugguauccucgguuaucccccuuaug

cacccccuggcagacccgucuaccguuuucaagaacggugacgaggcugaggauuuuguugaaguu

caccuucccgaugugcacgaacggaucucaggaguugacuugggucucccgaacugggggaaguau

guauuacugagugcaggggcccugacugccuugauguugauaauuuuccugaugacaugcugg

agaagagucaaucgaucggaaccuacacaacacaaucucagagggacagggagggaggugucaguc

acuccccaaagcgggaagaucauaucuucaugggaaucauacaagagcgggggugagaccggacug

uga

Pasteur疫苗株的核蛋白N(RAV-N)：

SEQIDNo.12所述的编码区的野生型mRNA序列：

auggaugccgacaagauuguauucaaagucaauaaucagguggucucuuugaagccugagauu

aucguggaucaauaugaguacaaguacccugccaucaaagauuugaaaaagcccuguauaacucua

ggaaaggcucccgauuuaaauaaagcauacaagucaguuuuaucaugcaugagcgccgccaaacuu

gauccugacgauguauguuccuauuuggcggcggcaaugcaguuuuuugaggggacauguccg

gaagacuggaccagcuauggaaucgugauugcacgaaaaggagauaagaucaccccagguucucug

guggagauaaaacguacugauguagaagggaauugggcucugacaggaggcauggaacugacaaga

gaccccacugucccugagcaugcguccuuagucggucuucucuugagucuguauagguugagc

aaaauauccgggcaaagcacugguaacuauaagacaaacauugcagacaggauagagcagauuuuu

gagacagccccuuuuguuaaaaucguggaacaccauacucuaaugacaacucacaaaaugugugcu

aauuggaguacuauaccaaacuucagauuuuuggccggaaccuaugacauguuuuucucccgg

auugagcaucuauauucagcaaucagagugggcacaguugucacugcuuaugaagacuguucagga

cuggugucauuuacuggguucauaaaacaaaucaaucucaccgcuagagaggcaauacuauau

uucuuccacaagaacuuugaggaagagauaagaagaauguuugagccagggcaggagacagcuguu

ccucacucuuauuucauccacuuccguucacuaggcuugagugggaaaucuccuuauucauca

aaugcuguuggucacguguucaaucucauucacuuuguaggaugcuauaugggucaagucaga

ucccuaaaugcaacgguuauugcugcaugugcuccucaugaaaugucuguucuagggggcuau

cugggagaggaauucuucgggaaagggacauuugaaagaagauucuucagagaugagaaagaacuu

caagaauacgaggcggcugaacugacaaagacugacguagcacuggcagaugauggaacugucaac

ucugacgacgaggacuacuucucaggugaaaccagaaguccggaagcuguuuauacucgaaucaua

augaauggaggucgacugaagagaucgcacauacggagauaugucucagucaguuccaaucaucaa

gcucguccaaacucauucgccgaguuucuaaacaagacauauucgagugacucauaa

Pasteur疫苗株的磷蛋白P(还称为M1)(RAV-P)：

SEQIDNo.13所述的编码区的野生型mRNA序列：

augagcaagaucuuugucaauccuagugcuauuagagccggucuggccgaucuugagauggcugaa

gaaacuguugaucugaucaauagaaauaucgaagacaaucaggcucaucuccaaggggaacccaua

gaaguggacaaucucccugaggauauggggcgacuucaccuggaugauggaaaaucgcccaacccu

ggugagauggccaaggugggagaaggcaaguaucgagaggacuuucagauggaugaaggagaggau

ccuagccuccuguuccagucauaccuggacaauguuggaguccaaauagucagacaaauaagguca

ggagagagauuucucaagauauggucacagaccguagaagagauuauauccuaugucgcggucaac

uuucccaacccuccaggaaagucuucagaggauaaaucaacccagacuaccggccgagagcucaag

aaggagacaacacccacuccuucucagagagaaagccaauccucgaaagccaggauggcggcucaa

acugcuucuggcccuccagcccuugaauggucggccaccaaugaagaggaugaucuaucaguggag

gcugagaucgcucaccagauugcagaaaguuucuccaaaaaauauaaguuucccucucgauccuca

gggauacucuuguauaauuuugagcaauugaaaaugaaccuugaugauauaguuaaagaggca

aaaaauguaccaggugugacccguuuagcccgugacggguccaaacucccccuaagauguguacug

ggaugggucgccuuggccaacucuaagaaauuccaguuguuagucgaauccaacaagcugaguaaa

aucaugcaagaugacuugaaucgcuauacaucuugcuaa

Pasteur疫苗株的基质蛋白M(还称为M2)(RAV-M)：

SEQIDNo.14所述的编码区的野生型mRNA序列：

augaacuuucuacguaagauagugaaaaauugcagggacgaggacacucaaaaacccucucccgug

ucagccccucuggaugacgaugacuuguggcuuccacccccugaauacgucccgcuaaaagaacuu

acaagcaagaagaacaggaggaacuuuuguaucaacggagggguuaaaguguguagcccgaauggu

uacucguucgggauccugcggcacauucugagaucauucgacgagauauauucugggaaucauagg

auggucggguuagucaaaguaguuauuggacuggcuuugucaggagcuccagucccugagggcaug

aacuggguauacaaguugaggagaacccuuaucuuccagugggcugauuccaggggcccucuugaa

ggggaggaguuggaauacucucaggagaucacuugggaugauaauacugaguucgucggauugcaa

auaagagugagugcaaaacagugucauauccggggcagaaucugguguaucaacaugaacucgaga

gcaggucaacuauggucugacaugucucuucagacacaaagguccgaagaggacaaagauuccucu

cugcuucuagaauaa

Pasteur疫苗株的RNA聚合酶L(RAV-L)：

SEQIDNo.15所述的编码区的野生型mRNA序列：

augcucgauccuggagaggucuaugaugacccuauugacccaaucgaguuagaggcugaacccaga

ggaacccccacuguccccaacaucuugaggaacucugacuacaaucucaacucuccuuugauagaa

gauccugcuagacuaauguuagaaugguuaaaaacagggaauagaccuuaucggaugacucuaaca

gacaauugcuccaggucuuucagaguuuugaaagauuauuucaagaagguagauuuggguucc

cucaaggugggcggaauggcugcacagucaaugauuucucucugguuauauggugcccacucugaa

uccaacaggagccggagauguauaacagacuuggcccauuucuauuccaagucgucccccauagag

aagcuguuaaaucucacgcuaggaaauagagggcugagaauccccccagagggaguguuaaguugc

cuugagaggguugauuaugauaaugcauuuggaagguaucuugccaacacguauuccucuuac

uuguucuuccauguaaucaccuuauacaugaacgcccuagacugggaugaagaaaagaccauccua

gcauuauggaaagauuuaaccucaguggacaucgggaaggacuugguaaaguucaaagaccaaaua

uggggacugcugaucgugacaaaggacuuuguuuacucccaaaguuccaauugucuuuuugac

agaaacuacacacuuaugcuaaaagaucuuuucuugucucgcuucaacuccuuaauggucuua

cuuucucccccagagccccgauacucagaugacuugauaucucagcuaugccagcuguacauugcu

ggggaucaagucuugucuauguguggaaacuccggcuaugaagucaucaaaauauuggagccauau

gucgugaauaguuuaguccagagagcagaaaaguuuaggccucucauucauuccuugggagac

uuuccuguauuuauaaaagacaagguaagucaacucgaagagacguucgguuccugugcaagaagg

uucuuuagggcucuggaucaauucgacaacauacaugacuugguuuuuguguauggcuguuac

aggcauugggggcacccauauauagauuaucgaaagggucugucaaaacuauaugaucagguucac

auuaaaaaagugauagauaaguccuaccaggagugcuuagcaagcgaccuagccaggaggauccuu

agaugggguuuugauaaguacuccaagugguaucuggauucacgauuccuagcccgagaccacccc

uugacuccuuauaucaaaacccaaacauggccacccaaacauauuguagauuuggugggggauaca

uggcacaagcucccgaucacgcaaaucuuugagauuccugaaucaauggauccaucagaaauauug

gaugacaaaucacauucuuucaccagaacgagacuagcuucuuggcugucagaaaaccgagggggg

ccuguuccuagcgaaaaaguuauuaucacggcccugucuaagccgccugucaauccccgagaguuu

cugaagucuauagaccucggaggauugccagaugaagacuugauaauuggccucaagccaaaggaa

cgggaauugaagauugaaggucgauucuuugcucuaaugucauggaaucuaagauuguauuuu

gucaucacugaaaaacucuuggccaacuacaucuugccacuuuuugacgcgcugacuaugacagac

aaccugaacaagguguuuaaaaagcugaucgacagggucaccgggcaagggcuucuggacuauuca

agggucacauaugcauuucaccuggacuaugaaaaguggaacaaccaucaaagauuagagucaaca

gaggauguauuuucuguccuagaucaaguguuuggauugaagagaguguuuucuagaacacac

gaguuuuuucagaaguccuggaucuauuauucagacagaucagaccucaucggguuacgggag

gaucaaauauacugcuuagaugcguccaacggcccaaccuguuggaauggccaggauggcgggcua

gaaggcuuacggcagaagggcuggagucuagucagcuuauugaugauagauagagaaucucaaauc

aggaacacaagaaccaaaguacuagcucaaggagacaaccagguuuuauguccgacauauauguug

ucgccagggcuaucucaagaggggcuccucuaugaauuggagagcauaucaaggaaugcauuuucg

auauacagagccgucgaggaaggggcaucuaaacuagggcugaucaucaagaaagaagagaccaug

uguaguuaugacuuccucaucuauggaaaaaccccuuuguuuagagguaacauauuggugccu

gaguccaaaagaugggccagagucucuugcgucucuaaugaccaaauagucaaccucgccaauaua

augucgacaguguccaccaacgcgcuaacaguggcacaacacucucaaucuuugaucaaaccgaug

agggauuuucugcucaugucaguacaggcagucuuucacuaccugcuauuuagcccaaucuua

aagggaagaguuuacaagauucugagcgcugaaggggagagcuuucuccuagccaugucaaggaua

aucuaucuagauccuucuuugggagggguaucuggaaugucccucggaagauuccauauacga

caguucucagacccugucucugaaggguuauccuucuggagagagaucugguuaagcucccacgag

uccuggauucacgcguugugucaagaggcuggaaacccagaucuuggagagagaacacucgagagc

uucacucgccuucuagaagauccuaccaccuuaaauaucagaggaggggccaguccuaccauucua

cucaaggaugcaaucagaaaggcuuuauaugacgagguggacaagguggagaacucagaguuucga

gaggcaauccuguuguccaagacccauagagauaauuuuauacucuucuuaacaucuguugag

ccucuguuuccucgauuucucagugagcuauucaguucgucuuuuuugggaauccccgaguca

aucauuggacugauacaaaacucccgaacgauaagaaggcaguuuagaaagagucucucaaaaacu

uuagaagaauccuucuacaacucagagauccacgggauuagucggaugacccagacaccucagagg

guuggggggguguggccuugcucuucagagagggcagaucuacuuagggagaucucuuggggaaga

aaagugguaggcacgacaguuccucacccuucugagauguugggguuacuucccaaguccucu

auuucuugcacuuguggagcaacaggaggaggcaauccuagaguuucuguaucaguacucccg

ucuuuugaucagucauuuuuuugcacggggccccuaaagggguacuugggcucguccaccucu

augucgacccagcuauuccaugcaugggaaaaagucacuaauguucauguggugaagagagcucua

ucguuaaaagaaucuauaaacugguucauuacuagagauuccaacuuggcucaaacucuaauu

aggaacauugugucucugacaggcccugauuucccucuagaggaggccccuguuuucaaaaggacg

gggucagccuugcauagguucaagucugccagauacagcgaaggaggguauucuucuguaugcccg

aaccuccucucucauauuucuguuaguacagacaccaugucugauuugacccaagacgggaagaac

uacgauuucauguuccagccauugaugcuuuaugcacagacauggacaucagagcugguacagaga

gacacaaggcuaagagacucuacguuucauuggcaccuccaaugcaacaggugugugagacccauu

gacgacgugacccuggagaccucucagaucuucgaguuuccggaugugucgaaaagaauauccaga

augguuucuggggcugugccucacuuccagaggcuucccgauauccgucugagaccaggagau

uuugaaucucuaagcgguagagaaaagucucaccauaucggaucagcucaggggcucuuauacuca

aucuuaguggcaauucacgacucaggauacaaugauggaaccaucuucccugucaacauauacggc

aagguuuccccuagagacuauuugagagggcucgcaaggggaguauugauaggauccucgauuugc

uucuugacgagaaugacaaauaucaauauuaauagaccucuugaauugaucucagggguaauc

ucauauauucuccugaggcuagauaaccaucccuccuuguacauaaugcucagagaaccgucu

uuuagagaagagauauuuucuaucccucagaaaauccccgccgcuuauccaaccacuaugaaagaa

ggcaacagaucaaucuuguguuaucuccaacaugugcuacgcuaugagcgagagguaaucacggcg

ucuccagagaaugacuggcuauggaucuuuucagacuuuagaagugccaaaaugacguaccuaacc

cucauuacuuaccagucucaucuucuacuccagaggguugagagaaaccuaucuaagaguaugaga

gauaaccugcgacaauugaguuccuugaugaggcaggugcugggcgggcacggagaagauaccuua

gagucagacgacaacauucaacgacuacuaaaagacucuuuacgaaggacaagauggguggaucaa

gaggugcgccaugcagcuagaaccaugacuggagauuacagccccaacaagaaggugucccguaag

guaggauguucagaaugggucugcucugcucaacagguugcagucucuaccucagcaaacccggcc

ccugucucggagcuugacauaagggcccucucuaagagguuccagaacccuuugaucucgggcuug

agagugguucagugggcaaccggugcucauuauaagcuuaagccuauucuagaugaucucaau

guuuucccaucucucugccuuguaguuggggacgggucaggggggauaucaagggcaguccucaac

auguuuccagaugccaagcuuguguucaacagucuuuuagaggugaaugaccugauggcuucc

ggaacacauccacugccuccuucagcaaucaugaggggaggaaaugauaucgucuccagagugaua

gauuuugacucaaucugggaaaaaccguccgacuugagaaacuuggcuaccuggaaauacuuccag

ucaguccaaaagcaggucaacauguccuaugaccucauuauuugcgaugcagaaguuacugacauu

gcaucuaucaaccggauaacccuguuaauguccgauuuugcauugucuauagauggaccacuc

uauuuggucuucaaaacuuaugggacuaugcuaguaaauccaaacuacaaggcuauucaacac

cugucaagagcguuccccucggucacaggguuuaucacccaaguaacuucgucuuuuucaucu

gagcucuaccuucgauucuccaaacgagggaaguuuuucagagaugcugaguacuugaccucu

uccacccuucgagaaaugagccuuguguuauucaauuguagcagccccaagagugagaugcagaga

gcucguuccuugaacuaucaggaucuugugagaggauuuccugaagaaaucauaucaaauccu

uacaaugagaugaucauaacucugauugacagugauguagaaucuuuucuaguccacaagaug

guggaugaucuugaguuacagaggggaacucugucuaaaguggcuaucauuauagccaucaug

auaguuuucuccaacagagucuucaacguuuccaaaccccuaacugaccccuuguucuaucca

ccgucugaucccaaaauccugaggcacuucaacauauguugcaguacuaugauguaucuaucu

acugcuuuaggugacgucccuagcuucgcaagacuucacgaccuguauaacagaccuauaacuuau

uacuucagaaagcaagucauucuagggaacguuuaucuaucuuggaguugguccaacgacaccuca

guguucaaaaggguagccuguaauucuagccugagucugucaucucacuggaucagguugauu

uacaagauagugaagacuaccagacucguuggcagcaucaaggaucuauccggagaaguggaaaga

caccuucauagguacaacagguggaucacccuagagaauaucagaucuagaucaucccuacuagac

uacaguugccugugcaucggauacuccuggaagccugcccaugcuaagacucuuguguga

在本发明的情形中，除了本文公开的核酸序列之外，不同狂犬病病毒分离株的核酸序列也结合在本文中。这些不同的狂犬病病毒分离株优选表现出与SEQIDNos.11-15所述的核酸序列或其片段至少50％、60％、70％、更优选至少80％且最优选至少90％的同一性。

所述不同的狂犬病病毒分离株的实例为：

在优选的实施方案中，本发明所述的mRNA不包含报告基因或标记基因。优选地，例如，本发明所述的mRNA不编码荧光素酶；绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(如eGFP，RFP或BFP)；α-珠蛋白；次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)；β-半乳糖苷酶；半乳糖激酶；碱性磷酸酶；分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP))或抗性基因(诸如针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素和zeocin的抗性基因)。在优选的实施方案中，本发明所述的mRNA不编码荧光素酶。在另一个实施方案中，本发明所述的mRNA不编码GFP或其变体。

