JP4588026B2 - 免疫活性化および遺伝子治療のための血液細胞へのｍＲＮＡの導入 - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの領域を含む少なくとも１つのｍＲＮＡが導入された血液細胞または血球細胞（例えば、赤血球（erythrocytes）、顆粒球、単核球（ＰＢＭＣ）および／または血小板）と、薬学的に許容可能な補形薬および／または賦形剤とを組み合わせた薬学的組成物に関するものである。さらに、本発明は、上記薬学的組成物の作製方法に関するものである。また、本発明は、このように核酸導入された血液細胞を、ｍＲＮＡによってコードされた抗原に対する免疫活性化用の薬または薬学的組成物を生成するために使用する使用方法に関するものである。本発明は、癌または感染症の治療および／または予防に使用されるものであり、遺伝子治療にも応用できる。
遺伝子治療および遺伝子ワクチン接種は、分子医学的な処置である。病気の治療および予防に分子医学を利用することは、医療行為にかなりの影響を与えるであろう。上記２つの処置は、患者の細胞または組織へ核酸を導入することと、それに続く、導入された核酸にコードされた情報を処理すること、すなわち所望のポリペプチドを発現することに基づいている。原則的に有利な処置は、特定のタンパク質をコードする（ｍ）ＲＮＡを、（適切な細胞への導入を介する）直接導入または間接導入することに基づいている。
現在では、ワクチン接種、特に、腫瘍抗原に対するワクチン接種にｍＲＮＡを使用する場合、適切な抗原をコードするｍＲＮＡは、（プロフェッショナル）抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に、樹状細胞（ＤＣ）に対して、従来のようにin vitroで導入されている（Boczkowskiら著(1996) J. Exp. Med. 184(2), 465-472; ＰＣＴ特許第９７／４１２１０号）。特別なサイトカインカクテルを用いて適切な単球を樹状細胞に分化させることにより、患者の血液から樹状細胞が得られる。しかしながら、この処置には時間がかかる。特に、採血と核酸導入との間の時間は、従来は約７日である（すなわち、樹状細胞に分化するためのin vitroでの培養は約１週間を要する）。したがって、患者の体内に細胞を戻すまでには一般的に９日間（核酸導入後、樹状細胞の成熟に２日を要する）かかる。この長い時間を決定する要因は、採血と核酸導入との間の、樹状細胞に分化するためのin vitroでの培養期間である。さらに、樹状細胞を作製する場合には、ＧＭＰ（医薬品の生成管理および品質管理に関する基準）条件を観察する必要がある。したがって、この処置は非常にコストがかかり、樹状細胞を作製中に、患者は特別な収容設備を必要とするかもしれないことを視野に入れておく必要がある。
従って、本発明の目的は、特定の抗原、特に、腫瘍および伝染性の病原菌由来の抗原に対して、患者の免疫を活性化するための新しいシステムを提供することである。この新しいシステムは、従来の処置の欠点を克服し、特に、困難でコストのかかるin vitroでのＡＰＣの作製を回避するものである。
この目的は、請求項に記載の本発明の特徴を有する実施形態によって達成される。
特に、本発明によれば、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの領域を含む少なくとも１つのｍＲＮＡが導入された血液細胞または血球細胞（例えば、赤血球（erythrocytes）、顆粒球、単核球（抹消血単核細胞；ＰＢＭＣ）および／または血小板（thrombocytes））を、薬学的に許容可能な補形剤および／または賦形剤と組み合わせた薬学的組成物が提供される。
本発明は、「本発明のｍＲＮＡによってコードされたある種の抗原に対して患者にワクチン接種を行うには、例えば個人の（特に、実際に治療される患者の）血から得られた血液細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を、困難で、時間がかかり、しかもコストの高い細胞培養技術によって、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）（特に、樹状細胞（ＤＣ））の割合が高い細胞集団に分化する必要はなく、免疫を活性化するために１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡを血液細胞に直接導入しさえすれば、例えば血液細胞（特に、血液細胞の上記部分集団）を採取した実際の患者に対して適切に免疫を活性化する薬学的組成物が得られる」という驚くべき発見に基づくものである。なお、上記免疫の活性化は、腫瘍由来の１つまたは複数の抗原を対象とするものであるか、または、病原菌または病原体由来の１つまたは複数の抗原を対象とするものであることが好ましい。
本発明の薬学的組成物中の血液細胞（特に、血液細胞の上記部分集団）の特徴は、特に、上記血液細胞に含まれる好適に分化されたプロフェッショナルＡＰＣ（例えば、樹状細胞など）の割合が小さいことである。核酸が導入された細胞は、本発明の薬学的組成物中に含まれている場合は、好ましくは５％未満、特に好ましくは２％以下の樹状細胞を含んでいる。従って、本発明では「血液細胞」を、全血、血清、または他の源（例えば、脾臓またはリンパ節）から採取される赤血球、顆粒球、単核球（ＰＢＭＣ）および／または血小板の混合物またはほぼ純粋な集団となるまで濃縮されたものを意味していると解釈することが好ましい。なお、プロフェッショナルＡＰＣの割合はほんの少しである。従来技術とは対照的に、本発明の血液細胞は、新鮮な血液細胞であること、すなわち、血液細胞の採取（特に、採血）と核酸導入との間の時間は非常に短いことが好ましい。上記時間は、例えば１２時間未満であり、好ましくは６時間未満であり、特に好ましくは２時間未満であり、非常に好ましくは１時間未満である。
上述したように、本発明の薬学的組成物のために使用される血液細胞は、本発明の薬学的組成物によって治療される実際の患者から採取された血液細胞であることが好ましい。したがって、本発明の薬学的組成物は、自家血液細胞（autologous blood cells）を含んでいることが好ましい。
本発明の他の好ましい実施形態では、本発明の細胞に導入されるｍＲＮＡは、腫瘍、病原体または病原菌由来の少なくとも１つの抗原をコードする領域を含んでいる。
本発明では、「腫瘍由来の抗原」という表現は、適当な抗原が腫瘍に関連する細胞に発現していることを意味している。したがって、本発明によれば、腫瘍由来の抗原は、特に悪化細胞（degenerate cells）そのものに発現されたものである。上記抗原は、細胞の表面上に位置する抗原であることが好ましい。しかしながら、腫瘍由来の抗原は、それ自体は（または、それ自体はもともと）悪化していない（悪化していなかった）が、問題となる腫瘍には関連している細胞内に発現する抗原でもある。さらに、腫瘍由来の抗原には、例えば腫瘍供給導管（tumour supply vessels）またはその（再）発生に関連する抗原、特に、新血管形成（neovascularization）または血管新生に関連する抗原（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦなどの増殖因子）が含まれる。腫瘍に関連するこのような抗原は、また、腫瘍を内蔵する組織の細胞由来の抗原も含んでいる。結合組織細胞由来の適当な抗原（例えば、細胞外マトリックス由来の抗原）について、本願で言及されるであろう。本発明の免疫の活性化には、さらに、上記ｍＲＮＡ分子は、腫瘍組織由来のｃＤＮＡライブラリーに対応するものであってもよい。適切なライブラリーの一部、好ましくは、腫瘍特異抗原をコードするｃＤＮＡライブラリーの一部を使用することもできる。対応する作製方法は、薬学的組成物を生成するための本発明の方法に関連して、以下で詳しく説明されるであろう。
本発明では、１つまたは複数のｍＲＮＡが導入された血液細胞（例えば、ＰＢＭＣ、赤血球、顆粒球および／または血小板）を含む薬学的組成物を、特に肉腫の治療または防止（予防）のための治療または予防接種（すなわち、ワクチン接種）に使用する。ワクチン接種は、腫瘍由来の１つの抗原（または複数の抗原）、この場合は、抗原に関する遺伝情報を、抗原をコードするｍＲＮＡの形状で血液細胞に導入することに基づいている。薬学的組成物に含まれるｍＲＮＡは、細胞中で（腫瘍）抗原に翻訳される。すなわち、修飾されたｍＲＮＡによってコード化されたポリペプチド、または抗原性ペプチドが発現される。これによって、核酸が導入された細胞を含む薬学的組成物が導入された後、上記ポリペプチドまたは抗原性ペプチドに対する免疫反応が活性化される。したがって、遺伝子ワクチンを癌の治療に使用するこのケースでは、腫瘍由来の抗原についての遺伝情報（特に、癌細胞上だけに発現するタンパク質）を導入することによって生じる免疫反応は、このような癌抗原をコードするｍＲＮＡが導入された血液細胞（例えば、赤血球、顆粒球、ＰＢＭＣおよび／または血小板）を含む本発明の薬学的組成物を投与することにより生じる。この場合、癌抗原は、生体中にて免疫細胞に対して提示され、癌細胞に対して効果的な免疫反応が生じる。
したがって、病原菌（例えば、ウイルス、バクテリア、または原生動物学的な細菌）に対するワクチン接種を行う場合には、このような病原菌由来の表面抗原を使用することが好ましい。これは、表面抗原をコードするｍＲＮＡが導入された血液細胞を含む本発明の薬学的組成物を用いてワクチン接種するためである。したがって、本発明の薬学的組成物は、特に、感染症に対しても使用される。感染症の例としては、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型肝炎、ヘルペス、帯状ヘルペス（水痘）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱病やデング熱（フラビウイルス）、インフルエンザ（インフルエンザウイルス）、出血性感染症（マールブルクまたはエボラウイルス）などのウイルス性感染症、レジオネラ症（レジオネラ菌）、胃潰瘍（ヘリコバクター）、コレラ（ビブリオ）、Ｅ．ｃｏｌｉ感染症、ブドウ球菌感染症、サルモネラ菌感染症または連鎖球菌感染症（破傷風）などのバクテリア性の感染症、または、原生動物による感染症（マラリア、睡眠病、リーシュマニア症、トキソプラズマ症（すなわち、プラスモジウム、トリパノソーマ、リーシュマニアおよびトキソプラズマに起因する感染症）、クラミジア感染症（例えば、クラミジアニューモニエまたはクラミジアトラコマチスに起因する感染症））があげられる。感染症では、抗原性潜在度（antigenic potential）の最も高い適当な表面抗原も、ｍＲＮＡによってコードされていることが好ましい。上記のような病原体または病原菌の遺伝子、特に、ウイルスの遺伝子では、これは、典型的に表面抗原の分泌された形状である。
