JP2022546417A - 最小ｍＲＮＡおよびその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、コード配列の発現に有用な最小構造を有する、完全に化学的に合成されたＲＮＡ分子（以下、「ＣｈｅｍＲＮＡ」と称する）に関する。本発明のＣｈｅｍＲＮＡは一般構造 ５´－Ｗ－Ｘ－Ｙ－(コード配列)－Ｚ－３´ を有し、ここでＷは、５´－キャップ、遊離５´－三リン酸基、遊離５´－二リン酸基、遊離５´－一リン酸基、遊離５´－ＯＨ基、および、前記５´－キャップ、前記遊離５´－三リン酸基、前記遊離５´－二リン酸基、前記遊離５´－一リン酸基の化学的に修飾された類似体からなる群から選ばれ、Ｘはオプションの５´ＵＴＲ配列であり、Ｙはオプションの開始コドン、Ｚは直接コード配列につながり、遊離３´－ＯＨ基、終止コドンおよび、オプションで３´ＵＴＲ配列を経由して、ポリ（Ａ）テイルにつながる終止コドン、からなる群から選ばれる。本発明はさらに、ＲＮＡポピュレーション（集団）の少なくとも８５％またはそれ以上が本発明のＲＮＡの化学構成と同一の構成を有するＲＮＡポピュレーションに関し、少なくとも１％のＲＮＡが全長ＲＮＡに比較して１ヌクレオチド短い状態で存在する本発明のＲＮＡを含むＲＮＡポピュレーションに関する。本発明のＲＮＡとＲＮＡポピュレーションは、細胞や生物において、または、無細胞発現系において、コード配列によってコードされるアミノ酸配列の発現のために有用である。本発明はさらに、薬学的組成物に関し、ＲＮＡまたはＲＮＡポピュレーションを含むワクチンと診断ツールに関する。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、コード配列の発現に有用な最小構造を有する、完全に化学的に合成されたＲＮＡ分子（以下、「ＣｈｅｍＲＮＡ」と称する）に関する。本発明のＣｈｅｍＲＮＡは一般構造 ５´－Ｗ－Ｘ－Ｙ－(コード配列)－Ｚ－３´ を有し、ここでＷは、５´－キャップ、遊離５´－三リン酸基、遊離５´－二リン酸基、遊離５´－一リン酸基、遊離５´－ＯＨ基、および、前記５´－キャップ、前記遊離５´－三リン酸基、前記遊離５´－二リン酸基、前記遊離５´－一リン酸基の化学的に修飾された類似体からなる群から選ばれ、Ｘはオプションの５´ＵＴＲ配列であり、Ｙはオプションの開始コドン、Ｚは直接コード配列につながり、遊離３´－ＯＨ基、終止コドンおよび、オプションで３´ＵＴＲ配列を経由して、ポリ（Ａ）テイルにつながる終止コドン、からなる群から選ばれる。本発明はさらに、ＲＮＡポピュレーション（集団）の少なくとも８５％以上が本発明のＲＮＡの化学構成と同一の構成を有するＲＮＡポピュレーションに関し、少なくとも１％のＲＮＡが完全長ＲＮＡに比較して１ヌクレオチド短い状態で存在する本発明のＲＮＡを含むＲＮＡポピュレーションに関する。本発明のＲＮＡとＲＮＡポピュレーションは、細胞や生物において、または、無細胞発現系において、コード配列によってコードされるアミノ酸配列の発現のために有用である。本発明はさらに、薬学的組成物に関し、ＲＮＡまたはＲＮＡポピュレーションを含むワクチンと診断ツールに関する。
合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ワクチン接種のためのタンパク質発現、および、例えばサイトカインや抗体のようなタンパク質の発現、遺伝病における欠損または異常タンパク質の置換、または、例えばＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳを用いるＤＮＡ修復、といった治療、のためのベクターとして、集中的に開発されている。先行技術によると、ｍＲＮＡは、インビトロで酵素過程によって作成される。典型的には、テンプレートＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ（インビトロ転写ｍＲＮＡ；ｉｖｔ ｍＲＮＡ）によってＲＮＡに転写され、そしてＤＮＡはＤＮａｓｅによって分解され、ｍＲＮＡはポリ（Ａ）ポリメラーゼによって最終的にポリアデニル化される（非特許文献１）。ｍＲＮＡの酵素的作成は効率的で、ロバストであり、多量の治療用ｍＲＮＡの作成を可能にする。しかしながら、それは二つの重大な欠点を有する：(i)生物学的過程を通しての作成のため、結果であるＲＮＡは、規制当局によって遺伝子治療製品として通常分類される； および(ii) ｍＲＮＡの酵素的作成は、ＤＮＡをＲＮＡに転写する追加の工程を通常必要とし、ＤＮＡテンプレートを前もって作成する必要もあるので、当該処理が間接的なものになる。抗ガンワクチンのような目的のため、特に、ｍＲＮＡワクチンが変異に対するＴ細胞免疫を誘引することを目的とするとき、一つのエピトープ（３から８アミノ酸程度に短い）のみをコードする必要があるので、ｍＲＮＡは比較的短くできるであろう。
国際公開第２０１７／１６７９１０号
Tusup et al. (2019) Chimia (Aarau) 73 (6), 391-394 Elfakess and Dikstein (2008) PLoS ONE 3 (8), e3094 Hinz et al. (2017) Methods in Mol. Biol. 1499, 203-222 Strenkowska et al. (2016) Nucleic Acids Research 44 (20), pages 9578-9590 Beaucage and Iyer (1992) Tetrahedron Vol. 48. No. 12, pp. 2223-2311 Beaucage and Reese (2009) Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem . 38:2.16.1‐2.16.31 Sahin et al. (2017) Nature 547, 222-226 Sekine, et al. (1996) J. Org. Chem. 61, 4412-4422
本発明の基礎をなす技術的課題は、酵素的に作成されるＲＮＡが遭遇する上記問題を解消するｍＲＮＡを提供することである。
上記技術課題への解決法は、特許請求の範囲ならびに本明細書および図面で規定される、本発明の態様の提供である。
示された作用剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞単独により放出され、１８時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＬ－２として測定された、ＩＬ－２放出をグラフで示す。 示された作用剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞とＢ１６細胞により放出され、１８時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＬ－２として測定された、ＩＬ－２放出をグラフで示す。 示された作用剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞単独により放出され、１８時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γ（ガンマ、ｇ）として測定された、ＩＦＮ－γ放出をグラフで示す。 示された作用剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞とＢ１６細胞により放出され、１８時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γ（ガンマ、ｇ）として測定された、ＩＦＮ－γ放出をグラフで示す。 示された作用剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞により放出され、１８時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＬ－２として測定された、ＩＬ－２放出をグラフで示す。酵素的ポリアデニル化未処理ＲＮＡで得られた結果を示している。試料は以下のとおりである。Ｃａｐｐｅｄ ５ｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－Ｎ７－ＭｅＧｐｐｐ，７ｍＧｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ｐｐｐ ５ｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－ｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ｐ ５ｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－ｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ＯＨ ５ｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－ＯＨ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； Ｋｉｆ１８ｂ ｃａｐｐｅｄ ｏｌｉｇｏ：５’－Ｎ７－ＭｅＧｐｐｐ，７ｍＧｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧｕｕｃｃａｇｇａａｕｕｕｇｕｕｇａｃｕｇｇｇａａａａｃｇｕｕＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）。 示された作用剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞により放出され、１８時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＬ－２として測定された、ＩＬ－２放出をグラフで示す。酵素的にポリアデニル化されたＲＮＡで得られた結果を示している。試料は以下のとおりである。Ｃａｐｐｅｄ ５ｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－Ｎ７－ＭｅＧｐｐｐ，７ｍＧｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ｐ ５ｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－ｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ＯＨ ５ｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－ＯＨ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； 示された作用剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞により放出され、４４時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＬ－２として測定された、ＩＬ－２放出をグラフで示す。試料は以下のとおりである。