在更优选的实施方案中，本发明所述的mRNA不编码来源于属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)家族的病毒的蛋白(或蛋白的片段)。优选地，所述mRNA不编码来源于流感病毒、更优选来源于甲型流感病毒的蛋白。优选地，本发明所述的mRNA不编码选自由下述组成的组的甲型流感蛋白：血凝素(HA)，神经氨酸酶(NA)，核蛋白(NP)，M1，M2，NS1，NS2(NEP：核输出蛋白)，PA，PB1(碱性聚合酶1)，PB1-F2和PB2。在另一个优选的蛋白中，本发明所述的mRNA不编码卵白蛋白(OVA)或其片段。优选地，本发明所述的mRNA不编码甲型流感蛋白或卵白蛋白。

在另一个实施方案中，本发明的mRNA优选包含至少一种下述结构元件：5’-和/或3’-不翻译区元件(UTR元件)，特别是包含或由来源于TOP基因的5’-UTR或其片段、同源物或变体的核酸序列组成的5’-UTR元件，或可来源于提供稳定的mRNA的基因或其同源物、片段或变体的5’-和/或3’-UTR元件；组蛋白茎环结构，优选在其3’不翻译区中的组蛋白茎环；5’-帽结构；聚腺苷酸尾，或聚胞苷酸序列。

在本发明第一方面的优选实施方案中，本发明的mRNA包含至少一个5’-或3’-UTR元件。在该情形中，UTR元件包含这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于任意天然存在的基因的5’-或3’-UTR，或来源于基因的5’-或3’-UTR的片段、同源物或变体。优选地，按照本发明使用的5’-或3’-UTR元件与本发明mRNA序列的编码区是异源的。即使来源于天然存在的基因的5’-或3’-UTR元件是优选的，合成改造的UTR元件也可以用在本发明的情形中。

在本发明第一方面特别优选的实施方案中，本发明的mRNA序列包含至少一个5’-不翻译区元件(5’UTR元件)，其包含或由来源于TOP基因的5’UTR或来源于TOP基因的5’UTR的片段、同源物或变体的核酸序列组成。

特别优选的是，所述5’UTR元件不包含TOP-基序或5’TOP，如上文定义。

在一些实施方案中，来源于TOP基因的5’UTR的5’UTR元件的核酸序列在其3’-末端终止于位于其所来源的基因或mRNA的起始密码子(例如A(U/T)G)上游位置1，2，3，4，5，6，7，8，9或10的核苷酸。因此，所述5’UTR元件不包含蛋白编码区的任意部分。因此，优选地，本发明mRNA的唯一的蛋白编码部分是由所述编码区提供的。

来源于TOP基因的5’UTR的核酸序列是来源于真核生物的TOP基因，优选植物或动物的TOP基因，更优选脊索动物的TOP基因，甚至更优选脊椎动物的TOP基因，最优选哺乳动物的TOP基因，如人的TOP基因。

例如，所述5’UTR元件优选地选自包含或由下述核酸序列组成的5’-UTR元件：所述核酸序列来源于选自由专利申请WO2013/143700(其公开内容通过引用结合在本文中)的SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422组成的组的核酸序列，来源于专利申请WO2013/143700的SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的同源物，来源于其变体，或优选地来源于相对应的RNA序列。术语“专利申请WO2013/143700的SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的同源物”是指除智人(homosapiens)外的物种的序列，所述序列与专利申请WO2013/143700的SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422所述的序列同源。

在优选的实施方案中，所述5’UTR元件包含或由这些的核酸序列组成：所述核酸序列来源于从选自专利申请WO2013/143700的SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的核酸序列、选自专利申请WO2013/143700的SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的同源物、选自其变体或相对应的RNA序列的核苷酸位置5(即，位于所述序列的位置5的核苷酸)延伸至紧接起始密码子(位于所述序列的3’端)的5’的核苷酸位置(例如，紧接ATG序列的5’的核苷酸位置)的核酸序列。特别优选的是，所述5’UTR元件是来源于从紧接5’TOP的3’的核苷酸位置延伸至紧接选自专利申请WO2013/143700的SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的核酸序列、选自专利申请WO2013/143700的SEQIDNos.1-1363，SEQIDNO.1395，SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的同源物、选自其变体或相对应的RNA序列的起始密码子(位于所述序列的3’端)的5’的核苷酸位置(例如，紧接ATG序列的5’的核苷酸位置)的核酸序列。

在特别优选的实施方案中，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于编码核糖体蛋白的TOP基因的5’UTR或来源于编码核糖体蛋白的TOP基因的5’UTR的变体。例如，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于专利申请WO2013/143700的SEQIDNOs：67，170，193，244，259，554，650，675，700，721，913，1016，1063，1120，1138和1284-1360中任一项所述的核酸序列、相对应的RNA序列、其同源物或其如本文定义的变体的5’UTR，优选地缺少5’TOP基序。如上文所述，从位置5延伸至紧接着ATG(其位于所述序列的3’端)的5’的核苷酸的序列对应所述序列的5’UTR。

优选地，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5’UTR或来源于编码编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5’UTR的同源物或变体。例如，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于专利申请WO2013/143700的SEQIDNOs：67，259，1284-1318，1344，1346，1348-1354，1357，1358，1421和1422中任一项所述的核酸序列、相对应的RNA序列、其同源物或其如本文定义的变体的5’UTR，优选地缺少5’TOP基序。

在特别优选的实施方案中，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于核糖体蛋白大亚基32基因，优选地来源于脊椎动物核糖体蛋白大亚基32(L32)基因，更优选地来源于哺乳动物核糖体蛋白大亚基32(L32)基因，最优选地来源于人核糖体蛋白大亚基32(L32)基因，或来源于核糖体蛋白大亚基32基因的5’UTR的变体，优选地来源于脊椎动物核糖体蛋白大亚基32(L32)基因、更优选地来源于哺乳动物核糖体蛋白大亚基32(L32)基因、最优选地来源于人核糖体蛋白大亚基32(L32)基因的5’UTR的变体，其中，优选地，所述5’UTR元件不包含所述基因的5’TOP。

因此，在特别优选的实施方案中，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列与SEQIDNo.16所述的核酸序列(缺少5’端寡嘧啶片段的人核糖体蛋白大亚基32的5’-UTR：GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC；对应专利申请WO2013/143700的SEQIDNo.1368)或优选地与相对应的RNA序列有至少约40％，优选至少约50％，优选至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，甚至更优选至少约99％的同一性，或者其中所述至少一个5’UTR元件包含由由核酸序列的片段组成，所述核酸序列的片段与SEQIDNo.16所述的核酸序列或更优选地与相对应的RNA序列有至少约40％，优选至少约50％，优选至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，甚至更优选至少约99％的同一性，其中，优选地，所述片段如上文所述，即，是占全长5’UTR的至少20％等的连续核苷酸片段。优选地，所述片段表现出至少约20个核苷酸以上、优选至少约30个核苷酸以上、更优选至少约40个核苷酸以上的长度。优选地，所述片段是本文所述的功能性片段。

在一些实施方案中，本发明的mRNA包含5’UTR元件，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成，所述核酸序列来源于脊椎动物TOP基因(诸如哺乳动物，例如人TOP基因)的5’UTR，选白RPSA，RPS2，RPS3，RPS3A，RPS4，RPS5，RPS6，RPS7，RPS8，RPS9，RPS10，RPS11，RPS12，RPS13，RPS14，RPS15，RPS15A，RPS16，RPS17，RPS18，RPS19，RPS20，RPS21，RPS23，RPS24，RPS25，RPS26，RPS27，RPS27A，RPS28，RPS29，RPS30，RPL3，RPL4，RPL5，RPL6，RPL7，RPL7A，RPL8，RPL9，RPL10，RPL10A，RPL11，RPL12，RPL13，RPL13A，RPL14，RPL15，RPL17，RPL18，RPL18A，RPL19，RPL21，RPL22，RPL23，RPL23A，RPL24，RPL26，RPL27，RPL27A，RPL28，RPL29，RPL30，RPL31，RPL32，RPL34，RPL35，RPL35A，RPL36，RPL36A，RPL37，RPL37A，RPL38，RPL39，RPL40，RPL41，RPLP0，RPLP1，RPLP2，RPLP3，RPLP0，RPLP1，RPLP2，EEF1A1，EEF1B2，EEF1D，EEF1G，EEF2，EIF3E，EIF3F，EIF3H，EIF2S3，EIF3C，EIF3K，EIF3EIP，EIF4A2，PABPCI，HNRNPA1，TPT1，TUBB1，UBA52，NPM1，ATP5G2，GNB2L1，NME2，UQCRB，或来源于其同源物或变体，其中优选地，所述5’UTR元件不包含所述基因的TOP-基序或5’TOP，并且其中任选地所述5’UTR元件在其5’-末端起始于位于5’端寡嘧啶片段(TOP)下游位置1，2，3，4，5，6，7，8，9或10的核苷酸，并且其中，进一步任选地来源于TOP基因的5’UTR的5’UTR元件在其3’-末端终止于位于其所来源的基因的起始密码子(A(U/T)G)上游的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9或10的核苷酸。

在进一步特别优选的实施方案中，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于下述的5’UTR：核糖体蛋白大亚基32基因(RPL32)，核糖体蛋白大亚基35基因(RPL35)，核糖体蛋白大亚基21基因(RPL21)，ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基1，心肌(ATP5A1)基因，羟基固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)，雄激素-诱导的1基因(AIG1)，细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)，或N-酰基鞘氨醇酰胺基水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)，或来源于其变体，优选地来源于脊椎动物核糖体蛋白大亚基32基因(RPL32)，脊椎动物核糖体蛋白大亚基35基因(RPL35)，脊椎动物核糖体蛋白大亚基21基因(RPL21)，脊椎动物ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基1，心肌(ATP5A1)基因，脊椎动物羟基固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)，脊椎动物雄激素-诱导的1基因(AIG1)，脊椎动物细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)，或脊椎动物N-酰基鞘氨醇酰胺基水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)，或来源于其变体，更优选地来源于哺乳动物核糖体蛋白大亚基32基因(RPL32)，核糖体蛋白大亚基35基因(RPL35)，核糖体蛋白大亚基21基因(RPL21)，哺乳动物ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基1，心肌(ATP5A1)基因，哺乳动物羟基固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)，哺乳动物雄激素-诱导的1基因(AIG1)，哺乳动物细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)，或哺乳动物N-酰基鞘氨醇酰胺基水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)，或来源于其变体，最优选地来源于人核糖体蛋白大亚基32基因(RPL32)，人核糖体蛋白大亚基35基因(RPL35)，人核糖体蛋白大亚基21基因(RPL21)，人ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基1，心肌(ATP5A1)基因，人羟基固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)，人雄激素-诱导的1基因(AIG1)，人细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)，或人N-酰基鞘氨醇酰胺基水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或来源于其变体，其中优选地，所述5’UTR元件不包含所述基因的5’TOP。

因此，在特别优选的实施方案中，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列与专利申请WO2013/143700的SEQIDNo.1368或SEQIDNOs1412-1420所述的核酸序列或相对应的RNA序列具有至少约40％，优选至少约50％，优选至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，甚至更优选至少约99％的同一性，或者其中所述至少一个5’UTR元件包含或由核酸序列的片段组成，所述核酸序列的片段与专利申请WO2013/143700的SEQIDNo.1368或SEQIDNOs1412-1420所述的核酸序列具有至少约40％，优选至少约50％，优选至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，甚至更优选至少约99％的同一性，其中优选地，所述片段如上文所述，即，是占全长5’UTR的至少20％等的连续核苷酸片段。优选地，所述片段表现出至少约20个核苷酸以上、优选至少约30个核苷酸以上、更优选地至少约40个核苷酸以上的长度。优选地，所述片段是本文所述的功能片段。

因此，在特别优选的实施方案中，所述5’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列与SEQIDNo.26所述的核酸序列(缺少5’端寡嘧啶片段的ATP5A1的5’-UTR：GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCG-GAGTAACTGCAAAG；对应专利申请WO2013/143700的SEQIDNo.1414)或优选地与相对应的RNA序列有至少约40％，优选至少约50％，优选至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，甚至更优选至少约99％的同一性，或者其中所述至少一个5’UTR元件包含或由核酸序列的片段组成，所述核酸序列的片段与SEQIDNo.26所述的核酸序列或更优选地与相对应的RNA序列具有至少约40％，优选至少约50％，优选至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，甚至更优选至少约99％的同一性，其中，优选地，所述片段如上文所述，即，是占全长5’UTR的至少20％等的连续核苷酸片段。优选地，所述片段表现出至少约20个核苷酸以上、优选至少约30个核苷酸以上、更优选至少约40个核苷酸以上的长度。优选地，所述片段是本文所述的功能性片段。

在进一步优选的实施方案中，本发明的mRNA还包含至少一个3’UTR元件，其包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于脊索动物基因、优选脊椎动物基因、更优选地哺乳动物基因、最优选地人基因的3’UTR，或来源于脊索动物基因、优选脊椎动物基因、更优选地哺乳动物基因、最优选地人基因的3’UTR的变体。

术语‘3’UTR元件’是指包含或由来源于3’UTR或来源3’UTR的变体的核酸序列组成的核酸序列。在本发明的意义内的3’UTR元件可以表示mRNA的3’UTR。因此，在本发明的意义内，优选地，3’UTR元件可以是mRNA(优选人工mRNA)的3’UTR，或者其可以是mRNA的3’UTR的转录模板。因此，3’UTR元件优选地是对应于mRNA的3’UTR、优选对应于人工mRNA(如通过遗传改造的载体构建体转录获得的mRNA)的3’UTR的核酸序列。优选地，所述3’UTR元件实现3’UTR的功能或编码实现3’UTR的功能的序列。

优选地，本发明的mRNA包含这样的3’UTR元件：其可能来源于涉及具有增强的半衰期(这提供稳定的mRNA)的mRNA的基因，例如，下文定义和描述的3’UTR元件。

在特别优选的实施方案中，所述3’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于选自由下述组成的组的基因的3’UTR：白蛋白基因，α-珠蛋白基因，β-珠蛋白基因，酪氨酸羟化酶基因，脂氧合酶基因，和胶原蛋白α基因，如胶原蛋白α1(I)基因，或来源于选自由下述组成的组的基因的3’UTR的变体：白蛋白基因，α-珠蛋白基因，β-珠蛋白基因，酪氨酸羟化酶基因，脂氧合酶基因，和胶原蛋白α基因，如专利申请WO2013/143700的SEQIDNo.1369-1390所述的胶原蛋白α1(I)基因，专利申请WO2013/143700通过引用结合在本文中。在特别优选的实施方案中，所述3’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于白蛋白基因、优选脊椎动物白蛋白基因、更优选地哺乳动物白蛋白基因、最优选地SEQIDNo.17所述的人白蛋白基因的3’UTR。

人白蛋白3’UTRSEQIDNo.17：

CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCT

在该情形中，特别优选的是，本发明的mRNA包含含有来源于专利申请WO2013/143700的SEQIDNo.1369-1390所述的核酸的相对应RNA序列或其片段、同源物或变体的3’-UTR元件。

最优选地，所述3’-UTR元件包含来源于SEQIDNo.18所述的人白蛋白基因的片段的核酸序列：

白蛋白73’UTR

CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCT

在该情形中，特别优选的是，本发明的mRNA的3’-UTR元件包含或由SEQIDNo.18所述的核酸序列的相对应的RNA序列组成。

在另一个特别优选的实施方案中，所述3’UTR元件包含或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于α-珠蛋白基因、优选脊椎动物α-或β-珠蛋白基因、更优选地哺乳动物α-或β-珠蛋白基因、最优选地SEQIDNo.19-21所述的人α-或β-珠蛋白基因的3’UTR：

智人(Homosapiens)血红蛋白，α1(HBA1)的3’-UTR：

GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(SEQID

智人血红蛋白，α2(HBA2)的3’-UTR

GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAG(SEQIDNo：

智人血红蛋白，β(HBB)的3’-UTR

GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC

例如，所述3’UTR元件可以包含或由α-珠蛋白基因(如人α-珠蛋白基因)的3’UTR的中心、α-复合物-结合部分组成，优选为SEQIDNo.22所述：

α-珠蛋白基因的3’UTR的中心、α-复合物-结合部分(在本文中还称为“muag”)

GCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG(SEQIDNO.