病原菌に対する免疫を活性化する場合には、導入されるｍＲＮＡ分子は、ある種の細胞種のｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの一部を含んでいてもよい。この場合、本発明では、病原体に感染した細胞のｃＤＮＡ（部分）ライブラリーを使用することが好ましい。したがって、例えばＨＩＶ感染では、病原体（この例ではＨＩＶ）によって発現誘導されたホスト遺伝子産物に対する免疫を活性化するために、ＨＩＶに感染したＴ細胞、好ましくは自家Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ集団を使用してもよい。
本発明では、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを使用することも好ましい。上記ポリペプチドは、ポリエピトープ（例えば、上記抗原、特に病原菌／病原体または腫瘍細胞由来の表面抗原）であり、好ましくは、分泌される形状のタンパク質である。
本発明の薬学的組成物は、ワクチンとして使用される場合、特に肉腫の治療に適しており（ｍＲＮＡは、腫瘍特異表面抗原（ＴＳＳＡ）をコードすることが好ましく）、例えば、悪性黒色腫、大腸癌、リンパ腫、肉腫、小細胞肺癌、芽球腫などの治療に特に適している。腫瘍抗原の具体的な例としては、特に、７０７−ＡＰ，ＡＦＰ，ＡＲＴ−４，ＢＡＧＥ，b−カテニン／ｍ，Ｂｃｒ−ａｂｌ，ＣＡＭＥＬ，ＣＡＰ−１，ＣＡＳＰ−８，ＣＤＣ２７／ｍ，ＣＤＫ４／ｍ，ＣＥＡ，ＣＴ，Ｃｙｐ−Ｂ，ＤＡＭ，ＥＬＦ２Ｍ，ＥＴＶ６−ＡＭＬ１，Ｇ２５０，ＧＡＧＥ，ＧｎＴ−Ｖ，Ｇｐ１００，ＨＡＧＥ，ＨＥＲ−２／ｎｅｕ，ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ，ＨＰＶ−Ｅ７，ＨＳＰ７０−２Ｍ，ＨＡＳＴ−２，ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ），ｉＣＥ，ＫＩＡＡ０２０５，ＬＡＧＥ，ＬＤＬＲ／ＦＵＴ，ＭＡＧＥ，ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ，ＭＣ１Ｒ，ミオシン／ｍ，ＭＵＣ１，ＭＵＭ−１，−２，−３，ＮＡ８８−Ａ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ｐ１９０ｍｉｎｏｒ ｂｃｒ−ａｂｌ，ＰｍＩ／ＲＡＲa，ＰＲＡＭＥ，ＰＳＡ，ＰＳＭ，ＲＡＧＥ，ＲＵ１またはＲＵ２，ＳＡＧＥ，ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３，ＴＥＬ／ＡＭＬ１，ＴＰＩ／ｍ，ＴＲＰ−１，ＴＲＰ−２，ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２およびＷＴ１があげられる。
また他の好ましい実施形態では、腫瘍または病原体由来の抗原は、腫瘍または病原体由来の抗原のポリエピトープである。１つの抗原または複数の抗原の「ポリエピトープ」は、アミノ酸配列であり、このアミノ酸配列中に、抗原の複数の領域または多くの領域が表されており、上記領域は、抗体の抗原結合領域またはＴ細胞受容体と相互作用する。ポリエピトープは、完全な修飾されていない形でもよいが、本発明では、特に、抗体／抗原またはＴ細胞受容体／抗原の相互作用を最適化するために修飾された形であってもよい。野生型ポリエピトープに関連する修飾は、例えば１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を含んでいてもよい。したがって、野生型ポリエピトープをコードするｍＲＮＡとは違って、修飾されたポリエピトープをコードする本発明のｍＲＮＡでは、１つまたは複数のヌクレオチドが欠失、付加および／または置換されている。
さらに、本発明の薬学的組成物は、遺伝子治療に使用され得る。この場合、ＲＮＡは、例えば、タンパク質（例えば、患者の血液細胞または血球細胞に無い、または機能していない酵素）をコードする。
（ｍ）ＲＮＡの安定性および核酸導入効率を上げるために、本発明の血液細胞に導入される各（ｍ）ＲＮＡは、一つまたはそれ以上の修飾、特に、化学的に修飾されていることが好ましい。このことにより、細胞への（ｍ）ＲＮＡの導入が向上し、および／または、コードされた抗原の発現が増加する。
例えば、真核生物のｍＲＮＡは、シグナルタンパク質（signal protein）と結合してin vivoでのｍＲＮＡの酵素分解を制御する不安定化配列エレメント（ＤＥＳ）を含んでいる。したがって、ｍＲＮＡをさらに安定させるために、腫瘍または病原体由来の少なくとも１つの抗原をコードする領域では、対応する野生型ｍＲＮＡの領域とは違って、１つまたは複数の変更が任意に行われている。その結果、不安定化配列エレメントが存在しなくなっている。当然、本発明では、ｍＲＮＡから、非翻訳領域（３’−ＵＴＲおよび／または５’−ＵＴＲ）に存在する任意のＤＳＥを排除することが好ましい。
このような不安定化配列エレメントの例としては、ＡＵの豊富な配列（「ＡＵ−ＲＥＳ」）があげられる。ＡＵ−ＲＥＳは、多数の不安定なｍＲＮＡの３’−ＵＴＲセグメントに存在する（Caput他著のProc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 1670 to 1674）。したがって、本発明で使用されるＲＮＡ分子は、野生型ｍＲＮＡとは違って、このような不安定化配列エレメントが無くなっているように変更されていることが好ましい。このことは、考えられるエンドヌクレアーゼによって認識されるシーケンスユニット（モチーフ）、例えば、トランスフェリン受容体をコードする遺伝子の３’−ＵＴＲセグメントに含まれるシーケンスＧＡＡＣＡＡＧにも当てはまる（Binder他著のEMBO J. 1994, 13, 1969 to 1980）。これらのシーケンスユニット（モチーフ）は、血液細胞への導入に使用される修飾されたｍＲＮＡから排除されていることが好ましい。
当業者は、本発明に基づいて修飾されたｍＲＮＡ中のコドンを置換するための様々な適切な方法に精通している。（生物学的に有効なペプチド、または抗原性のペプチドをコードする）コーディング領域がより短い場合は、例えば、標準的な技術を用いて全ｍＲＮＡを化学的に合成できる。
しかしながら、修飾されたｍＲＮＡを共通の方向性を持った突然変異生成技術（common directed mutagenesis technique）によって生成するために、ＤＮＡテンプレートを使用して塩基置換を行うことが好ましい(Maniatis 他著の Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001)。
したがって、この方法では、ｍＲＮＡを生成するために、適当なＤＮＡ分子がin vitroで転写される。このＤＮＡテンプレートは、in vitroでの転写のための適切なプロモータ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６プロモータ）を有している。上記プロモータの後には、生成されるｍＲＮＡ用の所望のヌクレオチド配列と、In vitro転写に対する終結シグナルとが続く。本発明では、ＲＮＡを作製するためのテンプレートであるＤＮＡ分子は、従来のように発酵性に増幅し（fermentative multiplication）、その後、バクテリア中で複製可能なプラスミドの一部として分離することによって生成される。本発明に適したプラスミドの例としては、ｐＴ７ＴＳ (GenBankアクセッション番号U26404; Lai 他著のDevelopment 1995, 121, 2349 〜 2360), ｐＧＥＭシリーズ（登録商標）（例えばｐＧＥＭ−１（GenBankアクセッション番号Ｘ６５３００；Ｐｒｏｍｅｇａ社製），およびｐＳＰ６４（GenBankアクセッション番号Ｘ６５３２７）があげられる（MezeiおよびStorts著の,Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (eds), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001も参照）。
当業者に公知の分子生物学的な方法によれば、既存の制限酵素認識部位に短い一本鎖転位を有する短い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用することにより、または、化学合成(Maniatis他著の前注も参照)によって生成された遺伝子を使用することにより、このように所望のヌクレオチド配列を適当なプラスミドにクローン化できる。次に、制限酵素を用いる消化により、ＤＮＡ分子が単一または複数コピー存在するプラスミドから、ＤＮＡ分子を切り出す。
血液細胞に導入するために使用できる修飾されたｍＲＮＡは、５’キャップ構造（修飾されたグアノシンヌクレオチド）を有していてもよい。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ，（５’）Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇがあげられる。