Ｃａｐ ５ｎ ＵＴＲ：５’－Ｎ７－ＭｅＧｐｐｐ，７ｍＧｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ３Ｐ ５ｎ ＵＴＲ：５’－ｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； Ｐ ５ｎ ＵＴＲ：５’－ｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ＯＨ ５ｎ ＵＴＲ：５’－ＯＨ－ｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）； Ｍｉｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－ＡＵＧＡＧＵＡＵＡＡＵＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＡＡＡＣＵＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）； Ｎｏ ＳＴＯＰ：５’－ＡＣＡＡＧＡＵＧＡＧＵＡＵＡＡＵＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＡＡＡＣＵＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）； Ｎｏ ＡＵＧ：５’－ＡＧＵＡＵＡＡＵＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＡＡＡＣＵＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）； Ｋｉｆ１８ｂ ｃａｐｐｅｄ ｏｌｉｇｏ：５’－Ｎ７－ＭｅＧｐｐｐ，７ｍＧｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧｕｕｃｃａｇｇａａｕｕｕｇｕｕｇａｃｕｇｇｇａａａａｃｇｕｕＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）。 示された作用剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞により放出され、２４時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＬ－２として測定された、ＩＬ－２放出をグラフで示す。試料は以下のとおりである。Ｃａｐ ５ｎ ＵＴＲ：５’－Ｎ７－ＭｅＧｐｐｐ，７ｍＧｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ３Ｐ ５ｎ ＵＴＲ：５’－ｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； Ｐ ５ｎ ＵＴＲ：５’－ｐ－ａｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）； ＯＨ ５ｎ ＵＴＲ：５’－ＯＨ－ｃａａｇＡＵＧａｇｕａｕａａｕｃａａｃｕｕｕｇａａａａａｃｕｇＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）； Ｍｉｎ ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－ＡＵＧＡＧＵＡＵＡＡＵＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＡＡＡＣＵＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）； Ｎｏ ＳＴＯＰ：５’－ＡＣＡＡＧＡＵＧＡＧＵＡＵＡＡＵＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＡＡＡＣＵＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）； Ｎｏ ＡＵＧ：５’－ＡＧＵＡＵＡＡＵＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＡＡＡＣＵＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）； Ｋｉｆ１８ｂ ｃａｐｐｅｄ ｏｌｉｇｏ：５’－Ｎ７－ＭｅＧｐｐｐ，７ｍＧｐｐｐ－ａｃａａｇＡＵＧｕｕｃｃａｇｇａａｕｕｕｇｕｕｇａｃｕｇｇｇａａａａｃｇｕｕＵＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）。 ＲＮＡトランスフェクションなしで７日インキュベーション後の健常ドナーのＰＭＢＣ培養のＦＡＣＳ解析のグラフを示す。 メチオニンを前（５´側）につなげた、インフルエンザウイルスエピトープＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）をコードするＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ Ｆｌｕ ｍａｔｒｉｘ（５’ＯＨ－ＡＵＧＧＧＧＡＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＵＧＵＧＵＵＣＡＣＧＣＵＣ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）でトランスフェクションし、７日インキュベーション後の健常ドナーのＰＭＢＣ培養のＦＡＣＳ解析のグラフを示す。 メチオニンを前（５´側）につなげたＣＭＶエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）をコードするＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ ＣＭＶ ｐｐ６５ （５’－ＯＨ ＡＵＧＡＡＣＣＵＧＧＵＧＣＣＣＡＵＧＧＵＧＧＣＵＡＣＧＧＵＵ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）でトランスフェクションし、７日インキュベーション後の健常ドナーのＰＭＢＣ培養のＦＡＣＳ解析のグラフを示す。 ＲＮＡトランスフェクションなしで１４日インキュベーション後の健常ドナーのＰＭＢＣ培養のＦＡＣＳ解析のグラフを示す。 メチオニンを前（５´側）につなげた、インフルエンザウイルスエピトープＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）をコードするＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ Ｆｌｕ ｍａｔｒｉｘ（５’ＯＨ－ＡＵＧＧＧＧＡＵＵＵＵＧＧＧＧＵＵＵＧＵＧＵＵＣＡＣＧＣＵＣ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）でトランスフェクションし、１４日インキュベーション後の健常ドナーのＰＭＢＣ培養のＦＡＣＳ解析のグラフを示す。 メチオニンを前（５´側）につなげた、ＣＭＶｐｐ６５エピトープＭＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）をコードするＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ ＣＭＶ ｐｐ６５ （５’－ＯＨ ＡＵＧＡＡＣＣＵＧＧＵＧＣＣＣＡＵＧＧＵＧＧＣＵＡＣＧＧＵＵ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）でトランスフェクションし、１４日インキュベーション後の健常ドナーのＦＡＣＳ解析のグラフを示す。 フォワードスキャッタリングとサイドスキャッタリングにおけるリンパ球上のゲーティング法であって、ＲＮＡトランスフェクションなしのコントロール培養の場合のＣＤ３＋およびＣＤ４＋ポピュレーション上のゲーティング法を示したものである。 ゲーティング後のＲＮＡなし培養のドットプロット解析を示したものである。 ゲーティング後のＯｌｉｇｏ Ｆｌｕ ｍａｔｒｉｘ ＲＮＡでトランスフェクトした培養のドットプロット解析を示したものである。 ゲーティング後のＯｌｉｇｏ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＲＮＡでトランスフェクトした培養のドットプロット解析を示したものである。 示された薬剤でトランスフェクトされたＯＴ１マウス脾細胞により放出され、４０時間インキュベーション後の細胞上清中のＩＬ－２として測定された、ＩＬ－２放出をグラフで示す。試料は以下のとおりである。ＳＩＩＮＦＥＫＬ－ＣＦ：５’－ＡＵＧＡＧＵＡＵＡＡＵ［２’－Ｆ－Ｃ］ＡＡ［２’－Ｆ－Ｃ］ＵＵＵＧＡＡＡＡＡ［２’－Ｆ－Ｃ］ＵＧ－３’（ここで２’－Ｆ－Ｃは２’フルオロデオキシシトシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）； ＳＩＩＮＦＥＫＬ：５’－ＡＵＧＡＧＵＡＵＡＡＵＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＡＡＡＣＵＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）。
具体的には、本発明は、下記、一般式（１）の構造を有する、完全に化学的に合成されたＲＮＡ（本明細書では「ＣｈｅｍＲＮＡ」とも称す）を提供する。
５´－Ｗ－Ｘ－Ｙ－(コード配列)－Ｚ－３´ （１）
ここで、
Ｗは、５´－キャップ、遊離５´－三リン酸基、遊離５´－二リン酸基、遊離５´－一リン酸基、遊離５´－ＯＨ基、および、前記５´－キャップ、前記遊離５´－三リン酸基、前記遊離５´－二リン酸基、前記遊離５´－一リン酸基の化学的に修飾された類似体からなる群から選ばれ、
Ｘは、存在しなくても存在しなくてもよく、存在する場合には５´ＵＴＲ配列であり、
Ｙは、存在しなくても存在しなくてもよく、存在する場合には開始コドンであり、
Ｚは、直接コード配列につながり、遊離３´－ＯＨ基、終止コドン、および、ポリ（Ａ）テイルにつながる終止コドン、オプションで３´ＵＴＲ配列を経由してポリ（Ａ）テイルにつながる終止コドン、からなる群から選ばれる。
本発明の好ましいＣｈｅｍＲＮＡは、下記の式（２）から（６１）に関する構造の一つを有する。
[式１]
Figure 2022546417000002
Figure 2022546417000003
Figure 2022546417000004
ここで、
ｐｏｌｙＡはポリ（Ａ）テイルであり、
ｓｔｏｐは終止コドンであり、
ＵＴＲは５´ＵＴＲであり、
ｔｒｉＰは遊離三リン酸基であり、
ｄｉＰは遊離二リン酸基であり、
ｍＰは遊離一リン酸基である。
本明細書に定義したように、Ｎ７ＭｅＧｐｐｐはＮ７－メチルグアノシン三リン酸である。
本発明の特に好ましいＣｈｅｍＲＮＡは、式（５８）によるものである。
本発明の他の特に好ましい複数のＣｈｅｍＲＮＡは、式（３）のそれらを含む。
更に好ましい本発明の態様では、ＣｈｅｍＲＮＡは式（１５）のＲＮＡである。
更に他の本発明の好ましい態様では、ＣｈｅｍＲＮＡは式（３９）による構造を有する。
更に好ましい本発明の態様では、ＣｈｅｍＲＮＡは式（５１）による構造を有する。
また更に好ましい本発明の態様では、ＣｈｅｍＲＮＡは式（６１）による構造を有する。
本発明の一つの態様では、ＲＮＡは、式（３）にさらに好ましい詳細において概説されるように、５´－キャップ、５´ＵＴＲ、開始コドン、コード配列および終止コドンを有する。一般的に、本発明のこの態様におけるＲＮＡは、別法として次の一般的構造で定義される。
５´－キャップ－５´ＵＴＲ－（開始コドン）－（コード配列）－（終止コドン）－３´
存在する場合には、終止コドンは好ましくは、ＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡから選ばれる。