在该情形中，特别优选的是，本发明mRNA的3’-UTR元件包含或由SEQIDNo.22所述的核酸序列的相对应的RNA序列或其同源物、片段或变体组成。

术语‘来源于[...]基因的3’UTR的核酸序列’优选地是指基于[...]基因的3’UTR序列或基于其部分的核酸序列，诸如基于下述基因的3’UTR或基于其部分：白蛋白基因，α-珠蛋白基因，β-珠蛋白基因，酪氨酸羟化酶基因，脂氧合酶基因，或胶原蛋白α基因，如胶原蛋白α1(I)基因，优选白蛋白基因。该术语包括对应于完整3’UTR序列的序列，其基因的全长3’UTR序列，和对应于基因的3’UTR序列的片段的序列，所述基因诸如白蛋白基因，α-珠蛋白基因，β-珠蛋白基因，酪氨酸羟化酶基因，脂氧合酶基因，或胶原蛋白α基因，如胶原蛋白α1(I)基因，优选白蛋白基因。

术语‘来源于[...]基因的3’UTR变体的核酸序列’优选是指基于基因的3’UTR序列的变体的核酸序列，诸如基于下述基因的3’UTR的变体或基于其部分，如上文所述：白蛋白基因，α-珠蛋白基因，β-珠蛋白基因，酪氨酸羟化酶基因，脂氧合酶基因，或胶原蛋白α基因，如胶原蛋白α1(I)基因。该术语包括对应于基因的3’UTR的变体的完整序列，即，基因的全长变体3’UTR序列，和对应于基因的变体3’UTR序列的片段的序列。在该情形中，片段由对应于全长变体3’UTR中的连续核苷酸片段的连续核苷酸片段组成，其占所述全长变体3’UTR的至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，even更优选至少70％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少90％。在本发明的意义中，所述变体的片段优选是本文所述的变体的功能性片段。

优选地，所述至少一个5’UTR元件和所述至少一个3’UTR元件协同作用增加上文所述的本发明的mRNA产生的蛋白生产。

在特别优选的实施方案中，本发明的包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区的mRNA包含组蛋白茎环序列/结构。所述组蛋白茎环序列优选选自WO2012/019780中公开的组蛋白茎环序列，WO2012/019780的公开内容通过引用结合在本文中。

适合用在本发明中的组蛋白茎环序列优选选自下式(I)或(II)中的至少一个：

式(I)(没有茎边界元件的茎环序列)：

式(II)(具有茎边界元件的茎环序列)：

其中：

茎1或茎2边界元件N_1-6是1-6个、优选2-6个、更优选2-5个、甚至更优选3-5个、最优选4-5个或5个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；

茎1[N_0-2GN_3-5]与元件茎2反向互补或部分反向互补，并且是5-7个核苷酸的连续序列；

其中N_0-2是0-2个、优选0-1个、更优选1个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物；

其中N_3-5是3-5个、优选4-5个、更优选4个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物，并且

其中G是鸟苷或其类似物，并且可以任选地被胞苷或其类似物替代，条件是其在茎2中的互补核苷酸胞苷被鸟苷替代；

环序列[N_0-4(U/T)N_0-4]位于元件茎1和茎2之间，并且是3-5个核苷酸、更优选4个核苷酸的连续序列；

其中每个N_0-4彼此独立地是0-4个、优选1-3个、更优选1-2个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物；并且

其中U/T表示尿苷或任选地胸苷；

茎2[N_3-5CN_0-2]与元件茎1反向互补或部分反向互补，并且是5-7个核苷酸的连续序列；

其中N_3-5是3-5个、优选4-5个、更优选4个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；

其中N_0-2是0-2个、优选0-1个、更优选1个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选白A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；并且

其中C是胞苷或其类似物，并且可以任选地被鸟苷或其类似物替代，条件是其在茎1中的互补核苷酸鸟苷被胞苷替代；

其中

茎1和茎2能够彼此碱基配对形成反向互补序列，其中碱基配对可以发生在茎1与茎2之间，例如，通过核苷酸A与U/T或G与C的沃森-克里克碱基配对或通过非沃森-克里克碱基配对，例如摆动碱基配对，反向沃森-克里克碱基配对，Hoogsteen碱基配对，反向Hoogsteen碱基配对，或者能够彼此碱基配对形成部分反向互补的序列，其中，基于一个茎中的一个或多个碱基在另一个茎的反向互补序列中不具有互补碱基，不完全的碱基配对可以发生在茎1和茎2之间。

按照本发明第一方面的进一步优选的实施方案，本发明的mRNA序列可以包含至少一种按照下列具体的式(Ia)或(IIa)中的至少一个所述的组蛋白茎环序列：

式(Ia)(没有茎边界元件的茎环序列)：

式(IIa)(具有茎边界元件的茎环序列)：

其中：

N，C，G，T和U如上文定义。

按照第一方面的另一个更特别优选的实施方案，本发明的mRNA序列可以包含至少一种按照下述具体的式(Ib)或(IIb)中的至少一个所述的组蛋白茎环序列：

式(Ib)(没有茎边界元件的茎环序列)：

式(IIb)(具有茎边界元件的茎环序列)：

其中：

N，C，G，T和U如上文定义。

特别优选的组蛋白茎环序列是SEQIDNO：23所述的序列：CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA，或更优选地是SEQIDNO：27所述的核酸序列相对应的RNA序列(CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCASEQIDNO：27)。

在本发明第一方面的特别优选的实施方案中，本发明的mRNA除了包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区之外还包含聚腺苷酸序列，其也称为聚腺苷酸尾，优选在存在于本发明的mRNA的3’-末端。当存在时，所述聚腺苷酸序列包含约25至约400个腺苷核苷酸的序列，优选约50至约400个腺苷核苷酸的序列，更优选约50至约300个腺苷核苷酸的序列，甚至更优选约50至约250个腺苷核苷酸的序列，最优选约60至约250个腺苷核苷酸的序列。在这一情形中，术语“约”是指其后数值的±10％的偏差。所述聚腺苷酸序列优选地位于本发明第一方面所述的本发明的mRNA中包含的编码区的3’。

按照进一步优选的实施方案，本发明的mRNA可以被至少10个胞嘧啶、优选至少20个胞嘧啶、更优选至少30个胞嘧啶的序列(所谓的“聚胞苷酸序列”)修饰。特别地，所述mRNA可以包含典型地约10-200个胞嘧啶核苷酸，优选约10-100个胞嘧啶核苷酸，更优选地约10-70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选地约20-50个或甚至20-30个胞嘧啶核苷酸的聚胞苷酸序列。该聚胞苷酸序列优选地位于编码区的3’，更优选地位于包含在本发明第一方面所述的本发明的mRNA中的可选的聚腺苷酸序列的3’。

在该情形中，在具体的实施方案中，本发明的mRNA序列可以包含：

a.)5’-帽结构，优选m7GpppN；

b.)编码区，所述编码区编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白，优选地来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)；

c.)聚腺苷酸序列，其优选包含64个腺苷；和

d.)任选地，聚胞苷酸序列，其优选包含30个胞嘧啶。

在本发明第一方面的一个特别优选的实施方案中，本发明包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区的mRNA优选地在5’-至3’-方向包含：

a.)5’-帽结构，优选m7GpppN；

c.)聚腺苷酸序列，其优选包含64个腺苷；

d.)任选地，聚胞苷酸序列，其优选包含30个胞嘧啶；和

e.)组蛋白茎环，其优选包含SEQIDNO：23所述的核酸序列相对应的RNA序列。

在本发明第一方面的一个进一步特别优选的实施方案中，本发明包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区的mRNA优选地在5’-至3’-方向包含：

a.)5’-帽结构，优选m7GpppN；

c.)任选地，来源于α珠蛋白基因的3’-UTR元件，其优选包含SEQIDNO.22所述的核酸序列相对应的RNA序列、其同源物、片段或变体；

d.)聚腺苷酸序列，其优选包含64个腺苷；

e.)任选地，聚胞苷酸序列，其优选包含30个胞嘧啶；和

f.)组蛋白茎环，其优选包含SEQIDNO：23所述的核酸序列相对应的RNA序列。

在另一个特别优选的实施方案中，本发明包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区的mRNA优选地在5’-至3’-方向包含：

a.)5’-帽结构，优选m7GpppN；

b.)任选地，来源于TOP基因的5’-UTR元件，其优选地来源于SEQIDNO.16所述的核酸序列相对应的RNA序列、其同源物、片段或变体；

c.)编码区，所述编码区编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白，优选地来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)；

d.)任选地，来源于提供稳定的mRNA的基因的3’UTR元件，其优选地来源于SEQIDNO.18所述的核酸序列相对应的RNA序列、其同源物、片段或变体；

e.)聚腺苷酸序列，其优选包含64个腺苷；

f.)任选地，聚胞苷酸序列，其优选包含30个胞嘧啶；和

g.)组蛋白茎环，其优选包含SEQIDNO：23所述的核酸序列相对应的RNA序列。

所述编码区可能至少部分编码SEQIDNos.1-10所述的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物中的一种。此外，本发明的mRNA的编码区可以编码这些氨基酸序列中至少两种的组合或其片段、变体或衍生物的组合。

另外，所述编码区可能是或可能至少部分包含SEQIDNo.11至SEQIDNo.15所述的序列或其片段、同源物或变体中的一种。此外，所述mRNA可能包含这些序列中至少两种的组合或其片段、同源物或变体的组合。

为了进一步提高例如针对体内降解(例如，通过核酸外切酶或核酸内切酶降解)的耐受性，本发明的mRNA可以提供为稳定的核酸，例如，以修饰的核酸的形式存在。按照本发明的进一步的实施方案，因此，优选地，本发明的mRNA被稳定，优选地通过主链修饰、糖修饰和/或碱基修饰稳定，更优选地通过改变G/C含量进行稳定。所有这些修饰可以引入到本发明的mRNA中，而不削弱所述mRNA被翻译成来源于狂犬病病毒肽或蛋白的抗原功能的功能。

在本发明的情形中，主链修饰优选是这样的修饰，即，其中本发明的mRNA中所包含的核苷酸的主链的磷酸被化学修饰，例如，阴离子核苷间连接，N3’→P5’修饰，用硼烷替代非桥接的氧原子，中性核苷间连接，核苷的酰胺连接，亚甲基(甲基亚胺基)连接，formacetal和硫代formacetal(thioformacetal)连接，引入磺酰基等。

在本发明的情形中，糖修饰优选是本发明的mRNA的核苷酸的糖的化学修饰，例如，核糖残基的甲基化等。

按照另一个实施方案，本发明的mRNA可以被修饰，并且因此通过修饰所述mRNA(优选其编码区)的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量而被稳定。

在本发明中，与其特定的野生型编码序列(即，未修饰的mRNA)编码区的G/C含量相比，本发明的mRNA(优选编码区)的G/C含量特别地被增加。然而，与特定野生型/未修饰的mRNA编码的氨基酸序列相比，本发明的mRNA所编码的氨基酸序列优选没有被修饰。

本发明的mRNA的G/C-含量的修饰是基于这样的事实，即，与具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的RNA序列相比，具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的RNA序列更稳定。因此，与其野生型编码序列或mRNA相比，编码序列或完整RNA的密码子可能是改变的，从而使其包含增加量的G/C核苷酸，但是保留翻译的氨基酸序列。关于几种密码子编码同一种氨基酸(所谓的遗传密码的简并性)的事实，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用(alternativecodonusage))。优选地，与野生型RNA编码区的G/C含量相比，本发明所述的本发明的mRNA的编码区的G/C含量增加至少7％，更优选增加至少15％，特别优选地增加至少20％。根据具体的实施方案，在编码本文定义的蛋白或肽或其片段或变体的区域中或野生型mRNA序列的完整序列或编码序列中至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％且最优选至少90％，95％或甚至100％的可取代的密码子被取代，由此增加所述序列的G/C含量。在该情形中，特别优选地是，与野生型序列相比，将本发明的mRNA的G/C含量增加至最大(100％可取代的密码子)，特别是将编码区中的G/C含量增加至最大。

按照本发明的进一步优选的实施方案，本发明的mRNA进行翻译优化，优选地通过将给定氨基酸的较不常见的tRNAs的密码子替换为各氨基酸更常见存在的tRNAs的密码子进行优化。这是基于这样的发现：翻译效率还取决于tRNAs在细胞中存在的不同频率。因此，如果在本发明的核酸序列的mRNA中存在增加程度的所谓的“较不常见的密码子”，与其中存在编码更常见的tRNAs的密码子的情形相比，相应的修饰的RNA以显著更少的程度翻译。优选地，与相对应的野生型RNA的编码区相比，本发明的mRNA的编码区优修饰，以使编码在细胞中相对稀少或较不常见的tRNA的野生型序列的至少一个密码子交换为编码在细胞中更常见或最常见的且与所述相对稀少或较不常见的tRNA携带相同的氨基酸的tRNA的密码子。通过这种修饰，本发明的mRNA的序列可以被修饰，以插入关于更经常存在的tRNAs是可用的密码子。换言之，按照本发明，通过这种修饰，编码在细胞中相对稀少的tRNA的野生型序列的所有密码子在每种情形中可以交换为编码在细胞中相对常见且在每种情形中与所述相对稀少的tRNA携带相同的氨基酸的各种tRNA的密码子。此外，特别优选地将本发明mRNA中增加的序列G/C含量(特别是最大化的)与不改变由本发明mRNA的编码区或编码区编码的蛋白的氨基酸序列的“常见”密码子联系起来。该优选实施方案允许提供特别有效地翻译和稳定的(修饰的)本发明的mRNA。

碱基的置换、添加或消除优选地使用用于制备所述核酸分子的DNA基质通过公知的定点诱变技术或使用寡核苷酸连接策略进行。在这样的方法中，为了制备本文定义的本发明的组合疫苗中的至少一种RNA，可以在体外转录相对应的DNA分子。该DNA基质优选包含合适的启动子，例如T7或SP6启动子，以用于体外转录，其后跟随着关于待制备的至少一种RNA的需要的核苷酸序列和体外转录的终止信号。形成至少一种目的RNA的基质的DNA分子可以通过发酵增殖和随后作为可以在细菌内复制的质粒的一部分分离来制备。可以作为适合于本发明提及的质粒是例如质粒pT7Ts(GenBank登记号U26404；Lai等人.，Development1995，121：2349至2360)，系列，例如，(GenBank登记号X65300；购自Promega)和pSP64(GenBank登记号X65327)；还参见Mezei和Storts，PurificationofPCRProducts(PCR产物的纯化)，在：Griffin和Griffin(编)，PCRTechnology：CurrentInnovation(PCR技术：当前创新)中，CRCPress，BocaRaton，FL，2001。

在特别优选的实施方案中，本发明第一方面所述的本发明的mRNA序列优选地在5’-至3’-方向上包含：

a)5’-帽结构，如本文定义，优选m7GpppN；

b)编码区，优选地，与野生型mRNA的编码区的G/C含量相比具有增加的甚至最大化的G/C含量，所述编码区编码来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白(RAV-N)、磷蛋白(RAV-P)、基质蛋白(RAV-M)或RNA聚合酶(RAV-L)的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物；

c)如本文定义的3’UTR元件，其优选地来源于提供稳定的mRNA的基因，最优选地来源于SEQIDNO.22所述的核酸序列相对应的RNA序列、其同源物、片段或变体；

d)聚腺苷酸序列，其优选地由64个腺苷组成；

e)任选地，聚胞苷酸序列，其优选地由30个胞嘧啶组成；

f)至少一个组蛋白茎环序列，优选SEQIDNO.23所述的核酸序列相对应的RNA序列。

最优选地，该具体实施方案的本发明的mRNA序列包含图1(SEQIDNO.24)所示的序列修饰。

在进一步优选的实施方案中，本发明第一方面所述的本发明的mRNA序列优选地在5’至3’方向上包含：

a)5’-帽结构，如本文定义，优选m7GpppN；

b)如本文定义的5’-UTR元件，优选包含或由这样的核酸序列组成，所述核酸序列来源于TOP基因的5’-UTR，优选缺少SEQIDNo.16所述的5’端寡嘧啶片段的人核糖体蛋白大亚基32的5’-UTR或相对应的RNA序列；或其片段、同源物或变体；

c)编码区，优选地，与野生型mRNA的编码区的G/C含量相比具有增加的甚至最大化的G/C含量，所述编码区编码来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白(RAV-N)、磷蛋白(RAV-P)、基质蛋白(RAV-M)或RNA聚合酶(RAV-L)的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物；

d)3’UTR元件，优选SEQIDNo.18所述的人白蛋白的3’-UTR元件或相对应的RNA，或其同源物、片段或变体；

e)聚腺苷酸序列，其优选地由64个腺苷组成；

f)任选地，聚胞苷酸序列，其优选地由30个胞嘧啶组成；

g)至少一个组蛋白茎环序列，优选SEQIDNO.23所述的核酸序列相对应的RNA序列。

最优选地，该具体实施方案的本发明的mRNA序列包含图2(SEQIDNO.25)所示的序列修饰。

在甚至更优选的实施方案中，本发明的mRNA序列包含或由图1或2所示的SEQIDNos.24和25的序列组成。

在进一步具体的实施方案中，本发明所述的mRNA可以进一步包含内部核糖体进入位点(IRES)序列或IRES-基序，其可以隔开数个开放阅读框，例如，通过本发明的mRNA编码两种以上的抗原肽或蛋白。如果mRNA是双顺反子或多顺反子mRNA，则IRES-序列可以是特别有帮助的。