本発明の他の好ましい実施形態では、修飾されたｍＲＮＡは、少なくとも約２５個、特に少なくとも３０個、好ましくは少なくとも５０個、特に好ましくは約７０個、非常に好ましくは約１００個のヌクレオチドのポリ（Ａ＋）尾部を含んでいる。しかしながら、ポリ（Ａ＋）尾部は、２００個以上のヌクレオチドを含んでいてもよい。
ｍＲＮＡを効率的に翻訳するには、さらに、リボソーム結合サイト（コザック配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ、ただし、ＡＵＧは開始コドンを形成している）にリボソームを効率的に結合する必要がある。この点に関して、リボソーム結合サイト周辺のＡ／Ｕ含有量が上昇することによって、より効率的にリボソームとｍＲＮＡとが結合できる、ということが発見された。
１つまたは複数のいわゆるＩＲＥＳ（内部リボソームエントリーサイト；internal ribosomal entry sites）をｍＲＮＡに挿入することもできる。したがって、ＩＲＥＳは、単一のリボソーム結合サイトとしての機能を果たすことができる。しかしながら、ＩＲＥＳは、複数の（例えば、２つの）ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを生成するためにも使用される。これらのペプチドまたはポリペプチドは、リボソームによって、互いにに独立して、ＰＢＭＣ（「マルチシストロン性」または「多シストロン性」の（例えば、バイシストロン性の）ｍＲＮＡ）に翻訳される。本発明に基づいて使用できるＩＲＥＳシーケンスの例としては、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄病ウイルス８ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のＩＲＥＳがあげられる。
本発明の他の好ましい実施形態では、５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域において、ｍＲＮＡは、細胞質中のｍＲＮＡの半減期を増大する能力のある安定化配列を有している。
これらの安定化配列は、ウイルス、バクテリア、および真核生物中に自然に存在する配列に対して１００％の相同性を有する配列を有していてもよい。しかしながら、安定化配列は、部分的に、または完全に合成されたものあってもよい。本発明で使用できる安定化配列の例としては、例えばホモサピエンスまたはアフリカツメガエルのα−グロビン遺伝子およびβ−グロビン遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）があげられる。安定化配列の他の例は、一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮＸＣＣＣ（Ｕ／Ａ）ＰｙＸＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣを有している。この一般式は、α−グロビン、α−（Ｉ）−コラーゲン、１５−リポキシゲナーゼまたはチロシン水酸化酵素をコードする非常に安定なｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ中に存在する（Holcik 他著の Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 2410〜2414も参照）。当然、このような安定化配列を、個々に使用しても、相互に組み合わせて使用しても、または、当業者に周知の他の安定化配列と組み合わせて使用してもよい。
更なる安定化のために、ｍＲＮＡは、自然に存在するヌクレオチドの少なくとも１つのアナログ（analogue）を有していることも好ましい。このことは、血液細胞に存在するＲＮＡ分解酵素は、基材として自然に存在するヌクレオチドを優先的に認識する、ということに基づいている。したがって、ヌクレオチドのアナログを挿入することにより、ＲＮＡは分解しにくくなる。なお、これらのアナログを、特にｍＲＮＡのコーディング領域に挿入する場合、翻訳効率に好ましい影響があることもあれば、好ましくない影響があることもある。
本発明に基づいて使用できるヌクレオチドのアナログの例としては、ホスホラミデート（phosphoramidate）、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホン酸塩（methylphosphonate）、７−デアザグアノシン（7-deazaguanosine）、５−メチルシトシン、および、イノシンがあげられるが、これらに限定されない。このようなアナログの生成については、当業者にとって公知である。例えば、米国特許の第４，３７３，０７１号、第４，４０１，７９６号、第４，４１５，７３２号、第４，４５８，０６６号、第４，５００，７０７号、第４，６６８，７７７号、第４，９７３，６７９号、第５，０４７，５２４号、第５，１３２，４１８号、第５，１５３，３１９号、第５，２６２，５３０号、第５，７００，６４２号に記載されている。本発明によれば、このようなアナログは、修飾されたｍＲＮＡの非翻訳領域および翻訳領域中に生じ得る。
さらに、予め採取された血液細胞に核酸を導入する前に、ｍＲＮＡをカチオン性物質またはポリカチオン性物質（特に、適切なペプチドまたはタンパク質）に付着させるか、または結合させることによって、好適に修飾されたｍＲＮＡの効率的な細胞への導入を改善できる。したがって、ＰＢＭＣの導入前に、ｍＲＮＡは、このような作用物質と共に複合体を形成するか、または濃縮されていることが好ましい。本願では、プロタミンを、ポリカチオン性の核酸結合タンパク質として使用することが特に効率的である。他のカチオン性のペプチドまたはタンパク質（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−アルギニンまたはヒストン）も使用し得る。修飾されたｍＲＮＡを安定化させるためのこの処理は、欧州特許第１０８３２３２号Ａ（EP-A-1083232）に記載されており、これに関する開示内容は、本発明に含まれる。細胞に導入されるｍＲＮＡは、効率的な移送に用いられる他の物質に付着されてもよいし、または混合されていてもよい。この例としては、マイクロ粒子またはナノ粒子、特にＰＬＧＡ（ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（poly(D,L-lactide-co-glycolide））をベースとするマイクロ粒子またはナノ粒子、および脂質への封入が上げられる。
さらに、本発明では、ｍＲＮＡは、抗原性ペプチド／ポリペプチドまたは遺伝子治療に有効なペプチド／ポリペプチドの他に、例えば、免疫反応を促進するサイトカイン（ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＦＮ−a，ＩＦＮ−g，ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＴ−aなどのモノカイン、リンフォカインまたはケモカイン）またはｈＧＨなどの増殖因子をコードする少なくとも１つの他の機能的セグメントを備えていてもよい。上記機能的セグメントの代り、または上記機能的セグメントに加えて、血液細胞または血球細胞、特に、赤血球、ＰＭＢＣ、顆粒球および／または血小板に導入するために生成されるｍＲＮＡは、核酸導入された細胞において特に効率的な免疫活性分子の出現を引き起こす少なくとも１つの副刺激分子（co-stimulating molecule）（例えば、ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６または４−１ＢＢリガンド）および／または少なくとも１つの転写因子（例えば、ＮＦ−kappaＢまたはＩＣＳＢＰ（interferon consensus binding protein））、および／または核酸導入された細胞をリンパ節へ誘導する少なくとも１つのホーミング受容体（例えば、ＣＣＲ７）、および／または少なくとも１つの自殺分子（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトクロムＰ４５０ ４Ｂ１（ｃｙｐ４Ｂ１）および／またはＦＰＧＳ（folylpolyglutamate synthase））をコードする。上記自殺分子は導入された細胞内で発現され、普段は不活性なプロドラッグ（prodrug）をその活性化形態（例えば、ＨＳＶ−ｔｋによるガンシグロビルまたはアシクロビル、および／または、ｃｙｐ４Ｂ１による４−イポメアノールまたは２−アミノアントラセンなどのヌクレオシドアナログ）に変換し、または既に活性化されている化学療法試薬（例えば、ＦＰＧＳによるメトトレキサートなどのアルキル化剤）の作用をさらに強め、それによって、壊死および／またはアポトーシスによる細胞の死を引き起こす。その結果、ｍＲＮＡによってコードされた抗原を含む細胞含有物が放出される。
さらに、本特許出願は、血液細胞を採取する工程（ａ）と、上記血液細胞に、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの領域を含む少なくとも１つのｍＲＮＡをin vitroにて導入する工程（ｂ）とを含む、上記薬学的組成物の作製方法を提供する。
血液細胞を、例えば、動物またはヒトの患者から、標準的な方法によって採取する。したがって、適当な血管を穿刺することにより全血が簡単に得られる。既知の方法により、固形の血液成分を凝固させることにより、血清が得られる。血液細胞が濃縮された部分集団の例として、ＰＢＭＣがあげられる。これらは、従来、Boyum(Nature 204, 793-794, 1964; Scan. J. Lab. Clin. Invest. Suppl. 97, 1967)が初めて言及した方法によって分離され得る。このことは、一般的に、血液を個体から採取し、当該血液を密度勾配遠心分離法のための例えば１．０７７ｇ／ｍｌ（２５°Ｃ）の濃度の溶液に添加することによって行われる。なお、上記溶液は、従来、フィコールとナトリウムジアトリゾエート（sodium diatrizoate）とを含む。室温で注意深く遠心分離する間に、ＰＢＭＣは、フィコール／血液の界面に集まり、赤血球および残留している白血球は沈殿する。ＰＢＭＣを含む界面は回収され、従来は適切な緩衝液（例えば、無菌ＰＢＳ）によって洗浄される。ＰＢＭＣを、水溶液（例えば、塩化アンモニウム）によって短時間等張処理することが好ましい。最後に、ＰＢＭＣを、ＰＢＳ（無菌）などの緩衝液によって、さらに１回または数回洗浄する。次に、取得した細胞を、適切な条件下（従来は−７０℃）で使用するまで保存する。