存在する場合には、本発明のＲＮＡは比較的短い５´ＵＴＲ配列を含むのが好ましい。本発明において使用するための特に好ましい５´ＵＴＲ配列は、１０ヌクレオチドを超えない５´ＵＴＲ配列から選ばれ、より好ましくは２から１０ヌクレオチドであり、すなわち本発明で使用するための非常に好ましい５´ＵＴＲ配列は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドの長さを有する。
本発明において使用される好ましい５´ＵＴＲ配列の例は、例えば、非特許文献２に開示されている。非常に好ましい５´ＵＴＲ配列は５´－ＡＡＧ－３´配列を含む。より具体的には、本発明のＲＮＡのための５´ＵＴＲ配列は、５´－ＡＡＧ－３´モチーフを含み、５ヌクレオチドの長さを有し、５´－ＡＡＧ－３´モチーフが直接開始コドンの前（５´側）に位置することがより好ましい。本発明において用いられる好ましい５´ＵＴＲ配列は、５´－ＡＣＡＡＧ－３´配列である。このモチーフ、５、６、７または８ヌクレオチドの長さの特に好ましい５´ＵＴＲ配列を用いる他の態様では、５´ＵＴＲ配列はこの配列もまた含むことができ、ここで５ヌクレオチド配列５´－ＡＣＡＡＧ－３´が開始コドンの前（５´側）に直接位置することが好ましい。
本発明の他の態様では、５´ＵＴＲは特許文献１に開示された５´ＵＴＲ配列から選ばれる。具体的には、５´ＵＴＲは、配列５´－ＣＧＣＣＡＣＣ－３´を含む、または、配列５´－ＣＧＣＣＡＣＣ－３´からなるのが好ましく、ここで、（５´末端から数えて）６位のＣヌクレオチドはアデノシンヌクレオチドによって置換されてよく、および／または、（５´末端から数えて）７位のＣヌクレオチドはグアノシンヌクレオチドによって置換されてよく、および／または、５位のＡヌクレオチドはグアノシンヌクレオチドによって置換されてもよい。そのような配列を含むこのタイプの特に好ましい５´ＵＴＲ 配列は、５´－ＣＧＣＣＡＣＣ－３´配列が開始コドンの前（５´側）に直接位置するこれらの配列から選ばれる。他の好ましい態様では、５´ＵＴＲは、ＮがＡ、Ｃ、Ｇおよび Ｕから選ばれる配列５´－ＣＮＧＣＣＡＣＣ－３´を含む、または、ＮがＡ、Ｃ、ＧおよびＵから選ばれる配列５´－ＣＮＧＣＣＡＣＣ－３´からなり、ここで（５´末端から数えて）７位のＣヌクレオチドはＡヌクレオチドによって置換されてよく、および／または、（５´末端から数えて）８位のヌクレオチドはＧヌクレオチドによって置換されてよく、および／または、（５´末端から数えて）６位のＡヌクレオチドはＧヌクレオチドによって置換されてよい。そのような配列を含むこのタイプの５´ＵＴＲ配列は、配列５´－ＣＮＧＣＣＡＣＣ－３´が直接開始コドンの前（５´側）に位置する配列から選ばれる。
本発明の驚くべき発見の一つは、コード配列の発現に有用な本明細書に開示され、記載されるＲＮＡは３´ポリ（Ａ）テイルを必要としないことである。したがって、本明細書に開示されるＲＮＡ分子の好ましい態様では、３´末端でポリ（Ａ）テイルを含まない。本発明の他の態様では、ＲＮＡは３´末端でポリ（Ａ）テイルを含む。ポリ（Ａ）テイルが存在する場合、それは比較的短いのが好ましい。好ましいポリ（Ａ）テイルは２から３０ヌクレオチドのように３０ヌクレオチドまでを有し、より好ましくは５から２０ヌクレオチドのように２０ヌクレオチドまで、さらにより好ましくは５から１５ヌクレオチドのように１５ヌクレオチドまで、まださらに好ましくは５から１０ヌクレオチドのように１０ヌクレオチドまでを有する。ポリ（Ａ）テイルの特に好ましい長さは、５、１０、１５、２０、２５および３０ヌクレオチドである。
本発明に関する、さらに、よりさらに、驚くべき発見は、ＣｈｅｍＲＮＡの好ましい態様は、特に細胞または生物において、コード配列の発現において有用であるために５´－キャップ構造を必要としないことである。
さらに、まだより顕著に驚くべき発見は、本発明のＣｈｅｍＲＮＡは、コード配列の発現において有用であるために、５´末端でリン酸基を欠くことができる（すなわち５´末端基はＯＨである）ことである。
さらに非常に驚くべき本発明の発見は、ＣｈｅｍＲＮＡは、コード配列の発現において有用であるために開始コドンおよび／または終止コドンさえ必要としないことである。
さらに、それらの完全に化学的な作成過程により、本願発明に係るＲＮＡとそのポピュレーションは、遺伝子治療製品として考慮されない可能性があり（非特許文献３参照）、これにより規制当局による承認手続きが非常に簡単で早くなる。
本発明の好ましいＲＮＡはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチドは好ましくは２００ヌクレオチド以上の長さを有さず（すなわち構成されず）、より好ましい長さは最長で１００ヌクレオチド、より好ましくは最長で８０ヌクレオチド、さらにより好ましくは最長で７０ヌクレオチドである。特に好ましい本発明のオリゴヌクレオチドＲＮＡは、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０から２００ヌクレオチドまでの長さであり、より好ましくは２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０から１２０ヌクレオチドまで、さらにより好ましくは２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０から１００ヌクレオチドまでの長さである。
ＲＮＡが一本鎖であることもまた好ましい。
本発明の他の態様では、本明細書に規定され開示されるＲＮＡはまた、部分的にまたは完全に二本鎖であってよい。本発明の部分的に二本鎖であるＲＮＡは、ヘアピンを形成する一本鎖ＲＮＡにおける自己相補配列部分により、二本鎖構造の二本鎖部分または領域を形成する一本鎖のみを含んでもよく、または二本鎖構造の一部または一領域のみを含んでよい。したがって、自己相補に起因する本発明の部分的二本鎖ＲＮＡの場合、このような本発明の部分的二本鎖ＲＮＡは一本鎖ＲＮＡでもあると理解すべきである。他の本発明の部分的二本鎖ＲＮＡは、二本以上、典型的には相補配列を有する二本鎖からなるので、本発明のＲＮＡの式は一本鎖のみ示すが、本明細書での様々な態様において示される鎖に完全または部分的に相補な鎖の配列は、当該技術分野で知られるＲＮＡ塩基対の相補性ルールによって決定されると理解すべきである。二本以上、典型的には二本鎖によって形成される本発明の部分的二本鎖ＲＮＡは、ゆらぎ二本鎖、一つの平滑末端とオーバーハングを有する一つの末端を有する二本鎖ＲＮＡ、同一鎖によって形成される二つのオーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡ、のようないずれの形も採用できる。本発明に関して、二本鎖ＲＮＡは、二本鎖が３本目のＲＮＡ鎖の異なる領域に相補であるように存在する種のような、三本鎖以上によって形成されると考えられる。本発明の所定の態様において、ＲＮＡは二つの平滑末端を有する完全二本鎖であることもできる。所定の態様において、二本鎖ＲＮＡ、具体的には二本以上、好ましくは二本の個々の鎖によって構成される二本鎖ＲＮＡは、例えば含有されたコード配列を通してペプチドをコードする一本鎖を提供するための前駆体として働き得る。
本発明の完全または部分的二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡにさらなる機能性を提供し得る。好ましい態様では、上記で規定された本発明の二本鎖は、ＲＩＧ－Ｉのリガンドとして機能することができるように、本発明の二本鎖ＲＮＡの平滑末端の一本鎖に付加された遊離５´三リン酸を有すると考えられる。他の態様は、４５ｂｐ以上の長さ、典型的には５０ｂｐ以上で、ＴＬＲ３の引き金を引く、本発明の二本鎖ＲＮＡのような、ＴＬＲの引き金を引くことができるＲＮＡに関する。
本発明のＲＮＡは、コード配列を含み、細胞インビトロまたはインビボ発現系、または、無細胞インビトロ発現系においてコード配列を発現することに好ましくは有用である。無細胞発現系における用途には、５´－キャップを有しない本発明のＲＮＡ、または、５´－キャップを欠く本発明のＲＮＡのようなＲＮＡを含む第一または第二ＲＮＡポピュレーションのそれぞれが特に好ましい。本発明によると、本明細書に規定され開示されるＲＮＡは「コードＲＮＡ」とも称される。本発明のＲＮＡは３´ポリ（Ａ）テイル、および／または、５´－キャップ、および／または、開始コドン、および／または、終止コドンを含むことを必要としないが、本発明のＲＮＡはまた「ｍＲＮＡ」として示される。
本明細書に開示するＲＮＡ分子のコード配列は特に限定されない。概要について上述したように、ＲＮＡの全ての長さがＲＮＡオリゴヌクレオチドの全ての長さの境界を本質的に含むように、好ましいコード配列は選択される。好ましいコード配列は４から６５アミノ酸をコードする。本発明に用いるための特に好ましいコード配列は、比較的短く、４から４０アミノ酸をコードする。より好ましいコード配列は８から３０アミノ酸のアミノ酸配列をコードする。
より詳細についてさらに以下に概説するように、コード配列によってコードされる好ましいペプチドは、好ましくはエピトープのような、ガンや腫瘍タンパク質（本明細書では「ガン抗原」とも称する）由来のペプチド、または、好ましくはウイルス、バクテリア、または真菌のような感染因子由来のペプチドである。
各タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドに関連する、ガンまたは腫瘍由来のペプチドは、それぞれ、本明細書では「ガンペプチド」として定義され、所定の好ましい態様において、ガンではない野生型配列のアミノ酸配列とは異なる少なくとも一つのアミノ酸配列を有し得る。
本発明のＲＮＡ種に含まれるコード配列によってコードされるさらに好ましいペプチドは、自己免疫細胞によって認識される組織のペプチドである。
本発明の他の利点は、正確なヌクレオチド位置で部位特異的化学修飾を有するｍＲＮＡを提供することが可能であることであり、これは、酵素的合成によってｍＲＮＡが調製される場合には通常は不可能である。例えば、特定の化学修飾（リン酸骨格、リボースまたは塩基部分での）を伴う一つのヌクレオチドを提供することが可能となる。好ましい態様では、ＲＮＡは一つのヌクレオチドでの化学修飾を有する。好ましい化学修飾は、３´末端ヌクレオチドに、および／または５´末端ヌクレオチドに存在する。
したがって、本発明の好ましい態様によると、ＲＮＡは少なくとも一つの化学修飾を含み、すなわち、少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチド類似体を含む。この点において、「化学修飾」および「化学的に修飾されたヌクレオチド類似体」は、対応する標準的（すなわち修飾されていない）ヌクレオチド、ａ、ｃ、ｇおよびｕそれぞれに比較して、ヌクレオチドが化学的に修飾されることを意味する。化学的修飾はヌクレオチドのリン酸、リボース、塩基部分でもよい。本願明細書を通して用いられるように、「ヌクレオチド」という用語は、他に特定しない限り、「リボヌクレオチド」を示すと理解される。当該修飾は、化学的合成の間に導入するか、または、例えばメチラーゼおよびデアミナーゼのファミリーから酵素によってＣｈｅｍＲＮＡに付加することができる。酵素的修飾の他の好ましい例としては、好ましくは概要について上述したような好ましい長さの範囲に従い、ＣｈｅｍＲＮＡ、好ましくは式（３）、（６）、（９）、（１２）、（１５）、（１８）、（２１）、（２４）、（２７）、（３０）、（３３）、（３６）、（３９）、（４２）、（４５）、（４８）、（５１）、（５４）、（５７）または（６０）による構造を有するＣｈｅｍＲＮＡ、特に好ましくは式（３）、（１５）、（３９）または（５１）による構造を有するＣｈｅｍＲＮＡを、Ｅ．Ｃｏｌｉからのポリ（Ａ）ポリメラーゼのような、ポリ（Ａ）ポリメラーゼとインキュベートすることによる、ＲＮＡの３´末端へのポリ（Ａ）テイルの付加である。