另外，本发明的mRNA可以使用本领域已知的任意方法制备，包括合成方法，诸如例如固相合成，以及体外方法，诸如体外转录反应。

按照本发明的一个实施方案，包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的编码区的mRNA可以不与用于增加本发明的mRNA或另外包含的核酸的转染效率和/或免疫刺激特性的任意其他的赋形剂、转染剂或复合剂缔合裸露地进行施用。

在优选的实施方案中，本发明的mRNA可以与阳离子或聚阳离子化合物和/或与聚合载体一起配制。因此，在本发明进一步的实施方案中，优选包含在本发明的药物组合物或疫苗中的本发明的mRNA或任意其他的核酸与阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体缔合或复合，任选地以选自下述范围的重量比缔合或复合：约6∶1(w/w)至约0.25∶1(w/w)，更优选地约5∶1(w/w)至约0.5∶1(w/w)，甚至更优选地约4∶1(w/w)至约1∶1(w/w)或约3∶1(w/w)至约1∶1(w/w)，并且最优选地以约3∶1(w/w)至约2∶1(w/w)的mRNA或核酸：阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的比率缔合或复合；或者任选地以约0.1-10范围内、优选以约0.3-4或0.3-1范围内、最优选地以约0.5-1或0.7-1范围内、甚至最优选地以约0.3-0.9或0.5-0.9范围内的mRNA或核酸与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的氮/磷比率缔合或复合。

因此，包含在本发明的药物组合物或疫苗中的本发明的mRNA或任意其他核酸也可以与用于增加本发明的mRNA或任选包含的另外包括在其中的核酸的转染效率和/或免疫刺激特性的赋形剂、转染剂或复合剂缔合。

在该情形中是特别优选的试剂的阳离子或聚阳离子化合物包括鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，或其它阳离子肽或蛋白，如聚-L-赖氨酸(PLL)，聚-精氨酸，碱性多肽，细胞渗透肽(CPPs)，包括HIV结合肽，HIV-1Tat(HIV)，Tat-衍生的肽，穿膜肽(Penetratin)，VP22衍生的或类似的肽，HSVVP22(单纯疱疹(Herpessimplex))，MAP，KALA或蛋白转导结构域(PTDs)，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，一种或多种MPG-肽，Pep-1，L-寡聚体，一种或多种降钙素肽，触角足衍生肽(特别地来白果蝇触角足(Drosophilaantennapedia))，pAntp，pIs1，FGF，乳铁蛋白，Transportan，Buforin-2，Bac715-24，SynB，SynB(1)，pVEC，hCT-衍生的肽，SAP，或组蛋白。

在这一情形中，鱼精蛋白是特别优选的。

另外，优选的阳离子或聚阳离子蛋白或肽可以选自具有下述总式(III)的下述蛋白或肽：

(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x，(式(III))

其中l+m+n+o+x＝8-15，并且l，m，n或o彼此独立地可以是选白0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15的任意数字，条件是Arg，Lys，His和Orn的总含量占该寡肽全部氨基酸的至少50％；并且Xaa可以是选白除Arg、Lys、His或Orn之外的天然(＝天然存在的)或非天然氨基酸中的任一种氨基酸；x是选白0，1，2，3或4的任意数字，条件是，Xaa的总含量不超过该寡肽全部氨基酸的50％。在这一情形中，特别优选的阳离子肽是，例如，Arg₇，Arg₈，Arg₉，H₃R₉，R₉H₃，H₃R₉H₃，YSSR₉SSY，(RKH)₄，Y(RKH)₂R等。在这一情形中，WO2009/030481的公开内容通过引用结合在本文中。

可以用作转染剂或复合剂的特别优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，例如，壳聚糖，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)，阳离子聚合物，例如，聚乙烯亚胺(PEI)，阳离子脂质，例如，DOTMA：[1-(2，3-二油酰氧基)丙基)]-N，N，N-三甲基氯化铵，DMRIE，二-C14-脒，DOTIM，SAINT，DC-Chol，BGTC，CTAP，DOPC，DODAP，DOPE：二油基磷脂酰乙醇胺，DOSPA，DODAB，DOIC，DMEPC，DOGS：Dioctadecylamidoglicylspermin，DIMRI：二肉豆蔻酰-氧丙基二甲基羟乙基溴化铵，DOTAP：二油基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷，DC-6-14：O，O-双十四酰基-N-(α-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物，CLIP1：外消旋-[(2，3-双十八基氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基氯化铵，CLIP6：外消旋-[2(2，3-双十六基氧基丙基-氧基甲氧基)乙基]三甲基铵，CLIP9：外消旋-[2(2，3-双十六基氧基丙基-氧基琥珀酰基氧基)乙基]-三甲基铵，oligofectamine，或阳离子或聚阳离子聚合物，例如，修饰的聚氨基酸，诸如β-氨基酸-聚合物或反向聚酰胺(reversedpolyamides)等，改性的聚乙烯，诸如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶溴化物))等，改性的丙烯酸酯，诸如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基丙烯酸甲酯))等，改性的氨基胺(modifiedamidoamines)，如pAMAM(聚(氨基胺))等，改性的聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺末端修饰的1，4丁二醇双丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状聚合物(dendrimers)，诸如聚丙胺树枝状聚合物或基于pAMAM的树枝状聚合物等，聚亚胺，诸如PEI：聚(乙烯亚胺)，聚(丙烯亚胺)等，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物，基于葡聚糖的聚合物，壳聚糖等，基于甲硅烷骨架的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物等，由一个或多个阳离子嵌段(例如选白上文提及的阳离子聚合物)的组合和一个或多个亲水或疏水嵌段(例如，聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物等。

按照本发明使用的聚合载体可以是由二硫化物-交联的阳离子组分形成的聚合载体。所述二硫化物-交联的阳离子组分可以是彼此相同的或不同的。所述聚合载体还可以包含其他组分。还特别优选按照本发明使用的聚合载体包含阳离子肽、蛋白或聚合物和任选地本文定义的其他组分的混合物，它们通过本文所述的二硫键交联。在该情形中，WO2012/013326的公开内容通过引用结合在本文中。

在该情形中，通过二硫化物交联形成聚合载体的基础的阳离子组分典型地选白任何适当的阳离子或聚阳离子肽、蛋白或适用于该目的的聚合物，特别是能够复合按照本发明定义的mRNA或核酸并且由此优选地缩合所述mRNA或所述核酸的任意阳离子或聚阳离子肽、蛋白或聚合物。所述阳离子或聚阳离子肽、蛋白或聚合物优选是线性分子，然而，也可以使用分支的阳离子或聚阳离子肽、蛋白或聚合物。

可以用于复合在本发明的药物组合物或疫苗中包含的本发明的mRNA或任意其他核酸的每个二硫化物-交联的阳离子或聚阳离子蛋白、肽或聚合物包含至少一个-SH结构部分，最优选地至少一个半胱氨酸残基或任意其他展现-SH结构部分的化学基团，其在与作为本文提及的聚合载体的阳离子组分的至少另一种阳离子或聚阳离子蛋白、肽或聚合物缩合时能够形成二硫键。

如上文定义，可以用于复合在本发明的药物组合物或疫苗中包含的本发明的mRNA或任意其他核酸的聚合载体可以由二硫化物-交联的阳离子(或聚阳离子)组分形成。

优选地，包含或另外被修饰以包含至少一个-SH结构部分的所述阳离子或聚阳离子肽或蛋白或聚合载体的聚合物选自上文关于复合剂定义的蛋白、肽和聚合物。

在进一步特别的实施方案中，可以用于复合包含在本发明的药物组合物或疫苗中的本发明的mRNA或任意其他核酸的聚合载体可以选自通式(IV)所述的聚合载体：

L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L式(IV)

其中

P¹和P³彼此是不同的或相同的，并且表示线性或分支的亲水聚合物链，每个P¹和P³表现出至少个-SH-结构部分，其能够在与组分P²缩合时形成二硫键，或者备选地与(AA)，(AA)_x或[(AA)_x]_z(如果所述组分用作P¹与P²之间或P³与P²之间的接头)和/或与其他组分(例如(AA)，(AA)_x，[(AA)_x]_z或L)缩合时形成二硫键，所述线性或分支亲水聚合物链彼此独立地选自聚乙二醇(PEG)，聚-N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺，聚-2-(甲基丙烯酰氧)乙基磷酰胆碱，聚(羟基烷基L-天冬酰胺)，聚(2-(甲基丙烯酰氧)乙基磷酰胆碱)，羟基乙基淀粉或聚(羟基烷基L-谷氨酰胺)，其中所述亲水聚合物链表现出约1kDa至约100kDa、优选约2kDa至约25kDa的分子量；或者更优选地约2kDa至约10kDa，例如，约5kDa至约25kDa或5kDa至约10kDa的分子量；

P²是阳离子或聚阳离子肽或蛋白，例如，如上文关于由二硫化物交联的阳离子组分形成的聚合载体所定义的，和优选地具有约3至约100个氨基酸的长度，更优选地具有约3至约50个氨基酸的长度，甚至更优选具有约3至约25个氨基酸的长度，例如，约3至10个，5至15个，10至20个或15至25个氨基酸的长度，更优选地，约5至约20个的长度，甚至更优选地约10至约20个的长度；或者

是阳离子或聚阳离子聚合物，例如，如上文关于由二硫化物交联的阳离子组分形成的聚合载体所定义的，典型地具有约0.5kDa至约30kDa的分子量，包括约1kDa至约20kDa、甚至更优选地约1.5kDa至约10kDa的分子量，或者具有约0.5kDa至约100kDa的分子量，包括约10kDa至约50kDa、甚至更优选地约10kDa至约30kDa的分子量；

每个P²展现至少两个-SH-结构部分，其能够在与其他组分P²或组分P¹和/或P³或备选地与其他组分(例如，(AA)，(AA)_x或[(AA)_x]_z)缩合时形成二硫键；

-S-S-是(可逆的)二硫键(为了更好的可读性，省略括号)，其中S优选地表示硫或携带-SH的结构部分，其已经形成(可逆的)二硫键。所述(可逆的)二硫键优选通过缩合每个组分P¹与P²，P²与P²，或P²与P³，或任选地本文定义的其他组分(例如，L，(AA)，(AA)_x，[(AA)_x]_z等的-SH-结构部分形成；所述-SH-结构部分可以是这些组分的结果的一部分或者通过下文定义的修饰而添加；

L是可选的配体，其可以存在或不存在，并且可以彼此独立地选自RGD，转铁蛋白，叶酸，信号肽或信号序列，定位信号或序列，核定位信号或序列(NLS)，抗体，细胞渗透肽，(例如TAT或KALA)，受体的配体(例如，细胞因子，激素，生长因子等)，小分子(例如，碳水化合物，如甘露糖或半乳糖或合成的配体)，小分子激动剂，受体的抑制剂或拮抗剂(例如，RGD拟肽类似物)，或本文定义的任意其他蛋白等；

n是整数，典型地选自约1-50的范围，优选选自约1，2或3-30的范围，更优选地选自约1，2，3，4或5-25的范围，或约1，2，3，4或5-20的范围，或约1，2，3，4或5-15的范围，或约1，2，3，4或5-10的范围，包括，例如，约4-9，4-10，3-20，4-20，5-20，或10-20的范围，或约3-15，4-15，5-15，或10-15的范围，或约6-11或7-10的范围。更优选地，n在约1，2，3，4或5-10的范围内，更优选地在约1，2，3或4-9的范围内，在约1，2，3或4-8的范围内，或在约1，2或3-7的范围内。

在该情形中，WO2011/026641的公开内容通过引用结合在本文中。每个亲水聚合物P¹和P³典型地展现出至少一个-SH-结构部分，其中所述至少一个-SH-结构部分能够在与组分P²或与组分(AA)或(AA)_x(如果用作P¹与P²之间或P³与P²之间的接头，如下文定义)和任选地与其他组分例如L和/或(AA)或(AA)_x(例如，如果包含两个以上-SH-结构部分)反应时形成二硫键。在上述通式(V)(为了更好的可读性，省略括号)内的下述亚式“P¹-S-S-P²”和“P²-S-S-P³”，其中任意的S、P¹和P³如本文定义，典型地表示这样一种情形：其中亲水聚合物P¹和P³的一个-SH-结构部分与上述通式(V)的组分的P²一个-SH-结构部分缩合，其中这些-SH-结构部分的两个硫形成二硫键-S-S-，如本文在式(V)中定义。这些-SH-结构部分典型地由亲水聚合物P¹和P³中的每一个提供，例如，通过内部半胱氨酸或任意其他(修饰的)携带-SH结构部分的氨基酸或化合物。因此，如果-SH-结构部分是由半胱氨酸提供的，亚式“P¹-S-S-P²”和“P²-S-S-P³”还可以写作“P¹-Cys-Cys-P²”和“P²-Cys-Cys-P³”，其中术语Cys-Cys表示经由二硫键不是经由肽键偶联的两个半胱氨酸。在该情形中，这些式中的术语“-S-S-”还可以写作“-S-Cys”、“-Cys-S”或“-Cys-Cys-”。在该情形中，术语“-Cys-Cys-”不表示肽键，而是表示两个半胱氨酸经由其-SH-结构部分形成二硫键的连接。因此，术语“-Cys-Cys-”还可以通常理解为“-(Cys-S)-(S-Cys)-”，其中在该具体情形中，S表示半胱氨酸的-SH-结构部分的硫。同样地，术语“-S-Cys”和“-Cys-S”表示含有-SH的结构部分与半胱氨酸之间的二硫键，其还可以写作“-S-(S-Cys)”和“-(Cys-S)-S”。备选地，亲水聚合物P¹和P³可以用-SH结构部分修饰，优选地通过与携带-SH结构部分的化合物的化学反应进行修饰，以使每个亲水聚合物P¹和P³携带至少一个这样的-SH结构部分。这样携带-SH结构部分的化合物可以是，例如，(另一个)半胱氨酸或任意其他(修饰的)氨基酸，其携带-SH结构部分。所述化合物还可以是任意非氨基化合物或结构部分，其包含或允许向本文定义的亲水聚合物P¹和P³中引入-SH结构部分。此类非氨基化合物还可以经由化学反应或化合物结合而连接到本发明所述的聚合载体式(VI)的亲水聚合物P¹和P³上，所述化合物的结合例如通过3-硫代丙酸或thioimolane的结合，通过酰胺形成(例如，羧酸，硫磺酸等)，通过迈克尔加成(例如，顺丁烯二酰亚胺结构部分，α，β不饱和的羰基等)，通过click化学(clickchemistry)(例如，叠氮化物或炔)，通过烯/炔methatesis(alkene/alkinemethatesis)(例如，烯或炔)，亚胺或腙形成(醛或酮，肼，羟胺，胺)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白G)或允许S_n-型取代反应的组分(例如，卤代烷，硫醇，醇，胺，肼，酰肼，硫磺酸酯，氧盐(oxyphosphoniumsalts)或其他可以用于连接其他组分的化学结构部分。在该情形中特别优选的PEG衍生物是α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇)。在每种情形中，SH-结构部分，例如，半胱氨酸或任意其他(修饰)的氨基酸或化合物的SH-结构部分，可以存在于亲水聚合物P¹和P³的末端或内部的任意位置。如本文定义的，亲水聚合物P¹和P³中的每一个典型地展现出至少一个-SH-结构部分，优选地位于一个末端，但是还可以包含两个或甚至更多个-SH-结构部分，其可以用于另外连接本文定义的其他组分，优选地其他功能性肽或蛋白，例如，配体，氨基酸组分(AA)或(AA)_x，抗体，细胞渗透肽或增强肽(例如TAT，KALA)等。

在该情形中，特别优选地，本发明的mRNA至少部分与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体、优选阳离子蛋白或肽复合。在该情形中，WO2010/037539和WO2012/113513的公开内容通过引用结合在本文中。部分意指仅有部分的本发明的mRNA与阳离子化合物复合，并且其余的本发明的mRNA(包含在本发明的药物组合物或疫苗中)是以未复合的形式存在的(“游离的”)。优选地，复合的mRNA∶游离的mRNA的比率(在本发明的药物组合物或疫苗中)选自约5∶1(w/w)至约1∶10(w/w)的范围，更优选地选自约4∶1(w/w)至约1∶8(w/w)的范围，甚至更优选地选自约3∶1(w/w)至约1∶5(w/w)或1∶3(w/w)的范围，并且最优选地，在本发明的药物组合物或疫苗中复合的mRNA∶游离的mRNA的比率选自约1∶1(w/w)的比率。

在本发明的药物组合物或疫苗中的复合的mRNA优选按照第一步以特定比率复合本发明的mRNA与阳离子或聚阳离子化合物和/或与聚合载体(优选地如本文定义)以形成稳定的复合物而制备。在该情形中，高度优选地，在复合所述mRNA后，在复合的mRNA的组分中没有游离的阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体，或仅有可忽略地少量的游离的阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体存在。因此，在所述复合的mRNA的组分中的所述mRNA和阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的比率典型地选自所述mRNA完全被复合并且在该组合物没有游离的阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体存在或仅有可忽略地少量的游离的阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体存在的范围。