本発明では、核酸導入直前の血液細胞は、新鮮な血液細胞であることが好ましい。すなわち、工程（ａ）における血液細胞の収集（特に、採血）と、工程（ｂ）における核酸導入との間の時間が非常に短いことが好ましい。上記時間は、例えば１２時間未満であり、好ましくは６時間未満であり、特に好ましくは２時間未満であり、非常に好ましくは１時間未満である。
血液細胞への核酸導入は、一般的な方法（例えば、電気穿孔法または化学的方法、特にリポフェクション）によって行われる。
血液細胞の好ましい実施形態に関しては、本発明の薬学的組成物に関する上記説明に記載されている。同様に、本発明の作製方法の工程（ｂ）におけるｍＲＮＡの好ましい実施形態に関しては、本発明の薬学的組成物の適切な実施形態に記載されている。
また他の好ましい実施形態では、工程（ｂ）の後、核酸導入された細胞を、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、２本鎖ＲＮＡなどのＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体リガンド、安定化されたＤＮＡ、またはＣｐＧ−ＤＮＡなど免疫活性剤によって活性化するための工程（ｃ）を行う。
本発明に基づいて使用できる血液細胞の例として、上記で詳しく説明したようなＰＢＭＣは、フィコールハイパック密度勾配遠心分離法によって得られる。必要であれば、続いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって洗浄する工程を１回または数回行う。
本発明の核酸導入のためのｍＲＮＡは、当業者にとって公知の方法、特に化学合成法、または特に好ましくは上記の分子生物学的な方法で作製される。
上述したように、工程（ｂ）でin vitroでの核酸導入に用いるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定性を増すために、少なくとも１つのカチオン性物質またはポリカチオン性物質と共に複合体を形成するか、または濃縮されている。その結果、核酸導入の効率がより良好になり、特に核酸導入された細胞の出現率が高くなる。適切なカチオン性物質またはポリカチオン性物質の例としては、プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−アルギニン、またはヒストンがあげられる（これらに関しては、上記欧州特許第１０８３２３２号Ａの開示内容も参照）。
好ましい一実施形態では、上記で規定された薬学的組成物を作製するための上記方法は、ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの一部を、患者の腫瘍組織または病原体に感染した患者の細胞から作製する工程（１）と、上記ｃＤＮＡライブラリーまたは上記ｃＤＮＡライブラリーの一部を用いて、ＲＮＡのin vitro転写のためのテンプレートを作製する工程（２）と、上記テンプレートをin vitro転写を行う工程（３）と、を含んでいる。
患者の腫瘍組織は、例えば簡単な生体検査によって得られる。しかしながら、患者の腫瘍組織は、腫瘍によって侵食された組織を外科的に除去することによっても得られる。同様に、病原体に感染された細胞（本発明では、細胞は複数の病原菌によって侵食されていることも当然ありえる）は、任意の感染した組織（例えば、リンパ節）の生体検査によって得られる。感染した細胞の特に適切な供給源の例としては、血液、血清、リンパ液および骨液があげられる。感染した細胞は、任意に、唾液、精液、膣液、尿、便、汗などの他の体液からも得られる。さらに、本発明の作製方法の好ましい実施形態の工程（１）のｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの一部の作製は、適切な組織または細胞を保存用に（好ましくは−７０℃未満の温度に）冷凍された後に行い得る。
ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの一部を作製する第１工程は、腫瘍組織または感染された細胞から、全ＲＮＡを分離することである。適切な方法は、Maniatis他著の前記文献に記載されている。適切な用具も、例えばＲｏｃｈｅ有限会社から市販されている(例えば、「High Pure RNA Isolation Kit」という製品)。適切なポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、全ＲＮＡから、当業者にとっては公知の方法によって分離されている(例えば、Maniatis他著の前文献も参照)。適切なキットは、市販もされている。一例としては、Ｒｏｃｈｅ有限会社の「High Pure RNA Tissue Kit」があげられる。次に、このようにして得られたポリ（Ａ＋）ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを生成する(例えば、Maniatis他著の前記文献も参照)。ｃＤＮＡのこの作製工程は、当業者が入手可能な市販のキット（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ株式会社の「SMART PCR cDNA Synthesis Kit」）を用いて行える。
上記作製方法の好ましい実施形態の工程（２）では、In vitro転写用のテンプレートは、ｃＤＮＡライブラリー（または、ｃＤＮＡライブラリーの一部）から合成される。本発明では、これを、特に、結果として生じるｃＤＮＡ断片を適切なＲＮＡ作製用ベクターにクローニングすることにより行われる。適切なＤＮＡテンプレートおよび本発明で好まれるプラスミドについては、細胞の核酸導入のために提供されるｍＲＮＡの作製に関連して、すでに上で説明した。
上記工程（２）で作製されたテンプレートのin vitro転写のために、上記テンプレートが環状プラスミド（ｃ）ＤＮＡの形である場合、テンプレートは制限酵素によってまず線形化される。実際のin vitro転写の前に、例えば適切なフェノール／クロロホルム、および／またはクロロホルム／フェノール／イソアミルのアルコール混合物を用いて、このようにして酵素処理されたテンプレートを再度精製することが好ましい。その結果、ＤＮＡテンプレートは、確実に、タンパク質のない形状となる。次の工程では、精製されたテンプレートからＲＮＡを酵素合成する。この第二工程（サブ工程）は、適当な反応混合物中で行われる。反応混合物は、タンパク質のない線形化されたＤＮＡテンプレートが、好ましくはリボヌクレアーゼ阻害剤が加えられた適切な緩衝液中に含まれるものである。そして、第二工程は、必要とされるリボヌクレアーゼ３燐酸塩（ｒＡＴＰ，ｒＣＴＰ，ｒＵＴＰおよびｒＧＴＰ）と、十分な量のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ）との混合物を使用して行われる。この反応混合物には、ＲＮａｓｅのない水が用いられる。ＣＡＰアナログも、実際のＲＮＡの酵素合成時に添加することが好ましい。３７℃で適切な時間（例えば、２時間）反応させた後、ＲＮａｓｅのないＤＮａｓｅを添加することにより、ＤＮＡテンプレートが分解される。なお、上記分解は、再び３７℃で行うことが好ましい。
このようにして作製されたＲＮＡを、酢酸アンモニウム／エタノールを用いて沈殿させ、ＲＮａｓｅのないエタノールによって１回または数回任意に洗浄することが好ましい。最後に、精製されたＲＮＡは乾燥され、好ましい実施形態では、ＲＮａｓｅのない水の中に溶解される。さらに、このようにして作製されたＲＮＡは、フェノール／クロロホルムまたはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて、数回抽出されてもよい。
また他の本発明の好ましい実施形態では、全ｃＤＮＡライブラリーの一部だけが取得され、適切なｍＲＮＡ分子に転写される。したがって、本発明では、本発明のｍＲＮＡ分子を作製するために、いわゆるサブトラクションライブラリー（subtraction library）を、ｃＤＮＡライブラリーの一部として使用することもできる。腫瘍組織のｃＤＮＡライブラリーにおける好ましい一部は、腫瘍特異抗原をコードする。腫瘍毎に適切な抗原が知られている。細胞が、病原体（または、複数の異なる病原体）に感染している場合は、ｃＤＮＡ部分ライブラリーの一部は、感染により発現誘導されている（ホスト）細胞遺伝子産物（ポリペプチド）をコードすることが好ましい。また他の好ましい実施形態では、腫瘍特異抗原をコードするｃＤＮＡライブラリーの一部、または発現誘導された遺伝子産物をコードするｃＤＮＡライブラリーの一部を、（例えば、上記方法の工程（１）の前に）まず決定してもよい。このことは、腫瘍特異抗原、または、病原体と感染することにより発現誘導された遺伝子産物の配列を、健康な組織または感染されていない細胞のｃＤＮＡライブラリーと照合することによって行うことが好ましい。
本発明の照合は、特に、健康な組織の発現パターンと問題となっている腫瘍組織の発現パターンとを比較すること、または、病原菌に対する免疫活性化では、健康な細胞の発現パターンと感染された細胞の発現パターンとを比較することを含んでいる。適切な発現パターンは、例えば、適切なハイブリダイゼーション実験により、核酸レベルで決定できる。このことは、例えば、組織または細胞由来の適切な（ｍ）ＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを、適切なアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルにて分離した後、これらを膜へ転写し、当該膜を適当な核酸プローブにてハイブリダイゼーションさせること（ノザンブロット、またはサザンブロット）によって行うことができる。なお、上記プローブは、各遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブであることが好ましい。したがって、対応するハイブリダイゼーションを比較することにより、免疫の活性化に特に適した遺伝子、すなわち、腫瘍組織のみ、または腫瘍組織に特に強く発現する遺伝子、または感染された細胞において発現誘導された遺伝子がわかる。