標準的ヌクレオチドに比較して、ヌクレオチド類似体の化学修飾は、リボース、リン酸、および／または塩基部分で行われ得る。高い安定性を有する分子に関して、特にＲＮＡ分解酵素に関して、リボースおよび／またはリン酸部分での修飾が特に好まれる。
リボースが修飾されたリボヌクレオチドの好ましい例は、２´－ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２または ＣＮから選ばれる基によって置換され、Ｒが Ｃ１－Ｃ６アルキル, アルケニルまたはアルキニルであり、ハロが Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであることを伴う、類似体である。より好ましいヌクレオチド類似体はメチル化およびフッ化ヌクレオチド類似体で、最も好ましくは２´－Ｏメチルおよび２´－Ｆ類似体である。
上述したように、少なくとも一つ修飾されたリボヌクレオチドは、塩基部分に化学修飾を有する類似体から選ばれ得る。このような類似体の例には、これに限らないが、５－アミノアリルウリジン、６－アザウリジン、８－アザアデノシン、５－ブロモウリジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、Ｎ６-メチルアデノシン、５-メチルシチジン、シュードウリジン、Ｎ１メチルシュードウリジン、Ｎ１メチルアデノシン、チミンおよび４-チオウリジンが含まれる。
隣接するリボヌクレオチド間のリン酸エステル基が修飾された、バックボーン修飾リボヌクレオチドの例は、ホスホロチオエート基である。
修飾ヌクレオチド類似体を含む、本発明に関するＲＮＡのさらに好ましい態様は、修飾がＲＮＡの３´末端であるＲＮＡから選ばれる。
好ましい修飾は、各ヌクレオチド類似体の最も好ましい位置が３´末端である、次の表に示される各修飾のうち一つを含む（左列：修飾ヌクレオチド類似体の名称、右列：略号）。
Figure 2022546417000005
本発明のＲＮＡはまた、式（１）のＷの群の定義に含まれるように、５´キャップまたは遊離５´－リン酸基、すなわち遊離５´－三リン酸、遊離５´－二リン酸または５´－一リン酸の化学類似体を含んでもよい。典型的には、そして好ましくは、リン酸含有5’基の類似体はチオリン酸であり、好ましいチオリン酸はリン酸基あたり一つの硫黄原子を含む。二つ以上のリン酸（すなわち遊離５´－二リン酸基、遊離５´－三リン酸、または５´キャップ）を有する５´－リン酸含有基は、好ましくは二つの三リン酸部分のような、二つ以上のリン酸を含み得ると理解される。各５´キャップおよび遊離５´－リン酸基へのチオリン酸の導入は、本技術分野で知られている。チオリン酸含有５´キャップ構造としては、例えば、非特許文献４が参照される。
本発明のＲＮＡの化学的合成のプロトコールは本技術分野で一般に知られるものであり、リン酸アミダイト法を基にした固相法によって典型的には実行される（例えば、非特許文献５および６を参照のこと）。
本発明のさらなる主題は、（第一）ＲＮＡポピュレーション（集団）であり、前記ＲＮＡポピュレーション中のＲＮＡ（複数）の少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％が、上述のように規定したＲＮＡと同一化学構造を有する（第一）ＲＮＡポピュレーションであり、ここで、前記ＲＮＡは完全に化学的に合成されると規定して理解してもよいし、概要について上述したように規定するが「完全に化学的に合成された」と明示的には限定しないようにしてもよい。
本発明の他の態様は、別の（第二）ＲＮＡポピュレーション（集団）であって、ｎヌクレオチドの全長を有する、本明細書で上述のように規定したＲＮＡと、化学構成が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、まださらにより好ましくは少なくとも９９％、全長ＲＮＡの化学構成に一致するが、長さが（ｎ－１）ヌクレオチドであるＲＮＡを少なくとも１％含む。ここで、長さ（ｎ－１）のＲＮＡの化学構成が長さｎの全長ＲＮＡの化学構成に一致する割合は、長さｎの全長ＲＮＡのうち、（ｎ－１）個のヌクレオチドの化学構成に関するものであることを意味する（すなわち、少なくとも１％の量で存在する、（ｎ－１）ヌクレオチド長を有するＲＮＡは、長さｎの全長ＲＮＡに比較して１ヌクレオチド短いとはいえ、他には、そのヌクレオチド配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは９８％、まだより好ましくは少なくとも９９％、長さｎの全長ＲＮＡのヌクレオチド配列に一致する）。さらに好ましい態様では、このＲＮＡポピュレーションは、化学構成が少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、まださらにより好ましくは少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、全長ＲＮＡの化学構成に一致するが、（ｎ－２）の長さであるＲＮＡを少なくとも１％さらに含み、ここで、長さ（ｎ－２）のＲＮＡの化学構成が長さｎの全長ＲＮＡの化学構成に一致する割合は、長さｎの全長ＲＮＡのうち、（ｎ－２）個のヌクレオチドの化学構成に関するものであることを意味する（すなわち、少なくとも１％の量で存在する、（ｎ－２）個のヌクレオチドを有するＲＮＡは、長さｎの全長ＲＮＡに比較して２ヌクレオチド短いとは言え、他には、そのヌクレオチド配列は、少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは９７％、まだより好ましくは９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、長さｎの全長ＲＮＡのヌクレオチド配列に一致する）。まださらに好ましい態様では、ＲＮＡポピュレーションは、化学構成が少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、まだより好ましくは少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、全長ＲＮＡの化学構成に一致するが、（ｎ－３）の長さを有するＲＮＡを少なくとも１％さらに含み、ここで、長さ（ｎ－３）のＲＮＡの化学構成が長さｎの全長ＲＮＡの化学構成に一致する割合は、長さｎの全長ＲＮＡのうち、（ｎ－３）個のヌクレオチドの化学構成に関するものであることを意味する（すなわち、少なくとも１％の量で存在する、（ｎ－３）ヌクレオチドを有するＲＮＡは、長さｎの全長ＲＮＡに比較して３ヌクレオチドだけ短いとは言え、他には、そのヌクレオチド配列は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは９７％、まだより好ましくは９８％、特に好ましくは少なくとも９８．５％、長さｎヌクレオチドの全長ＲＮＡのヌクレオチド配列に一致する）。本発明のこの態様ではまた、ＲＮＡは完全に化学的に合成されると規定して理解してもよいし、または、概要について上述したように規定するが「完全に化学的に合成される」と明示的には限定しないようにしてもよい。本発明によると、本明細書に開示される第二ＲＮＡポピュレーションにおいて「ｎ」に関するすべての参照は、「ｎ」は整数であると理解され、少なくとも１０である整数、本発明の所定の態様では少なくとも２０，本発明の他の好ましい態様では少なくとも３０、好ましくは２０から２００まで、より好ましくは３０から２００まで、さらにより好ましくは３０から１２０まで、まださらに好ましくは３０から１００まで、である整数であると理解される。
本発明は、本明細書に規定されるＲＮＡ，または、本明細書に規定される第一ＲＮＡポピュレーション（集団）、または、本明細書に規定される第二ＲＮＡポピュレーション（集団）を含む薬学的組成物に関し、適宜一つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、および／または希釈剤と組み合わせる。好ましくは、薬学的組成物は、本明細書に規定されるＲＮＡ，または、本明細書に規定される第一ＲＮＡポピュレーション、または、本明細書に規定される第二ＲＮＡポピュレーションを含むワクチンの形状である。
さらに効果を高めるために、本発明に係るワクチンは、好ましくは一つ以上のアジュバントを含み、ワクチンの相乗的効果を達成するのが好ましい。ここで、「アジュバント」は、免疫反応を促進するいかなる化合物も含む。これに関して、様々な機構が可能であり、アジュバントのさまざまな種類に依存する。例えば、ＤＣの成熟を可能にする化合物、例えばリポポリサッカライドまたはＣＤ４０リガンド、は適切なアジュバントのファーストクラスを形成する。一般に、ＧＭ－ＣＳＦのような、「危険信号」（ＬＰＳ、ＧＰ９６、ｄｓＲＮＡなど）のタイプの免疫システムまたはサイトカインに影響するいずれの因子も、管理された方法において免疫反応を高めることができる、および／または、免疫反応に影響を与えることができるアジュバントとして使用することができる。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドも、ある特定の状況において起こるその副作用を考慮しなくてはならないが、これに関連して適宜使用することができる。特に好ましいアジュバントは、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインのようなサイトカイン、例えばＩＬ-１、ＩＬ－２，ＩＬ－３，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－６，ＩＬ－７，ＩＬ－８，ＩＬ－９，ＩＬ－１０，ＩＬ－１２，ＩＮＦα、ＩＮＦ－γ、ＧＭ－ＣＦＳ，ＬＴ－αであるか、または、例えばｈＧＨのような増殖因子である。さらによく知られるアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバントまたはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）、最も好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１のようなオイルである。Ｐａｍ３Ｃｙｓのようなリポペプチドもまた、本発明のワクチン、および／または、薬学的組成物においてアジュバントとして使用するのに特に適切である。
好ましい態様では、本発明に係るワクチンは他の治療用薬品とともに用いることもできる。本発明のワクチンは、ガン患者のための化学療法薬、免疫チェックポイント阻害薬またはＨＩＶ患者用多剤併用療法、または、マラリア感染に対する薬剤として使用され交差提示を改善するとして知られるクロロキン、のような他の治療とともに用いてもよい。