优选地，所述mRNA与所述阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体(优选地如本文定义的)的比率选自下述范围：约6∶1(w/w)至约0,25∶1(w/w)，更优选地约5∶1(w/w)至约0,5∶1(w/w)，甚至更优选地约4∶1(w/w)至约1∶1(w/w)或约3∶1(w/w)至约1∶1(w/w)，并且最优选地，约3∶1(w/w)至约2∶1(w/w)的比率。备选地，在所述复合的mRNA的组分中，所述mRNA∶所述阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体(优选地如本文定义的)的比率也可以基于整个复合物的氮/磷比率(N/P-比率)计算。在本发明的情形中，关于在所述复合物mRNA∶阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体(优选地如本文定义的)的比率，N/P-比率优选地在约0.1-10的范围内，优选地在约0.3-4的范围内，并且最优选地在约0.5-2或0.7-2的范围内，并且最优选地在约0.7-1,5，0.5-1或0.7-1的范围内，并且甚至最优选地在约0.3-0.9或0.5-0.9的范围内，优选地条件是在所述复合物中的阳离子或聚阳离子化合物是阳离子或聚阳离子蛋白或肽和/或如上文定义的聚合载体。在该具体的实施方案中，所述复合的mRNA也包括在术语“佐剂组分”中。

在另一方面中，本发明提供包含多种或多于一种(优选2-10种，更优选地2-5种，最优选地2-4种)本文定义的本发明的mRNA序列的组合物。这些本发明的组合物包含多于一种本发明的mRNA序列，其优选地编码不同的肽或蛋白，所述肽或蛋白优选地包括不同的病原体抗原或其片段、变体或衍生物。在该情形中特别优选的是至少一种mRNA序列编码至少一个来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)的抗原肽或蛋白，并且至少一种mRNA序列编码来源于狂犬病病毒的另一种抗原(特别是核蛋白N(RAV-N))的至少一个抗原肽或蛋白。

因此，在进一步特别优选的方面中，本发明还提供包含本文定义的至少一种本发明的mRNA序列的药物组合物或包含多种本文定义的本发明的mRNA序列和任选地药用载体和/或赋形剂的本发明的组合物。

本发明的药物组合物包含至少一种本文定义的本发明的mRNA序列作为第一成分。

作为第二成分，本发明的药物组合物可以任选地包含至少一种另外的药物活性组分。在该联系下，药物活性组分是具有治愈、改善或预防本文提及的特定适应证或疾病的治疗效果的化合物，所述特定的适应证或疾病优选是狂犬病。此类化合物包括，但不暗示任何限制，肽或蛋白，优选如本文定义的，核酸，优选如本文定义的，(治疗活性)低分子量有机或无机化合物(分子量小于5000，优选小于1000)，糖，抗原或抗体，优选如本文定义的，现有技术中已知的治疗剂，抗原细胞，抗原细胞片段，细胞级分；细胞壁组分(例如，多糖)，改性、减毒或灭活的(例如，化学灭活或通过辐照灭活)病原体(病毒、细菌等)，佐剂，优选如本文定义的，等等。在该情形中，特别优选的是狂犬病疫苗，例如“Tollwutimpfstoff(HDC)inaktiviert”或Rabipur，或狂犬病免疫球蛋白(immuneglobulines)，例如MerieuxP或Berirab。

本发明的药物组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或经由植入型储库(implantedreservoir)施用。术语肠胃外用于本文中时包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内和舌下注射或灌输技术。

特别优选地是皮内和肌内注射。本发明药物组合物的无菌注射形式可以是水性或油性混悬液。这些混悬液可以使用适当的分散剂或湿润剂和混悬剂按照本领域已知的技术配制。

优选地，本发明的疫苗可以通过常规的有针注射或无针喷射注射(jetinjection)而施用。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物可以通过本文定义的喷射注射施用，优选肌内或皮内施用，更优选皮内施用。

按照一个具体的实施方案，本发明的药物组合物可以包含佐剂。在该情形中，佐剂可以理解为适于起始或增加先天性免疫系统的免疫应答(即，非特异性免疫应答)的任何化合物。换言之，当施用时，本发明的药物组合物优选地引发由任选地包含在其中的佐剂引起的先天性免疫应答。优选地，所述佐剂可以选自技术人员已知并且适于本情形的佐剂，即，支持在哺乳动物中诱导先天性免疫应答，例如，上文定义的佐剂蛋白或下文定义的佐剂。

作为适于存储和递送的佐剂，特别优选的是上文定义为本发明的mRNA序列的赋形剂、转染剂或复合剂的阳离子或聚阳离子化合物。

此外，本发明的药物组合物可以包含一种或多种另外的佐剂，所述佐剂适于起始或增加先天性免疫系统的免疫应答，即，非特异性免疫应答，特别是通过与病原体相关的分子模式(PAMPs)结合而进行。换言之，当施用时，所述药物组合物或疫苗优选地引发由任选地包含在其中的佐剂引起的先天性免疫应答。优选地，所述佐剂可以选自技术人员已知并且适于本情形的佐剂，即，支持在哺乳动物中诱导先天性免疫应答，例如，上文定义的佐剂蛋白或下文定义的佐剂。按照一个实施方案，所述佐剂可以选自上文定义的佐剂。

此外，所述佐剂可以选自技术人员已知并且适于本情形的佐剂，即，支持在哺乳动物中诱导先天性免疫应答和/或适于存储和递送本发明的药物组合物或疫苗的组分。作为适于存储和递送的佐剂，优选的是上文定义的阳离子或聚阳离子化合物。同样地，所述佐剂可以选自由下述组成的组：例如，上文定义的阳离子或聚阳离子化合物，壳聚糖，TDM，MDP，胞壁酰二肽，pluronics，明矾溶液，氢氧化铝，ADJUMERTM(聚膦腈)；磷酸铝凝胶；来自藻类的葡聚糖；algammulin；氢氧化铝凝胶(明矾)；高蛋白吸收性氢氧化铝凝胶；低粘度氢氧化铝凝胶；AF或SPT(角鲨烷乳液(5％)，吐温80(0.2％)，PluronicL121(1.25％)，磷酸缓冲盐水，pH7.4)；AVRIDINETM(丙二胺)；BAYR1005TM((N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基b-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基-十二烷酰-酰胺氢化乙酸盐)；CALCITRIOLTM(1-α，25-二羟基-维生素D3)；磷酸钙凝胶；CAPTM(磷酸钙纳米颗粒)；霍乱全毒素，霍乱-毒素-A1-蛋白-A-D-片段融合蛋白，霍乱毒素的B亚基；CRL1005(嵌段共聚物P1205)；包含细胞因子的脂质体；DDA(二甲基二(十八烷基)溴化铵)；DHEA(脱氢表雄酮)；DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰磷脂酰甘油)；DOC/明矾复合物(脱氧胆酸钠盐)；弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐剂；γ菊粉；Gerbu佐剂(下述的混合物：i)N-乙酰基葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D35谷氨酰胺(GMDP)，ii)二甲基二(十八烷基)氯化铵(DDA)，iii)锌-L-脯氨酸盐复合物(ZnPro-8)；GM-CSF)；GMDP(N-乙酰基葡糖胺基-(b1-4)-N-乙酰基胞壁酰-L47丙氨酰-D-异谷氨酰胺)；咪喹莫特(imiquimod)(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)；ImmTher^TM(N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-甘油二棕榈酸酯)；DRVs(制备自脱水-再水合的囊泡的免疫脂质体)；干扰素γ；白介素-1β；白介素-2；白介素-7；白介素-12；ISCOMSTM；ISCOPREP7.0.3.TM；脂质体；LOXORIBINETM(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)；LT5口服佐剂(大肠杆菌(E.coli)不稳定的肠毒素-原毒素)；任何组合物的微球体和微粒；MF59TM；(角鲨烯水乳状液)；MONTANIDEISA51TM(纯化的不完全弗氏佐剂)；MONTANIDEISA720TM(可代谢的油性佐剂)；MPLTM(3-Q-脱酰基-4′-单磷酰基脂质A)；MTP-PE和MTP-PE脂质体((N-乙酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-(羟基磷酰氧基))-乙基酰胺，单钠盐)；MURAMETIDETM(Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3)；MURAPALMITINETM和DMURAPALMITINETM(Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-甘油二棕榈酰)；NAGO(神经氨酸酶-半乳糖氧化酶)；任何组合物的纳米球体或纳米颗粒；NISVs(非离子表面活性剂囊泡)；PLEURANTM(β-葡聚糖)；PLGA，PGA和PLA(乳酸和羟基乙酸的均聚物和共聚物；微球体/纳米球体)；PLURONICL121TM；PMMA(聚甲基甲基丙烯酸酯)；PODDSTM(类蛋白微球体)；聚乙烯氨基甲酸酯衍生物；聚-rA：聚-rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸复合物)；聚山梨酸酯80(吐温80)；蛋白脂质卷(proteincochleates)(AvantiPolarLipids，Inc.，Alabaster，AL)；STIMULONTM(QS-21)；Quil-A(Quil-A皂苷)；S-28463(4-氨基-otec-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1TM(″Syntex佐剂制剂″)；仙台脂蛋白体和包含仙台的脂质基质；司盘-85(三油酸山梨坦)；Specol(Marcol52、司盘85和吐温85的乳状液)；角鲨烯或(2，6，10，15，19，23-六甲基二十四烷和2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳已烷)；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸盐酸盐)；(N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala二棕榈氧基丙酰胺)；苏氨酰-MDP(TermurtideTM或[thr1]-MDP；N-乙酰基胞壁酰-L苏氨酰-D-异谷氨酰胺)；Ty颗粒(Ty-VLPs或病毒样颗粒)；Walter-Reed脂质体(包含吸附在氢氧化铝上的脂质A的脂质体)，和脂肽，包括Pam3Cys，特别是铝盐，如Adju-phos，铝胶(Alhydrogel)，Rehydragel；乳液，包括CFA，SAF，IFA，MF59，Provax，TiterMax，Montanide，Vaxfectin；共聚物，包括Optivax(CRL1005)，L121，泊洛沙姆4010)等；脂质体，包括Stealth，cochleates，包括BIORAL；植物来源的佐剂，包括QS21，QuilA，Iscomatrix，ISCOM；适合于共刺激的佐剂，包括番茄素(Tomatine)，生物聚合物，包括PLG，PMM，菊粉，微生物衍生的佐剂，包括罗莫肽(Romurtide)，DETOX，MPL，CWS，甘露糖，CpG核酸序列，CPG7909，人TLR1-10的配体，鼠TLR1-13的配体，ISS-1018，35IC31，咪唑并喹啉，聚肌胞(Ampligen)，Ribi529，IMOxine，IRIVs，VLPs，霍乱毒素，热不稳定的毒素，Pam3Cys，鞭毛蛋白，GPI锚，LNFPIII/LewisX，抗菌肽，UC-1V150，RSV融合蛋白，cdiGMP；和适合作为拮抗剂，包括CGRP神经肽。

特别优选的佐剂可以选自支持诱导幼稚T-细胞的Th1-免疫应答或成熟的佐剂，如GM-CSF，IL-12，IFNg，上文定义的任意免疫刺激性核酸，优选免疫刺激性RNA，CpGDNA等。

在进一步优选的实施方案中，也可能本发明的药物组合物除了提供抗原的mRNA之外包含其他组分，所述其他组分选自包括下述的组：其他抗原或其他提供抗原的核酸；其他免疫治疗剂；一种或多种辅助物质；或已知由于其与人Toll-样受体的结合亲和性(作为配体)而是免疫刺激性的任意其他的化合物；和/或佐剂核酸，优选免疫刺激性RNA(isRNA)。

如果需要的话，本发明的药物组合物可以另外包含一种或多种辅助物质，以增加其免疫原性或免疫刺激能力。由此优选地获得本文定义的本发明的mRNA序列和辅助物质(其可以任选地包含本发明的药物组合物中)的协同作用。取决于辅助物质的不同类型，在这一方面可以考虑多种机制。例如，允许树突细胞(DCs)成熟的化合物，例如，脂多糖，TNF-α或CD40配体，形成第一类适当的辅助物质。通常，可以使用以“危险信号”形式影响免疫系统的任何试剂(LPS，GP96等)或允许免疫应答以靶向方式增强和/或影响的细胞因子(诸如GM-CFS)作为辅助物质。特别优选的辅助物质是进一步促进先天性免疫应答的细胞因子，诸如单核因子，淋巴因子，白介素或趋化因子，诸如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21，IL-22，IL-23，IL-24，IL-25，IL-26，IL-27，IL-28，IL-29，IL-30，IL-31，IL-32，IL-33，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，LT-β或TNF-α，生长因子，诸如hGH。

可以包含在本发明的药物组合物中的其他添加剂是乳化剂，诸如例如，湿润剂，诸如例如，十二烷基硫酸钠；着色剂；赋味剂，药用载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。

本发明的药物组合物还可以另外包含任一种其他化合物，所述化合物已知由于其与人Toll样受体TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10的结合亲和性(作为配体)，或由于其与鼠Toll样受体TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10，TLR11，TLR12或TLR13的结合亲和性(作为配体)而具有免疫刺激性。

在这一情形中，特别优选的是，所述任选包含的佐剂组分包括包含在本发明的药物组合物中作为提供抗原的mRNA的本发明的mRNA，例如，编码狂犬病病毒的抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的mRNA。

除此之外，本发明的药物组合物可以包含促进所述药物组合物的施用和组分摄入的其他组分。所述其他组分可以是适当的载体或赋形剂，用于支持任意免疫应答的另外的佐剂，抗菌剂和/或抗病毒剂。

因此，在进一步的实施方案中，本发明的药物组合物还包含药用载体和/或赋形剂。

所述药用载体典型地包括包含本发明的药物组合物的组分的组合物的液体或非液体基础。如果组合物以液体形式提供，则所述载体典型地是不含致热原的水；等渗的盐水或缓冲的(水性)溶液，例如，磷酸、柠檬酸等缓冲的溶液。参考特定的参比介质，注射缓冲液可以是高渗的、等渗的或低渗的，即，参考特定的参比介质，缓冲液可以具有更高、相等的或更低的盐含量，其中，优选可以使用前述盐的所述浓度，其不引起由于渗透性或其他浓度作用导致的细胞损害。参比介质是，例如，在“体内”方法中存在的液体，诸如血液、淋巴、细胞质液体，或其他体液，或例如可以在“体外”方法中用作参比介质的液体，诸如常规的缓冲液或液体。所述常规的缓冲液或液体是技术人员已知的。Ringer-乳酸盐溶液是特别优选的液体基础。

然而，适于施用给待治疗的患者的一种或多种相容的固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物也可以用于本发明所述的药物组合物。术语“相容的”用作本文中意指本发明的药物组合物的这些组成成分能够与本发明的药物组合物的组分以这样的方式混合，所述方式是指不发生将基本上减少所述药物组合物在典型应用条件下的药物有效性的相互作用。

本发明的药物组合物的另一种组分可以是免疫治疗剂，所述免疫治疗剂可以选自免疫球蛋白，优选IgGs，单克隆或多克隆抗体，一种或多种多克隆血清等，最优选地是针对狂犬病病毒的免疫球蛋白，例如MerieuxP或Berirab。优选地，所述另一种免疫治疗剂可以作为肽/蛋白提供，或者可以由核酸编码，优选地由DNA或RNA编码，更优选地由mRNA编码。除了由本发明的提供抗原的mRNA引发的主动接种之外，所述免疫治疗剂允许提供被动接种。

此外，在一个具体的实施方案中，除了所述提供抗原的mRNA之外，其他抗原也可以包含在本发明的药物组合物中，并且典型地是诸如细胞、细胞裂解物、病毒、减毒病毒、灭活病毒、蛋白、肽、核酸或其他生物分子或大分子或其片段的物质。优选地，抗原可以是蛋白和肽或其片段，诸如这些蛋白或肽的表位，优选地具有5-15个、更优选地6-9个氨基酸。特别地，所述蛋白、肽或表位可以来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白N(RAV-N)、磷蛋白P(RAV-P)、基质蛋白(RAV-M)或RNA聚合酶L(RAV-L)或其片段、变体或衍生物。此外，抗原还可以包括任意其他生物分子，例如，脂质，碳水化合物等。优选地，所述抗原是蛋白或(多-)肽抗原，核酸，编码蛋白或(多-)肽抗原的核酸，多糖抗原，多糖缀合物抗原，脂质抗原，糖脂抗原，碳水化合物抗原，细菌，细胞(疫苗)或杀死的或减毒的病毒。在这一情形中，特别优选的是加入包含灭活的病毒的狂犬病疫苗，例如，包含灭活的狂犬病病毒株Flury-LEP的Rabipur或包含灭活的狂犬病病毒株WISTARPM/WI38-1503-3M的“inaktivierter(HDC)Tollwutimpfstoff”。