また他の好ましい実施形態では、上記ハイブリダイゼーション実験は、マイクロアレイ（１つまたは複数のマイクロアレイ）を解析することにより行われる。適切なＤＮＡマイクロアレイでは、核酸プローブ（特に、オリゴヌクレオチドプローブ）が（特に小さなまたは最小のスペースに）規定どおり配置されている。各プローブは、例えば、対応する（ｍ）ＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーにあるか無いかが調査される遺伝子を表している。したがって、何百、何千、何万〜何十万の遺伝子さえ、適切なマイクロ配列で表せる。次に、特定の組織または特定の細胞の発現パターンを分析するため、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ、または好ましくはポリ（Ａ＋）ＲＮＡに対応するｃＤＮＡのどちらかに、適切なマーカー（特に、蛍光マーカー）を用いてラベルし、適切なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイと接触させる。ｃＤＮＡ種が、マイクロアレイ上に存在するプローブ分子、特に、オリゴヌクレオチドプローブ分子と結合すれば、その結果、程度に差はあるが蛍光シグナルが観察される。そして、上記蛍光シグナルは、適切な検出デバイス（例えば、適切に設計された蛍光スペクトロメーター）によって測定できる。ライブラリー中のｃＤＮＡ（またはＲＮＡ）種の発現が頻繁なほど、シグナル（例えば、蛍光シグナル）の輝度は強くなるであろう。対応するマイクロアレイハイブリダイゼーション実験（または、複数または多数のこのような実験）は、腫瘍組織と健康な組織とに対して、または、感染された細胞と感染されていない細胞とに対して、別々に行われる。したがって、マイクロアレイ実験で読み取られたシグナル間の差は、腫瘍組織だけに発現した、または腫瘍組織に頻繁に発現した遺伝子を示しているか、あるいは、病原体に感染することにより発現誘導された遺伝子を示している。このようなＤＮＡマイクロアレイ分析は、例えば、Schena (2003), Microarray Analysis, ISBN 0-471-41443-3, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに記載されている。上記公開文献の関連する開示内容は、本発明に含まれる。
しかしながら、感染特有の発現パターンまたは腫瘍組織特有の発現パターンのプロッティング（plotting）は、決して核酸レベルの分析に制限されない。当然、当業者は、タンパク質レベルの発現分析に使用される従来技術にも精通している。本願では、特に２次元ゲル電気泳動法および質量分析の技術について説明されている。これらの技術は、タンパク質バイオチップ（ずなわち、例えば、健康な組織または腫瘍組織、あるいは、感染した細胞または感染していない細胞由来のタンパク質抽出物が、マイクロアレイ基材に塗布された抗体および／またはペプチドと接触されるタンパク質レベルのマイクロアレイ）と好適に組み合わせられ得る。質量分析方法の例としては、特に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（matrix assisted laser desorption ionisation - time of flight）法があげられる。健康な組織と比較される腫瘍組織の発現パターン、または、感染されていない細胞と比較される感染した細胞の発現パターンを得るためのタンパク質化学分析の上記技術は、例えば、Rehm（２０００）のDer Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 第３版に記載されている。この関連する開示内容は、本発明に含まれることを明記する。タンパク質マイクロアレイに関しては、Schena（２００３）の前記文献の関連する詳細な内容を再度参照のこと。
本発明の薬学的組成物は、核酸導入された細胞の他に、１つまたは複数の薬学的に許容可能な補形剤および／または１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいる。適切な補形剤または賦形剤は、特定の血液細胞に適合された無菌の培地（media）または緩衝溶液であることが好ましい。
本発明の薬学的組成物の適切な製剤および作製のための方法は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」（Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980）に記載されている。この内容は、本発明の開示内容に含まれる。非経口的な投与に適した補形剤の例としては、無菌の水、無菌の緩衝溶液、または、無菌の培地の他に、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および、特に生物学的適合性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコライドコポリマー、または、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーがあげられる。本発明の組成物は、充填剤、または、ラクトースまたはマンニトールなどの物質、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を共有結合するための物質、金属イオンと錯化（complexation）するための物質、または、ポリマー化合物の特別な調製品の中、または調製品の上（例えば、ポリラクテート、ポリグリコール酸あるいはヒドロゲル、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層状の小胞、赤血球フラグメントまたはスフェロプラスト上）に材料を封入するための物質を含んでいてもよい。組成物の特別な実施形態は、例えば、溶解性、安定性、生体利用効率、または、分解性について、物理的な特性の機能として選択される。本発明の活性成分が、組成物中に、制御されて、または、断続的に放出されるということは、脂溶性貯蔵物（lipophilic depots）（例えば、脂肪酸、ワックス、または、オイル）をベースとして製剤が行われていることを意味する。本発明の物質、またはこのような物質を含む組成物を被覆すること、すなわち、ポリマー（例えば、ポリオクサマーまたはポリオキサミン）によって被覆することは、本発明の枠組みの範囲内で開示されている。さらに、本発明の物質または組成物は、保護コーティング（例えば、プロテアーゼ阻害剤または浸透性増強剤（permeability enhancer））を有していてもよい。好ましい親水性補形剤は、例えば、注射用の水（ＷＦＩ）、または、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩などを用いた緩衝水、または、適切な細胞培地であり、ｐＨは、典型的に、５．０〜８．０に調整されており、好ましくは６．０〜７．０に調整されている。補形剤または賦形剤は、さらに、塩分（例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、または、例えば溶液を等張性にする他の成分を含んでいることが好ましい。補形剤または賦形剤は、さらに、上記成分の他に、ウシ胎仔血清、増殖因子、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリソルベート８０、糖、または、アミノ酸などの付加成分をさらに含んでいてもよい。
本発明の薬学的組成物の投与および服用方法は、治療対象となる病気、および、治療対象となる病気の進行の程度、ならびに、患者の体重、年齢、性別によって決まる。
したがって、このような製剤中の核酸導入された細胞の濃度は、広い範囲内（例えば、５×１０４〜１×１０８細胞／ｍｌ）で変化してもよい。本発明の薬学的組成物は、非経口で（例えば、静脈、動脈内、皮下、または、筋肉内の経路によって）患者に投与されることが好ましい。さらに、本発明の薬学的組成物は、局部的に（例えば、腫瘍に）注入されてもよい。
したがって、本発明は、本発明の薬学的組成物を患者（特に、人間）に投与することを含む、肉腫または感染症（例えば、上述の病気）を治療する方法、または、予防または防止する方法を提供する。
治療または予防の方法の好ましい一実施形態では、つまり、本発明にもとづいて核酸導入された血液細胞（すなわち、赤血球、顆粒球、単核球および／または血小板、または、これらの濃縮された部分的集団またはほぼ純粋な部分的集団の混合物）を、肉腫または感染症を治療および／または防止するための薬学的組成物を作製するために上記のように使用する場合は、本発明の薬学的組成物に加えて、１つまたは複数のサイトカイン、および／または、１つまたは複数の副刺激分子が患者に投与される。さらに投与される特に適切な種に関しては、抗原の他に、ｍＲＮＡによってコードされる分子に関する上記説明も参照のこと。