本発明のワクチン組成物は、生物に導入することによって免疫反応を刺激する、一般的なワクチン接種に用いられる。ここでＲＮＡは、裸の形（すなわち、具体的には、非複合体の形）で適用されてもよく、または、カチオンイオンとの複合体、リポソーム、またはポリマーのような粒子に含まれてもよく、または細胞（例えばインビトロエレクトロポレーションおよびそれに続く養子免疫療法、または針を必要とするまたは針を必要としない装置による直接注入による）、本明細書で開示されるＲＮＡまたは第一または第二ＲＮＡポピュレーション中に含まれてもよい。本発明のワクチン組成物は、好ましくは静脈注射または皮下注射により全身的に注入することができ、同様に腫瘍、筋肉、真皮、リンパ節への注入のようにｍＲＮＡの送達が求められる場所で局所的に注入することもできる。他の好ましい投与経路は、鼻腔投与および経口投与である。別の態様において、治療される患者から、本発明のＲＮＡまたはＲＮＡポピュレーションを中に導入する、ＤＣ（または、ＤＣが最初に単離されまたは少なくとも精製される、ＰＭＢＣのような前駆細胞集団）のような抗原提示細胞を（典型的には患者から採取された血液サンプルから）調製する。適宜、インキュベーション工程の後に、好ましくは静脈内投与によって、ＲＮＡ担持ＤＣを患者に再導入する。
本発明に係るワクチンはガンまたは腫瘍の治療に適切である。好ましくは、本発明のＲＮＡ、または本発明の第一または第二ＲＮＡポピュレーションにおけるＲＮＡは、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）のエピトープをコードするコード配列を含む。ＲＮＡ／ＲＮＡポピュレーションによってコードされるエピトープが由来する腫瘍抗原の特定の例には、７０７－ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、βカテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、－２、－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｐ１９０ ｍｉｎｏｒ ｂｃｒ－ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２およびＷＴ１が含まれる。腫瘍抗原由来ＭＨＣ関連エピトープの特定の配列については、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅを参照する。本発明のＲＮＡにおける特に好ましいコード配列は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－関連エピトープをコードし、より具体的には、ＭＡＧＥ－Ａ１からＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＭＡＧＥ－Ａ３からＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕからＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびＹＬＶＰＱＱＧＦＦＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＭＵＣ１からＡＰＤＴＲＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）および／またはＮＬＴＩＳＤＶＳＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）をコードする。本発明の他の好ましい態様において、ＲＮＡのコード配列は腫瘍において見つけられる一つ以上の変異を含む腫瘍エピトープをコードする。この種類の好ましい腫瘍エピトープの具体的な例は、非特許文献７に記載されており、より具体的には、この文献のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｔａｂｌｅ １の「ＡＡｓｅｑｕｅｎｃｅ」「Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ＭＨＣＩ ｅｐｉｔｏｐｅ」および「Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ＭＨＣ ＩＩ ｅｐｉｔｏｐｅ」、およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｔａｂｌｅ ２の「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と名付けられたそれぞれの欄に見られるエピトープであり、これらの配列を本明細書で明示的に参照する。腫瘍ペプチドもまたＴＣＲまたは免疫グロブリン鎖の超可変ループからのエピトープの例であり、特に慢性リンパ腫または白血病細胞の具体例である。
本発明に係るワクチンは、さらに感染症に対しても使用し得る。本発明の態様のコード配列によりコードされる好ましいエピトープは、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ、Ｂ、Ｃ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹（水疱瘡）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱病、デング熱等、フラビウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、出血性感染症（マールブルクまたはエボラウイルス）、レジオネラ症（レジオネラ）や、胃潰瘍（ヘリコバクター）や、コレラ（ビブリオ）や、大腸菌による感染や、ブドウ球菌や、サルモネラや、連鎖球菌（破傷風）のようなバクテリア感染症、マラリアや、睡眠病や、リーシュマニア症や、トキソプラズマ症のような原生動物病原体による感染、すなわちそれぞれマラリア原虫、トリパノソーマ、リーシュマニアおよびトキソプラズマによる感染、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ・アルビカンスにより引き起こされる真菌感染のような真菌感染を引き起こす感染因子に含まれる。本発明のＲＮＡの好ましい態様は、例えば、好ましくはＰＬＴＦＧＷＣＹＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）ＴＬＮＡＷＶＫＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ＡＦＨＨＶＡＲＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ＶＬＥＷＲＦＤＳＲＬ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ＶＩＹＱＹＭＤＤＬ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＫＹＴＡＦＴＩＰＳＩ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）およびＫＬＴＰＬＣＶＴＬ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）から選ばれるＨＩＶ－１由来エピトープ、または、好ましくは、例えばＲＬＶＴＬＫＤＩＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）のようなＨＰＶ１１由来エピトープ、またはＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）または好ましくは ＴＬＧＩＶＣＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）から選ばれるＨＰＶ１６由来エピトープのような各病原体からのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－提示エピトープをコードする。好ましいエピトープのさらなる例には、インフルエンザウイルスのエピトープ、より好ましくはインフルエンザＡおよびＢサブタイプ、特にインフルエンザＡ由来エピトープ、およびコロナウイルス、より好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来エピトープが含まれる。好ましいペプチドの例、より好ましくは病原体バクテリアのエピトープは、ペプチドであり、より好ましくは結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のエピトープである。腫瘍抗原の場合として、本発明に係るＲＮＡのコード配列によりコードされるエピトープの多くの具体的配列は当業者に知られており、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅで入手可能なデータベースから選択され得る。
本明細書に明示的に開示されるすべての特定のエピトープ同様に、文献および公共のエピトープデータベースを参照することにより、それぞれ、所定の態様によって、本発明のＲＮＡのコード配列は特定のエピトープ配列、具体的には特定のＭＨＣクラスＩエピトープ配列または特定のＭＨＣクラスＩＩエピトープ配列、を含む配列をコードすることができると理解される。他の態様では、本発明に係るＲＮＡのコード配列はこのような特定のエピトープをコードするヌクレオチド配列からなる。
本発明に係るワクチンは、交差提示を増加し、したがって抗原特異的エフェクターＴ細胞の誘導を行う、薬学的化合物であるクロロキンと組み合わせて用いられてもよい。
本発明の態様、具体的にＲＮＡ、第一ＲＮＡポピュレーションおよび第二ＲＮＡポピュレーションは薬剤として有用である。本発明の態様、具体的にＲＮＡ、第一ＲＮＡポピュレーションおよび第二ＲＮＡポピュレーションはガンおよび腫瘍の治療に特に有用であり、ウイルス性、原核生物性および真菌性感染因子による感染のような感染症の治療および／または予防においても特に有用である。
本発明は、ガンおよび腫瘍の治療のための薬剤の調製への、本明細書で開示されるＲＮＡおよび／または第一ＲＮＡポピュレーションおよび／または第二ＲＮＡポピュレーションの使用もまた提供する。本発明は、感染症の治療および／または予防のための薬剤の調製への、本明細書で開示されるＲＮＡおよび／または第一ＲＮＡポピュレーションおよび／または第二ＲＮＡポピュレーションの使用もまた提供する。
本発明はさらに、本発明に係る薬学的組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるガンまたは腫瘍の治療の方法を提供する。
本発明はさらに、本発明に係るワクチンの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における感染症の治療および／または予防の方法を提供する。
本発明のさらなる課題は、本発明のＲＮＡおよび／または第一ＲＮＡポピュレーションおよび／または第二ＲＮＡポピュレーションの少なくとも一つを含む診断キットである。前記ＲＮＡまたは複数のＲＮＡは、それぞれ、好ましくはウイルス、バクテリアまたは真菌のペプチドのような感染因子のペプチドをコードするのが好ましい。好ましいペプチドはこのような感染因子のエピトープである。具体的なエピトープの例、および好ましいエピトープの例は、本発明のワクチンに関して概要を上述してある。
前記診断キットは、少なくとも一つのトランスフェクション試薬、例えばリポソーム試薬、および／または、検出法および／または分離法を実行するための装置または装置用部分（例えばエレクトロポレーションのための電極）をさらに含むのが好ましい。