本文定义的本发明的药物组合物或疫苗还可以包含其他的添加剂或另外的化合物。可以包含在所述药物组合物中的其他的添加剂是乳化剂，诸如例如，湿润剂，诸如例如，十二烷基硫酸钠；着色剂；赋味剂，药用载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂，RNA酶抑制剂和/或抗菌剂或抗病毒剂。另外地，本发明的药物组合物可以包含针对狂犬病病毒的基因的小干扰RNA(siRNA)，例如，针对下述基因的siRNA：所述基因编码狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白N(RAV-N)、磷蛋白P(RAV-P)、基质蛋白(RAV-M)或RNA聚合酶L(RAV-L)。

本发明的药物组合物典型地包含“安全且有效量”的本发明的药物组合物的组分，特别是本文定义的本发明的mRNA序列。用于本文中时，“安全且有效量”意指足以显著诱导疾病或病症的正向改善或预防疾病、优选本文定义的狂犬病的本文定义的本发明的mRNA序列的量。然而，同时，“安全且有效量”足够小到避免严重的副作用，并且允许优势和风险之间的合理关系。这些限制的确定典型地属于合理的医学判断范围之内。

本发明的药物组合物可以用于人，并且还用于兽医用医学目的，优选用于人医学目的，一般作为药物组合物或作为疫苗使用。

按照另一个特别优选的方面，本发明的药物组合物(或本文定义的本发明的mRNA序列或包含多种本文定义的本发明的mRNA序列的本发明的组合物)可以提供为疫苗或用作疫苗。典型地，所述疫苗如上文关于药物组合物所定义。另外，所述疫苗典型地包含：本文定义的本发明的mRNA序列或包含多种本文定义的本发明的mRNA序列的本发明的组合物。

本发明的疫苗还可以包含药用载体、佐剂和/或赋形剂，如本文关于本发明的药物组合物所定义的。在本发明的疫苗的具体情形中，药用载体的选择原则上取决于本发明的疫苗施用的方式。例如，本发明的疫苗可以系统或局部地施用。系统施用的途径通常包括，例如，经皮、口服、肠胃外途径，包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、皮内和腹膜内注射和/或鼻内施用途径。局部施用的途径通常包括，局部施用途径，以及皮内、经皮、皮下或肌内注射或病灶内、颅内、肺内、心内和舌下注射。更优选地，疫苗可以通过皮内、皮下或肌内途径施用。因此，本发明的疫苗优选以液体(或有时以固体)形式配制。优选地，本发明的疫苗可以通过常规有针注射或无针喷射注射施用。在优选的实施方案中，本发明的疫苗可以通过本文定义的喷射注射施用，优选肌内或皮内施用，更优选皮内施用。

如果需要的话，本发明的疫苗可以另外包含一种或多种辅助物质，以增加其免疫原性或免疫刺激能力。特别优选的是关于所述药物组合物定义的辅助物质或添加剂的佐剂。

在另一方面，本发明涉及试剂盒(kit)或部件的试剂盒(kitofparts)，其包括本发明的mRNA序列、包含多种本发明的mRNA序列的本发明的组合物、本发明的药物组合物或疫苗的组分和任选地具有关于组分的给药和剂量的信息的技术说明书。

除了本发明的mRNA序列、本发明包含多种本发明的mRNA序列的组合物、本发明的药物组合物或疫苗的组分之外，所述试剂盒另外可以包含药用赋形剂、佐剂和至少一种本文定义的其他组分，以及用于施用的方式和技术说明书。本发明的mRNA序列、本发明包含多种本发明的mRNA序列的组合物、本发明的药物组合物或疫苗以及例如佐剂的组分可以以冻干形式提供。在优选的实施方案中，在使用所述试剂盒进行接种之前，将所提供的赋形剂以预先确定的量添加到所述冻干的组分中，所述预先确定量例如写在所提供的技术说明书中。通过这样做，提供本发明上述方面所述的本发明的mRNA序列、本发明包含多种本发明的mRNA序列的组合物、本发明的药物组合物或疫苗，然后其也可以用在上述方法中。

本发明还提供本文定义的本发明的mRNA序列、本文定义的本发明包含多种本发明的mRNA序列的组合物、本发明的药物组合物、本发明的疫苗(全都包含本文定义的本发明的mRNA序列)或包含其的试剂盒的一些应用和用途。

在另一方面中，本发明提供编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的mRNA序列，和组合物、药物组合物、疫苗和试剂盒，全都包含所述mRNA序列，其用于预防(暴露前预防或暴露后预防)和/或治疗性治疗狂犬病病毒感染(狂犬病)的方法中。因此，在另一个方面中，本发明涉及本发明的mRNA序列、本发明包含多种本发明的mRNA序列的组合物、本发明的药物组合物、本发明的疫苗和本文定义的本发明的试剂盒作为药物的第一医学用途。特别地，本发明提供编码上文定义的狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的mRNA序列用于制备药物的应用。

按照另一个方面，本发明涉及如本文定义的编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的mRNA序列的第二医学用途，其任选地以包含多种本发明的mRNA序列的组合物、药物组合物或疫苗、试剂盒或部件的试剂盒的形式，用于治疗本文定义的狂犬病病毒感染(狂犬病)。特别地，用在上述方法中的编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的mRNA序列是与药用赋形剂和可选的另外的佐剂以及上文定义的可选的另外的其他组分(例如，其他抗原或狂犬病免疫球蛋白)配制在一起的mRNA序列。

在该情形中，本发明所述的用于狂犬病病毒感染的暴露后治疗的mRNA序列可以与施用狂犬病免疫球蛋白组合。

可以备选地这样提供本发明的mRNA序列，以通过几次剂量施用其用于预防或治疗狂犬病，每个剂量包含本发明编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白或其片段、变体或衍生物的mRNA序列，例如，第一剂量包含至少一种编码来源于糖蛋白G(RAV-G)(或其片段、变体或衍生物)的至少一个抗原肽或蛋白的mRNA，第二剂量包含至少一种编码来源于狂犬病病毒的不同抗原(优选来源于核蛋白N(RAV-N)(或其片段、变体或衍生物))的至少一个抗原肽或蛋白的mRNA序列。通过该实施方案，两个剂量以间隔的方式(即，随后的，一个在另一个之后立刻的)施用，例如，在少于10分钟内，优选少于2分钟，并且在身体的相同部位施用，以获得如同施用包含二者(例如，编码糖蛋白G(RAV-G)的mRNA和编码核蛋白N(RAV-N)的mRNA)的单一组合物相同的免疫性效果。

按照特定的实施方案，本发明的mRNA序列、或本发明的药物组合物或疫苗可以作为单次剂量施用给患者。在特定实施方案中，本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗可以作为单次剂量、然后稍后第二次剂量并且任选地其后甚至第三次、第四次(或更多次)剂量等施用给患者。按照该实施方案，可以在特定的时间间隔，优选如下文定义，在第二次(或第三次、第四次等)接种后，对患者施用本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗的加强接种。优选地，施用至少一个剂量的本发明的mRNA序列、药物组合物或疫苗，优选1-10个剂量，更优选2-7个剂量，甚至更优选2-5个剂量，并且最优选3-5个剂量。在特别优选的实施方案中，施用3个剂量。在另一个实施方案中，施用5个剂量。在该情形中，特别优选地是，几次剂量包含相同的编码狂犬病病毒的相同的抗原肽或蛋白(例如糖蛋白G(RAV-G))的mRNA序列。在该实施方案中，所述剂量以特定的时间期间给予，例如，20-30天或20-60天。两次以上剂量的施用之间的时间间隔优选是5-120天，更优选7-15天或15-30天。在优选的实施方案中，两次以上剂量的施用之间的时间间隔是至少7天，更优选是28天。例如，对于暴露后的预防，可以在20-30天内施用至少5次剂量的本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗。例如，对于没有暴露于狂犬病病毒的预防性治疗，可以在20-60天内施用至少3次剂量的本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗。

在优选的实施方案中，单一剂量的本发明的mRNA序列、组合物或疫苗包含特定量的本发明所述的mRNA。优选地，本发明的mRNA序列以至少40μg/剂量的量、优选40-700μg/剂量的量、更优选以80-400μg/剂量的量提供。更具体地，在优选通过使用常规的针进行的皮内注射的情形中，包含在单一剂量中的本发明的mRNA序列的量典型地为至少200μg，优选200μg-1.000μg，更优选300μg-850μg，甚至更优选300μg-700μg。在优选通过喷射注射(例如，使用Tropis装置)进行的皮内注射的情形中，包含在单一剂量中的本发明的mRNA序列的量典型地为至少80μg，优选80μg-700μg，更优选80μg-400μg。此外，在优选通过使用常规的针或通过喷射注射进行的肌内注射的情形中，包含在单一剂量中的本发明的mRNA序列的量典型地为至少80μg，优选80μg-1.000μg，更优选80μg-850μg，甚至更优选80μg-700μg。

更具体地，下述具体的实施方案是特别优选的：

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(40μg/剂量)施用给患者，优选皮内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(80μg/剂量)施用给患者，优选皮内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(160μg/剂量)施用给患者，优选皮内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(320μg/剂量)施用给患者，优选皮内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(40μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射皮内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(80μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射皮内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(160μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射皮内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(320μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射皮内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(40μg/剂量)施用给患者，优选肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(80μg/剂量)施用给患者，优选肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(160μg/剂量)施用给患者，优选肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(320μg/剂量)施用给患者，优选肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(640μg/剂量)施用给患者，优选肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(40μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(80μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(160μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(320μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

·本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗优选在20-60天内以三次剂量(640μg/剂量)施用给患者，优选通过喷射注射肌内施用，例如，在治疗的第0、7和28天或第0、28和56天施用。

在特定实施方案中，使用上文公开的本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗的所述加强接种(第二次、第三次等疫苗接种)可以使用如关于本文定义的本发明的mRNA序列或本发明的药物组合物或疫苗所定义的另外的化合物或组分。

按照另一个方面，本发明还提供用于表达所编码的来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)、核蛋白N(RAV-N)、磷蛋白P(RAV-P)、基质蛋白(RAV-M)或RNA聚合酶L(RAV-L)的抗原肽或蛋白的方法，所述方法包括下述步骤，例如，a)提供本文定义的本发明的mRNA序列或本文定义的本发明包含多种本发明的mRNA序列的组合物，b)将本文定义的本发明的mRNA序列或本文定义的本发明包含多种本发明的mRNA序列的组合物应用或施用至表达系统，例如，无细胞的表达系统、细胞(例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体。所述方法可以用于实验室、用于研究、用于诊断、用于肽或蛋白的商业生产和/或用于治疗目的。在这一情形中，典型地在制备本文定义的本发明的mRNA序列或包含多种本文定义的本发明的mRNA序列的本发明的组合物后，典型地以例如裸露或复合形式或作为本文所述的药物组合物或疫苗，优选通过转染或通过使用本文所述的任一种施用模式应用于或施用于不含细胞的表达系统、细胞(例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体。所述方法可以在体外、体内或离体进行。所述方法可以进一步在治疗特定疾病的情形中进行，特别在治疗传染病(优选如本文所定义的狂犬病)的情形中进行。

在这一情形中，体外在本文中定义为将本文定义的本发明的mRNA或包含多种本文定义的本发明的mRNA序列的本发明的组合物转染或转导到在生物体外的培养物中的细胞中；体内在本文中定义为通过将本发明的mRNA或本发明的组合物应用到完整生物体或个体而将本发明的mRNA或包含多种本发明的mRNA序列的本发明的组合物转染或转导到细胞中，离体在本文中定义为将本发明的mRNA或包含多种本发明的mRNA序列的本发明的组合物转染或转导到生物体或个体之外的细胞中并且随后将所转染的细胞应用到所述生物体或个体。

同样地，按照另一个方面，本发明还提供本文定义的本发明的mRNA序列或包含多种本文定义的本发明的mRNA序列的本发明的组合物(优选用于诊断或治疗目的)用于表达所编码的肽或蛋白的应用，例如，通过将本文定义的本发明的mRNA序列或包含多种本文定义的本发明的mRNA序列的本发明的组合物应用或施用到例如不含细胞的表达系统、细胞(例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体中。所述应用可以用于实验室、用于研究、用于诊断、用于肽或蛋白的商业生产和/或用于治疗目的。在这一情形中，典型地在制备本文定义的本发明的mRNA序列或包含多种本文定义的本发明的mRNA序列的本发明的组合物之后，典型地，优选以裸露形式或复合形式或作为本文所述的药物组合物或疫苗，优选通过转染或通过使用本文所述的任一种施用模式应用于或施用于不含细胞的表达系统、细胞(例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体。所述应用可以在体外(invitro)、体内(invivo)或离体(exvivo)进行。所述应用可以进一步在治疗特定疾病的情形中进行，特别在治疗狂犬病病毒感染的情形中进行。

在另一方面中，本发明提供治疗或预防狂犬病病毒感染的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供本发明的mRNA序列，包含多种本发明的mRNA序列的组合物，包含上文定义的本发明的mRNA序列的药物组合物或试剂盒或部件的试剂盒；

b)将所述mRNA序列、组合物、药物组合物或试剂盒或部件的试剂盒应用到或施用到组织或生物体中；

c)任选地施用狂犬病免疫球蛋白。

综上所述，本发明在特定方面提供包含编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白的mRNA序列。本发明的mRNA序列用在预防和/或治疗性治疗由狂犬病病毒引起的感染的方法中。因此，本发明涉及本文定义的mRNA序列，其用于预防和/或治疗性治疗狂犬病感染的方法。

在本发明中，如果没有另外指明，则各备选方案和各实施方案的不同的特征在适当的时候可以彼此组合。此外，如果没有特别提及，术语“包含”不应该狭义地解释为仅限于“由……组成”。相反，在本发明的情形中，在本文中使用“包含”时，“由……组成”是发明人特别考虑的落入“包含”的范围内的实施方案。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请如同每个个体出版物或专利申请特别地、单独地指示通过引用结合一样通过引用结合在本文中。尽管为理解清楚性的目的，已经通过举例说明和实例的方式详细描述了前述发明，按照本发明的教导，对于本领域的普通技术人员容易地是清楚的，可以在不背离后附权利要求书的精神或范围的前提下对其进行特定的变化和改进。

附图：

下文显示的附图仅是举例说明，并且应该以其他方式描述本发明。这些附图不应该解释为将本发明限于此。

图1：显示SEQIDNO.24所述的mRNA序列R2403，其包含：编码狂犬病病毒糖蛋白G(RAV-G)的G/C优化的编码区，SEQIDNo.22所述的3’-UTR元件muag，由64个腺苷酸组成的聚腺苷酸序列，由30个胞嘧啶组成的聚胞苷酸序列和SEQIDNo.27所述的组蛋白茎环序列，如在RAV-GmRNA疫苗中包含的。

图2：显示SEQIDNO.25所述的mRNA序列R2507，其包含：含有SEQIDNO.16所述的核酸序列相应的RNA序列的5’-UTR元件，编码狂犬病病毒糖蛋白G(RAV-G)的G/C优化的编码区，SEQIDNo.18所述的3’-UTR元件白蛋白7，由64个腺苷酸组成的聚腺苷酸序列，由30个胞嘧啶组成的聚胞苷酸序列和SEQIDNo.27所述的组蛋白茎环序列，如在RAV-GmRNA疫苗中包含的。

图3：显示用编码RAV-G蛋白的mRNAR2403转染HeLa细胞导致所编码的RAV-G蛋白在细胞表面上的表达，并且该蛋白被抗-RAV-G抗体识别。编码A/Netherlands/602/2009的流感HA蛋白的构建体R2429作为阴性对照，还有未转染的细胞作为阴性对照。转染后24小时，将RAV-G蛋白用狂犬病特异性抗体和FITC-标记的二级抗体染色，并且通过FACS进行分析，如实施例2所示。

图4：显示RAV-GmRNA疫苗在小鼠中是免疫原性的，并且诱导与许可的疫苗相当的高滴度的中和抗体。

雌性BALB/c小鼠皮内(i.d.)注射RAV-GmRNA疫苗(80μg的R2403)或皮内注射Ringer-乳酸盐(RiLa)作为缓冲液对照。两组分别肌内(i.m.)注射1/10人剂量的许可的疫苗和HDC。所有动物在第21天接受加强注射，并且在第35天采集血液样品，用来确定狂犬病病毒的中和滴度，如实施例3所述。

(A)RAV-GmRNA疫苗诱导与HDC和疫苗相当的中和抗体，充分高于0.5IU/ml的WHO标准。图表中的线表示中值(n＝8只小鼠/组)。

(B)RAV-GmRNA疫苗在小鼠中诱导持续长久的病毒中和滴度，充分高于0.5IU/ml。

图5：显示RAV-GmRNA疫苗诱导抗原特异性的CD8⁺T细胞。

该实验如实施例4所述进行，并且通过细胞内细胞因子染色分析T细胞的细胞因子的抗原特异性诱导。图表中的线表示中值(n＝8只小鼠/组)。

图6：显示RAV-GmRNA疫苗以显著高于的频率诱导抗原特异性的CD4⁺T细胞。

该实验如实施例4所述进行，并且通过细胞内细胞因子染色分析T细胞。图表中的线表示中值(n＝8只小鼠/组)。组间的统计学差异通过MannWhitney检验进行评估。

图7：显示RAV-GmRNA疫苗在C57BL/6小鼠中诱导剂量依赖性的功能抗体(病毒中和抗体)应答，这证明RAV-GmRNA与功能抗体的诱导之间的剂量依赖性关系。