したがって、本発明は、治療または予防の方法も提供するものである。この方法は、本発明に基づいて核酸導入された血液細胞と、少なくとも１つのサイトカイン（例えば、上記サイトカインの１つまたは複数）、特にＧＭ−ＣＳＦとを、患者（特に、人間）に投与する工程を含んでいる。この方法は、特に、適切な肉腫（例えば、上記の肉腫）または感染症を治療および／または予防するために使用される。したがって、本発明は、概して、核酸導入された（上記のような）血液細胞と、少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦなどの１つまたは複数の上記サイトカイン）とを、好ましくは薬学的に許容可能な補形剤および／または賦形剤と共に含む薬学的組成物にも関するものである。したがって、本発明は、さらに、サイトカイン（例えば、上記サイトカインの１つまたは複数）、特に、ＧＭ−ＣＳＦを、上記のような核酸導入された血液細胞と共に、肉腫（例えば、上で例をあげた肉腫）または感染症（例えば、上で例をあげた感染症）を治療および／または予防するために使用することに関するものである。
また他の本発明の好ましい実施形態では、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）は、本発明に基づいて核酸導入された細胞を含む薬学的組成物と同時に投与され、または、好ましくは上記組成物の前または後に投与される（または、上記サイトカインは、上で例を挙げた血液細胞と同時に、または、血液細胞の前または後に投与するための薬を作製するために使用される）。サイトカイン（特に、ＧＭ−ＣＳＦ）は、上で規定された薬学的組成物を投与する少し前（例えば、約２時間未満、例えば、約５分前まで）に投与されるか、または、少し後（例えば、約５分、１０分、１５分、３０分、４５分、または６０分後）またはかなり後（例えば、約２時間、６時間、１２時間、２４時間、または３６時間後）に投与されるか、または、一般的には、本発明に基づいて細胞が核酸導入された後に、投与されることが非常に好ましい。
サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）は、本発明に基づく薬学的組成物または本発明に基づいて核酸導入された血液細胞と同じ経路で投与されてもよいし、別の経路で投与されてもよい。サイトカインに関しては、投与の適切な経路および可能な適切な製剤は、本発明の薬学的組成物に関する上記説明に記載されている。患者がヒトである場合には、ＧＭ−ＣＳＦの量は、１００μｇ／ｍ２であることが特に推奨される。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）は、皮下注射（s.c. injection）によって投与されることが特に好ましい。
本発明の薬学的組成物または本発明に基づいて核酸導入された血液細胞と、上記組成物または血液細胞と任意に関連付けられているサイトカインまたは他の副刺激分子とは、間隔をおいて投与されることが好ましい。例えば、本発明の薬学的組成物は、より短い間隔（例えば、毎日、１日おき、３日おきなど）で投与されてもよいし、好ましくは、長い間隔（例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回など）で投与されてもよい。本願では、間隔を変更することも出来る。間隔を変更する場合は、患者の免疫学的なパラメータを特に考慮する必要がある。例えば、本発明の薬学的組成物の投与、（および、上記組成物と任意に関連付けられているサイトカインまたは副刺激分子の投与）は、「治療開始時の間隔はより短く（例えば、２週間に１回であり）、その後、治療の経過または適切に決定された患者の免疫学的なパラメータに応じて、間隔が広げられる（例えば、１月に１回に）」という治療体系に従ったものであってもよい。したがって、患者に応じて、特に、患者の状態および免疫学的なパラメータに応じて、それぞれ個人に専用に作成された治療体系を適用することが出来る。
したがって、本発明は、要するに、まず、（上記のような）血液細胞または血球細胞を患者（動物またはヒト）から採取し、本発明に基づいて、上記で定義したｍＲＮＡをin vitroで導入し、最後に、適切な患者、好ましくは最初に特定の血液細胞を採取したのと同じ患者に投与する治療方法も提供するものである。本発明の薬学的組成物の製剤および投与については関連する説明を参照のこと。
したがって、本発明では、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの領域を有する少なくとも１つのｍＲＮＡが導入された血液細胞または血球細胞は、ｍＲＮＡにコードされた抗原に対する免疫反応を活性化するために（または、免疫活性用の薬を作製するために）使用される。
したがって、驚くべきことに、本発明によれば、ある種の抗原に対してワクチン接種する場合に、患者の適切な免疫反応を引き起こすために特定の抗原をコードするｍＲＮＡを導入する前に、高コストの細胞培養技術によって適切な血液細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に、特に樹状細胞（ＤＣ）に分化させる必要のないことがわかった。ＡＰＣの特徴は、特に、副刺激分子の発現とサイトカインの分泌とによりリンパ球と相互作用し、このリンパ球を介して、抗原に特有の免疫反応を引き起こすことができる点である。樹状細胞以外の他のＡＰＣは、マクロファージおよびＢリンパ球である。本発明に基づいて使用される血液細胞は、Ｂ細胞、単球、Ｔリンパ球を含み、任意に顆粒球を含み、形質細胞様（plasmacytoid）ＤＣ（ｐＤＣ）および骨髄のＤＣ（ｍＤＣ）に分割できる少数のＤＣを含んでいる。このように核酸導入された血液細胞の作用形態の特定の論理に拘束されず、本発明では、一般的知識を考慮すれば、例えば注射によって患者に投与される核酸導入された細胞は、ｍＲＮＡにコードされたタンパク質を発現し、直接的（ＰＢＭＣなどの血液細胞に存在するＡＰＣを介して）に、または、間接的（ＡＰＣではないが、死亡し、生体中に存在するＡＰＣの食作用によって吸収される核酸導入された細胞、または、生体中に存在するＡＰＣの食作用によって吸収される核酸導入された細胞によって分泌されるタンパク質を介して）に、抗原特有の免疫を活性化すると考えられる。したがって、従来技術とは異なり、本発明は、例えば濃縮されたＡＰＣ集団を得るため、または別な方法で人工的なＡＰＣを生成するために、高コストのプロセス工程（例えば、細胞培養工程など）は必要ない。さらに、大量のサイトカインを使用する必要はない。典型的に、本発明では、血液細胞の収集（例えば、採血）と、例えば腫瘍または感染ワクチンとして使用される薬学的組成物の投与との間の時間は、わずか１時間〜数時間（例えば２時間）である。本発明によれば、従来の方法とは対照的に、in vitroで作製されたＡＰＣではなく、むしろ、上記の利点を有する血液細胞（一般的に、赤血球、単核球、顆粒球および／または血小板、または、これらの血液細胞の濃縮された集団またはほぼ純粋な集団の混合体）が投与される。
図１に、ＣＤ４特異的ヘルパーＴ細胞またはＣＤ１９特異的Ｂ細胞中のＥＧＦＰの発現についてのＦＡＣＳ実験の結果のグラフを示す。ＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡ（左側のグラフ）、または、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡ（対照；右側のグラフ）を、電気穿孔法によって、新鮮なヒトＰＢＭＣにin vitroで導入した。次に、ＥＧＦＰの発現を、ＥＧＦＰの蛍光に基づくＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ４陽性細胞またはＣＤ１９陽性細胞は、蛍光性の抗ＣＤ４抗体（上側のグラフ）または抗ＣＤ１９抗体（下側のグラフ）によって検出された。これらの結果は、ＰＢＭＣ中に存在するＣＤ４陽性細胞が、ｍＲＮＡを利用してＥＧＦＰを発現することを示している。
さらに、図２は、ｍＲＮＡが導入されたＰＢＭＣが、ｍＲＮＡにコードされた抗原に対してＴ細胞を活性化できることを示しているＦＡＣＳ実験の結果のグラフを示す。これらの実験を、２つの異なる電気穿孔法、すなわち、ＡＭＡＸＡ社のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置と、Ｅｑｕｉｂｉｏ社のＥＡＳＹＪＥＣＴ ＰＬＵＳ標準的電気穿孔システムとによって行った。新鮮なヒトＰＢＭＣに、ＥＧＦＰｍＲＮＡまたはインフルエンザマトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡを導入した。インフルエンザマトリックスタンパク質のＧＩＬＧＦＶＦＰＬペプチドを負荷したＰＢＭＣをポジティブコントロールとして使用した。核酸導入の後、またはポジティブコントロールでペプチドを負荷した後、これらの細胞を、１週間、新鮮な自家ＰＢＭＣと共に共存培養した。つぎに、これらの細胞を、PercPラベル付きＣＤ８特異的モノクローナル抗体（細胞毒性Ｔ細胞を検出するため）、またはＰＥラベリングにより蛍光を発するＭＨＣ４量体（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって表されるインフルエンザマトリックスタンパク質エピトープに特有の細胞毒性Ｔ細胞だけを認識する）によってラベルする。どちらの電気穿孔方法でも、活性化に使用されるＰＢＭＣにＥＧＦＰｍＲＮＡが導入されている場合は、ＣＤ８陽性の細胞毒性Ｔ細胞のわずか０．１％または０．７％は、ドミナントインフルエンザマトリックスタンパク質エピトープに対して特有のものであることが分かった。これとは対照的に、ＰＢＭＣにインフルエンザマトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡが導入されている場合は、ドミナントインフルエンザマトリックスタンパク質エピトープに対して特有のものであるＣＤ８陽性の細胞毒性Ｔ細胞が観察される頻度は、１週間後１．６％または２．５％である。従って、本発明によれば、ドミナントインフルエンザマトリックスタンパク質エピトープに対して特有のものである細胞毒性Ｔ細胞の増殖は、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡを有するＰＢＭＣの電気穿孔法によって誘発されるのであって、ＥＧＦＰｍＲＮＡの導入によって誘発されるのではないということが確定された。さらに、この結果は、電気穿孔法の種類には無関係である。
以下の制限的ではない例を参照して本発明をより詳細に説明する。