本発明は、ガン、自己免疫疾患、感染症、および／または、そのような疾患を有すると、および／または感染因子によって感染されたと、疑われる対象において当該疾患を引き起こす感染因子の存在、を診断する方法にさらに関する。このような方法は、対象のＴ細胞ポピュレーションを、前記ガン、自己免疫疾患の標的組織または感染因子、のペプチド、好ましくはエピトープをコードするコード配列を有する、少なくとも一つのＲＮＡおよび／または少なくとも一つの第一ＲＮＡポピュレーションおよび／または少なくとも一つの第二ＲＮＡポピュレーションで刺激する工程と、前記ペプチド、好ましくは前記エピトープに特異的なＴ細胞の存在を検出する工程と、を含む。本発明に関して「Ｔ細胞ポピュレーション」はＴ細胞を含む対象の細胞ポピュレーションである。典型的なＴ細胞ポピュレーションは対象から得たＰＭＢＣである。
前記Ｔ細胞を刺激する工程は、前記感染因子のペプチド好ましくはエピトープをコードするコード配列を含む、少なくとも一つのＲＮＡおよび／または少なくとも一つの第一ＲＮＡポピュレーションおよび／または少なくとも一つの第二ＲＮＡポピュレーションで、対象の細胞ポピュレーションをトランスフェクトし、前記ペプチド好ましくは前記エピトープに特異的なＴ細胞の存在を検出する工程を含むのが好ましい。トランスフェクト後、細胞を、好ましくは１から３０時間の期間、適切な状況下で典型的にはインキュベートする。
刺激されたＴ細胞の検出は、知られた方法での培養、好ましくは検出される抗原に特異的なＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、のＦＡＣＳ解析を典型的には含む。他には、ＣｈｅｍＲＮＡによってコードされたペプチドにより刺激されたＴ細胞であるかどうかを評価するためにＴ細胞からのサイトカイン分泌を用いることができる（例えば、インターロイキン２（ＩＬ－２）またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）産生を測定するための、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳｐｏｔ）
所定の抗原、好ましくはガンまたは腫瘍抗原、に特異的なＴ細胞の刺激は、すでに述べたように腫瘍およびガンの治療のための方法（および本発明のＲＮＡまたはＲＮＡポピュレーションの使用）において使用することもできる。ある所定の態様において、癌または腫瘍を患う対象から得たＴ細胞、すなわち典型的には上述したＴ細胞ポピュレーションを適切なガンペプチドでトランスフェクトし、陽性Ｔ細胞を好ましくはＦＡＣＳによって検出・エンリッチメントし、ガンまたは腫瘍を患う対象に増殖した抗ガンペプチド刺激Ｔ細胞を戻し入れる。検出・エンリッチメントされたＴ細胞を対象に再注入するまえに増殖するのが好ましい。適切な増殖技術は、本技術分野で知られている。上述した方法は、自己免疫疾患を制御するために使用できる制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を特異的に刺激するために用いることもできる。
本明細書で規定された構造を有するＲＮＡを用いる、開示、規定、記載された適用、使用、方法のすべておよびいずれかに関して、本発明はこのような適用、使用および方法も対象とする。ここで前記ＲＮＡは、ＲＮＡが、完全に、またはほぼ、酵素的に調製されることを除き、上述のように規定した完全に化学的に合成されたＲＮＡと同一または実質的に同一の構造を有する、酵素的に合成されたＲＮＡである。ＲＮＡの酵素的合成の方法は、本分野で知られている。典型的には、Ｔ７またはＳｐ６ ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼを用い、キットとして試薬を含むさまざまなプロトコールがさまざまな販売業者から市販されている（例えば、米国マサチューセッツ州ＩｐｓｗｉｃｈにあるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．、米国ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎにあるＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、および様々な他社）。
本発明について、以下の限定されない実施例によって、さらに説明する。
実施例１
以下のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、商用品提供元（米国テキサス州ＬｅｗｉｓｖｉｌｌｅにあるＢｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｃ．）による通常オリゴヌクレオチド合成をもちいて化学的に合成した。
［配１０］
Figure 2022546417000006
５´－ｃａｐを非特許文献８の方法を基に化学的に作成した。結果は以下の構造である（開始および終止コドンは下線が引かれている）。
［配１１］
Figure 2022546417000007
このコード配列は、オボアルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ エピトープ (オボアルブミンにおける位置２５７から２６４；ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｐ０１０１２)を含むＭＥＳＩＩＮＦＥＫＬアミノ酸配列をコードする。
他の態様において、上記と同一配列であるが、３´－（Ａ）２０テイルを有する、完全に化学的に合成されたＲＮＡ（この場合も開始および終止コドンは下線が引かれている）を調製した。
［配１２］
Figure 2022546417000008
比較例（「ＳＩＩＮＦＥＫＬ ＣｈｅｍＲＮＡ Ｐｏｌｙ－Ａ」）において、ポリＡテイルを有しない上記ＲＮＡ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ ＣｈｅｍＲＮＡ）を製造元の説明書に従って、市販されている酵素（米国マサチューセッツ州ＩｐｓｗｉｃｈにあるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．のカタログ番号：Ｍ０２７６のＥ. ｃｏｌｉ ポリＡポリメラーゼ）を用いてＡＴＰ存在下、ポリＡポリメラーゼで２時間インキュベートすることによってポリアデニル化した。
コントロールとして以下のＲＮＡを用いた。
ポジティブコントロール：オボアルブミンをコードする、酵素的に調製されたｍＲＮＡ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ ＤｉｅｇｏにあるＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＬＬＣ）
ネガティブコントロール：ルシフェラーゼをコードする、酵素的に調製されたｍＲＮＡ（発明者により実験室で調製された）
ＲＮＡは、リポフェクタミン試薬ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（米国マサチューセッツ州ＷａｌｔｈａｍにあるＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）を用いて、細胞培養ウェルあたり、２００ｎｇのＲＮＡと４００ｎｇのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ、または、２０ｎｇのＲＮＡと４０ｎｇのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ、または、２０ｎｇのＲＮＡと４０ｎｇのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを混合することによって調製した。混合物を、製造元のＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ試薬用説明書に従って、ＲＡＧ２ ＫＯ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスＯＴ１脾細胞のみ、および、前記脾細胞およびシンジェニックなＢ１６癌細胞、のそれぞれに、１００μｌ培養ウェルあたり１００，０００脾細胞を加える（脾細胞のみ）、または、１００μｌ培養ウェルあたり１００，０００脾細胞および５０，０００Ｂ１６細胞を加える（脾細胞およびＢ１６細胞）ことにより、トランスフェクトした。
１８時間のインキュベーション後、培養上清中のＩＦＮ－γおよびＩＬ－２のそれぞれを、市販され入手可能なアッセイ（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－γ および ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－２、両方とも米国カリフォルニア州Ｓａｎ ＤｉｅｇｏにあるＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．が提供している）を用いてＥＬＩＳＡによって測定した。サイトカインは、Ｔリンパ球が活性化されたとき、すなわちＨ－２ ＫｂマウスクラスＩ分子上のＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを認識する時、ＯＴ１細胞によって産生され、培養液に放出される。結果を図１（ＩＬ－２放出、Ａ：脾細胞のみ、Ｂ：脾細胞およびＢ１６細胞）および図２（ＩＦＮ－γ放出、Ａ：脾細胞のみ、Ｂ：脾細胞およびＢ１６細胞）に示す。
図１および図２は、完全に化学的に合成されたＲＮＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ ＣｈｅｍＲＮＡ が、ＯＴ１細胞によって、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γそれぞれの強力な放出を生み出したことを示している。産生されたシグナルは、ポジティブコントロール オボアルブミンｍＲＮＡ（全長オボアルブミンをコードする、酵素的に合成されたｍＲＮＡ）の場合より強かった。ポリＡポリメラーゼによるＳＩＩＮＦＥＫＬ ＣｈｅｍＲＮＡの処理は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの効果を改善しない。ポリＡテイルが強力なサイトカイン反応に必要ではないことは、さらに大きな驚きである。
実施例２
以下のＲＮＡは、商用品提供元（それぞれ、米国テキサス州ＬｅｗｉｓｖｉｌｌｅにあるＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｃ．，またはスイス連邦ＢａｌｇａｃｈにあるＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）によって化学的に合成することにより、調製された。実施例１で概説したように、必要に応じて、ＲＮＡにはキャップが付加されている。以下の配列において、大文字はそれぞれ開始コドンと終止コドンを示す。コンストラクトは、開始コドンの前（５´側）に直接的に５´ＵＴＲ配列（ａｃａａｇ）を含む。
［配１３］
Figure 2022546417000009

このコンストラクトはしたがって、５´キャップ構造を有するが、ポリＡテイルを含まない（実施例１を参照）。
［配１４］
Figure 2022546417000010

このコンストラクトは、５´キャップ構造とポリＡテイルを欠く。このコンストラクトは５´末端に三リン酸基（５´－ｐｐｐと示す）を有する。
［配１５］
Figure 2022546417000011