该实验如实施例5所述进行，并且确定病毒中和滴度(IU/ml)。图表中的线表示中值(n＝8只小鼠/组)。统计学分析：ANOVA(Kruskal-Wallis)，^**：p≤0.01；^*：p≤0.05。

图8：显示RAV-GmRNA疫苗保护小鼠抵抗致死性的狂犬病病毒攻击感染。

该实验如实施例6所述进行。

(A)感染狂犬病的小鼠的存活。所有接种RAV-GmRNA或的小鼠都得到针对致死性攻击感染的保护，体重没有减轻。

(B)感染狂犬病的小鼠的重量动力学。几只接种HDC疫苗的小鼠表现出体重减轻，并且有一只小鼠达到定义的终点标准，因此将其在研究结束之前处死。

图9：显示RAV-GmRNA疫苗保护小鼠抵抗致死性的病毒攻击感染-免疫时间表的影响

该实验如实施例6所述进行。

(A)感染狂犬病的小鼠的存活，(B)感染狂犬病的小鼠的重量动力学。

使用RAV-GmRNA以接种间间隔一周或三周时间间隔接种三次的小鼠被保护免于死亡和体重减轻，这表明RAV-GmRNA接种不限于固定的免疫模式。另外，关于针对死亡或体重减轻的保护作用，使用RAV-GmRNA仅两次接种就足以保护小鼠抵抗致死性的攻击感染。

图10：显示RAV-GmRNA疫苗在40℃保存6个月或在60℃保持1个月后是稳定的且有免疫原性。

该实验如实施例7所述进行。

(A)病毒中和滴度。在多至40℃的温度保存6个月后或在60℃保持1个月后，所述疫苗仍然是完全有免疫原性的。

(B)免疫的小鼠的存活。在多至40℃的温度保存6个月后或在60℃保持1个月后，所述疫苗仍然是完全有保护性的。

图11：显示RAV-GmRNA疫苗在成年的猪中诱导保护性免疫应答。

该实验如实施例8所述进行。

接种了RAV-GmRNA的猪表现出充分高于0.5IU/mlWHO标准的功能性抗体应答。

图12：显示RAV-GmRNA疫苗在新生的猪中诱导与基准疫苗相当的显著的病毒中和滴度。

该实验如实施例9所述进行。

(A)病毒中和滴度的动力学(平均值和标准差，SD)。

(B)加强接种后2周的病毒中和滴度。

图13：显示RAV-GmRNA疫苗在小鼠中在肌内注射后诱导病毒中和滴度。该实验如实施例10所述进行。

图14：显示在皮内接种RAV-GmRNA疫苗后在小鼠中诱导病毒中和滴度。该实验如实施例11所述进行。

图15：显示在皮内接种RAV-GmRNA疫苗后在家养的猪中诱导病毒中和滴度。该实验如实施例12所述进行。

图16：显示在肌内接种RAV-GmRNA疫苗后在家养的猪中诱导病毒中和滴度。该实验如实施例13所述进行。

实施例

下文所示的实施例仅是举例说明，并且应该以其他方式描述本发明。这些实施例不应该解释为将本发明限于此。

实施例1：制备狂犬病mRNA疫苗

1.制备DNA和mRNA构建体

对于本实施例，制备编码Pasteur疫苗株的糖蛋白G(RAV-G)的DNA序列，并且用于后续的体外转录。相对应的mRNA序列RAV-G(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(R2403)和32L-RAV-G(GC)-白蛋白7-A64-C30-组蛋白SL(R2507)显示在图1和2中，如SEQ.IDNo.24和25所述。

2.体外转录

在CAP类似物(m⁷GpppG)的存在下，使用T7聚合酶，体外转录按照第1段制备的各种DNA质粒。然后，用(CureVac，Tübingen，Germany；WO2008/077592A1)纯化mRNA。

mRNA序列RAV-G(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(R2403；SEQIDNO：24)在5’-至3’-方向上包含：

a.)由m7GpppN组成的5’-帽结构；

b.)G/C最大化的编码区，其编码SEQIDNo.1所述的Pasteur疫苗株的RAV-G的全长蛋白；

c.)来源于α珠蛋白基因的3’-UTR元件，其包含SEQIDNO.22所述的核酸序列的对应的RNA序列；

d.)聚腺苷酸序列，其包含64个腺苷酸；

e.)聚胞苷酸序列，其包含30个胞嘧啶；和

f.)组蛋白茎环结构，其包含SEQIDNo27所述的RNA序列。

术语“R2403”用在本文中是指由SEQIDNO：24所述的序列定义的mRNA序列。“R2403”mRNA可以以冻干形式提供，其优选地用于本发明的mRNA序列的保存和/或运输，或者可以以在适当的液体中的溶解形式提供。在施用给受试者之前，SEQIDNO：24所述的mRNA如果是以冻干形式提供的，典型地在本文定义的适当的液体中重构，优选在Ringer-乳酸盐中重构，以获得液体制剂。

mRNA序列32L-RAV-G(GC)-白蛋白7-A64-C30-组蛋白SL(R2507)在5’-至3’-方向上包含：

a.)由m7GpppN组成的5’-帽结构；

b.)5’-UTR元件，其包含SEQIDNO.16所述的核酸序列的对应RNA序列；

c.)G/C最大化的编码区，其编码SEQIDNo.1所述的Pasteur疫苗株的RAV-G的全长蛋白；

d.)来源于α珠蛋白基因的3’-UTR元件，其包含SEQIDNO.18所述的核酸序列的对应的RNA序列；

e.)聚腺苷酸序列，其包含64个腺苷酸；

f.)聚胞苷酸序列，其包含30个胞嘧啶；和

g.)组蛋白茎环结构，其包含SEQIDNo27所述的RNA序列。

3.试剂

复合试剂：鱼精蛋白

4.制备疫苗

通过以比率(1∶2)(w/w)向mRNA中加入鱼精蛋白(佐剂组分)使所述mRNAR2403或R2507与鱼精蛋白复合。在温育10分钟后，加入相同量的游离mRNAR2403或R2507，其用作提供抗原的RNA。

实施例2：体外表征编码狂犬病病毒G蛋白(RAV-G)的mRNA

在转染前24小时，将HeLa细胞以300000个细胞/孔的密度接种在6孔平板的细胞培养基(RPMI，10％FCS，1％L-谷氨酰胺，1％Pen/Strep)中。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，将HeLa细胞转染5μg编码RAV-G的mRNA(R2403)或编码A/Netherlands/602/2009的流感HA蛋白的mRNA(R2429)(作为阴性对照)，并且在转染后24小时用狂犬病病毒特异性抗体(HyTestLtd；#11/06-R7-C5)和FITC标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(Invitrogen，#871942A)染色，并且通过流式细胞计数(FACS)进行分析。流式细胞计数数据通过FlowJo软件进行定量评估。

图3证明了，如对于狂犬病G蛋白所预测的，RAV-G蛋白在转染的细胞的表面上表达，并且可以被抗-狂犬病抗体识别。

实施例3：通过AV-GmRNA疫苗诱导体液免疫应答

免疫

在第0天，将BALB/c小鼠皮内(i.d.)注射包含编码狂犬病病毒糖蛋白G(RAV-G)的mRNA的mRNA疫苗(实施例1所述的R2403；80μg/只小鼠/接种日)或Ringer-乳酸盐(RiLa)(作为缓冲液对照)。两个对照组分别肌内(i.m.)注射1/10人剂量的许可的疫苗(Novartis)和HDC(人二倍体细胞疫苗，SanofiPasteurMSDGmbH)。所有动物在第21天接受加强注射，并且在第35天收集血液样品，用于确定病毒中和滴度。

为了建立抗-RAV-G免疫应答的长期动力学，在15，29，38和48周后从第1组采集血液样品，并且确定病毒中和滴度。

表1：动物组

许可的狂犬病疫苗(Novartis)和HDC(人二倍体细胞，SanofiPasteurMSDGmbH)包含灭活的狂犬病病毒。

病毒中和检测

通过病毒中和测定进行病毒中和抗体应答(特异性B细胞免疫应答)的检测。所述测定的结果称为病毒中和滴度(VNT)。按照WHO标准，如果各自的VNT是至少0.5IU/ml，则认为抗体滴度是保护性的。因此，在第35天从接种的小鼠和在第42天从接种的人或如所示在接种后采集血液样品，并且制备血清。这些血清用于荧光抗体滴度中和(FAVN)检测，所述检测使用OIE(世界动物健康组织(WorldOrganisationforAnimalHealth))推荐的且最先在CliquetF.，AubertM.&SagneL.(1998)；J.Immunol.Methods，212，79-87中所述的细胞培养物适应的狂犬病病毒攻击病毒株(CVS)进行。之后不久，以连续两倍稀释四次一式四份检测热灭活的血清，检测其以50μl的体积中和CVS的100TCID₅₀(组织培养感染剂量50％)的潜力。因此，将血清稀释液在37℃(在具有5％CO₂的潮湿的培养箱中)用病毒温育1小时，然后加入胰蛋白酶解的BHK-21细胞(4x10⁵个细胞/ml；50μl/孔)。将感染的细胞培养物在潮湿的培养箱中在37℃和5％CO₂培养48小时。在室温用80％丙酮固定细胞后，用FITC抗-狂犬病缀合物分析细胞的感染。将平板用PBS洗涤两次，并且去除过量的PBS。关于是否存在狂犬病病毒，将细胞培养物评分为正或负。在血清处理的孔中负评分的细胞表示狂犬病病毒的中和。每次FAVN检测包括WHO或OIE标准血清(正参比血清)，其作为使该测定标准化的参比。参照WHO提供的标准血清，计算测试血清的中和活性，并且表示为国际单位/ml(IU/ml)。

结果

如图4A中可以看出的，RAV-GmRNA疫苗(R2403)诱导与HDC和疫苗相当的中和抗体滴度，充分高于0.5IU/ml的WHO标准。

如图4B中可以看出的，RAV-GmRNA疫苗在小鼠中诱导持续长久的狂犬病病毒中和。

实施例4：通过RAV-GmRNA疫苗诱导细胞免疫应答

免疫

在第0天，将BALB/c小鼠皮内(i.d.)注射RAV-GmRNA疫苗R2403(80μg/只小鼠/次接种/天)或作为缓冲液对照的Ringer-乳酸盐(RiLa)。一个对照组肌内(i.m.)注射1/10人剂量的许可的疫苗所有动物在第21天接受加强注射。收集血清和脾(在第28天，n＝8，在第35天，n＝8)，用于抗原特异性T细胞的分析。

表2：动物组

细胞内细胞因子染色

按照标准流程分离来自接种的和对照小鼠的脾细胞。简言之，将分离的脾通过细胞滤网碾磨，并且在PBS/1％FBS中洗涤，然后进行红血细胞溶解。在用PBS/1％FBS彻底洗涤步骤后，将脾细胞接种在96孔平板(2x10⁶个细胞/孔)中并在4℃保持过夜。次日，将细胞用RAV-G肽文库(JPT)和抗-CD28抗体(BDBiosciences)在37℃在GolgiPlug^TM/GolgiStop^TM混合物(分别为包含布雷菲德菌素A(BrefeldinA)和莫能菌素(Monensin)的蛋白转运抑制剂；BDBiosciences)的存在下刺激6小时，所述RAV-G肽文库包含SEQIDNo.1所述的来自狂犬病病毒Pasteur疫苗株的狂犬病G蛋白的氨基酸序列，所述氨基酸序列作为15个氨基酸的肽展示，在相邻的肽之间具有11个氨基酸的重复。刺激后，将细胞洗涤，并用Cytofix/Cytoperm试剂(BDBiosciences)按照供应商的使用说明对细胞内细胞因子进行染色。使用下述抗体进行染色：CD8-PECy7(1∶200)，CD3-FITC(1∶200)，IL2-PerCP-Cy5.5(1∶100)，TNFα-PE(1∶100)，IFNγ-APC(1∶100)(eBioscience)，CD4-BDHorizonV450(1∶200)(BDBiosciences)，并用1∶100稀释的FcγR-封闭液温育。使用AquaDye区分活细胞/死细胞(Invitrogen)。用CantoII流式细胞仪(BecktonDickinson)收集细胞。用FlowJo软件(TreeStar，Inc.)分析流式细胞计数的数据。使用GraphPadPrism软件，Version5.01进行统计学分析。通过MannWhitney检验测定组间统计学差异。

结果

从图5可以看出，RAV-GmRNA疫苗(R2403)以与疫苗相当的频率诱导IFNγ阳性、TNFα阳性和IFNγ/TNFα双阳性的多功能性CD8⁺T细胞。

从图6可以看出，RAV-GmRNA疫苗(R2403)以比包含完全灭活的狂犬病病毒的疫苗显著更高的频率诱导IFNγ阳性、TNFα阳性和IFNγ/TNFα双阳性的多功能性CD4⁺T细胞。

实施例5：在C57BL/6小鼠中通过RAV-GmRNA疫苗诱导剂量依赖性的体液免疫应答

免疫

在第0天，将C57BL/6小鼠皮内(i.d.)注射不同剂量的RAV-GmRNA疫苗R2403或作为缓冲液对照的Ringer-乳酸盐(RiLa)，如表3所示。两个组分别肌内(i.m.)注射1/10人剂量的许可的疫苗和HDC。所有动物在第21天接受加强注射。在第35天收集血液样品，并且在荧光抗体病毒中和(FAVN)检测中分析血清，如实施例3所述。

表3：动物组

结果

从图6可以看出，RAV-GmRNA疫苗诱导剂量依赖性的抗体应答。与0.1人剂量的HDC疫苗相比，20μg、40μg和80μg的剂量诱导显著更高的病毒中和抗体滴度。

实施例6：小鼠的狂犬病病毒攻击感染

免疫

按照表3所示的时间表，将雌性BALB/c小鼠皮内(i.d.)注射RAV-GmRNA疫苗R2403或作为缓冲液对照的Ringer-乳酸盐(RiLa)。两个对照组分别肌内(i.m.)注射1/10人剂量的许可的疫苗和HDC。最后一次免疫后十六天，用40倍LD50剂量的狂犬病病毒CVS毒株颅内(i.c.)感染动物。监测小鼠的特异性的狂犬病症状和体重发展。

表4：动物组

结果

从图8A可以看出，RAV-GmRNA疫苗保护所有的小鼠抵抗致死性的狂犬病病毒攻击感染。接种了RAV-GmRNA或的全部小鼠都被保护抵抗致死性的攻击感染，体重没有减轻。

从图8B可以看出，有几只接种了HDC疫苗的小鼠表现出体重减轻，并且在HDC组中的一只患病小鼠达到定义的终点标准，因此其在研究结束之前被处死。

从图9A可以看出，RAV-GmRNA疫苗两次接种(致敏/加强，以三周的时间间隔)足以完全保护小鼠抵抗狂犬病病毒的致死性攻击感染。

实施例7：通过保存后的RAV-GmRNA疫苗诱导体液免疫应答

为了检验RAV-GmRNA疫苗的稳定性，将样品在5℃、25°和40℃保存6个月和在60℃保存一个月。然后，用这些样品接种小鼠，并且评价它们的免疫原性和保护潜力。

免疫

按照表5所示的时间表，将雌性BALB/c小鼠皮内(i.d.)注射RAV-GmRNA疫苗R2403或作为缓冲液对照的Ringer-乳酸盐(RiLa)。一个对照组肌内(i.m.)注射1/10人剂量的许可的疫苗HDC(按供应商推荐的，保存在2-8℃)。最后一次接种后两周，采集血液样品，并且在如实施例3所述的荧光抗体病毒中和(FAVN)检测中分析血清。在最后一次免疫后六(Sechs)周，使用25-倍LD50的狂犬病病毒CVS毒株颅内(i.c.)感染动物。监测小鼠的特异性狂犬病症状和体重发展。

表5：动物组

结果

从图10A可以看出，在多至40℃保存6个月或在60℃保存1个月后，所述RAV-GmRNA疫苗是稳定的且有免疫原性。另外，如在致死性攻击感染中所证实的，所述疫苗仍然是充分保护性的(10B)。

实施例8：通过RAV-GmRNA疫苗在猪中诱导体液免疫应答

免疫

按照表6所示的时间表，将两组猪(匈牙利大白猪，6-8周龄，母猪；n＝5)皮内(i.d.)注射RAV-GmRNA疫苗R2507或作为缓冲液对照的Ringer-乳酸盐(RiLa)。第一次接种前一周(免疫前血清)和第一次接种后2，3和5周，采集血液样品，并且在实施例3所述的荧光抗体病毒中和(FAVN)检测中分析血清。