［実施例１］
［ＰＢＭＣの分離］
末梢血単核球を、健康なＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ドナーから分離した。単核球を、フィコールハイパック濃度勾配遠心分離法によって得た。得られたＰＢＭＣをＰＢＳによって３回洗浄した。
［ＰＢＭＣの分離］
末梢血単核球を、健康なＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ドナーから分離した。単核球を、フィコールハイパック濃度勾配遠心分離法によって得た。得られたＰＢＭＣをＰＢＳによって３回洗浄した。
［実施例２］
［電気穿孔法によるＰＢＭＣへの核酸導入］
得られたＰＢＭＣに、Nucleofector装置とヒトB-cell Nucleofector Kit（双方ともドイツのケルンにあるＡＭＡＸＡ有限会社製）とを用いて、作製者の指示に従って核酸導入した。各核酸導入では、４×１０６個の細胞に５μｇのＲＮＡを導入した。
［電気穿孔法によるＰＢＭＣへの核酸導入］
得られたＰＢＭＣに、Nucleofector装置とヒトB-cell Nucleofector Kit（双方ともドイツのケルンにあるＡＭＡＸＡ有限会社製）とを用いて、作製者の指示に従って核酸導入した。各核酸導入では、４×１０６個の細胞に５μｇのＲＮＡを導入した。
モノクローナル抗体ＣＤ４−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ１９−ＰＥ（双方ともＤＢ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、ＥＧＦＰｍＲＮＡが導入されたＰＢＭＣの免疫発現頻度解析のために使用した。
核酸導入後、１．５×１０６個の細胞を、２４ウェルの培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で、１００ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ(ドイツ、Deisenhofen、Sigma社製)と、２．５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−α(R&D Systems社製)とを含む１．５ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（ベルギーのBio Whittaker社製）中で、成熟するよう培養した。ポジティブコントロールとして、核酸導入されていない熟成したＰＢＭＣに対して、１時間、インフルエンザマトリックスタンパク質の１ｍｇ／ｍｇのＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）を負荷した。２４時間培養した後、成熟したＰＢＭＣを培地によって洗浄した。次に、これらの細胞を、同系解凍済みＰＢＭＣ（syngenic thawed PBMCs）（１ウェルにつき１０７個の細胞）を活性化するために使用した。４日後、新鮮な培地、すなわち、１０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２および５ｍｇ／ｍｌの組換えＩＬ−７（双方ともＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した。６日間育成した後、細胞を、インフルエンザマトリックスタンパク質特異的ＰＥラベル付きヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ４量体によってラベルした。ＣＤ８特異的細胞を、ＰｅｒｃＰラベル付きＣＤ８抗体に対して方向づけられているＦＩＴＣラベル付き抗ＣＤ４抗体を用いて検出した。
［実施例３］
［in vitroで核酸導入されたヒトＰＢＭＣにおけるＥＧＦＰの発現］
ＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡを、電気穿孔法（またはリポ移入、データは示されていない）によって新鮮なヒトＰＢＭＣに導入した。核酸導入の１日後、蛍光性のモノクローナル抗体（ヘルパーＴ細胞用の抗ＣＤ４抗体、またはＢ細胞用の抗ＣＤ１９抗体）によってラベルされた細胞中のＥＧＦＰの発現を、ＦＡＣＳによって分析した。図１に示すように、ＣＤ４陽性細胞は、ｍＲＮＡを利用して、ＥＧＦＰを発現する。ＥＧＦＰの発現は、Ｂ細胞またはＴ細胞ではない他の細胞（例えば、単球（図示せず））のみならず、Ｂ細胞においても確認できた。
［in vitroで核酸導入されたヒトＰＢＭＣにおけるＥＧＦＰの発現］
ＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡを、電気穿孔法（またはリポ移入、データは示されていない）によって新鮮なヒトＰＢＭＣに導入した。核酸導入の１日後、蛍光性のモノクローナル抗体（ヘルパーＴ細胞用の抗ＣＤ４抗体、またはＢ細胞用の抗ＣＤ１９抗体）によってラベルされた細胞中のＥＧＦＰの発現を、ＦＡＣＳによって分析した。図１に示すように、ＣＤ４陽性細胞は、ｍＲＮＡを利用して、ＥＧＦＰを発現する。ＥＧＦＰの発現は、Ｂ細胞またはＴ細胞ではない他の細胞（例えば、単球（図示せず））のみならず、Ｂ細胞においても確認できた。
［実施例４］
［ｍＲＮＡによって核酸導入されたＰＢＭＣによるＴ細胞の活性化］
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性の健康なドナー由来のＰＢＭＣに、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡを導入した。核酸導入は、ＡＭＡＸＡ社のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置またはＥｑｕｉｂｉｏ社の標準的な電気穿孔システム（ＥＡＳＹＪＥＣＴ ＰＬＵＳ）を用いて行った。核酸導入されたＰＢＭＣを、自家の新鮮なＰＢＭＣと共に、１週間in vitroで共存培養した。成熟は、ＬＰＳおよび／またはＴＮＦ−αによる培養により、一晩、任意に行った。しかしながら、活性化されていない核酸導入されたＰＭＢＣでも同じ結果が得られた。次に、これらの細胞を、モノクローナル抗体（ＣＤ８陽性の細胞毒性Ｔ細胞用の抗ＣＤ８抗体）および蛍光性ＭＨＣ４量体によってラベルした。蛍光性ＭＨＣ４量体は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって表されるインフルエンザマトリックスタンパク質エピトープに特有の細胞毒性Ｔ細胞だけを認識するものである。図２の結果が示すように、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡの電気穿孔法でだけ、インフルエンザマトリックスタンパク質から派生したドミナントエピトープに特有の細胞毒性Ｔ細胞が増殖している。一方、ＥＧＦＰｍＲＮＡの導入は、ＣＤ８陽性の細胞毒性Ｔ細胞の繁殖を引き起こさない。さらに、この結果は、使用する電気穿孔システムには依存していない。また、この結果は、核酸導入されたＰＢＭＣが共存培養の前にＬＰＳおよびＴＮＦ−αによって一晩処理されたかどうかには依存していない。
［ｍＲＮＡによって核酸導入されたＰＢＭＣによるＴ細胞の活性化］
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性の健康なドナー由来のＰＢＭＣに、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡを導入した。核酸導入は、ＡＭＡＸＡ社のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置またはＥｑｕｉｂｉｏ社の標準的な電気穿孔システム（ＥＡＳＹＪＥＣＴ ＰＬＵＳ）を用いて行った。核酸導入されたＰＢＭＣを、自家の新鮮なＰＢＭＣと共に、１週間in vitroで共存培養した。成熟は、ＬＰＳおよび／またはＴＮＦ−αによる培養により、一晩、任意に行った。しかしながら、活性化されていない核酸導入されたＰＭＢＣでも同じ結果が得られた。次に、これらの細胞を、モノクローナル抗体（ＣＤ８陽性の細胞毒性Ｔ細胞用の抗ＣＤ８抗体）および蛍光性ＭＨＣ４量体によってラベルした。蛍光性ＭＨＣ４量体は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって表されるインフルエンザマトリックスタンパク質エピトープに特有の細胞毒性Ｔ細胞だけを認識するものである。図２の結果が示すように、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡの電気穿孔法でだけ、インフルエンザマトリックスタンパク質から派生したドミナントエピトープに特有の細胞毒性Ｔ細胞が増殖している。一方、ＥＧＦＰｍＲＮＡの導入は、ＣＤ８陽性の細胞毒性Ｔ細胞の繁殖を引き起こさない。さらに、この結果は、使用する電気穿孔システムには依存していない。また、この結果は、核酸導入されたＰＢＭＣが共存培養の前にＬＰＳおよびＴＮＦ−αによって一晩処理されたかどうかには依存していない。
さらに、マウスのin vivoでの実験によって、電気穿孔法によって核酸導入された新鮮な脾臓細胞は、本発明の意味での血液細胞と同じく、免疫反応を引き起こす能力があることが分かる。このことは、特に、注目する抗原をコードするバイシストロン性のｍＲＮＡに当てはまり、同時に、サイトカイン、共活性受容体、ホーミング分子、および／または、（壊死またはアポトーシスを引き起こす）自殺分子にも当てはまる。
Claims (35)
- 少なくとも１つのｍＲＮＡが導入された血液細胞を、薬学的に許容可能な補形剤および／または賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物であって、
上記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの領域を含み、
該血液細胞は、ほぼ純粋なまたは濃縮されたＰＢＭＣであり、５％以下の樹状細胞（ＤＣ）を含んでいる、