このコンストラクトは、５´キャップ構造とポリＡテイルを欠く。このコンストラクトは５´末端に一リン酸基（５´－ｐと示す）を有する。
［配１６］
Figure 2022546417000012

このコンストラクトは５´キャップ構造を欠き、さらに５´末端リボースのＣ－５´でリン酸基さえ有さず、したがって５´ＯＨ基のみ有する。さらにこのコンストラクトは、ポリＡテイルを欠く。
［配１７］
Figure 2022546417000013
ここでは、オリゴヌクレオチドをネガティブコントロールとして用いる。オボアルブミンｍＲＮＡをポジティブコントロールとして用いる。いずれのＲＮＡもトランスフェクションされていない脾細胞のみ（単独）をさらなるネガティブコントロールとして用いる。
マウスＯＴ１脾細胞（１ウェルあたり、１００μｌ、１００，０００細胞）を、それぞれ２００ｎｇ、２０ｎｇおよび５ｎｇのＲＮＡを１ウェルあたり用いたことを除き、実施例１で述べたように上のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。
別の実験において、実施例１で述べたようにＲＮＡ（ａ）、（ｃ）および（ｅ）をポリアデニル化し、概要を上述した分量で（ＣｈｅｍＲＮＡとして、ポリＡテイル付加からの追加の重量は考慮せず）トランスフェクションに用いた。
これらの細胞を１８時間インキュベートし、実施例１で述べたように、培養上清中のＩＬ－２を測定した。
結果を図３Ａ（ポリアデニル化ＲＮＡなし）および図３Ｂ（ポリアデニル化コンストラクト（ａ）、（ｃ）および（ｅ））に示す。
非常に驚いたことに、（ａ）から（ｄ）のすべてのコンストラクトが、全長オボアルブミンｍＲＮＡに比較して、ＯＴ１細胞によるＩＬ－２のより高い放出を引き起こした。したがって、本発明のＲＮＡは５´キャップ構造とポリＡテイルを欠いていても、脾細胞で発現し、結果として強いＩＬ－２発現になる。さらにより驚いたことに、これは、ＲＮＡが５´三リン酸のみを有する、または、５´末端ヌクレオチドでリン酸化がないときの場合でもである。図３Ｂに示されているように、試験されたコンストラクトが少ない量の時、それぞれのアデニル化されていないＲＮＡに比較して、短いポリＡテイルの付加により、やや高いＩＬ－２が示された。
実施例３
免疫細胞におけるＩＬ－２反応の誘因に通常関係する必要な構造を、より少なく有するＲＮＡについてはどうか、さらに明らかにするために、さらなるコンストラクトが商用品提供元（スイス連邦ＢａｌｇａｃｈにあるＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）によって合成された。
［配１８］
Figure 2022546417000014

このコンストラクトは、５´末端（すなわちＯＨ）でのキャップまたはリン酸基およびポリＡテイルを欠くことに加え、５´ＵＴＲ配列および終止コドンすら欠く。
［配１９］
Figure 2022546417000015

このコンストラクトは、５´ＵＴＲ ＡＣＡＡＧ を含むことを除き、コンストラクト（ｆ）に対応する。
［配２０］
Figure 2022546417000016

このコンストラクト（ｈ）は、示されたエピトープのみのコード配列からなる（５´末端にキャップ構造またはリン酸基を有さないので、５´末端ヌクレオチドの５´Ｃに結合する基はＯＨである）ので、絶対の最小ＣｈｅｍＲＮＡである。標準的な開始コドンも有しない。
コンストラクト（ａ）から（ｈ）を、実施例１で概説した方法を用いて、ただし２００ｎｇ、２０ｎｇおよび５ｎｇのＲＮＡを用いてＯＴ１マウス脾細胞にトランスフェクトした。４４時間インキュベーション後、実施例１で概説したように培養上清中のＩＬ－２レベルを測定した。結果を図４に示す。全く予想していなかったことに、コンストラクト（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）（すなわち開始コドンなしのコード配列）でさえ、ネガティブコントロールより明らかに高いＯＴ１細胞によるＩＬ－２放出に結果としてなり、ポジティブコントロール：オボアルブミンｍＲＮＡよりもさらに高い結果となった。
２４時間後のＩＬ－２の測定ではあるが、上記実験を繰り返し、４４時間インキュベーション後に得られた結果を確認した。結果を図５に示す。興味深いことに、コンストラクト（ｆ）（本物のｍＲＮＡのうち、開始コドンのみ有し、他の属性を有さないことを特徴とする）が、２４時間インキュベーション後、２００ｎｇで、最も高いＩＬ－２濃度を与えた。
実施例４
本発明のＲＮＡを、ペプチドの発現、特に、好ましくは感染因子のエピトープおよびガンペプチドのエピトープのようなオリゴペプチドの発現に使用できるか、またヒト細胞においてそのようなペプチドの発現をすることができるか、についてさらに調べた。
ウイルスペプチドの発現のためのコンストラクトの例として、以下のコンストラクトが、商用品提供元（スイス連邦ＢａｌｇａｃｈにあるＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）によって、化学合成を用いて、調製された。
［配２１］
Figure 2022546417000017
［配２２］
Figure 2022546417000018
どちらのコンストラクトも、開始コドン（５´末端にキャップなし、リン酸基なし）およびコード配列（終止コドンなし、ポリＡテイルなし）のみからなる。
ＰＭＢＣを健常なボランティアのＨＬＡ－Ａ２陽性ドナーの血液から単離した。三つの培養を開始するため、１０００万のＰＭＢＣを、各１０ｍｌ完全培地に用いた。トランスフェクション用に、ＲＮＡを、リポフェクタミン試薬ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（米国マサチューセッツ州ＷａｌｔｈａｍにあるＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）を用い、２５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地中に１μｇのＲＮＡと、２５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地中に２μｇのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘと、を混合することによって調製した。各混合液をそれぞれのＰＭＢＣ培養に加えた。三つ目の培養は、ＲＮＡが加えられていない同じ５０μｌの混合液で処理した。一週間のインキュベーション後、抗体およびテトラマーの染色を２ｍｌの細胞培養について行った。ＦＡＣＳ解析を以下の設定で行った。
ＦＡＣＳ：ＦＳＣ－ＳＳＣにおけるリンパ球へのゲーティング
フィコエリスリン（ＰＥ）：ＦＬＵ Ｍａｔｒｉｘ テトラマー（ペプチド：ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ; ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０を有するＨＬＡ－Ａ２）
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）：ＣＭＶ ｐｐ６５ テトラマー（ペプチド：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３ を有するＨＬＡ－Ａ２）
結果を図６に示す。
実験を、ＦＡＣＳ解析の前に、さらに一週間、合計２週間の細胞培養まで延ばし、７日目でトランスフェクションプロトコールを繰り返し、５ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＩＬ－２で補充した新鮮な培地によって培地を置換した。５ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＩＬ－２で補充した新鮮な培地での置換は９日目と１２日目にも繰り返した。
結果を図７に示す。
実験により、５´キャップなし、５´リン酸基なし、５´ＵＴＲ欠損、終止コドンおよびポリＡテイル欠損の、本発明のキャップされていないＣｈｅｍＲＮＡが、ＰＭＢＣによって発現され、ヒトＴ細胞に提示されることが示された。
図６Ｂ（ＲＮＡのトランスフェクションを伴わない培養と比較した）に示されたＦＡＣＳ解析は、一週間後、ＦＬＵエピトープをコードするＲＮＡでトランスフェクトしたＰＭＢＣ培養において、明らかに、ＦＬＵ特異的Ｔ細胞が増殖していることを示した。これは、ＲＮＡでコードされたエピトープが産生され、Ｔ細胞に提示されたことを示す。
２週間後、Ｏｌｉｇｏ Ｆｌｕ ｍａｔｒｉｘでトランスフェクトした培養でのシグナルが大きく増加し（図７Ｂ）、またＯｌｉｇｏ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＲＮＡでトランスフェクトした培養においてもポジティブシグナルが検出された（図７Ｃ）。Ｏｌｉｇｏ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＲＮＡでトランスフェクトした培養のシグナルは、Ｏｌｉｇｏ Ｆｌｕ ｍａｔｒｉｘ ＲＮＡでトランスフェクトした培養に比較して弱く、これは細胞がアネルギー性であるかペプチド配列が適切でなかったためである可能性がある。
実施例５
さらに、ＲＮＡ配列中、特にコード配列中、に修飾ヌクレオチドが含まれた場合に、本発明のＲＮＡを、ペプチド、特に好ましくは感染因子のエピトープおよび癌ペプチドのエピトープのようなオリゴペプチド、の発現に使用できるかどうか、そのようなペプチドの発現を提供できるかどうか、を調べた。
使用したコンストラクトは以下のとおりである。
［配２３］
Figure 2022546417000019
このコンストラクトは実施例２のコンストラクト（ｆ）に対応する。
［配２４］
Figure 2022546417000020
コントロールとして、以下のＲＮＡを用いた。
ポジティブコントロール：オボアルブミンをコードする、酵素的に調製されたｍＲＮＡ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ ＤｉｅｇｏにあるＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＬＬＣ）
ネガティブコントロール：ルシフェラーゼをコードする、酵素的に調製されたｍＲＮＡ（発明者により実験室で調製された）
マウスＯＴ１脾細胞（１ウェルあたり１００μｌ、１００，０００細胞）を、それぞれ２００ｎｇ、２０ｎｇおよび０ｎｇ（ネガティブコントロールとして）のＲＮＡを１ウェルあたりに用いたことを除き、実施例１で述べたように上述のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。４０時間インキュベーション後、実施例１で概説したように培養上清中のＩＬ－２レベルを測定した。結果を図８に示す。
図８に示すように、ＲＮＡに２´－Ｆ－Ｃを含むことは、コードするペプチドの発現を干渉しない。
本発明は、好ましくはペプチド、より好ましくはウイルスのような感染因子のエピトープ、またはガン抗原のエピトープをコードする、コード配列を有するが、一つ、複数、またはいずれのメッセンジャーＲＮＡ特異的構造特徴を有しない、様々な化学的に合成されたＲＮＡの種類が、生細胞、特に哺乳類細胞、によって発現されることを示した。これは全く予期しなかった発見であり、様々な診断および治療適用への最小ＣｈｅｍＲＮＡの使用を切り開く。