表6：动物组

结果

从图11可以看出，所述RAV-GmRNA疫苗在致敏/加强接种后诱导免疫应答，充分高于0.5IU/ml的WHO标准。

实施例9：RAV-GmRNA疫苗在新生猪中的病毒中和滴度的诱导与基准疫苗相当

免疫

在第0天，如表7所示，将来自两窝的3-4日龄的仔猪(德国家养猪，两种性别的)皮内(i.d.)注射RAV-GmRNA疫苗R2403和不相关的对照mRNA疫苗(编码流感H5N1的HA蛋白的R2402)。第三组肌内(i.m.)注射一个人剂量的许可的疫苗所有的动物在第21天接受加强注射。在第0天(免疫前血清)和第21、28、35、49和70天采集血液样品。制备血清，并且在如实施例3所述的荧光抗体病毒中和(FAVN)检测中进行分析。

表7：动物组

结果

从图12可以看出，所述RAV-GmRNA疫苗在新生猪的致敏-加强接种后诱导病毒中和抗体，充分高于0.5IU/ml的WHO标准。

实施例10：在小鼠中肌内免疫后RAV-GmRNA疫苗诱导病毒中和滴度

免疫

按照表8所示的时间表，将雌性BALB/c小鼠肌内(i.m.；M.tibialis)注射RAV-GmRNA疫苗R2507或作为缓冲液对照的Ringer-乳酸盐(RiLa)。在最后一次接种后一周，采集血液样品，并且在如实施例3所述的荧光抗体病毒中和(FAVN)检测中分析血清。

表8：动物组

结果

从图13可以看出，在肌内注射后，所述RAV-GmRNA疫苗在小鼠中诱导病毒中和滴度，充分高于0.5IU/ml的WHO标准。

实施例11：在小鼠中通过RAV-GmRNA疫苗诱导体液免疫应答

免疫

在第0天，将BALB/c小鼠皮内(i.d.)注射包含编码狂犬病病毒糖蛋白G(RAV-G)的mRNA的mRNA疫苗(实施例1所述；80μg/只小鼠/接种日)。所有动物在第7天和第21天接受加强注射。为了建立抗-RAV-G免疫应答的长期动力学，在第0、21和35天采集血清，用于确定病毒中和滴度。

病毒中和检测

病毒中和检测如实施例3所述进行。

结果

从图14可以看出，仅在两次接种后，所述RAV-GmRNA疫苗((R2403))诱导中和抗体滴度，充分高于0.5IU/ml的WHO标准。

实施例12：在家养的猪中通过RAV-GmRNA疫苗诱导体液免疫应答

免疫

在第0和14天，将两组猪(匈牙利大白猪，6-8周龄，母猪；n＝5)皮内(i.d.)注射RAV-GmRNA疫苗R2507或作为缓冲液对照的Ringer-乳酸盐(RiLa)。第一次接种(第0天)前一周(免疫前血清)和第一次接种后第14和21天，采集血液样品，并且在实施例3所述的荧光抗体病毒中和(FAVN)检测中分析血清。

结果

从图15可以看出，在家养的猪中，仅用RAV-GmRNA疫苗接种一次就足以达到0.5IU/ml中和抗体滴度的WHO标准。

实施例13：在家养的猪中通过RAV-GmRNA疫苗诱导体液免疫应答

免疫

在第1、8和29天，将家养的猪(匈牙利大白猪，6-8周龄，母猪；n＝5)肌内(i.m.)注射RAV-GmRNA疫苗R2403。在第1，8，15，29，36，43，57和115天采集血液样品，并且在如实施例3所述的荧光抗体病毒中和(FAVN)检测中分析血清。

结果

从图16可以看出，用RAV-GmRNA疫苗肌内接种能够在家养的猪中诱导高于0.5IU/ml的WHO标准的中和抗体滴度。长期动力学显示，甚至在最后一次接种后115天，中和抗体滴度仍然高于0.5IU/ml的WHO标准。

实施例14：在人中通过RAV-GmRNA疫苗诱导体液免疫应答

免疫

在正在进行的临床试验(I期)中获得的初步结果证明本发明所述的疫苗的安全性和功效。在临床研究中，在第0、7和28天，使用Tropis装置通过喷射注射在人志愿者中皮内注射RAV-GmRNA疫苗R2403。如本文实施例1所述制备mRNA，即，与鱼精蛋白以2∶1(w/w)比率复合的mRNA与等量的游离mRNA混合。在这三个接种日的每一天，施用80μgmRNA。

为了评估本发明所述的疫苗的安全性模式，在施用后监测受试者(生命体征，接种部位耐受性评估，在第二次和第三次注射后的血液学分析)。在正在进行的临床研究中获得的初步结果表明，用本发明所述的mRNA免疫在人中是充分耐受的。

通过确定来自六名受试者的血清中的病毒中和滴度(VNT)分析免疫的功效。为了该目的，在作为基线的第0天和第42天采集血液样品。在如实施例3所述的荧光抗体病毒中和(FAVN)检测中分析血清的病毒中和抗体。结果总结在表9中。

表9：人受试者免疫后的病毒中和滴度

在六名受试者的五名(受试者编号1，2，4，5和6)中，在第42天检测到至少0.5IU/ml的病毒中和滴度。按照WHO标准，由此在这些受试者中已经获得了保护性抗体应答，这证实用本发明所述的mRNA免疫的功效。

结论：

按照正在进行的临床试验的初步结果，使用本发明所述的mRNA用于免疫人受试者具有有利的安全性模式。这些初步的研究已经证明该方法的功效，在第42天，在六名研究的受试者中的五名中获得保护性抗体应答(VNT≥0.5IU/ml)。

Claims

1.mRNA序列，其包含编码来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)，核蛋白N(RAV-N)，磷蛋白P(RAV-P)，基质蛋白M(RAV-M)，RNA聚合酶L(RAV-L)的至少一个抗原肽或蛋白或其片段，变体或衍生物的编码区；

其中，所述编码区的G/C含量与野生型mRNA编码区的G/C含量相比增加，并且其中，与所述野生型mRNA编码的氨基酸序列相比，所述GC富集的mRNA编码的氨基酸序列优选没有被修饰。

2.权利要求1所述的mRNA序列，其中所述编码区编码狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)的全长蛋白。

3.权利要求1-2中任一项所述的mRNA序列，其中所述抗原肽或蛋白来源于狂犬病疫苗株，特别是Pasteur疫苗株或Flury-LEP疫苗株。

4.权利要求1-3中任一项所述的mRNA序列，其另外包含：

a)5’-帽结构，

b)聚腺苷酸序列，

c)和任选地聚胞苷酸序列。

5.权利要求4所述的mRNA序列，其中所述聚腺苷酸序列包含约25至约400个腺苷核苷酸的序列，优选约50至约400个腺苷核苷酸的序列，更优选约50至约300个腺苷核苷酸的序列，甚至更优选约50至约250个腺苷核苷酸的序列，最优选约60至约250个腺苷核苷酸的序列。

6.权利要求1-5中任一项所述的mRNA序列，其还包含至少一个组蛋白茎环。

7.权利要求6所述的mRNA序列，其中所述至少一个组蛋白茎环选自下式(I)或(II)：

式(I)(没有茎边界元件的茎环序列)：

式(II)(具有茎边界元件的茎环序列)：

其中：

茎1或茎2边界元件N_1-6是1-6个，优选2-6个，更优选2-5个，甚至更优选3-5个，最优选4-5个或5个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；

其中N_0-2是0-2个，优选0-1个，更优选1个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物；

其中N_3-5是3-5个，优选4-5个，更优选4个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物，并且

环序列[N_0-4(U/T)N_0-4]位于元件茎1和茎2之间，并且是3-5个核苷酸，更优选4个核苷酸的连续序列；

其中每个N_0-4彼此独立地是0-4个，优选1-3个，更优选1-2个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物；并且

其中U/T表示尿苷或任选地胸苷；

其中N_3-5是3-5个，优选4-5个，更优选4个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；

其中N_0-2是0-2个，优选0-1个，更优选1个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；并且

其中

茎1和茎2能够彼此碱基配对，

形成反向互补序列，其中碱基配对可以发生在茎1与茎2之间，或者

形成部分反向互补的序列，其中不完全的碱基配对可以发生在茎1和茎2之间。

8.权利要求7所述的mRNA序列，其中所述至少一个组蛋白茎环选自下式(Ia)或(IIa)中的至少一个：

式(Ia)(没有茎边界元件的茎环序列)

式(IIa)(具有茎边界元件的茎环序列)。

9.权利要求1-8中任一项所述的mRNA序列，其还包含3’-UTR元件。

10.权利要求9所述的mRNA序列，其中所述至少一个3’UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于提供稳定的mRNA的基因的3’UTR或来源于其同源物，片段或变体。

11.权利要求10所述的mRNA序列，其中所述3’UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于选自由下述组成的组的基因的3’UTR：白蛋白基因，α-珠蛋白基因，β-珠蛋白基因，酪氨酸羟化酶基因，脂氧合酶基因，和胶原蛋白α基因，或来源于其同源物，片段或变体。

12.权利要求11所述的mRNA序列，其中所述3’-UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于α-珠蛋白基因的3’UTR，优选包含SEQIDNO.22所述的核酸序列相对应的RNA序列，其同源物，片段或变体。

13.权利要求9-12中任一项所述的mRNA序列，其中所述mRNA序列包含，优选地在5’-至3’-方向上包含：

a.)5’-帽结构，优选m7GpppN；

b.)编码区，所述编码区编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白，优选地编码来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)的至少一个抗原肽或蛋白；

c.)3’-UTR元件，所述3’-UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于α珠蛋白基因，优选包含SEQIDNO.22所述的核酸序列相对应的RNA序列，其同源物，片段或变体；

d.)聚腺苷酸序列，其优选包含64个腺苷；

e.)聚胞苷酸序列，其优选包含30个胞嘧啶；和

14.权利要求13所述的mRNA序列，其中所述mRNA序列包含SEQIDNo.24所述的RNA序列。

15.权利要求9所述的mRNA序列，其中所述至少一个3’UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于脊椎动物白蛋白基因的3’UTR或来源于其变体，优选地来源于哺乳动物白蛋白基因的3’UTR或来源于其变体，更优选地来源于人白蛋白基因的3’UTR或来源于其变体，甚至更优选地来源于GenBank登记号NM_000477.5所述的人白蛋白基因的3’UTR，或来源于其片段或变体。

16.权利要求15所述的mRNA序列，其中所述3’UTR元件来源于SEQIDNO.18所述的核酸序列，优选来源于相对应的RNA序列，其同源物，片段或变体。

17.权利要求1-16中任一项所述的mRNA序列，其还包含5’-UTR元件，所述5’-UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于TOP基因的5’UTR，优选地来源于相对应的RNA序列，其同源物，片段或变体，优选地缺少5’TOP基序。

18.权利要求17所述的mRNA序列，其中所述5’UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于编码核糖体蛋白的TOP基因的5’UTR，优选地来源于相对应的RNA序列，或来源于其同源物，片段或变体，优选地缺少5’TOP基序。

19.权利要求18所述的mRNA序列，其中所述5’UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5’UTR或来源于其同源物，片段或变体，优选地缺少5’TOP基序，并且更优选包含SEQIDNO.16所述的核酸序列相对应的RNA序列或由SEQIDNO.16所述的核酸序列相对应的RNA序列组成。

20.权利要求19所述的mRNA序列，其中所述mRNA序列包含，优选地在5’-至3’-方向上包含：

a.)5’-帽结构，优选m7GpppN；

b.)5’-UTR元件，所述5’-UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于TOP基因的5’-UTR，优选包含SEQIDNO.16所述的核酸序列相对应的RNA序列，其同源物，片段或变体或由SEQIDNO.16所述的核酸序列相对应的RNA序列，其同源物，片段或变体组成；

c.)编码区，所述编码区编码狂犬病病毒的至少一个抗原肽或蛋白，优选地编码来源于狂犬病病毒的糖蛋白G(RAV-G)的至少一个抗原肽或蛋白；

d.)3’-UTR元件，所述3’-UTR元件包含下述核酸序列或由下述核酸序列组成：所述核酸序列来源于提供稳定的mRNA的基因，优选包含SEQIDNO.18所述的核酸序列相对应的RNA序列，其同源物，片段或变体或由SEQIDNO.18所述的核酸序列相对应的RNA序列，其同源物，片段或变体组成；

e.)聚腺苷酸序列，其优选包含64个腺苷；

f.)聚胞苷酸序列，其优选包含30个胞嘧啶；和

21.权利要求20所述的mRNA序列，其中所述mRNA序列包含SEQIDNo.25所述的RNA序列。

22.权利要求1-21中任一项所述的mRNA序列，其中所述mRNA序列与阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体缔合或复合，任选地以选自下述范围的mRNA：阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的重量比缔合或复合：约6∶1(w/w)至约0.25∶1(w/w)，更优选地约5∶1(w/w)至约0.5∶1(w/w)，甚至更优选地约4∶1(w/w)至约1∶1(w/w)或约3∶1(w/w)至约1∶1(w/w)，并且最优选地约3∶1(w/w)至约2∶1(w/w)的比率；或者任选地以下述范围的mRNA：阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的氮/磷比率缔合或复合：约0.1-10的范围，优选约0.3-4或0.3-1的范围，并且最优选约0.5-1或0.7-1的范围，并且甚至最优选约0.3-0.9或0.5-0.9的范围。

23.权利要求22所述的mRNA序列，其中所述mRNA序列与阳离子蛋白或肽缔合或复合，优选与鱼精蛋白缔合或复合。

24.组合物，其包含多个或多于一个mRNA序列，每个mRNA序列如权利要求1-23中任一项所述。

25.药物组合物，其包含权利要求1-23中任一项定义的mRNA序列，或权利要求24定义的组合物，和任选地药用载体。

26.权利要求25所述的药物组合物，其中所述mRNA序列至少部分与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体复合，优选地与阳离子蛋白或肽，并且最优选与鱼精蛋白复合。

27.权利要求26所述的药物组合物，其中复合的mRNA与游离mRNA的比率选自约5∶1(w/w)至约1∶10(w/w)的范围，更优选地选自约4∶1(w/w)至约1∶8(w/w)的范围，甚至更优选地选自约3∶1(w/w)至约1∶5(w/w)或1∶3(w/w)的范围，并且最优选地，复合的mRNA：游离mRNA的比率选自1∶1(w/w)的比率。

28.试剂盒或部件的试剂盒，其包含权利要求1-23中任一项定义的mRNA序列，权利要求24定义的组合物，权利要求25-27中任一项定义的药物组合物的组分，和任选地具有关于所述组分的施用和剂量的信息的技术说明书。

29.权利要求1-23中任一项定义的mRNA序列，权利要求24定义的组合物，权利要求25-27中任一项定义的药物组合物和权利要求28定义的试剂盒或部件的试剂盒，其用作药物。

30.权利要求1-23中任一项定义的mRNA序列，权利要求24定义的组合物，权利要求25-27中任一项定义的药物组合物和权利要求28定义的试剂盒或部件的试剂盒，其用于治疗或预防狂犬病病毒感染。

31.权利要求30的用途的mRNA序列，组合物，药物组合物和试剂盒或部件的试剂盒，其中所述治疗是暴露后的预防。

32.权利要求31的用途的mRNA序列，组合物，药物组合物和试剂盒或部件的试剂盒，其中所述治疗与狂犬病免疫球蛋白的施用组合。

33.权利要求29-32中任一项的用途的mRNA序列，组合物，药物组合物和试剂盒或部件的试剂盒，其中所述mRNA序列，组合物，药物组合物或试剂盒或部件的试剂盒通过皮下，肌内或皮内注射施用，优选通过肌内或皮内注射施用，更优选通过皮内注射施用。

34.权利要求33的用途的mRNA序列，组合物，药物组合物和试剂盒或部件的试剂盒，其中所述注射通过使用常规的有针注射或喷射注射进行，优选地通过使用喷射注射进行。

35.治疗或预防狂犬病病毒感染的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供权利要求1-23中任一项定义的mRNA序列，权利要求24定义的组合物，权利要求25-27中任一项定义的药物组合物，或权利要求28定义的试剂盒或部件的试剂盒；

b)将所述mRNA序列，组合物，药物组合物或试剂盒或部件的试剂盒应用或施用至组织或生物体；

c)任选地施用狂犬病免疫球蛋白。

36.权利要求35所述的方法，其中所述mRNA序列，组合物，药物组合物或试剂盒或部件的试剂盒通过皮下，肌内或皮内注射施用至所述组织或所述生物体，优选地通过肌内或皮内注射施用，更优选地通过皮内注射施用。

37.权利要求36所述的方法，其中所述注射通过使用常规的有针注射或喷射注射进行，优选地通过使用喷射注射进行。