肉腫または感染症の治療および／または予防のための、薬学的組成物。 - 上記血液細胞は、２％以下の樹状細胞（ＤＣ）を含んでいる請求項１に記載の薬学的組成物。
- 自家血液細胞を含む請求項１または２に記載の薬学的組成物。
- 上記ｍＲＮＡは、腫瘍または病原体由来の少なくとも１つの抗原をコードする領域を含んでいる請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 上記抗原は、腫瘍または病原体由来の抗原のポリエピトープである請求項４に記載の薬学的組成物。
- 上記ポリエピトープは、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加および／または置換によって修飾されている請求項５に記載の薬学的組成物。
- 上記血液細胞は、腫瘍組織または病原体に感染された細胞のｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの一部に対応する複数のｍＲＮＡが導入されている請求項４〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 上記ｃＤＮＡライブラリーの一部は、腫瘍特異抗原、または病原体の感染により発現誘導された遺伝子産物をコードする請求項７に記載の薬学的組成物。
- 上記腫瘍抗原は、
７０７−ＡＰ，ＡＦＰ，ＡＲＴ−４，ＢＡＧＥ，β−カテニン／ｍ，Ｂｃｒ−ａｂｌ，ＣＡＭＥＬ，ＣＡＰ−１，ＣＡＳＰ−８，ＣＤＣ２７／ｍ，ＣＤＫ４／ｍ，ＣＥＡ，ＣＴ，Ｃｙｐ−Ｂ，ＤＡＭ，ＥＬＦ２Ｍ，ＥＴＶ６−ＡＭＬ１，Ｇ２５０，ＧＡＧＥ，ＧｎＴ−Ｖ，Ｇｐ１００，ＨＡＧＥ，ＨＥＲ−２／ｎｅｕ，ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ，ＨＰＶ−Ｅ７，ＨＳＰ７０−２Ｍ，ＨＡＳＴ−２，ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ），ｉＣＥ，ＫＩＡＡ０２０５，ＬＡＧＥ，ＬＤＬＲ／ＦＵＴ，ＭＡＧＥ，ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ，ＭＣ１Ｒ，ミオシン／ｍ，ＭＵＣ１，ＭＵＭ−１，−２，−３，ＮＡ８８−Ａ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ｐ１９０ｍｉｎｏｒｂｃｒ−ａｂｌ，ＰｍＩ／ＲＡＲa，ＰＲＡＭＥ，ＰＳＡ，ＰＳＭ，ＲＡＧＥ，ＲＵ１またはＲＵ２，ＳＡＧＥ，ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３，ＴＥＬ／ＡＭＬ１，ＴＰＩ／ｍ，ＴＲＰ−１，ＴＲＰ−２，ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２およびＷＴ１からなる群より選択される請求項４〜８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。 - 上記病原体は、ウイルス、バクテリアおよび原生動物からなる群より選択される請求項４〜８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 上記ウイルス、バクテリアまたは原生動物由来の抗原は、分泌タンパク質由来である請求項１０に記載の薬学的組成物。
- 抗原、および／または５’非翻訳領域、および／または３’非翻訳領域をコードする上記ｍＲＮＡの上記領域は、野生型ｍＲＮＡとは違って、不安定化配列エレメントが無いように変更されている請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 上記ｍＲＮＡは、翻訳効率を上げるために使用されるシーケンス領域を含んでいる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 上記ｍＲＮＡは、さらに、
少なくとも１つのサイトカイン、および／または、
少なくとも１つの副刺激分子、および／または、
少なくとも１つの転写因子、および／または、
少なくとも１つのホーミング受容体、および／または、
少なくとも１つの自殺遺伝子をコードする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。 - 上記ｍＲＮＡは、
５’キャップ構造、および／または、
少なくとも約２５個のヌクレオチドのポリ（Ａ＋）尾部、および／または、
少なくとも１つのＩＲＥＳ、および／または、
少なくとも１つの５’安定化配列、および／または、
少なくとも１つの３’安定化配列を有している請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。 - 上記５’安定化配列および／または３’安定化配列は、α−グロビン遺伝子またはβ−グロビン遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）と、一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮＸＣＣＣ（Ｕ／Ａ）ＰｙＸＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣにて示される安定化配列とからなる群より選択される請求項１５に記載の薬学的組成物。
- 上記ｍＲＮＡは、自然発生的なヌクレオチドの少なくとも１つのアナログを有している請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 上記アナログは、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホン酸塩、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンおよびイノシンからなる群より選択される請求項１７に記載の薬学的組成物。
- 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を作製する方法であって、
ほぼ純粋なまたは濃縮されたＰＢＭＣであり、５％以下の樹状細胞（ＤＣ）を含んでいる血液細胞に、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの領域を含む少なくとも１つのｍＲＮＡをin vitroにて導入する工程（ｂ）を含む方法。 - 上記工程（ｂ）における導入直前の上記血液細胞は、２％以下の樹状細胞（ＤＣ）を含んでいる請求項１９に記載の方法。
- 上記血液細胞は、自家血液細胞である請求項１９に記載の方法。
- 上記ｍＲＮＡは、請求項４〜１８のいずれか１項に記載されたものである請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
- 上記工程（ｂ）において導入に用いられるｍＲＮＡは、少なくとも１つのカチオン性物質またはポリカチオン性物質と共に複合体を形成するかまたは濃縮されている請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
- 上記カチオン性物質またはポリカチオン性物質は、プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−アルギニンおよびヒストンからなる群より選択される請求項２３に記載の方法。
- 上記ｍＲＮＡは、
ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの一部を、患者の腫瘍組織または病原体に感染された患者の細胞から作製する工程（１）と、
上記ｃＤＮＡライブラリーまたは上記ｃＤＮＡライブラリーの一部を用いて、ＲＮＡのin vitro転写のためのテンプレートを作製する工程（２）と、
上記テンプレートを用いてin vitro転写を行う工程（３）と、を含む方法によって作製される請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。 - 上記腫瘍組織の上記ｃＤＮＡライブラリーの一部は、腫瘍特異抗原、または病原体の感染によって発現誘導された遺伝子産物をコードする請求項２５に記載の方法。
- 上記腫瘍特異抗原の配列、または病原体の感染によって発現誘導された遺伝子産物の配列は、工程（１）の前に決定されている請求項２６に記載の方法。
- 上記腫瘍特異抗原の配列、または病原体の感染によって発現誘導された遺伝子産物の配列の決定は、健康な組織または感染していない細胞由来のｃＤＮＡライブラリーと照合する工程を含んでいる請求項２７に記載の方法。
- 上記腫瘍特異抗原の配列、または病原体の感染によって発現誘導された遺伝子産物の配列の決定は、マイクロアレイにより解析する工程を含んでいる請求項２８に記載の方法。
- 請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法によって得られる薬学的組成物。
- 少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの領域を含む少なくとも１つのｍＲＮＡが導入された血液細胞を、薬学的に許容可能な補形剤および／または賦形剤と任意に組み合わせ、上記ｍＲＮＡにコードされる抗原に対する免疫反応を活性化するための薬を作製するための血液細胞の使用方法であって、
該血液細胞は、ほぼ純粋なまたは濃縮されたＰＢＭＣであり、５％以下の樹状細胞（ＤＣ）を含んでいる方法。 - 上記血液細胞は、２％以下の樹状細胞（ＤＣ）を含んでいる請求項３１に記載の方法。
- 上記血液細胞は、自家血液細胞である請求項３１または３２に記載の方法。
- 上記ｍＲＮＡは、請求項４〜１８のいずれか１項に記載されたものである請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
- 上記免疫反応を、肉腫または感染症の治療および／または予防のために使用する請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
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