第一に、コザックではない周囲においてＡＵＧ開始コドンを有しポリＡテイルを欠く、５´キャップされたＲＮＡが、特定のＴ細胞の刺激（トランスフェクトされたマウスＯＴ１脾細胞におけるＩＬ－２産生）を示したことは予期しないことである。更に本発明に関するさらなる研究は、さらにより驚くべき結果、すなわちＩＬ－２放出のためのＯＴ１マウス脾細胞の刺激のためにキャップは実際には必要ない、という結果を導いた。これは、５´リン酸を有さず代わりに５´ＯＨを有するＲＮＡを用いることを可能にさえする。本発明のさらなる結果は、５´ＵＴＲがコード配列の発現のために絶対に必要ではないことを示す。コード配列の発現を最適にするために開始コドンの存在は好ましいが、開始コドンもまた絶対に必要なわけではない。ＲＮＡの３´末端の最後のヌクレオチドがコード配列の最後のヌクレオチドである場合には、終止コドンも存在する必要はない。

Claims (39)

  1. 完全に化学的に合成されたＲＮＡであって、下記一般式（１）の構造を有する：
    ５´－Ｗ－Ｘ－Ｙ－(コード配列)－Ｚ－３´ （１）
    ここで、
    Ｗは、５´－キャップ、遊離５´－三リン酸基、遊離５´－二リン酸基、遊離５´－一リン酸基、遊離５´－ＯＨ基、および、前記５´－キャップ、前記遊離５´－三リン酸基、前記遊離５´－二リン酸基、前記遊離５´－一リン酸基の化学的に修飾された類似体からなる群から選ばれ、
    Ｘは、存在しなくても存在しなくてもよく、存在する場合には５´ＵＴＲ配列であり、
    Ｙは、存在しなくても存在しなくてもよく、存在する場合には開始コドンであり、
    Ｚは、直接コード配列につながり、遊離３´－ＯＨ基、終止コドン、および、ポリ（Ａ）テイルにつながる終止コドン、オプションで３´ＵＴＲ配列を経由してポリ（Ａ）テイルにつながる終止コドン、からなる群から選ばれる。
  2. 請求項１に記載のＲＮＡであって、以下の一般式（２）から（６１）までからなる群から選ばれる構造を有することを特徴とするＲＮＡ：
    ［式１］
    Figure 2022546417000021
    Figure 2022546417000022
    Figure 2022546417000023
    ここで、
    ｐｏｌｙＡはポリ（Ａ）テイルであり、
    ｓｔｏｐは終止コドンであり、
    ＵＴＲは５´ＵＴＲであり、
    ｔｒｉＰは遊離三リン酸基であり、
    ｄｉＰは遊離二リン酸基であり、
    ｍＰは遊離一リン酸基である。
  3. 請求項２に記載のＲＮＡであって、一般式（３）、（１５）、（３９）、（５１）および（５８）からなる群から選ばれる構造を有する、ことを特徴とするＲＮＡ。
  4. 請求項１から３のいずれかに記載のＲＮＡであって、ＵＴＲがもし存在するのであれば、前記ＵＴＲは２から１０ヌクレオチドの長さを有する、ことを特徴とするＲＮＡ。
  5. 請求項４に記載のＲＮＡであって、前記ＵＴＲが２から５ヌクレオチドの長さを有する、ことを特徴とするＲＮＡ。
  6. 請求項４または５に記載のＲＮＡであって、前記ＵＴＲは配列ａａｇを有する、ことを特徴とするＲＮＡ。
  7. 請求項６に記載のＲＮＡであって、前記ＵＴＲは配列ａｃａａｇを有する，ことを特徴とするＲＮＡ。
  8. 請求項１，２、４、５、６，７または８の何れかに記載のＲＮＡであって、もし、ポリ（Ａ）テイルが存在するのであれば、前記ポリ（Ａ）テイルは３０ヌクレオチドまでの長さ、好ましくは５から３０ヌクレオチドの長さを有する、ことを特徴とするＲＮＡ。
  9. 請求項８に記載のＲＮＡであって、前記ポリ（Ａ）テイルは２０ヌクレオチドまでの長さ、好ましくは５から２０ヌクレオチドの長さを有する、ことを特徴とするＲＮＡ。
  10. 請求項９に記載のＲＮＡであって、前記ポリＡ鎖は１０ヌクレオチドまでの長さ、好ましくは５から１０ヌクレオチドの長さを有する、ことを特徴とするＲＮＡ。
  11. 請求項１乃至１０の何れかに記載のＲＮＡであって、前記コード配列は６５アミノ酸までのアミノ酸をコードし、好ましくは４から４０アミノ酸をコードする、ことを特徴とするＲＮＡ。
  12. 請求項１１に記載のＲＮＡであって、前記コード配列は４から３０アミノ酸をコードし、好ましくは８から２０アミノ酸をコードする、ことを特徴とするＲＮＡ。
  13. 請求項１乃至１２の何れかに記載のＲＮＡであって、前記ＲＮＡはＲＮＡオリゴヌクレオチドである、ことを特徴とするＲＮＡ。
  14. 請求項１３に記載のＲＮＡであって、最大２００ヌクレオチド、好ましくは最大１２０ヌクレオチド、より好ましくは最大１００ヌクレオチドからなる、ことを特徴とするＲＮＡ。
  15. 請求項１乃至１４の何れかに記載のＲＮＡであって、前記ＲＮＡは少なくとも一つの化学修飾を含み、好ましくは一つのヌクレオチドで、より好ましくは末端ヌクレオチドで化学修飾を含む、ことを特徴とするＲＮＡ。
  16. 請求項１乃至１５の何れかに記載のＲＮＡであって、前記ＲＮＡは酵素的に修飾される、ことを特徴とするＲＮＡ。
  17. 請求項１乃至１６の何れかに記載のＲＮＡであって、前記コード配列は、感染因子のペプチド、またはガンペプチド、または自己免疫細胞によって認識される組織のペプチド、をコードする、ことを特徴とするＲＮＡ。
  18. 請求項１７に記載のＲＮＡであって、前記感染因子はウイルス、バクテリアおよび真菌から選ばれる、ことを特徴とするＲＮＡ。
  19. 請求項１７に記載のＲＮＡであって、前記ガンペプチドは、ガンではない野生型のアミノ酸配列とは異なる、少なくとも一つのアミノ酸を含む、ことを特徴とするＲＮＡ。
  20. 請求項１乃至１９の何れかに記載のＲＮＡであって、前記ＲＮＡの前記コード配列は、前記ＲＮＡが細胞、生物または無細胞発現系に存在するときに発現する、ことを特徴とするＲＮＡ。
  21. 請求項１乃至２０の何れかに記載のＲＮＡであって、前記ＲＮＡは一本鎖である、ことを特徴とするＲＮＡ。
  22. ＲＮＡポピュレーション（集団）であって、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の前記ＲＮＡポピュレーション中のＲＮＡが、請求項１乃至２１に記載のＲＮＡと同一の化学構成を有する、ことを特徴とするＲＮＡポピュレーション。
  23. ＲＮＡポピュレーション（集団）であって、請求項１乃至２１で規定されたｎヌクレオチドの全長を有するＲＮＡと、化学構成が、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、またより好ましくは少なくとも９８％、まださらにより好ましくは少なくとも９９％、全長ＲＮＡの化学構成に一致するが、全長ＲＮＡとして（ｎ－１）ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡを少なくとも１％含み、ここで長さ（ｎ－１）のＲＮＡの化学構成が長さｎの全長ＲＮＡの化学構成に一致する割合は、長さｎの全長ＲＮＡのうち、（ｎ－１）個のヌクレオチドの化学構成に関するものであることを意味する、ことを特徴とするＲＮＡポピュレ―ション。
  24. 請求項２２または２３に記載のＲＮＡポピュレーション（集団）であって、化学構成が、少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、まだより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、全長ＲＮＡの化学構成に一致するが、全長ＲＮＡとして（ｎ－２）の長さを有するＲＮＡを少なくとも１％含み、ここで長さ（ｎ－２）のＲＮＡの化学構成の、長さｎの全長ＲＮＡの化学構成に一致する割合は、長さｎの全長ＲＮＡのうち、（ｎ－２）個のヌクレオチドの化学構成に関することを意味する、ことを特徴とするＲＮＡポピュレーション。
  25. 請求項２２乃至２４に記載のＲＮＡポピュレーション（集団）であって、化学構成が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、まだより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９８．５％、全長ＲＮＡの化学構成に一致するが、全長ＲＮＡとして（ｎ－３）の長さを有するＲＮＡを少なくとも１％含み、ここで長さ（ｎ－３）のＲＮＡの化学構成の、長さｎの全長ＲＮＡの化学構成に一致する割合は、長さｎの全長ＲＮＡのうち、（ｎ－３）個のヌクレオチドの化学構成に関することを意味する、ことを特徴とするＲＮＡポピュレーション。
  26. 請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーションを含む、薬学的組成物。
  27. 請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーションを含む、診断キット。
  28. 請求項２７の診断キットであって、前記コード配列は感染因子のペプチドをコードする、ことを特徴とするキット。
  29. 請求項２８の診断キットであって、前記感染因子に特異的なＴ細胞をさらに含む、ことを特徴とするキット。
  30. 請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーションを含む、ワクチン。
  31. 薬品としての使用のための、請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーション。
  32. 請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーションの、診断過程への使用。
  33. 請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーションの、無細胞発現系、細胞または生物におけるコード配列の発現への使用。
  34. 細胞または生物におけるアミノ酸配列発現の方法であって、
    請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーションを前記細胞または生物に導入する工程を含む、細胞または生物におけるアミノ酸配列発現の方法。
  35. 無細胞発現系におけるアミノ酸配列発現の方法であって、
    請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーションを無細胞発現系存在下でインキュベートする工程を含む、無細胞発現系におけるアミノ酸配列発現の方法。
  36. 請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡ、または、請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーションの、ガンまたは腫瘍の治療における使用。
  37. 請求項３６に記載の使用のためのＲＮＡまたはＲＮＡポピュレーションであって、前記治療はガン患者が患うガンに対する前記ガン患者のワクチン接種を含む、ことを特徴とするＲＮＡまたはＲＮＡポピュレーション。
  38. 請求項３６または３７の使用のためのＲＮＡであって、前記ＲＮＡは請求項１９で規定される、ことを特徴とするＲＮＡ。
  39. 感染症の治療および／または予防における使用のための、請求項１乃至２１の何れかに係るＲＮＡまたは請求項２２乃至２５の何れかに係るＲＮＡポピュレーション。
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